CN110955039A - 相差显微成像系统及其成像方法 - Google Patents

相差显微成像系统及其成像方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种结构简单且成本低廉的相差显微成像系统，其包括具有光轴的显微镜、光源阵列、图像获取模块及计算模块，显微镜包括物镜和载玻片，光源阵列设置在载玻片远离物镜的一侧，并用于发射关于光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜进入显微镜，其中，第一光束和第二光束透过样品后与所述光轴形成有限角度，图像获取模块设置在显微镜的像侧，并用于获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像，计算模块用于将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减，并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。本发明提供一种简单且易操作的相差显微成像系统的成像方法。

Description

相差显微成像系统及其成像方法
【技术领域】
本发明涉及显微成像技术领域，具体涉及一种相差显微成像系统及其成像方法。
【背景技术】
相差显微技术由荷兰科学家泽尔尼克发明，用于观察未染色标本。由于光波通过活细胞和未染色的生物标本，其波长和振幅并不发生变化，人眼无法观察，但是其相位发生改变。相差显微技术通过改变相位差，并利用光的衍射和干涉现象，把相位差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。同普通光学显微镜和暗视野显微镜相比，能够比较清楚的观察到活细胞以及细胞内的某些细微结构，因而在生物、医学诊断、科研、生命科学等领域都有广泛应用。
目前，相差显微成像技术已经很成熟，主要以透射方式为主，利用物体不同结构成分之间的折射率和厚度的差别，把通过物体不同部分的光程差转变为振幅的差别，经过带有环状光阑的聚光镜和带有相位片的相差物镜实现对微小生物组织的观察。此时，相差显微镜需要用特殊的物镜、光阑及相位片，结构复杂且成本高昂。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种相差显微成像系统及其成像方法，该相差显微成像系统结构简单且成本低廉，该相差显微成像系统的成像方法简单易操作。
本发明的技术方案如下：
一种相差显微成像系统包括具有光轴的显微镜，所述显微镜包括物镜和载玻片，所述相差显微成像系统还包括：
光源阵列，设置在所述载玻片远离所述物镜的一侧，并用于发射关于所述光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束透过样品并自所述物镜进入所述显微镜，其中，第一光束和第二光束透过样品后与所述光轴形成有限角度；
图像获取模块，设置在所述显微镜的像侧，并用于获取对应所述第一光束的第一图像和对应所述第二光束的第二图像；
计算模块，用于将所述第一图像的灰度值与所述第二图像的灰度值相减，并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。
优选地，所述第一光束和所述第二光束的光谱至少部分重叠，所述光源阵列用于依次发射所述第一光束和所述第二光束。
优选地，所述第一光束和所述第二光束的光谱不重叠，所述光源阵列用于依次发射所述第一光束和所述第二光束。
优选地，所述第一光束和所述第二光束的光谱不重叠，所述光源阵列用于同时发射所述第一光束和所述第二光束。
优选地，所述图像获取模块为单色相机。
优选地，所述图像获取模块为彩色相机。
优选地，所述彩色相机具有RGBIR感光元件，所述第一光束为红外光光束，所述第二光束为复合光光束或单色光光束。
优选地，所述图像获取模块包括第一相机、第二相机及分光元件，所述分光元件设于所述显微镜的像侧，且所述分光元件将所述第一光束和所述第二光束分成两个光路，其中一光路为所述第一光束，另一光路为所述第二光束，所述第一相机和所述第二相机分别设置在所述两个光路上。
优选地，所述图像获取模块还包括设于所述第一相机与所述分光元件之间的第一滤光片及设于所述第二相机与所述分光元件之间的第二滤光片，其中，所述第一滤光片用于过滤所述第二光束，所述第二滤光片用于过滤所述第一光束。
优选地，所述第一相机和所述第二相机均为单色相机，或者，所述第一相机和所述第二相机中至少一方为彩色相机。
