CN110974804A - p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用，属于基因工程技术领域。p53信使RNA纳米粒通过下述方法制备：1、体外合成化学修饰的p53mRNA，2、自组装方法制备纳米体系进行体内递送p53信使RNA。p53信使RNA纳米粒通过恢复p53抑癌功能发挥抗肿瘤及增强化疗敏感性治疗作用。本发明的优点：1.本发明中p53信使RNA成功通过纳米体系递送至p53失活的肝癌和肺癌肿瘤细胞内，在体内外高效快速地诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞从而显著抑制了肿瘤细胞的生长；2.纳米粒递送的p53信使RNA可通过回补肿瘤内缺失的抑癌因子p53来增强mTOR抑制剂依维莫司的抗肿瘤作用。

Description

p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用技术领域。
背景技术
癌症的发生发展除了肿瘤抑制因子的失活外，还伴有促肿瘤生长功能通路的异常激活，如哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)，一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可促进细胞的生长和增殖。mTOR信号通路在60％的肿瘤中异常激活从而增加肿瘤细胞的增殖能力，包括肝癌和肺癌。
依维莫司(RAD001)是一种典型的mTOR抑制剂，已被FDA临床批准用于晚期肾癌、胰腺神经内分泌肿瘤及其他类型的癌症。然而，依维莫司并不能有效提高肝细胞肝癌(HCC)及非小细胞肺癌(NSCLC)患者的生存率。研究显示依维莫司的临床治疗差异性主要取决于不同肿瘤细胞存在的耐药机制，包括i)保护性自噬的激活；ii)凋亡通路的失调(如，抗凋亡蛋白Bcl-2的上调)。从而依维莫司与自噬抑制剂或Bcl-2抑制剂联合使用可以提高抗肿瘤的疗效，然而这些抑制剂也可以通过干扰正常细胞的生理功能诱导不可避免的毒副作用。
肿瘤患者中p53是突变频率最高的一个基因,根据癌症基因组图谱(TCGA)数据库统计(http://cbio portal.org)，36％的肝细胞肝癌和68％的非小细胞肺癌中检测到p53基因低表达。p53抑癌基因参与调节多重细胞通路，作为转录因子，p53可以激活其下游基因，如促凋亡蛋白Bax(Bcl-2相关蛋白)和PUMA(p52上调凋亡调节因子)从而抵抗致癌信号的促增殖作用。作为细胞周期检查点，p53可以诱导细胞周期停滞，参与DNA复制和修复过程，保护基因组完整性。此外，细胞质p53还可以抑制引起化疗耐药的保护性自噬的激活。
对于p53基因功能的恢复，目前有两种策略：i)使用小分子抑制剂阻断MDM2对p53的拮抗作用，从而释放p53或使其突变体的功能重新活化；ii)通过病毒或非病毒载体进行DNA转染恢复功能性拷贝。尽管这些尝试都取得了一些成功，但两种方法都存在很大的应用局限性，例如，对于p53抑癌基因发生缺失突变时，小分子抑制剂将无效果；基于p53的DNA基因疗法存在基因组整合以及导致基因组突变的潜在风险。
发明内容
近几年，信使RNA(mRNA)由于其独特的优势(例如，不存在基因组整合、直接和快速的蛋白质表达等)引起了研究人员的广泛关注。利用肿瘤抑制基因mRNA治疗肿瘤是直接和非常有希望的一种策略，但是如何高效递送mRNA到肿瘤部位仍然是一个难点及挑战，因此目前为止还没有关于使用信使RNA修复p53抑癌基因功能的报道。
因此我们设计了针对p53的信使RNA(mRNA)通过肿瘤靶向的纳米体系递送p53mRNA至肝细胞肝癌和非小细胞肺癌中进行p53功能的恢复，结果表明，p53mRNA成功通过纳米体系递送至p53失活的肝细胞肝癌(Hep3B)及非小细胞肺癌细胞(H1299)，并高效快速地诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞从而显著抑制了肿瘤细胞的生长。与此同时，p53mRNA纳米系统可通过p53功能介导的抑制保护性自噬和诱导凋亡通路双重作用加强p53缺陷的肿瘤细胞对依维莫司的化疗敏感性，从而在体内和体外实验中产生协同抗肿瘤效果。
本发明的目的在于公开了p53信使RNA纳米粒。
本发明第二个目的在于公开了上述p53信使RNA纳米粒的制备方法。
本发明第三个目的在于公开了上述p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种p53信使RNA纳米粒，所述p53信使RNA纳米粒是通过下述方法制备：
(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；
对于体外转录(IVT)，将
Figure BDA0002271620900000021
转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM 5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶(DNase)处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVT RNA转录物中；得到p53信使RNA；
p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；
(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；
在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；
随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并进一步混合在一起，形成最终混合物；
在800转/分的磁力搅拌下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase/RNase的胎牛血清超纯水中30分钟，其中超纯水为分子生物学级；
使用超滤装置(EMD Millipore，MWCO 100kDa)通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物；用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。
上述技术方案中p53信使RNA纳米粒的制备方法，其中，所述制备方法包括下述步骤：
(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；
对于体外转录(IVT)，将
Figure BDA0002271620900000031
转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM 5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶(DNase)处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVT RNA转录物中；
p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；
