CN110964637A - 一种体外动态细胞培养装置及其培养方法 - Google Patents

一种体外动态细胞培养装置及其培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种体外动态细胞培养装置及其培养方法，该装置中的A连接件(6)和B连接件(7)用于支撑培养皿(1)；第二夹具组件(3)安装在驱动组件(4)上，驱动组件(4)安装在基座(5)的上面板，驱动组件(4)用于提供第二夹具组件(3)的往复运行；第一夹具组件(2)与第二夹具组件(3)对称安装在培养皿1的两侧。通过控制系统(100)输出的驱动电机触发信号F1给驱动组件(4)，实现组合体的拉伸。该装置可置于细胞培养箱内进行动态培养，在不改动细胞培养装置的条件下进行简单的细胞培养优化功能，降低成本。本发明模拟体内细胞处于力学微环境，建立力学刺激下细胞培养方法，对细胞、组织工程支架及组织培养方法的发展起到积极的作用。

Description

一种体外动态细胞培养装置及其培养方法
技术领域
本发明涉及一种模拟体内细胞微环境的培养装置，更特别地说，是指一种研究细胞在一定力学刺激下的生长及分化的体外动态细胞培养装置及其培养方法。
背景技术
近年来，随着细胞培养技术、移植技术及生物材料技术的发展推动临床医学步入了“再生医学”的新阶段—组织工程。组织工程是将体外培养的相关组织细胞接种在一种具有优良相容性及降解性的生物材料上形成细胞－材料复合支架，然后将该细胞－材料复合支架植入到损伤组织部位，当附载细胞的生物材料随着时间被机体降解吸收的同时，细胞在不断的增殖、迁移和分化进而形成新的组织，达到组织修复和功能重建的目的。构建功能性组织工程支架的主要影响因素包括种子细胞、支架材料及外界刺激等。而细胞的体外功能化培养是组织工程研究的关键，也是将支架应用于临床的技术基础。同时在体外给细胞提供和体内条件相近似的的生存条件对于组织工程支架的培养和功能化至关重要，其中力学、电学等物理因素起着不可忽视的作用。
细胞培养技术是一种用于细胞生物学和分子生物学等研究的重要方法。研究细胞的功能、代谢以及细胞对环境诸因素影响的反应等需要一个既能使细胞脱离复杂环境的直接影响，又能维持正常生命活动的条件。这一条件的建立离不开培养基和细胞培养箱。细胞培养的营养环境可由培养基提供，而细胞培养的环境参数则可由细胞培养箱提供。常规的细胞培养箱能精确地提供细胞培养需要的温度、湿度、气体环境，性能稳定、响应迅速、可靠性高，且能有效防范对培养细胞的污染。但是均不能提供模拟体内力学的微环境。
力学的微环境对器官组织的发育再生及细胞的增殖、迁移分化和凋亡等各个层次的生命活动都有重要的影响。例如：肌腱是连接骨和肌肉的重要组织，在肌腱的体内环境中会不断的收到力学载荷的作用，肌腱的生长、发育和再生都与力学刺激密切相关。有关力学刺激的生物效应和作用已经在多种细胞和组织中得到研究，有关研究表明不同程度的肌腱刺激可诱导肌腱干细胞向不同方向分化，低强度的力学刺激可以促进干细胞的增殖且促进细胞向肌腱方向分化，高强度的力学刺激可以导致干细胞向脂肪、骨及软骨的方向分化。
综上所述，加载一定程度的力学刺激对细胞生长、迁移及分化有影响。目前，虽然有研究者开始考虑将力学刺激应用在细胞和组织的培养中，但还没有发现可以提供力学刺激的同时还方便将其置于培养箱内的一种可调节便携式动态培养装置。
发明内容
为了解决现有细胞培养箱不能满足在模拟体内力学微环境对细胞或组织进行动态培养的技术问题，本发明提出了一种在可控的力学刺激下的生长及分化的体外动态细胞培养装置及其培养方法。本发明通过控制拉伸速率及伸长率来模拟体内细胞微环境的拉伸应力，实现了细胞在周期性力学刺激下的生长及分化，构建具有功能化的组织工程支架。
本发明的一种体外动态细胞培养装置，其包括有培养皿(1)、第一夹具组件(2)、第二夹具组件(3)、驱动组件(4)、基座(5)、A连接件(6)和B连接件(7)；
培养皿(1)的容池(1B)内盛装细胞培养液；培养皿(1)的底部放置在相对设置的A连接件(6)和B连接件(7)上，且位于基座(5)的圆孔(5C)处；
第一夹具组件(2)包括有第一夹具本体(2A)、A内套件(2B)、A外套件(2C)；其中，A内套件(2B)与A外套件(2C)套接一起后形成右端活动件；
第一夹具本体(2A)的固定端上设有AA支臂(2A1)，AA支臂(2A1)上设有用于A螺钉(10A)穿过的AA通孔(2A12)，穿过AA通孔(2A12)的A螺钉(10A)与A螺母(11C)配合安装在基座(5)的EA限位槽(5A)处，实现将第一夹具本体(2A)的固定端安装在基座(5)的上面板(5D)上；第一夹具本体(2A)的纤维束安装端是AB支臂(2A2)，AB支臂(2A2)上设有A限位凸台(2A21)，A限位凸台(2A21)穿过A内套件(2B)上的AB通孔(2B1)后，且A内套件(2B)的A下压板(2B2)与AB支臂(2A2)接触；
A内套件(2B)上设有AB通孔(2B1)和A下压板(2B2)；AB通孔(2B1)用于AB支臂(2A2)上的A限位凸台(2A21)穿过；A下压板(2B2)的两端卡在A外套件(2C)的A卡槽(2C4)中；
A外套件(2C)上设有AC通孔(2C1)、平行排布的AD通孔(2C3)、A上压板(2C2)和A卡槽(2C4)；AC通孔(2C1)用于A内套件(2B)穿过；A卡槽(2C4)用于安装A内套件(2B)的A下压板(2B2)的两端；平行排布的AD通孔(2C3)设置在A外套件(2C)的一侧面板上，平行排布的AD通孔(2C3)用于螺旋纤维束的一端穿过，穿过平行排布的AD通孔(2C3)的螺旋纤维束的一端通过A内套件(2B)的A下压板(2B2)侧壁接触，实现螺旋纤维束一端的压紧；
第二夹具组件(3)包括有第二夹具本体(3A)、B内套件(3B)、B外套件(3C)；其中，B内套件(3B)与B外套件(3C)套接一起后形成左端活动件；
第二夹具本体(3A)的固定端上设有BA支臂(3A1)，BA支臂(3A1)上设有用于E螺钉(10E)穿过的BA通孔(3A12)，穿过BA通孔(3A12)的E螺钉(10E)与滑块(4C)的滑块上面板(4C1)上的螺纹孔配合，实现将第二夹具本体(3A)的固定端安装在滑块(4C)上；第二夹具本体(3A)的纤维束安装端是BB支臂(3A2)，BB支臂(3A2)上设有B限位凸台(3A21)，B限位凸台(3A21)穿过B内套件(3B)上的BB通孔(3B1)后，且B内套件(3B)的B下压板(3B2)与BB支臂(3A2)接触；