优选地，所述图像获取模块为相机，所述相机包括第一感光元件、第二感光元件及分光元件，所述分光元件将所述第一光束和所述第二光束分成两个光路，其中一光路为所述第一光束，另一光路为所述第二光束，所述第一感光元件和所述第二感光元件分别设置在所述两个光路上。
优选地，所述第一感光元件和所述第二感光元件均为黑白感光元件，或者，所述第一感光元件和所述第二感光元件中至少一方为彩色感光元件。
优选地，所述光源阵列包括用于分别发射所述第一光束和所述第二光束的两个光源组，所述光源组包括发光光源，一所述光源组中的所述发光光源与另一所述光源组中的所述发光光源关于所述光轴轴对称设置。
优选地，所述光源阵列包括用于分别发射所述第一光束和所述第二光束的两个光源组，所述光源组包括光纤和发光光源，所述发光光源发出的光通过所述光纤传导到所述载玻片上，且一所述光源组中的所述光纤的出射端与另一所述光源组中的所述光纤的出射端关于所述光轴轴对称设置。
本发明还提供一种上述中任一项所述的相差显微成像系统的成像方法，所述成像方法包括以下步骤：
光源阵列发射关于光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束透过样品并自物镜进入显微镜，其中，第一光束和第二光束透过样品后与所述光轴形成有限角度；
图像获取模块在所述显微镜的像侧获取对应所述第一光束的第一图像和对应所述第二光束的第二图像；
计算模块将所述第一图像的灰度值与所述第二图像的灰度值相减，并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。
与相关技术相比，本发明提供的相差显微成像系统及其成像方法的有益效果在于：所述光源阵列发射关于所述光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束透过样品并自所述物镜进入所述显微镜，而所述第一光束和所述第二光束透过样品后会发生相位变化，相位变化会引起传播方向的局部变化，由于所述第一光束和所述第二光束以所述光轴为对称轴，因此所述第一光束和所述第二光束成像后存在对称的相位差，因此，通过所述图像获取模块在所述显微镜的像侧获取对应所述第一光束的第一图像和对应所述第二光束的第二图像，并通过所述计算模块对所述第一图像与所述第二图像进行相减运算以获得相差图像。这样的相差显微成像系统不仅结构简单且成本低廉，而且使用该相差显微成像系统的成像方法简单易操作。
【附图说明】
图1为本发明提供的相差显微成像系统的结构框图；
图2为本发明提供的相差显微成像系统的一种结构示意图；
图3为图2所示的相差显微成像系统中光源阵列的一种结构示意图；
图4为图2所示的相差显微成像系统中光源阵列的另一种结构示意图；
图5为本发明提供的相差显微成像系统另一种结构示意图；
图6为图2所示的相差显微成像系统中图像获取模块的另一种结构示意图；
图7为本发明提供的成像方法的步骤流程图。
【具体实施方式】
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部份实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
请结合参阅图1和图2，相差显微成像系统100包括具有光轴1A的显微镜1、光源阵列3、图像获取模块5及计算模块7。
显微镜1包括物镜11和载玻片13。样品(图中未示出)设置于载玻片13上，且位于物镜11的视野范围内。
光源阵列3设置在载玻片13远离物镜11的一侧，并用于发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束(即第一光束和第二光束以光轴1A为对称轴轴对称设置)，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。其中，第一光束和第二光束的光谱至少部分重叠，光源阵列3用于依次发射第一光束和第二光束。
需要说明的是，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成的有限角度是指第一光束和第二光束透过样品后虽然发生倾斜，但第一光束和第二光束仍能自物镜11进入显微镜1。
在第一光束和第二光束的光谱完全重叠(即第一光束和第二光束的光谱相同)时，第一光束和第二光束可以为相同的复合光光束，也可以为相同的单色光光束。其中，该单色光为单一发光波长的光，优选选自R、G、B三原色光；由两种或两种以上的单色光复合而成的光为复合光。例如，在第一光束和第二光束的光谱完全重叠时，第一光束和第二光束可以均为R和G两种原色光复合而成的复合光光束，也可以均为R原色光光束。