(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；
在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；
随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并进一步混合在一起，形成最终混合物；
在800转/分的磁力搅拌下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase/RNase的胎牛血清超纯水中30分钟，其中超纯水为分子生物学级；
使用超滤装置(EMD Millipore，MWCO 100kDa)通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物；用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。
上述技术方案所述的p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
上述技术方案所述的应用，其中：所述p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用是指在制备恢复p53抑癌功能药物中的应用。
上述技术方案所述的应用，其中：所述恢复p53抑癌功能是指在肝细胞肝癌Hep3B和非小细胞肺癌细胞H1299中恢复p53抑癌功能。
上述技术方案所述的应用，其中：所述p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用是指在制备加强p53缺失的肝细胞肝癌和非小细胞肺癌细胞对mTOR抑制剂依维莫司的敏感性药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明中p53信使RNA纳米粒成功通过纳米体系递送至p53失活的肝细胞肝癌(Hep3B)及非小细胞肺癌细胞(H1299)，并高效快速地诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞从而显著抑制了肿瘤细胞的生长。
2、本发明中p53信使RNA纳米粒可通过p53功能介导的抑制保护性自噬和诱导凋亡通路双重作用加强p53缺陷的肿瘤细胞对依维莫司的化疗敏感性，从而在体内和体外实验中产生协同抗肿瘤效果。
附图说明：
1、图1为本发明制备流程和实验例实验机制概括示意图；其中图1A为制备工艺概括示意图，图1B为实验例实验机制概括示意图。
2、图2为p53信使RNA纳米粒的表征图，其中A：lipid-PEGs(DMPE-PEG and DSPE-PEG),polymer(PDSA)和(G0-C14)化学结构式；B:纳米粒子质谱分析；C.纳米粒子在PBS中不同时间的颗粒直径大小；D.纳米粒子在透射电镜下的形态。
3、图3为增强绿色荧光蛋白信使RNA(EGFPmRNA)纳米粒的细胞活性和转染效率；其中A-C:共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察EGFPmRNA纳米粒的转染效率；D：CLSM观察纳米粒将cy5标记的mRNA递送到细胞质中；E-F：流式细胞仪在Hep3B细胞中检测到复合纳米粒对EGFPmRNA的胞内递送。
4、图4为纳米载体递送p53mRNA在Hep3B中恢复p53抑癌功能。其中A.共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察p53蛋白表达；B.免疫印迹检测p53蛋白表达量；C.细胞集落形成试验观察p53mRNA纳米粒对Hep3B增殖的抑制；D.流式细胞术检测p53mRNA纳米粒诱导细胞凋亡；E.流式细胞术检测p53mRNA纳米粒引起的G1周期阻滞。
5、图5为依维莫司通过诱导保护性自噬引发Hep3的耐药性。其中A：细胞存活实验检测不同药物浓度对细胞的杀伤性；B：蛋白免疫印迹实验检测p-mTOR和p-p70S6K表达；C：蛋白免疫印迹实验检测自噬水平；D：透射电镜观察依维莫司引起自噬小体的增加；E共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-LC3荧光表达。
6、图6为p53信使RNA纳米粒增强依维莫司抗肿瘤效果及其机制。其中A：细胞存活实验；B：流式细胞术检测细胞凋亡；C：细胞集落形成试验观察p53mRNA纳米粒联合依维莫司对Hep3B的增殖抑制；D：透射电镜观察p53信使RNA纳米粒引起线粒体凋亡同时抑制自噬小体的形成。
7、图7为药代动力学(PK)和生物分布(BD)研究结果。其中A体内mRNA血液循环时间测定(裸Cy5-labeled mRNA，Cy5-labeled mRNA NPs.NP25,NP50,and NP75代表复合lip-PEG外层DSPE-PEG/DMPE-PEG的比例(25:75,50:50,and 75:25)。B Hep3B移植瘤老鼠尾静脉注射裸Cy5-mRNA,Cy5-mRNA NP25,Cy5-mRNA NP50,or Cy5-mRNA NP75纳米粒后，不同时间点近红外荧成像监测纳米粒在肿瘤部位的聚集。
8、图8为p53mRNA纳米粒的体内治疗效果及其在体内对依维莫司的增敏能力。其中A：Hep3B异种移植瘤小鼠模型；B：治疗模式图，对Hep3B异种移植的无胸腺裸鼠进行了体内抗肿瘤研究,每三天通过尾静脉系统注射一次p53mRNA纳米粒，共注射6次；C：不同处理后瘤体生长曲线图；D：不同时间治疗后活体组织免疫荧光检测p53蛋白、活化的caspase3蛋白的表达。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例及试验例对p53信使RNA纳米粒及其制备方法和在制备治疗肿瘤药物中的应用作进一步的说明。
一、材料：
L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((H-cys-ome)2·2HCl)、三甲胺、阳离子型乙二胺聚酰胺-胺(PAMAM)第0代树枝状大分子(G0)和脂肪酸二氯化物来自Sigma-Aldrich公司。
聚乙二醇分子量(MW)为2000的双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺-乙二醇和聚乙二醇分子量(MW)为5000的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇购自Avanti Polar Lipids公司。
Lipofectamine 2000(Lip2k)购自美国Invitrogen，(加利福尼亚州卡尔斯巴德市)。
TriLink生物科技有限公司(TriLink Biotechnologies)购买增强绿色荧光蛋白信使RNA EGFPmRNA(用5-甲基胞苷和伪尿苷修饰)和从CleanCapTM公司购买cy5-Fluc信使RNA(对照cy5标记的信使RNA)。
依维莫司(RAD001)购于Sigma-Aldrich。