B内套件(3B)上设有BB通孔(3B1)和B下压板(3B2)；BB通孔(3B1)用于BB支臂(3A2)上的B限位凸台(3A21)穿过；B下压板(3B2)的两端卡在B外套件(3C)的B卡槽(3C4)中；
B外套件(3C)上设有BC通孔(3C1)、平行排布的BD通孔(3C3)、B上压板(3C2)和B卡槽(3C4)；BC通孔(3C1)用于B内套件(3B)穿过；B卡槽(3C4)用于安装B内套件(3B)的B下压板(3B2)的两端；平行排布的BD通孔(3C3)设置在B外套件(3C)的一侧面板上，平行排布的BD通孔(3C3)用于螺旋纤维束的一端穿过，穿过平行排布的BD通孔(3C3)的螺旋纤维束的另一端通过B内套件(3B)的B下压板(3B2)侧壁接触，实现螺旋纤维束另一端的压紧；
驱动组件(4)包括有步进电机(4A)、滑轨支架(4B)、滑块(4C)、丝杠(4D)、滑轨(4E)；驱动组件(4)所需能源由可充电的小型电池供给。驱动组件(4)用于提供拉伸速率为2～30mm/min，拉伸伸长率为20～600％。
步进电机(4A)的输出轴上连接有联轴器，联轴器的另一端连接有丝杠(4D)的一端，丝杠(4D)的另一端安装在DA滚珠轴承(4D1)的内圈中；
滑轨支架(4B)的一端是DA立板(4B1)，DA立板(4B1)上设有DA通孔(4B2)；滑轨支架(4B)的另一端是DB立板(4B3)，DB立板(4B3)上设有DB通孔(4B4)；滑轨支架(4B)的底面板(4B5)上安装有滑轨(4E)，且底面板(4B5)通过B螺钉(10B)与B螺母(11B)的配合实现将滑轨支架(4B)固定在基座(5)的上面板(5D)上；DA通孔(4B2)用于丝杠(4D)的另一端穿过；DB通孔(4B4)内安装有DA滚珠轴承(4D1)，且DA滚珠轴承(4D1)的内圈套接在丝杠(4D)的另一端上；
滑块(4C)的上端是滑块上面板(4C1)，滑块(4C)的下端是滑轨槽(4C3)，滑块(4C)的中部设有丝杠通孔(4C2)；滑块上面板(4C1)上固定有第二夹具本体(3A)的BA支臂(3A1)；滑轨槽(4C3)卡合在滑轨(4E)上；丝杠通孔(4C2)用于丝杠(4D)的另一端穿过；
滑轨(4E)上设有用于滑块(4C)的滑轨槽(4C3)移动的导轨槽(4E1)；滑轨(4E)安装在滑轨支架(4B)的底面板(4B5)上；
在步进电机(4A)输出的驱动力下使第二夹具组件(3)做往复运动，由于螺旋纤维束的两端分别固定在第一夹具组件(2)与第二夹具组件(3)之间，从而使得螺旋纤维束产生拉伸牵引，可对刺激的频率和拉伸的长度进行调节；
基座(5)的圆孔(5C)处用于放置培养皿(1)，培养皿(1)的两侧设置第一夹具组件(2)与第二夹具组件(3)；基座(5)的圆孔(5C)处的下面板(5E)上通过螺钉与螺母的配合固定有A连接件(6)和B连接件(7)；
基座(5)的上面板(5D)的EA限位槽(5A)处通过A螺钉(10A)与A螺母(11A)的配合实现将第一夹具组件(2)的AA支臂(2A1)安装在基座(5)的一端，进而使得第一夹具组件(2)也位于培养皿(1)的一侧；
基座(5)的上面板(5D)的EB限位槽(5B)处通过B螺钉(10B)与B螺母(11B)的配合实现将滑轨支架(4B)的底面板(4B5)安装在基座(5)的另一端，由于第二夹具本体(3A)的BA支臂(3A1)固定在滑块(4C)的上面板(4C1)上，进而使得第二夹具本体(3A)也位于培养皿(1)的另一侧；
A连接件(6)的一端通过C螺钉(10C)与C螺母(11C)的配合安装在基座(5)的下面板(5E)上；
B连接件(7)的一端通过D螺钉(10D)与D螺母(11D)的配合安装在基座(5)的下面板(5E)上；
基座(5)的下面板(5E)上的A连接件(6)和B连接件(7)是相对放置的；A连接件(6)的另一端上和B连接件(7)的另一端上放置有培养皿(1)；
在本发明中，应用权利要求1所述的体外动态细胞培养装置进行的体外动态细胞培养方法，其特征在于包括有下列步骤：
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束；
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板中，接种体积为20～40μL，密度为1×106cell/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液；放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件(2C)的AD通孔(2C3)中，将A内套件(2B)从下至上穿过A外套件(2C)的AC通孔(2C1)，且A内套件(2B)的A下压板(2B2)卡合在A外套件(2C)的A卡槽(2C4)中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体(2A)的A限位凸台(2A21)上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件(3C)的BD通孔(3C3)中，将B内套件(3B)从下至上穿过B外套件(3C)的BC通孔(3C1)，且B内套件(3B)的B下压板(3B2)卡合在B外套件(3C)的B卡槽(3C4)中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体(3A)的B限位凸台(3A21)上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体；
步骤四，组装培养皿；
将培养皿(1)置于基座(5)的圆孔(5C)处，并用A连接件(6)和B连接件(7)支撑；向培养皿(1)中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润；
步骤五，动态环境下的细胞培养；
设置动态培养参数：拉伸速率5～30mm/min，拉伸伸长率为20～600％，拉伸时间24～72小时，连续拉伸2～24小时；