用于蛋白质印迹实验的主要抗体包括：P53抗体(SantaCruz，sc-126；1:1000稀释度)、Bcl-2抗体(Abcam,1:1000稀释度)、Bax抗体(Cell Signaling Technology，#2774；1:1000稀释度)、PUMA抗体(SantaCruz，H-136；1:1000稀释度)、Cleaved-Caspase3抗体(CellSignaling Technology，#9661；1:1000稀释度)、Cleaved-caspase9抗体(Abcam，ab2324；1:1000稀释度)、p21抗体(Abcam，ab109520；1:2000稀释度)、Cyclin E1抗体(Abcam，ab3927；1:2000稀释度)、mTOR抗体(Cell Signaling Technology，2972；1:1000稀释度)、p-mTOR抗体(Cell Signaling Technology，5536；1:1000稀释度)、p-p70S6K抗体(Cell SignalingTechnology，9205；1:2000稀释度)，p-4EBP1抗体(Cell Signaling Technology，13443；1:2000稀释度)，LC3B抗体(abclonal；1:1000稀释度)。从Cell Signaling Technology获得GAPDH抗体(Cell Signaling Technology，5174；1:2000稀释度)、beta-Actin抗体(CellSignaling Technology；1:2000稀释度)、抗兔和抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)结合的第二抗体。用于共聚焦激光扫描显微镜实验的第二抗体包括：Alexa
Figure BDA0002271620900000061
标记山羊抗兔IgG(LifeTechnologies公司，A-11034)和Alexa
Figure BDA0002271620900000062
标记山羊抗鼠IgG(LifeTechnologies公司，A-28181)。根据上述方法(38)，通过1，2-环氧十四烷与G0的开环反应制备了阳离子类脂化合物G0-C14。如我们先前的研究(41)所述，通过对(H-Cys-OMe)2·2HCl和脂肪酸二氯化物的一步缩聚合成了疏水性二硫酰胺聚合物，并用水银VX-300光谱仪在400兆赫下对其进行了核磁共振氢谱表征(美国瓦里安公司)。
二、细胞系：
p53缺失的人肝细胞癌(HCC)细胞系Hep3B(Hep 3B2.1-7，ATCC#HB-8064)和p53缺失的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系H1299(ATCC#CRL-5803)购自美国ATCC细胞库，EMEM培养基用于培养Hep3B细胞，RPMI-1640培养基用于培养H1299细胞。1％青霉素/链霉素抗生素(Thermo-Fisher Scientific)和10％胎牛血清(FBS；
Figure BDA0002271620900000071
)加入细胞培养基。
实施例1：p53信使RNA纳米粒的制备：
一、体外合成化学修饰的p53mRNA：
利用体外转录技术(IVT)合成增强绿色荧光蛋白(EGFP)和p53信使RNA(mRNA)。在RNA的5'端设计有一个非翻译区(UTR)以增强mRNA的翻译起始。为了提高其稳定性和翻译效率，进一步应用反向帽类似物(ARCR)在mRNA的5'末端。为了避免mRNA引起的免疫刺激，用5-甲基-胞苷三磷酸(5’-Methyl-CTP)和假尿苷-5'-三磷酸(Pseudo-UTP)替代常规三磷酸胞苷和尿苷三磷酸。具体过程为：
携带T7启动子的人p53基因开放阅读框(ORF)质粒购自Addgene公司。用HindIII/ApaI核酸内切酶消化形成线性化DNA。然后，用聚合酶链式反应(PCR)扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并按照纯化试剂盒进行PCR产物纯化。对于体外转录(IVT)，将
Figure BDA0002271620900000072
转录试剂盒(Ambion)与1-2μg纯化的聚合酶链式反应产物(即模板)、6mM 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物(抗-反向帽类似物，ARCA)、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM 5-甲基-胞苷三磷酸(5’-Methyl-CTP)、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5'-三磷酸(Pseudo-UTP)(TriLink生物科技有限公司)一起使用。反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶(DNase)处理。随后，使用poly(A)试剂盒(Ambion)将3’poly(A)试剂盒添加到IVT RNA转录物中。p53的信使RNA经MEGAclear试剂盒(ambion)纯化，然后用热敏磷酸酶(美国新英格兰生物实验室)在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物。
二、G0-C14与信使RNA的静电络合反应：
为了评估阳离子化合物G0-C14与信使RNA的络合作用，使用E-
Figure BDA0002271620900000073
预制琼脂糖凝胶(Invitrogen)对裸p53信使RNA或p53信使RNA与G0-C14(G0-C14/信使RNA的重量比：0.1、1、5、10、15和20)进行电泳研究。为了评估有机溶剂(DMF)中信使RNA的稳定性，将裸信使RNA与有机溶剂一起培养30分钟，然后滴加入琼脂糖凝胶中，在紫外光下对凝胶进行成像，并对各组的条带进行分析。
三、p53信使RNA纳米粒即脂质聚合物复合信使RNA纳米粒的制备：
采用改进的自组装方法制备了p53信使RNA纳米粒(包裹信使RNA的脂类聚合物复合纳米粒)。通过阳离子类脂分子G0-C14、一种疏水性氧化还原响应的聚合物——半胱氨酸聚合物(二硫酰胺)(PDSA)和脂类聚合物(乙二醇)(lipid-PEG)化合物,来设计脂质-聚合物杂化纳米粒，以有效装载化学修饰的mRNA。首先利用阳离子脂G0-C14与mRNA进行络合，选择二硫酰胺在正常生理条件下形成稳定的纳米粒，将1,2-二肉豆蔻酰基-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](DMPE-PEG)和1,2-二硬脂酰-sn-丙三氧基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)](DSPE-PEG)包裹在纳米粒表面以通过去聚乙二醇化效应获得相对较长的体内循环时间和较高的肿瘤细胞摄取，负载p53mRNA纳米复合物进入细胞并感应肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽(GSH)进而在细胞质快速触发释放负载的mRNA。如图1所示(图1为本发明制备工艺和实验例实验机制概括示意图，其中图1A为制备工艺概括示意图，图1B为实验例实验机制概括示意图)，在重量比(G0-C14/mRNA w/w％)为10或更高的情况下，mRNA可以与G0-C14有效地络合，而二甲基甲酰胺(DMF)对mRNA的完整性没有影响。我们在G0-C14/mRNA重量比率为15的条件下制备了氧化还原响应的杂化纳米粒复合物，并且调整mRNA纳米粒的平均大小约为125nm，保证在生理条件下稳定。如透射电镜(TEM)，固体二硫酰胺聚合物核有助于在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中形成坚硬和稳定的纳米结构，同时通过快速分解释放mRNA纳米粒，对二硫苏糖醇(DTT，一种还原剂)做出有效反应，这种氧化还原响应的纳米载体有助于负载的mRNA充分释放并最大程度发挥治疗作用。