将组合体培养结束后，观察、记录组合体上的细胞存活状态；使用活死染色试剂盒对支架上的细胞进行活死细胞染色计数，以确定动态力学刺激下细胞的存活率及增殖状态。
本发明设计的体外动态细胞培养装置与现有技术相比本发明的优点在于：
①本发明模拟体内力学微环境，为体外培养的细胞具有力学刺激的生长环境，改善静态细胞生长条件，从而促进细胞、组织的生长、提高细胞活性和组织工程支架的功能化。
②本发明的可控便携式小型化动态培养装置，能够调控拉伸过程的拉伸速率和拉伸距离，且便于将装置放入培养箱中培养。
③采用本发明动态培养装置在设定的动态培养参数下进行的动态细胞培养，能够使细胞在螺旋纤维束上粘附生长(存活率比静态培养提高了10～15％)，细胞质基质疏松多孔，是动态培养下促进细胞质基质分泌，细胞生长状态良好。
④本发明动态培养装置不光可用于细胞、组织的培养，也可以用于细胞、组织动态生长、形貌及分化研究，对细胞－材料复合物体外构建及功能化有广泛应用前景。
⑤本发明动态培养装置结构紧凑合理，操作简单，夹持方法多样化，适用于多种维度纤维材料携带细胞进行培养。
附图说明
图1是本发明体外动态细胞培养装置的结构图。
图1A是本发明体外动态细胞培养装置另一视角的结构图。
图1B是本发明体外动态细胞培养装置中夹具与培养皿的结构图。
图1C是本发明体外动态细胞培养装置的底部结构图。
图2是本发明中第一夹具的结构图。
图2A是本发明中第一夹具的分解图。
图3是本发明中第二夹具的结构图。
图3A是本发明中第二夹具的分解图。
图4是本发明中驱动组件的结构图。
图4A是本发明中驱动组件的分解图。
图5是本发明的可调节便携式动态体外细胞培养系统结构框图。
图6是本发明中显示系统的数字化显示的示意图。
图7是本发明实施例1细胞培养1天在螺旋纤维束上生长的SEM图。
图8是本发明实施例1细胞培养3天在螺旋纤维束上生长的SEM图。
图9是本发明实施例1细胞在螺旋状纤维束上生长的荧光图片。
1.培养皿 1A.容器底部 1B.容池
2.第一夹具组件 2A.第一夹具本体 2A1.AA支臂
2A12.AA通孔 2A2.AB支臂 2A21.A限位凸台
2B.A内套件 2B1.AB通孔 2B2.A下压板
2C.A外套件 2C1.AC通孔 2C2.A上压板
2C3.AD通孔 2C4.A卡槽 3.第二夹具组件
3A.第二夹具本体 3A1.BA支臂 3A12.BA通孔
3A2.BB支臂 3A21.B限位凸台 3B.B内套件
3B1.BB通孔 3B2.B下压板 3C.B外套件
3C1.BC通孔 3C2.B上压板 3C3.BD通孔
3C4.B卡槽 4.驱动组件 4A.步进电机
4B.滑轨支架 4B1.DA立板 4B2.DA通孔
4B3.DB立板 4B4.DB通孔 4C.滑块
4C1.上面板 4C2.丝杠通孔 4C3.滑轨槽
4D.丝杠 4D1.滚珠轴承 4E.滑轨
4E1.导轨槽 5.基座 5A.EA限位槽
5B.EB限位槽 5C.圆孔 5D.上面板
5E.下面板 6.A连接件 7.B连接件
10A.A螺钉 10B.B螺钉 10C.C螺钉
10D.D螺钉 10E.E螺钉 11A.A螺母
11B.B螺母 11C.C螺母 11D.D螺母
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
参见图1、图1A所示，本发明设计的体外动态细胞培养装置，其包括有培养皿1、第一夹具组件2、第二夹具组件3、驱动组件4、基座5、A连接件6和B连接件7；A连接件6和B连接件7用于支撑培养皿1；第二夹具组件3安装在驱动组件4上，驱动组件4安装在基座5的上面板，驱动组件4用于提供第二夹具组件3的往复运行；第一夹具组件2与第二夹具组件3对称安装在培养皿1的两侧。本发明的体外动态细胞培养装置的外部罩了透明罩，所述透明罩一方面用于提供培养环境为无菌环境，另一方面也提供给了使用者方便观察无菌培养环境的实时状况。
培养皿1
参见图1、图1A、图1B、图1C所示，培养皿1是具有一定高度的透明容器，容池1B内盛装细胞培养液。培养皿直径一般为90mm。培养皿1的底部放置在相对设置的A连接件6和B连接件7上，且位于基座5的圆孔5C处。A连接件6的一端设有用于C螺钉10C穿过的通孔，C螺钉10C与C螺母11C配合实现将A连接件6的一端固定在基座5的下面板5E上。B连接件7的一端设有用于D螺钉10D穿过的通孔，D螺钉10D与D螺母11D配合实现将B连接件7的一端固定在基座5的下面板5E上。
培养皿1的容器底部1A与第一夹具组件2的AB支臂2A2的底部和第二夹具组件3的BB支臂3A2的底部不接触。培养皿1的容池1B内用于放置细胞培养液。细胞培养液用于对纤维束上的细胞进行培养，该纤维束安装在第一夹具组件2的A外套件2C和第二夹具组件3的B外套件3C上，且纤维束浸泡在细胞培养液中。
第一夹具组件2
参见图1、图1A、图1C、图2、图2A所示，第一夹具组件2包括有第一夹具本体2A、A内套件2B、A外套件2C；其中，A内套件2B与A外套件2C套接一起后形成右端活动件。
第一夹具本体2A的固定端上设有AA支臂2A1，AA支臂2A1上设有用于A螺钉10A穿过的AA通孔2A12，穿过AA通孔2A12的A螺钉10A与A螺母11C配合(如图1C)安装在基座5的EA限位槽5A处，实现将第一夹具本体2A的固定端安装在基座5的上面板5D上。第一夹具本体2A的纤维束安装端是AB支臂2A2，AB支臂2A2上设有A限位凸台2A21，A限位凸台2A21穿过A内套件2B上的AB通孔2B1后，且A内套件2B的A下压板2B2与AB支臂2A2接触。
A内套件2B上设有AB通孔2B1和A下压板2B2；AB通孔2B1用于AB支臂2A2上的A限位凸台2A21穿过；A下压板2B2的两端卡在A外套件2C的A卡槽2C4中。A内套件2B采用聚四氟乙烯材料加工。
A外套件2C上设有AC通孔2C1、平行排布的AD通孔2C3、A上压板2C2和A卡槽2C4；AC通孔2C1用于A内套件2B穿过；A卡槽2C4用于安装A内套件2B的A下压板2B2的两端；平行排布的AD通孔2C3设置在A外套件2C的一侧面板上，平行排布的AD通孔2C3用于螺旋纤维束的一端穿过，穿过平行排布的AD通孔2C3的螺旋纤维束的一端通过A内套件2B的A下压板2B2侧壁接触，实现螺旋纤维束一端的压紧。
第二夹具组件3
参见图1、图1A、图2、图2A、图3、图3A所示，第二夹具组件3包括有第二夹具本体3A、B内套件3B、B外套件3C；其中，B内套件3B与B外套件3C套接一起后形成左端活动件。
第二夹具本体3A的固定端上设有BA支臂3A1，BA支臂3A1上设有用于E螺钉10E穿过的BA通孔3A12，穿过BA通孔3A12的E螺钉10E与滑块4C的滑块上面板4C1上的螺纹孔配合，实现将第二夹具本体3A的固定端安装在滑块4C上。第二夹具本体3A的纤维束安装端是BB支臂3A2，BB支臂3A2上设有B限位凸台3A21，B限位凸台3A21穿过B内套件3B上的BB通孔3B1后，且B内套件3B的B下压板3B2与BB支臂3A2接触。
B内套件3B上设有BB通孔3B1和B下压板3B2；BB通孔3B1用于BB支臂3A2上的B限位凸台3A21穿过；B下压板3B2的两端卡在B外套件3C的B卡槽3C4中。B内套件3B采用聚四氟乙烯材料加工。
B外套件3C上设有BC通孔3C1、平行排布的BD通孔3C3、B上压板3C2和B卡槽3C4；BC通孔3C1用于B内套件3B穿过；B卡槽3C4用于安装B内套件3B的B下压板3B2的两端；平行排布的BD通孔3C3设置在B外套件3C的一侧面板上，平行排布的BD通孔3C3用于螺旋纤维束的一端穿过，穿过平行排布的BD通孔3C3的螺旋纤维束的另一端通过B内套件3B的B下压板3B2侧壁接触，实现螺旋纤维束另一端的压紧。
驱动组件4
在本发明中，驱动组件4所需能源由可充电的小型电池供给。驱动组件4用于提供拉伸速率为2～30mm/min，拉伸伸长率为20～600％。参见图1、图1A、图1C、图4所示，驱动组件4包括有步进电机4A、滑轨支架4B、滑块4C、丝杠4D、滑轨4E；
步进电机4A的输出轴上连接有联轴器，联轴器的另一端连接有丝杠4D的一端，丝杠4D的另一端安装在DA滚珠轴承4D1的内圈中。通过显示屏设置好固定的拉伸速率及拉伸长度，启动驱动组件4运行，即可为接种细胞的螺旋纤维束提供力学刺激的生长环境。对步进电机4A输出功率的调节，能够达到对螺旋纤维束拉伸的长度进行调节。
滑轨支架4B的一端是DA立板4B1，DA立板4B1上设有DA通孔4B2；滑轨支架4B的另一端是DB立板4B3，DB立板4B3上设有DB通孔4B4；滑轨支架4B的底面板4B5上安装有滑轨4E，且底面板4B5通过B螺钉10B与B螺母11B的配合实现将滑轨支架4B固定在基座5的上面板5D上。DA通孔4B2用于丝杠4D的另一端穿过；DB通孔4B4内安装有DA滚珠轴承4D1，且DA滚珠轴承4D1的内圈套接在丝杠4D的另一端上。
滑块4C的上端是滑块上面板4C1，滑块4C的下端是滑轨槽4C3，滑块4C的中部设有丝杠通孔4C2。滑块上面板4C1上固定有第二夹具本体3A的BA支臂3A1。滑轨槽4C3卡合在滑轨4E上。丝杠通孔4C2用于丝杠4D的另一端穿过。
滑轨4E上设有用于滑块4C的滑轨槽4C3移动的导轨槽4E1。滑轨4E安装在滑轨支架4B的底面板4B5上。
在本发明中，在步进电机4A输出的驱动力下使第二夹具组件3做往复运动，由于螺旋纤维束的两端分别固定在第一夹具组件2与第二夹具组件3之间，从而使得螺旋纤维束产生拉伸牵引，可对刺激的频率和拉伸的长度进行调节。
基座5
参见图1、图1A、图1C所示，为了实现布局合理、以及对固定在基座5上的零部件装配位置的精准，在基座5上设有圆孔5C、螺纹孔、通孔、限位槽等。
基座5的圆孔5C处用于放置培养皿1，培养皿1的两侧设置第一夹具组件2与第二夹具组件3。基座5的圆孔5C处的下面板5E上通过螺钉与螺母的配合固定有A连接件6和B连接件7。
基座5的上面板5D的EA限位槽5A处通过A螺钉10A与A螺母11A的配合实现将第一夹具组件2的AA支臂2A1安装在基座5的一端，进而使得第一夹具组件2也位于培养皿1的一侧。
基座5的上面板5D的EB限位槽5B处通过B螺钉10B与B螺母11B的配合实现将滑轨支架4B的底面板4B5安装在基座5的另一端，由于第二夹具本体3A的BA支臂3A1固定在滑块4C的上面板4C1上，进而使得第二夹具本体3A也位于培养皿1的另一侧。
A连接件6的一端通过C螺钉10C与C螺母11C的配合安装在基座5的下面板5E上。
B连接件7的一端通过D螺钉10D与D螺母11D的配合安装在基座5的下面板5E上。
基座5的下面板5E上的A连接件6和B连接件7是相对放置的。A连接件6的另一端上和B连接件7的另一端上放置有培养皿1。
控制模块
在组织工程技术领域中，为了实现模拟体内力学微环境下的细胞培养，使体外培养的细胞具有力学刺激的生长环境，参见图5所示，本发明设计了可调节便携式动态体外细胞培养系统。所述动态体外细胞培养系统包括有控制模块100、显示模块200以及体外动态细胞培养装置(如图1所示)。体外动态细胞培养装置用于实现细胞培养的力学刺激的生长环境。控制模块100由处理器、继电器和电源模块组成，处理器选用stm32开发板(野火MINI芯片)，继电器选用Risym公司的24V继电器、电源模块选用Risym公司的24V/12V直流电源转换芯片。控制模块100用于对步进电机4A的驱动，即驱动电机触发信号F1的实现为：滑块4C的速度等于驱动信号脉冲频率乘以步进电机步距角，然后除以360度乘以分频数乘以丝杠导程；驱动关系表达为
Figure BDA0002345341960000111
V为滑块速度，f为驱动信号脉冲频率，θs为步进电机距角，N为分频数，L为丝杠导程。
在本发明中，控制模块100一方面输出驱动电机触发信号F1给驱动组件4的步进电机4A，所述驱动电机触发信号F1用于实现对步进电机4A的驱动，进而带动丝杠4D转动，丝杠4D上的滑块4C随着丝杠4D实现沿丝杠4D的直线往复运动，使得第二夹具本体3A向第一夹具本体2A靠近，以达到在规定的拉伸速率、拉伸长度、拉伸时间下运动。控制模块100另一方面输出显示信号F2给显示模块200(如图6所示)。
在本发明中，显示模块200用于直观地显示出拉伸速率、拉伸长度、拉伸时间。
本发明设计的体外动态细胞培养装置(如图1所示)可以在紫外灯下消毒灭菌。灭菌后的体外动态细胞培养装置能够放置于培养箱(Eppendorf Galaxy 48R CO2培养箱)内进行培养。这样更能确保细胞能够在培养温度37℃、95％相对湿度和5％的CO2的培养环境条件。本发明的体外动态细胞培养装置(如图1所示)集成了小型化、便携、集参数直观显示、结构设计合理、使用操作方便的优点。