该方法具体包括以下步骤：
1、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；
2、将24μg的信使RNA(在24μl水中)和360μg的G0-C14(在144μl有机溶剂中)轻轻混合(在15的G0-C14/信使RNA重量比下)，以实现静电络合；
3、随后，将4mg二硫酰胺聚合物(在200μl有机溶剂中)和2.8mg混合脂质乙二醇(在140μl有机溶剂中)依次添加到混合物中，并进一步混合在一起。在磁力搅拌(800转/分)下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase(脱氧核糖核酸酶)/RNase(核糖核酸酶)的胎牛血清超纯水(分子生物学级)中30分钟。使用超滤装置(EMD Millipore，MWCO 100kDa)通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物。用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。
四：合成信使RNA纳米粒的表征：
实验材料与相应试剂：L-胱氨酸二甲酯二盐酸盐((H-cys-ome)2·2HCl)、三甲胺、阳离子型乙二胺聚酰胺-胺(PAMAM)第0代树枝状大分子(G0)和脂肪酸二氯化物来自Sigma-Aldrich公司。聚乙二醇分子量(MW)为2000的双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺-乙二醇和聚乙二醇分子量(MW)为5000的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇购自Avanti Polar Lipids公司。TriLink生物科技有限公司(TriLink Biotechnologies)购买增强绿色荧光蛋白信使RNAEGFPmRNA(用5-甲基胞苷和伪尿苷修饰)和从CleanCapTM公司购买cy5-Fluc信使RNA(对照cy5标记的信使RNA)。
实验步骤：1、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；2、将24μg的信使RNA(在24μl水中)和360μg的G0-C14(在144μl有机溶剂中)轻轻混合(在15的G0-C14/信使RNA重量比下)，以实现静电络合；3、随后，将4mg二硫酰胺聚合物(在200μl有机溶剂中)和2.8mg混合脂质乙二醇(在140μl有机溶剂中)依次添加到混合物中，并进一步混合在一起。在磁力搅拌(800转/分)下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase(脱氧核糖核酸酶)/RNase(核糖核酸酶)的胎牛血清超纯水(分子生物学级)中30分钟。使用超滤装置(EMD Millipore，MWCO 100kDa)通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物。用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。
实验结果：我们使用动态光散射(DLS，美国布鲁克海文仪器公司)测定了72小时内37℃下磷酸盐缓冲液(含10％血清)中的信使RNA纳米粒大小及其稳定性(如图2A,B,C所示，其中A：lipid-PEGs(DMPE-PEG and DSPE-PEG),polymer(PDSA)和(G0-C14)化学结构式；B:纳米粒子质谱分析；C.纳米粒子在PBS中不同时间的颗粒直径大小)。使用透射电镜(JEOL1200EX)80KV观察信使RNA纳米粒的形态(如图2D所示，其中D：纳米粒子在透射电镜下的形态)。为了检测信使RNA包封率(EE％)，根据上述方法制备了cy5信使RNA纳米粒。简言之，用100μL二甲基亚砜(DMSO)处理5μL纳米粒溶液，并用Synergy HT多功能微孔板阅读器检测cy5信使RNA的荧光强度。在这项研究中，纳米粒中负载的信使RNA的量被计算为约50％。如透射电镜(TEM)，固体二硫酰胺聚合物核有助于在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中形成坚硬和稳定的纳米结构，同时通过快速分解释放mRNA纳米粒，对二硫苏糖醇(DTT，一种还原剂)做出有效反应，这种氧化还原响应的纳米载体有助于负载的mRNA充分释放并最大程度发挥治疗作用。
五、绿色荧光EGFP信使RNA纳米粒在细胞质中递送效率的定量检测：
实验材料与相应试剂:Lipofectamine 2000(Lip2k)购自美国Invitrogen，(加利福尼亚州卡尔斯巴德市)。TriLink生物科技有限公司(TriLink Biotechnologies)购买增强绿色荧光蛋白信使RNA EGFPmRNA(用5-甲基-胞苷三磷酸和假尿苷-5'-三磷酸修饰)和从CleanCapTM公司购买cy5-Fluc信使RNA(对照cy5标记的信使RNA)。p53缺失的人肝细胞癌(HCC)细胞系Hep3B(Hep 3B2.1-7，ATCC#HB-8064)和p53缺失的人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系H1299(ATCC#CRL-5803)购自美国ATCC细胞库，EMEM培养基用于培养Hep3B细胞，RPMI-1640培养基用于培养H1299细胞。1％青霉素/链霉素抗生素(Thermo-Fisher Scientific)和10％胎牛血清(FBS；
Figure BDA0002271620900000101
)加入细胞培养基。
实验步骤：p53失活Hep3B细胞或H1299细胞以每孔5000细胞的密度均匀铺在96孔板中。在细胞贴壁24小时后，用不同浓度(0.102、0.207、0.415或0.830μg/ml)的增强绿色荧光蛋白信使RNA转染细胞24小时，然后添加0.1ml新鲜完全培养基并进一步培养24小时，以评估细胞活力和转染效率。与纳米载体相比，Lip2k被用作转染效率的阳性对照。细胞活力通过AlarmaBlue进行测试，一种无毒的细胞活力检测方法，可以通过酶标仪(TECAN，Infinite M200 Pro)检查实时细胞增殖情况。用96孔的Spectramax平板阅读器(分子装置，加利福尼亚州森尼维尔)在545nm和590nm下检测吸光度。为了测定细胞的转染效率，用纳米粒或Lip2k的增强绿色荧光蛋白信使RNA处理细胞24小时，用2.5％的乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶分离并收集在磷酸盐缓冲液溶液中，然后用流式细胞仪(德国海德堡BDBiosystems)评价绿色荧光蛋白(GFP)的表达。用Flowjo软件计算分析转染了增强绿色荧光蛋白阳性细胞的百分比。