采用本发明体外动态细胞培养装置进行的动态细胞培养，具有下列步骤：
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台(型号Thermo 1389)中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束。
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板(型号COSTAR 3516)中，接种体积为20～40μL，密度为1×106cell/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液。放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件2C的AD通孔2C3中，将A内套件2B从下至上穿过A外套件2C的AC通孔2C1，且A内套件2B的A下压板2B2卡合在A外套件2C的A卡槽2C4中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体2A的A限位凸台2A21上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件3C的BD通孔3C3中，将B内套件3B从下至上穿过B外套件3C的BC通孔3C1，且B内套件3B的B下压板3B2卡合在B外套件3C的B卡槽3C4中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体3A的B限位凸台3A21上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体。
步骤四，组装培养皿；
将培养皿1(型号CORNING 430167)置于基座5的圆孔5C处，并用A连接件6和B连接件7支撑；向培养皿1中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润。
步骤五，动态环境下的细胞培养；
设定培养装置的动态培养参数，这些参数也通过显示模块200直观地显示出，以方便使用者记录下各参数。
设置动态培养参数：拉伸速率5～30mm/min，拉伸伸长率为20～600％，拉伸时间24～72小时，连续拉伸2～24小时；
将组合体培养结束后，观察、记录组合体上的细胞存活状态；使用活死染色试剂盒对支架上的细胞进行活死细胞染色计数，以确定动态力学刺激下细胞的存活率及增殖状态。
实施例1
利用本发明设计的体外动态细胞培养装置(如图1所示)，设置拉伸速率为10mm/min，拉伸伸长率为20％，拉伸72小时(即3天)，每天连续拉伸2小时的动态力学刺激条件下，观察RMSC-bm细胞在螺旋纤维束上的生长状态。
动态体外细胞培养步骤
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台(型号Thermo 1389)中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束。
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板(型号COSTAR 3516)中，接种体积为40μL，密度为1×106cell/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液。放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件2C的AD通孔2C3中，将A内套件2B从下至上穿过A外套件2C的AC通孔2C1，且A内套件2B的A下压板2B2卡合在A外套件2C的A卡槽2C4中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体2A的A限位凸台2A21上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件3C的BD通孔3C3中，将B内套件3B从下至上穿过B外套件3C的BC通孔3C1，且B内套件3B的B下压板3B2卡合在B外套件3C的B卡槽3C4中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体3A的B限位凸台3A21上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体。
步骤四，组装培养皿；
将培养皿1(型号CORNING 430167)置于基座5的圆孔5C处，并用A连接件6和B连接件7支撑；向培养皿1中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润。
步骤五，动态环境下的细胞培养；
设定培养装置的动态培养参数，这些参数也通过显示模块200直观地显示出，以方便使用者记录下各参数。
设置动态培养参数：拉伸速率10mm/min，拉伸伸长率为20％，每天连续拉伸2小时；
步骤51，第一天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；细胞存活状态如图7所示。图中细胞在螺旋纤维束上粘附生长，细胞质基质状态较为致密，说是细胞生长状态良好。
步骤52，第二天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；
步骤53，第三天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；细胞存活状态如图8所示。图中细胞在螺旋纤维束上粘附生长，细胞质基质疏松多孔，是动态培养下促进细胞质基质分泌，细胞生长状态良好。
步骤54，记录组合体上的细胞存活状态；
将组合体培养3天后，观察、记录组合体上的细胞存活状态；使用活死染色试剂盒对支架上的细胞进行活死细胞染色计数，以确定动态力学刺激下细胞的存活率及增殖状态。如图9所示，图中白色部分强度较大且分布均匀，说明细胞在螺旋纤维上的存活率较高状态良好，且在纤维束上均匀粘附。
对比例1