实验结果：为了进一步验证体外转染的有效性，我们选择增强绿色荧光蛋白mRNA(EGFP-mRNA)作为模型mRNA。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)可以直接观察到EGFPmRNA纳米粒的高转染效率，纳米粒和商业化的转染试剂Lipofectamine 2000(Lip2k)转染的Hep3B细胞中检测到大量绿色荧光(见图3A-C，其中图3为增强绿色荧光蛋白信使RNA(EGFPmRNA)纳米粒的细胞活性和转染效率；A-C:共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察EGFPmRNA纳米粒的转染效率)。纳米粒可有效将cy5标记的mRNA递送到细胞质中，并呈时间依赖性，大多数mRNA纳米粒在进入细胞1小时后首先与溶酶体绿色(LysoTracker Green)共定位(见图3D，其中D：CLSM观察纳米粒将cy5标记的mRNA递送到细胞质中)。培养3小时后，部分cy5标记的mRNA进入细胞质，培养6小时后，大量的cy5标记的mRNA从溶酶体逃逸并扩散到细胞质中。相比之下，裸mRNA在培养6小时后不能进入细胞。在p53缺失的肝细胞肝癌(Hep3B)细胞中观察到复合纳米粒对mRNA的有效胞内递送(见图3E,3F；其中E-F：流式细胞仪在Hep3B细胞中检测到复合纳米粒对EGFPmRNA的胞内递送)。
以下通过具体实验例来详细说明本发明一种p53信使RNA纳米粒及其应用，实验例实验机制概括示意图如图1B所示。
实验例1：纳米载体递送p53mRNA在肝细胞肝癌(Hep3B)和非小细胞肺癌细胞(H1299)中恢复p53抑癌功能：
实验方法及步骤：
1.免疫荧光(IF)染色：Hep3B细胞在室温下用4％多聚甲醛(Electron MicroscopySciences)固定15分钟，然后在0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)-磷酸盐缓冲液中渗透10分钟。样品在室温下用磷酸盐封闭缓冲溶液(含2％牛血清蛋白、2％正常山羊血清和0.2％凝胶)进一步培养30分钟。随后，用4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)固定15分钟。在4℃条件下一抗孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤，然后于室温下在封闭缓冲液(1:1000稀释液)中与Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG(分子探针公司)中孵育60分钟。最后，用磷酸盐缓冲液清洗染色样品，用Hoechst 33342(分子探针公司-英杰公司，H1399，1:2000磷酸盐缓冲液稀释)对细胞核进行染色，并用抗猝灭试剂处理(LifeTechnologies)。透射电镜检测方法，处理后的细胞用2.5％戊二醛溶液(Sigma Aldrich，G5882)洗涤并固定过夜。样品用1.5％四氧化锇处理，在分级乙醇中脱水，并嵌入812树脂(Ted Pella，18109)。切片后用2％乙酸双氧铀固定，然后用Tecnai 10透射电镜(飞利浦，荷兰)成像观察。
2.蛋白质印迹法(WB)检测：在溶解缓冲液(1mM乙二胺四乙酸，20mM Tris HCl PH7.6，140mM氯化钠，1％抑肽酶，1％乙基苯基聚乙二醇，1mM甲基磺酰氟液和1mM钒酸钠)中裂解细胞或肿瘤组织，并添加蛋白酶抑制剂(Cell Signaling Technology)。蛋白质浓度由BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce)检测。将25μg蛋白质加载到6-12％的预制凝胶(Invitrogen)，然后转移到ImmobilonTM PVDF膜(Bio-Rad，162-0176和162-0177)。转膜完成后用5％牛血清白蛋白(BSA)在洗涤缓冲液(150mM氯化钠，50mM三氨基甲烷盐酸盐pH7.4，0.1％吐温20)中封闭1小时，并与一抗孵育4℃过夜。使用对应的的辣根过氧化物酶(HRP)进行二抗结合室温孵育2小时。用增强化学发光法(ECL)检测系统(Amersham/GE Healthcare)检测条带。
3.细胞集落形成试验：用软琼脂集落形成法测定细胞增殖能力。用p53信使RNA纳米粒或空纳米粒处理细胞48小时。然后，将细胞悬浮在0.36％的琼脂糖(Invitrogen)中，在完全培养基中稀释，然后以低密度(每孔约1000个细胞)重新接种到6孔板中，其中含有0.75％的琼脂糖预成型层，培养2周。然后用磷酸盐缓冲液洗涤平板，在4％多聚甲醛中固定20分钟，然后用0.005％结晶紫染色。扫描并分析图像。
4.细胞凋亡与细胞周期检测：使用FITC膜联蛋白v/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)检测细胞凋亡。简言之，将1×106个细胞接种到6孔板中。贴壁过夜后，用p53信使RNA纳米粒处理细胞24小时，然后与1ml新鲜培养基混合，继续培养24小时。收集所有贴壁细胞和培养基中的漂浮细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，并以1×106细胞/ml的浓度重悬于遇冷1×缓冲液中。将5μl的异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V和5μl的碘化丙啶碘化丙啶进一步与100μl的细胞悬浮液混合。然后在室温下培养混合物15分钟(避光)，并使用FACS Calibur流式细胞仪(德国海德堡BD Biosystems)进行分析。用空纳米粒、裸p53信使RNA或p53信使RNA纳米粒处理后培养48小时，并用70％乙醇将其固定过夜，然后在磷酸盐缓冲液中洗涤两次，并在37℃下用碘化丙啶孵育30分钟；用流式细胞仪测定细胞周期分布(细胞周期中按DNA含量分为G1、S和G2/M)，结果由Flowjo软件分析。
实验结果：为了研究纳米载体介导的p53mRNA可以有效恢复肿瘤抑制因子p53的功能，采用免疫荧光(IF)染色和蛋白质印迹法(WB)检测p53mRNA纳米粒处理后细胞中p53蛋白的表达(见图4A，其中图4为纳米载体递送p53mRNA在Hep3B中恢复p53抑癌功能。A.共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察p53蛋白表达)。免疫荧光结果显示，纳米粒介导的p53mRNA在两个细胞系的细胞质中成功表达p53蛋白。同样，蛋白质印迹法结果也表明，负载p53mRNA的纳米粒处理后，两个细胞中p53蛋白的表达显著增加(见图4B，其中B:免疫印迹检测p53蛋白表达量)。接下来，我们检测了p53mRNA纳米粒是否能恢复p53对肿瘤细胞的抑制作用。使用p53mRNA纳米粒处理后，与空纳米粒处理组相比，p53mRNA纳米粒处理的细胞集落形成也被显著抑制(见图4C，其中C:细胞集落形成试验观察p53mRNA纳米粒对Hep3B增殖的抑制)，进一步证明p53基因回补介导了显著的抗肿瘤功能,同时，采用膜联蛋白V(AnnV)和碘化丙啶(PI)共染色法检测细胞凋亡，并进行流式细胞术分析，图4D(其中D:流式细胞术检测p53mRNA纳米粒诱导细胞凋亡)所示，在Hep3B和H1299细胞中，p53mRNA纳米粒在0.415和0.830μg/ml的浓度下作用下细胞凋亡显著增加，而空纳米粒和裸mRNA并不诱导凋亡。