设置拉伸速率为10mm/min，拉伸伸长率为20％，拉伸72小时(即3天)，每天连续拉伸2小时的静态条件下，观察RMSC-bm细胞在螺旋纤维束上的生长状态。
静态体外细胞培养步骤
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台(型号Thermo 1389)中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束。
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板(型号COSTAR 3516)中，接种体积为40μL，密度为1×106cell/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液。放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件2C的AD通孔2C3中，将A内套件2B从下至上穿过A外套件2C的AC通孔2C1，且A内套件2B的A下压板2B2卡合在A外套件2C的A卡槽2C4中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体2A的A限位凸台2A21上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件3C的BD通孔3C3中，将B内套件3B从下至上穿过B外套件3C的BC通孔3C1，且B内套件3B的B下压板3B2卡合在B外套件3C的B卡槽3C4中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体3A的B限位凸台3A21上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体。
步骤四，组装培养皿；
将培养皿1(型号CORNING 430167)置于基座5的圆孔5C处，并用A连接件6和B连接件7支撑；向培养皿1中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润。
步骤五，静态环境下的细胞培养；
将组合体培养3天后，观察、记录组合体上的细胞存活状态；使用活死染色试剂盒对支架上的细胞进行活死细胞染色计数，以确定动态力学刺激下细胞的存活率及增殖状态。
经记录，实施例1与对比例1在细胞存活参数上的相对可知，实施例1的细胞存活率高于对比例1的存活率的15％。
实施例2
利用本发明设计的体外动态细胞培养装置(如图1所示)，设置拉伸速率为30mm/min，拉伸伸长率为100％，拉伸24小时(即1天)，每天连续拉伸24小时的动态力学刺激条件下，观察NIT-3T3细胞在螺旋纤维束上的生长状态。
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台(型号Thermo 1389)中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束。
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板(型号COSTAR 3516)中，接种体积为20μL，密度为1×106cell/mL的胚胎成纤维细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液。放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件2C的AD通孔2C3中，将A内套件2B从下至上穿过A外套件2C的AC通孔2C1，且A内套件2B的A下压板2B2卡合在A外套件2C的A卡槽2C4中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体2A的A限位凸台2A21上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件3C的BD通孔3C3中，将B内套件3B从下至上穿过B外套件3C的BC通孔3C1，且B内套件3B的B下压板3B2卡合在B外套件3C的B卡槽3C4中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体3A的B限位凸台3A21上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体。
步骤四，组装培养皿；
将培养皿1(型号CORNING 430167)置于基座5的圆孔5C处，并用A连接件6和B连接件7支撑；向培养皿1中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润。
步骤五，动态环境下的细胞培养；
设定培养装置的动态培养参数，这些参数也通过显示模块200直观地显示出，以方便使用者记录下各参数。
设置动态培养参数：拉伸速率30mm/min，拉伸伸长率为100％，连续拉伸24小时；拉伸结束后，静态培养2小时；然后记录组合体上的细胞存活状态。细胞在螺旋纤维束上粘附生长，细胞质基质疏松多孔，是动态培养下细胞质基质分泌速度缓慢增加，细胞生长状态良好。经记录，实施例2与对比例1在细胞存活参数上的相对可知，实施例2的细胞存活率高于对比例1的存活率的10％。
实施例3
利用本发明设计的体外动态细胞培养装置(如图1所示)，设置拉伸速率为5mm/min，拉伸伸长率为50％，拉伸时间48小时(即2天)，每天连续拉伸10小时的动态力学刺激条件下，观察RMSC-bm细胞在螺旋纤维束上的生长状态。
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台(型号Thermo 1389)中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束。
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板(型号COSTAR 3516)中，接种体积为40μL，密度为1×106cell/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液。放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件2C的AD通孔2C3中，将A内套件2B从下至上穿过A外套件2C的AC通孔2C1，且A内套件2B的A下压板2B2卡合在A外套件2C的A卡槽2C4中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体2A的A限位凸台2A21上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件3C的BD通孔3C3中，将B内套件3B从下至上穿过B外套件3C的BC通孔3C1，且B内套件3B的B下压板3B2卡合在B外套件3C的B卡槽3C4中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体3A的B限位凸台3A21上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体。
步骤四，组装培养皿；
将培养皿1(型号CORNING 430167)置于基座5的圆孔5C处，并用A连接件6和B连接件7支撑；向培养皿1中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润。
步骤五，动态环境下的细胞培养；
设定培养装置的动态培养参数，这些参数也通过显示模块200直观地显示出，以方便使用者记录下各参数。
设置动态培养参数：拉伸速率5mm/min，拉伸伸长率为50％，每天连续拉伸10小时；
步骤51，第一天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；
步骤52，第二天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；细胞在螺旋纤维束上粘附生长，细胞质基质疏松多孔，是动态培养下促进细胞质基质分泌，细胞生长状态良好。
步骤53，记录组合体上的细胞存活状态；
将组合体培养2天后，观察、记录组合体上的细胞存活状态；使用活死染色试剂盒对支架上的细胞进行活死细胞染色计数，以确定动态力学刺激下细胞的存活率及增殖状态。细胞在螺旋纤维束上粘附生长，细胞质基质疏松多孔，是动态培养下细胞质基质分泌速度缓慢增加，细胞生长状态良好。经记录，实施例3与对比例1在细胞存活参数上的相对可知，实施例3的细胞存活率高于对比例1的存活率的15％。

Claims (7)

1.一种体外动态细胞培养装置，其特征在于：体外动态细胞培养装置包括有培养皿(1)、第一夹具组件(2)、第二夹具组件(3)、驱动组件(4)、基座(5)、A连接件(6)和B连接件(7)；
培养皿(1)的容池(1B)内盛装细胞培养液；培养皿(1)的底部放置在相对设置的A连接件(6)和B连接件(7)上，且位于基座(5)的圆孔(5C)处；
第一夹具组件(2)包括有第一夹具本体(2A)、A内套件(2B)、A外套件(2C)；其中，A内套件(2B)与A外套件(2C)套接一起后形成右端活动件；
第一夹具本体(2A)的固定端上设有AA支臂(2A1)，AA支臂(2A1)上设有用于A螺钉(10A)穿过的AA通孔(2A12)，穿过AA通孔(2A12)的A螺钉(10A)与A螺母(11C)配合安装在基座(5)的EA限位槽(5A)处，实现将第一夹具本体(2A)的固定端安装在基座(5)的上面板(5D)上；第一夹具本体(2A)的纤维束安装端是AB支臂(2A2)，AB支臂(2A2)上设有A限位凸台(2A21)，A限位凸台(2A21)穿过A内套件(2B)上的AB通孔(2B1)后，且A内套件(2B)的A下压板(2B2)与AB支臂(2A2)接触；
A内套件(2B)上设有AB通孔(2B1)和A下压板(2B2)；AB通孔(2B1)用于AB支臂(2A2)上的A限位凸台(2A21)穿过；A下压板(2B2)的两端卡在A外套件(2C)的A卡槽(2C4)中；
A外套件(2C)上设有AC通孔(2C1)、平行排布的AD通孔(2C3)、A上压板(2C2)和A卡槽(2C4)；AC通孔(2C1)用于A内套件(2B)穿过；A卡槽(2C4)用于安装A内套件(2B)的A下压板(2B2)的两端；平行排布的AD通孔(2C3)设置在A外套件(2C)的一侧面板上，平行排布的AD通孔(2C3)用于螺旋纤维束的一端穿过，穿过平行排布的AD通孔(2C3)的螺旋纤维束的一端通过A内套件(2B)的A下压板(2B2)侧壁接触，实现螺旋纤维束一端的压紧；
第二夹具组件(3)包括有第二夹具本体(3A)、B内套件(3B)、B外套件(3C)；其中，B内套件(3B)与B外套件(3C)套接一起后形成左端活动件；
第二夹具本体(3A)的固定端上设有BA支臂(3A1)，BA支臂(3A1)上设有用于E螺钉(10E)穿过的BA通孔(3A12)，穿过BA通孔(3A12)的E螺钉(10E)与滑块(4C)的滑块上面板(4C1)上的螺纹孔配合，实现将第二夹具本体(3A)的固定端安装在滑块(4C)上；第二夹具本体(3A)的纤维束安装端是BB支臂(3A2)，BB支臂(3A2)上设有B限位凸台(3A21)，B限位凸台(3A21)穿过B内套件(3B)上的BB通孔(3B1)后，且B内套件(3B)的B下压板(3B2)与BB支臂(3A2)接触；
B内套件(3B)上设有BB通孔(3B1)和B下压板(3B2)；BB通孔(3B1)用于BB支臂(3A2)上的B限位凸台(3A21)穿过；B下压板(3B2)的两端卡在B外套件(3C)的B卡槽(3C4)中；
B外套件(3C)上设有BC通孔(3C1)、平行排布的BD通孔(3C3)、B上压板(3C2)和B卡槽(3C4)；BC通孔(3C1)用于B内套件(3B)穿过；B卡槽(3C4)用于安装B内套件(3B)的B下压板(3B2)的两端；平行排布的BD通孔(3C3)设置在B外套件(3C)的一侧面板上，平行排布的BD通孔(3C3)用于螺旋纤维束的一端穿过，穿过平行排布的BD通孔(3C3)的螺旋纤维束的另一端通过B内套件(3B)的B下压板(3B2)侧壁接触，实现螺旋纤维束另一端的压紧；
驱动组件(4)包括有步进电机(4A)、滑轨支架(4B)、滑块(4C)、丝杠(4D)、滑轨(4E)；
步进电机(4A)的输出轴上连接有联轴器，联轴器的另一端连接有丝杠(4D)的一端，丝杠(4D)的另一端安装在DA滚珠轴承(4D1)的内圈中；