此外，p53mRNA纳米粒处理Hep3B和H1299细胞后，观察到明显的细胞周期分布变化。图4E(其中E:流式细胞术检测p53mRNA纳米粒引起的G1周期阻滞)显示p53mRNA纳米粒处理的Hep3B细胞与对照组、空纳米粒组或裸mRNA组相比，G1期的细胞比列明显增高，S和G2期细胞比列下降。
实验例2：p53回补加强p53缺失的肝细胞肝癌和非小细胞肺癌细胞对mTOR抑制剂依维莫司的敏感性：
实验方法及步骤：
1.细胞存活实验：将p53失活Hep3B或H1299细胞以5000细胞/孔的密度均匀铺在96孔板中。细胞贴壁24小时后加不同药物浓度的依维莫司。培养24小时后，再加入0.1ml新鲜完全培养基继续培养24小时，用Alarma Blue检测细胞活性。
2.蛋白免疫印迹：在溶解缓冲液(1mM乙二胺四乙酸，20mM Tris HCl PH 7.6，140mM氯化钠，1％抑肽酶，1％乙基苯基聚乙二醇，1mM甲基磺酰氟液和1mM钒酸钠)中裂解细胞或肿瘤组织，并添加蛋白酶抑制剂(Cell Signaling Technology)。蛋白质浓度由BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce)检测。将25μg蛋白质加载到6-12％的预制凝胶(Invitrogen)，然后转移到ImmobilonTM PVDF膜(Bio-Rad，162-0176和162-0177)。转膜完成后用5％牛血清白蛋白(BSA)在洗涤缓冲液(150mM氯化钠，50mM三氨基甲烷盐酸盐pH7.4，0.1％吐温20)中封闭1小时，并与一抗孵育4℃过夜。使用对应的的辣根过氧化物酶(HRP)进行二抗结合室温孵育2小时。用增强化学发光法(ECL)检测系统(Amersham/GE Healthcare)检测条带。
3.透射电镜：细胞或肿瘤组织在室温下用4％多聚甲醛(Electron MicroscopySciences)固定15分钟，然后在0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)-磷酸盐缓冲液中渗透10分钟。样品在室温下用磷酸盐封闭缓冲溶液(含2％牛血清蛋白、2％正常山羊血清和0.2％凝胶)进一步培养30分钟。随后，用4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)固定15分钟。在4℃条件下一抗孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤，然后于室温下在封闭缓冲液(1:1000稀释液)中与Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG(分子探针公司)中孵育60分钟。最后，用磷酸盐缓冲液清洗染色样品，用Hoechst 33342(分子探针公司-英杰公司，H1399，1:2000磷酸盐缓冲液稀释)对细胞核进行染色，并用抗猝灭试剂处理(LifeTechnologies)。透射电镜检测方法，处理后的细胞用2.5％戊二醛溶液(Sigma Aldrich，G5882)洗涤并固定过夜。样品用1.5％四氧化锇处理，在分级乙醇中脱水，并嵌入812树脂(Ted Pella，18109)。切片后用2％乙酸双氧铀固定，然后用Tecnai 10透射电镜(飞利浦，荷兰)成像观察。
4.共聚焦荧光显微镜：使用表达重组体GFP-LC3(LentiBrite GFP-LC3BLentiviral Biosensor；Millipore,17-10193)的预包装病毒颗粒来转染形成稳定表达GFP-LC3的细胞系。然后，用依维莫司或p53信使RNA纳米粒处理GFP-LC3稳转细胞，37℃培养24小时。用共聚焦荧光显微镜观察GFP-LC3的荧光强度。为了量化自噬水平，计算了表达GFP-LC3的细胞中自噬小点的形成。细胞表现出明显的点状GFP-LC3聚集，但没有核内GFP-LC3被定义为自噬，而那些在细胞质和细胞核中都呈现GFP-LC3阳性点状(绿色)扩散分布的细胞被认为是非自噬形成细胞。
实验结果：为了研究p53蛋白回补后对依维莫司敏感性的影响，首先测定了依维莫司对p53缺失的Hep3B和H1299细胞的细胞毒性，并探讨了其对mTOR通路的影响。Hep3B和H1299对依维莫司作用不敏感，超过50％的细胞在64nM(摩尔浓度)下仍然存活(图5A，其中图5为依维莫司通过诱导保护性自噬引发Hep3的耐药性。A:细胞存活实验检测不同药物浓度对细胞的杀伤性)。更重要的是，当mTOR促增殖途径靶点(如p-mTOR和p-p70S6K)被依维莫司下调时，细胞活力并没有显著降低(图5B，其中B:蛋白免疫印迹实验检测p-mTOR和p-p70S6K表达)。然后我们研究了依维莫司对自噬途径的影响，通过蛋白质印迹法发现LC3B-2的蛋白水平明显增加(图5C，其中C：蛋白免疫印迹实验检测自噬水平)，通过透射电镜发现自噬小体的数目显著增加(图5D，其中D:透射电镜观察依维莫司引起自噬小体的增加)，并通过共聚焦激光扫描显微镜观察了GFP-LC3的荧光增强(图5E，其中E:共聚焦激光扫描显微镜观察GFP-LC3荧光表达)，这表明依维莫司诱导了Hep3B细胞保护性自噬的激活。
实验例3：p53mRNA纳米粒通过抑制保护性自噬增强依维莫司的抗肿瘤效果：
实验方法及步骤：
1.细胞存活实验：将p53失活Hep3B或H1299细胞以5000细胞/孔的密度均匀铺在96孔板中。细胞贴壁24小时后，增强绿色荧光蛋白信使RNA纳米粒(对照组)、p53信使RNA纳米粒、依维莫司或p53信使RNA纳米粒联合依维莫司处理组。所用的信使RNA浓度为0.415μg/ml，依维莫司的浓度在Hep3B细胞中为32nM(H1299细胞中为16nM)。培养24小时后，再加入0.1ml新鲜完全培养基继续培养24小时，用上述Alarma Blue细胞活性验证p53信使RNA纳米粒的体外疗效及其对依维莫司的增敏效果。
2.细胞凋亡检测：使用FITC膜联蛋白v/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒(BDBiosciences)检测细胞凋亡。简言之，将1×106个细胞接种到6孔板中。贴壁过夜后，用p53信使RNA纳米粒处理细胞24小时，然后与1ml新鲜培养基混合，继续培养24小时。收集所有贴壁细胞和培养基中的漂浮细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤两次，并以1×106细胞/ml的浓度重悬于遇冷1×缓冲液中。将5μl的异硫氰酸荧光素(FITC)膜联蛋白V和5μl的碘化丙啶碘化丙啶进一步与100μl的细胞悬浮液混合。然后在室温下培养混合物15分钟(避光)，并使用FACSCalibur流式细胞仪(德国海德堡BD Biosystems)进行检测，结果由Flowjo软件分析。
3.细胞集落形成试验：用软琼脂集落形成法测定细胞增殖能力。将细胞悬浮在0.36％的琼脂糖(Invitrogen)中，在完全培养基中稀释，然后以低密度(每孔约1000个细胞)重新接种到6孔板中，其中含有0.75％的琼脂糖预成型层，培养2周。然后用磷酸盐缓冲液洗涤平板，在4％多聚甲醛中固定20分钟，然后用0.005％结晶紫染色。扫描并分析图像。
4.透射电镜：细胞或肿瘤组织在室温下用4％多聚甲醛(Electron MicroscopySciences)固定15分钟，然后在0.2％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)-磷酸盐缓冲液中渗透10分钟。样品在室温下用磷酸盐封闭缓冲溶液(含2％牛血清蛋白、2％正常山羊血清和0.2％凝胶)进一步培养30分钟。随后，用4％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)固定15分钟。在4℃条件下一抗孵育过夜，用磷酸盐缓冲液洗涤，然后于室温下在封闭缓冲液(1:1000稀释液)中与Alexa Fluor 647标记山羊抗小鼠IgG(分子探针公司)中孵育60分钟。最后，用磷酸盐缓冲液清洗染色样品，用Hoechst 33342(分子探针公司-英杰公司，H1399，1:2000磷酸盐缓冲液稀释)对细胞核进行染色，并用抗猝灭试剂处理(LifeTechnologies)。透射电镜检测方法，处理后的细胞用2.5％戊二醛溶液(Sigma Aldrich，G5882)洗涤并固定过夜。样品用1.5％四氧化锇处理，在分级乙醇中脱水，并嵌入812树脂(Ted Pella，18109)。切片后用2％乙酸双氧铀固定，然后用Tecnai 10透射电镜(飞利浦，荷兰)成像观察。
实验结果：根据AlarmaBlue细胞存活分析，依维莫司治疗效果欠佳(Hep3B细胞中约70％的存活率、H1299细胞中超过80％的存活率)，而p53mRNA纳米粒联合依维莫司处理的两个细胞系均表现出显著的体外抗肿瘤作用(Hep3B细胞中约19％的存活率、H1299细胞中约14％的存活率)，并计算联合治疗指数(CI)以评估两者是否有协同效应，“p53mRNA纳米粒+依维莫司”处理Hep3B细胞的CI值为1.71，H1299细胞CI值为1.74，表明两个细胞系都存在协同治疗效应(CI>1)(图6A，图6为p53信使RNA纳米粒增强依维莫司抗肿瘤效果及其机制；A:细胞存活实验)。细胞凋亡的流式细胞术分析显示，依维莫司诱导较少的细胞凋亡，而与p53mRNA纳米粒共同处理细胞可显著增加细胞凋亡(图6B，其中B:流式细胞术检测细胞凋亡)，同时集落形成实验也显示出一致的结果(图6C，其中C:细胞集落形成试验观察p53mRNA纳米粒联合依维莫司对Hep3B的增殖抑制)。通过透射电镜清楚地观察到“p53mRNA纳米粒+依维莫司”组的自噬小体数量(绿色箭头)比依维莫司单独组显著减少(图6D，其中D:透射电镜观察p53信使RNA纳米粒引起线粒体凋亡同时抑制自噬小体的形成)。结果表明，复合纳米粒负载的p53mRNA介导的p53功能恢复不仅可以激活凋亡通路还可以加强p53缺失的肝细胞肝癌和非小细胞肺癌细胞对依维莫司的敏感性。
实验例4：药代动力学(PK)和生物分布(BD)研究：
实验方法与步骤：药代动力学(PK)和生物分布(BD)研究，我们用三种不同的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇/双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺-乙二醇比率(即，脂质乙二醇层中二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇的NP25:25％；脂质乙二醇层中二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇的NP50:50％；脂质乙二醇层中二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇的NP75:75％；脂质乙二醇层中二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇的NP75:75％；w/w％)制备了用于本研究的信使RNA纳米粒。在体内药代动力学研究中，健康的BALB/c小鼠(6周大，每组n＝3)通过尾静脉注射裸Cy5-mRNA，Cy5-mRNA NP25，Cy5-mRNA NP50或Cy5-mRNA NP75。在不同的预定时间间隔(0、0.5、1、2、4、8、12和24小时)，通过眶后静脉血取血。轻轻按压伤口一分钟以止血。用酶标仪测定Cy5-mRNA的荧光强度。去除背景后，用初始时间点(0小时)归一化后，通过测量这些时间点血液中cy5 mRNA的百分比来评估药代动力学。在生物分布研究中，对Hep3B皮下成瘤裸鼠通过尾静脉(n＝3/组)注入裸Cy5-mRNA，Cy5-mRNA NP25，Cy5-mRNA NP50或Cy5-mRNANP75(以750μg/kg动物体重的mRNA剂量)。24小时后，处死所有小鼠，使用英国Syngene公司多成像系统PXi(synoptics ltd)观察器官和肿瘤的分布情况。
实验结果：通过血清白蛋白介导的去聚乙二醇化对混合脂质聚合物纳米粒的细胞摄取、药代动力学(PK)和肿瘤积聚中起着关键作用，我们制备了三种不同的聚乙二醇：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇(DSPE-PEG)/双肉豆蔻磷脂酰乙醇胺-乙二醇(DMPE-PEG)比率(NP25:25％的DSPE-PEG在脂质乙二醇层；NP50:50％的DMPE-PEG在脂质乙二醇层；NP75:75％的DSPE-PEG在脂质乙二醇层；w/w％)。通过向免疫健全的BALB/c小鼠静脉注射(IV)来评价三种Cy5标记的mRNA纳米粒的药代动力学。裸Cy5-mRNA作为对照。图7A(图7为药代动力学(PK)和生物分布(BD)研究结果，A:体内mRNA血液循环时间测定(裸Cy5-labeled mRNA，Cy5-labeled mRNA NPs.NP25,NP50,and NP75代表复合lip-PEG外层DSPE-PEG/DMPE-PEG的比例(25:75,50:50,and 75:25)。)显示裸mRNA在几分钟内被快速清除，而混合型纳米粒包裹的mRNA有效延长了循环半衰期(T1/2)(NP25:T1/2<30分钟；NP50:T1/2≈30分钟；NP75:T1/2≈1小时)。给药2小时后，约40％的NP75仍在血液中循环。然后我们检测了这些纳米粒的生物分布(BioD)和肿瘤积累。通过静脉注射Hep3B异种移植的无胸腺裸鼠Cy5-mRNA、Cy5-mRNA NP25、Cy5-mRNA NP50或Cy5-mRNA NP75。如图7B(B:Hep3B移植瘤老鼠尾静脉注射裸Cy5-mRNA,Cy5-mRNA NP25,Cy5-mRNA NP50,or Cy5-mRNA NP75纳米粒后，不同时间点近红外荧光成像监测纳米粒在肿瘤部位的聚集)所示，注射24小时后肿瘤中几乎不能检测到裸Cy5-mRNA的荧光信号。值得注意的是，NP75在所有这些组中表现出最高的肿瘤积累，这可能是由于它的长循环，并用于以下所有体内研究。
实验例5：p53mRNA纳米粒的体内治疗效果及其在体内对依维莫司的增敏能力：
实验方法与步骤：