滑轨支架(4B)的一端是DA立板(4B1)，DA立板(4B1)上设有DA通孔(4B2)；滑轨支架(4B)的另一端是DB立板(4B3)，DB立板(4B3)上设有DB通孔(4B4)；滑轨支架(4B)的底面板(4B5)上安装有滑轨(4E)，且底面板(4B5)通过B螺钉(10B)与B螺母(11B)的配合实现将滑轨支架(4B)固定在基座(5)的上面板(5D)上；DA通孔(4B2)用于丝杠(4D)的另一端穿过；DB通孔(4B4)内安装有DA滚珠轴承(4D1)，且DA滚珠轴承(4D1)的内圈套接在丝杠(4D)的另一端上；
滑块(4C)的上端是滑块上面板(4C1)，滑块(4C)的下端是滑轨槽(4C3)，滑块(4C)的中部设有丝杠通孔(4C2)；滑块上面板(4C1)上固定有第二夹具本体(3A)的BA支臂(3A1)；滑轨槽(4C3)卡合在滑轨(4E)上；丝杠通孔(4C2)用于丝杠(4D)的另一端穿过；
滑轨(4E)上设有用于滑块(4C)的滑轨槽(4C3)移动的导轨槽(4E1)；滑轨(4E)安装在滑轨支架(4B)的底面板(4B5)上；
在步进电机(4A)输出的驱动力下使第二夹具组件(3)做往复运动，由于螺旋纤维束的两端分别固定在第一夹具组件(2)与第二夹具组件(3)之间，从而使得螺旋纤维束产生拉伸牵引，可对刺激的频率和拉伸的长度进行调节；
基座(5)的圆孔(5C)处用于放置培养皿(1)，培养皿(1)的两侧设置第一夹具组件(2)与第二夹具组件(3)；基座(5)的圆孔(5C)处的下面板(5E)上通过螺钉与螺母的配合固定有A连接件(6)和B连接件(7)；
基座(5)的上面板(5D)的EA限位槽(5A)处通过A螺钉(10A)与A螺母(11A)的配合实现将第一夹具组件(2)的AA支臂(2A1)安装在基座(5)的一端，进而使得第一夹具组件(2)也位于培养皿(1)的一侧；
基座(5)的上面板(5D)的EB限位槽(5B)处通过B螺钉(10B)与B螺母(11B)的配合实现将滑轨支架(4B)的底面板(4B5)安装在基座(5)的另一端，由于第二夹具本体(3A)的BA支臂(3A1)固定在滑块(4C)的上面板(4C1)上，进而使得第二夹具本体(3A)也位于培养皿(1)的另一侧；
A连接件(6)的一端通过C螺钉(10C)与C螺母(11C)的配合安装在基座(5)的下面板(5E)上；
B连接件(7)的一端通过D螺钉(10D)与D螺母(11D)的配合安装在基座(5)的下面板(5E)上；
基座(5)的下面板(5E)上的A连接件(6)和B连接件(7)是相对放置的；A连接件(6)的另一端上和B连接件(7)的另一端上放置有培养皿(1)。
2.根据权利要求1所述的体外动态细胞培养装置，其特征在于：驱动组件(4)所需能源由可充电的小型电池供给。
3.根据权利要求1所述的体外动态细胞培养装置，其特征在于：驱动组件(4)用于提供拉伸速率为2～30mm/min，拉伸伸长率为20～600％。
4.应用权利要求1所述的体外动态细胞培养装置进行的体外动态细胞培养方法，其特征在于包括有下列步骤：
步骤一，灭菌处理纤维束；
将螺旋纤维束放入75％酒精中浸泡半小时实现消毒，取出螺旋纤维束再放置在无菌超净台中打开紫外灯照射半小时灭菌，得到无菌纤维束；
步骤二，预培养纤维束；
将无菌纤维束置于六孔板中，接种体积为20～40μL，密度为1×106cell/mL的大鼠骨髓间充质干细胞悬液固定1h后，再加入2mL的细胞培养液；放置在培养箱中培养一天后，得到预培养纤维束；
步骤三，无菌纤维束的组装；
将培养纤维束的一端固定在A外套件(2C)的AD通孔(2C3)中，将A内套件(2B)从下至上穿过A外套件(2C)的AC通孔(2C1)，且A内套件(2B)的A下压板(2B2)卡合在A外套件(2C)的A卡槽(2C4)中；然后将带有多根纤维束的右端活动件套接在第一夹具本体(2A)的A限位凸台(2A21)上；
将培养纤维束的另一端固定在B外套件(3C)的BD通孔(3C3)中，将B内套件(3B)从下至上穿过B外套件(3C)的BC通孔(3C1)，且B内套件(3B)的B下压板(3B2)卡合在B外套件(3C)的B卡槽(3C4)中；然后将带有多根纤维束的左端活动件套接在第二夹具本体(3A)的B限位凸台(3A21)上；
左右两端组装完成后，得到细胞－螺旋纤维束－支架固定的组合体；
步骤四，组装培养皿；
将培养皿(1)置于基座(5)的圆孔(5C)处，并用A连接件(6)和B连接件(7)支撑；向培养皿(1)中加入30mL的细胞培养液，该细胞培养液能够将组合体完全浸润；
步骤五，动态环境下的细胞培养；
设置动态培养参数：拉伸速率5～30mm/min，拉伸伸长率为20～600％，拉伸时间24～72小时，连续拉伸2～24小时；
将组合体培养结束后，观察、记录组合体上的细胞存活状态；使用活死染色试剂盒对支架上的细胞进行活死细胞染色计数，以确定动态力学刺激下细胞的存活率及增殖状态。
5.根据权利要求4所述的体外动态细胞培养装置进行的体外动态细胞培养方法，其特征在于：根据拉伸时间的不同，则步骤五的具体步骤有；
设置动态培养参数：拉伸速率10mm/min，拉伸伸长率为20％，每天连续拉伸2小时；
步骤51，第一天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；
步骤52，第二天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；
步骤53，第三天，在动态培养参数下，拉伸负载细胞的螺旋纤维束，拉伸结束后，静态培养；
步骤54，记录组合体上的细胞存活状态。
6.根据权利要求1所述的体外动态细胞培养装置进行的体外动态细胞培养方法，其特征在于：根据拉伸时间的不同，则步骤五的具体步骤有；
设置动态培养参数：拉伸速率30mm/min，拉伸伸长率为100％，连续拉伸24小时；拉伸结束后，静态培养2小时；然后记录组合体上的细胞存活状态。
7.根据权利要求1所述的体外动态细胞培养装置进行的体外动态细胞培养方法，其特征在于：细胞在螺旋纤维束上粘附生长，且存活率比静态培养提高了10～15％，细胞质基质疏松多孔，是动态培养下促进细胞质基质分泌，细胞生长状态良好。
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