1.建立异种移植瘤小鼠模型，将100μL磷酸盐缓冲液中约1×107Hep3B肝癌细胞与100μL基质胶(BD Biosciences)混合，皮下(s.c.)植入雌性裸鼠右侧下肢。每隔一天对小鼠进行肿瘤生长监测。当肿瘤体积达到约70-100mm3时，将小鼠随机分为5组(n＝5)，分别进行磷酸盐缓冲液、增强绿色荧光蛋白信使RNA纳米粒、依维莫司、p53信使RNA纳米粒或“p53信使RNA纳米粒+依维莫司”治疗。用于体内治疗研究的信使RNA纳米粒在脂质聚乙二醇层中有75％(w/w％)的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-乙二醇。经尾静脉以750μg/kg的信使RNA剂量分别注射增强绿色荧光蛋白信使RNA纳米粒或p53信使RNA纳米粒，而依维莫司在六次治疗中每隔三天以5mg/kg剂量口服。第一次治疗的日期定为第0天，从第0天到第33天，每隔三天用卡尺测量肿瘤大小，平均肿瘤体积(mm3)计算为：4π/3×肿瘤长度/2×肿瘤宽度/2。根据报告的方法验证并计算相对肿瘤体积(％)。在此期间记录所有小鼠的体重变化。
2.为了验证p53信使RNA纳米粒对依维莫司增敏的体内机制，采用p53信使RNA纳米粒经尾静脉注射，每三天以750μg/kg的信使RNA剂量对异种肝移植小鼠进行3次治疗。最后一次进行p53信使RNA纳米粒治疗后12、24、48、60小时处死小鼠，并收集肿瘤组织进行切片。静脉注射磷酸盐缓冲液的小鼠作为对照，并在最后一次治疗后处死小鼠。通过免疫荧光检测p53蛋白、活化的caspase3蛋白的表达。
实验结果：对Hep3B异种移植的无胸腺裸鼠进行了体内抗肿瘤研究,每三天通过尾静脉系统注射一次p53mRNA纳米粒，共注射6次。同时，依维莫司作为口服药物，在每次静脉注射纳米粒后立即口服(图8B p53mRNA纳米粒的体内治疗效果及其在体内对依维莫司增敏的治疗模式图)。磷酸盐缓冲液mRNA纳米粒和无功能的EGFPmRNA纳米粒作对照。对照组处理的Hep3B荷瘤小鼠显示出类似的快速肿瘤生长，而仅口服依维莫司的小鼠表现出中等的抗肿瘤活性(图8A Hep3B异种移植瘤小鼠治疗后瘤体解剖结果)。结果显示p53mRNA纳米粒对Hep3B肿瘤的生长具有很强的抑制作用。值得注意的是，与单用依维莫司(平均肿瘤体积为2831.0mm3)或p53mRNA纳米粒(平均肿瘤体积为1151.8mm3)相比，p53mRNA纳米粒联合使用依维莫司治疗可显著提高疗效(平均肿瘤体积为201.1mm3)，CI值为5.08，表明依维莫司与p53mRNA纳米粒的具有显著协同作用(图8C不同处理后瘤体生长曲线图；图8D不同时间治疗后活体组织免疫荧光检测p53蛋白、活化的caspase3蛋白的表达)。这一协同抗肿瘤作用表明，在对p53缺陷癌症的治疗中，p53mRNA纳米粒联合mTOR抑制剂具有显著的抗肿瘤治疗效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种p53信使RNA纳米粒，所述p53信使RNA纳米粒是通过下述方法制备：
(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；
对于体外转录，将
Figure FDA0002271620890000012
T7转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM 5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVT RNA转录物中；得到p53信使RNA；
p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；
(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；
在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；
随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并进一步混合在一起，形成最终混合物；
在800转/分的磁力搅拌下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase/RNase的胎牛血清超纯水中30分钟，其中超纯水为分子生物学级；
使用EMD Millipore的MWCO 100kDa超滤装置通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物；用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。
2.上述p53信使RNA纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
(1)、用HindIII/ApaI核酸内切酶消化携带T7启动子的人p53基因开放阅读框质粒形成线性化DNA，然后，PCR扩增含有T7启动子的p53开放阅读框，并对PCR产物进行纯化；
对于体外转录，将
Figure FDA0002271620890000011
T7转录试剂盒与1-2μg作为模板的纯化的聚合酶链式反应产物、6mM 3′-O-Me-m7G(5′)ppp(5′)G帽结构类似物、1.5mM三磷酸鸟苷、7.5mM 5-甲基-胞苷三磷酸、7.5mM三磷酸腺苷和7.5mM假尿苷-5’-三磷酸一起使用，反应在37℃下进行4小时，随后进行脱氧核糖核酸酶处理；随后，使用poly(A)试剂盒将3’poly(A)试剂盒添加到IVT RNA转录物中；
p53信使RNA经MEGAclear试剂盒纯化后用热敏磷酸酶在37℃下处理30分钟，随后进一步纯化得到所需mRNA产物；
(2)、将G0-C14、二硫酰胺和脂质乙二醇分别溶解于有机溶剂中，分别形成浓度为2.5mg/ml、20mg/ml和20mg/ml的均匀溶液；
在G0-C14/p53信使RNA重量比为15的条件下，将p53信使RNA和G0-C14轻轻混合，以实现静电络合；
随后，将200μl有机溶剂中的4mg二硫酰胺聚合物和140μl有机溶剂中的2.8mg混合脂质乙二醇依次添加到p53信使RNA和G0-C14的混合物中，并进一步混合在一起，形成最终混合物；
在800转/分的磁力搅拌下将最终混合物逐滴添加到10毫升不含DNase/RNase的胎牛血清超纯水中30分钟，其中超纯水为分子生物学级；
使用EMD Millipore的MWCO 100kDa超滤装置通过离心去除形成的纳米粒分散液中的有机溶剂和游离化合物；用高压水洗涤3次后，将p53信使RNA纳米粒收集并分散于pH7.4-PBS缓冲液中以供进一步使用或储存于-80℃冰箱。
3.权利要求1所述的p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用是指在制备恢复p53抑癌功能药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述恢复p53抑癌功能是指在肝细胞肝癌Hep3B和非小细胞肺癌细胞H1299中恢复p53抑癌功能。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述p53信使RNA纳米粒在制备治疗肿瘤药物中的应用是指在制备加强p53缺失的肝细胞肝癌和非小细胞肺癌细胞对mTOR抑制剂依维莫司的敏感性药物中的应用。
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