在第一光束和第二光束的光谱仅部分重叠时，第一光束和第二光束可以分别为光谱部分重叠不同的复合光光束；也可以其中一方为单色光光束，另一方为复合光光束。例如，在第一光束和第二光束的光谱仅部分重叠时，第一光束为由R和G两种单色光复合而成的复合光光束，第二光束为由R和B两种原色光复合而成的复合光光束；或者，第一光束为由R和G两种原色光复合而成的复合光光束，第二光束为R或G原色光光束。
在本实施例中，第一光束和第二光束的光谱完全重叠；也就是说，第一光束和第二光束的光谱相同。
请参阅图3和图4，光源阵列3包括用于分别发射第一光束和第二光束的两个光源组。为了使本领域技术人员清楚的理解光源阵列3的设置方式，特定义两个光源组分别为第一光源组3a和第二光源组3b。
其中，光源组可以设置成：
光源组包括发光光源，一光源组中的发光光源与另一光源组中的发光光源关于光轴1A轴对称设置，以使得第一光束和第二光束以光轴1A为对称轴轴对称设置；如图2所示，第一光源组3a和第二光源组3b均仅为一个发光光源；如图3所示，第一光源组3a包括两个发光光源31a，第二光源组3b包括两个发光光源31b；可以理解的是，光源组也可以包括三个发光光源或者四个发光光源或者五个发光光源等；或者，
光源组包括光纤和发光光源，发光光源发出的光通过光纤传导到载玻片13上，且一光源组中的光纤的出射端与另一光源组中的光纤的出射端关于光轴1A轴对称设置，以使得第一光束和第二光束以光轴1A为对称轴轴对称设置；如图4所示，第一光源组3a包括一个发光光源31a和一个光纤32a，第二光源组3b包括一个发光光源31b和一个光纤32b；可以理解的是，光源组也可以包括n个发光光源和n个光纤，其中，n为大于1的整数。
发光光源可以是发射复合光的复合光光源，也可以是发射单色光的单色光光源。
在本实施例中，在一个光源组包括多个发光光源时，该多个发光光源可为同一种光源，例如均为同一光谱的复合光光源或均为同一波长的单色光光源；或者，该多个发光光源为不同的光源，此时，一发光光源中的不同光源与另一发光光源的不同光源以光轴1A为对称轴轴对称设置，例如，一个光源组包括两个发光光源，该两个发光光源分别为R及B原色光光源，则该光源组的R原色光光源与另一光源组的R原色光光源以光轴1A为对称轴轴对称设置，且该光源组的B原色光与另一光源组的B原色光以光轴1A为对称轴轴对称设置。也就是说，在多个发光光源为不同的光源时，第一光束和第二光束为相同的复合光光束(即第一光束和第二光束的光谱完全重叠)。
具体地，发光光源可以采用LED灯，也可以采用OLED灯，对此本发明不作具体限定。
在本实施例中，优选地，第一光束和第二光束均为单色光光束。
图像获取模块5设置在显微镜1的像侧，并用于获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。具体地，在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。由于以光轴1A为对称轴轴对称设置的第一光束和第二光束透射过样品(生物组织)时，因样品对光线的吸收和光线的折射这两个因素的影响，导致第一光束和第二光束到达像面上的光强度发生不同程度的衰减，从而导致图像获取模块5获取的第一图像的不同像素上的图像强度以及第二图像的不同像素上的图像强度与样品对光的吸收和对光的倾斜这两个因素相关。由于样品的各部分生物结构基本上都是透明的，其对第一光束和第二光束的光吸收差异不是很大，因而光吸收对成像(即第一图像和第二图像)的影响并不明显，但样品的各部分生物结构的折射率的差异则很明显，这意味着，第一光束和第二光束通过样品的各部分生物结构的过程中，产生的相位差则比较显著，反映在第一光束和第二光束上为第一光束和第二光束的路径的发生了倾斜，最终，第一图像和第二图像具有相反的相位差，从而使得第一图像和第二图像的对比度提升。
图像获取模块5为单色相机，单色相机获取的图像的像素值即为图像的灰度值。该单色相机的感光光谱覆盖第一光束和第二光束的发光光源光谱。
计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减，并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。具体地，设第一图像的灰度值为I1，设第二图像的灰度值为I2，设第一图像的灰度值与第二图像的灰度值的差值为Iphase，则
Figure BDA0002275765210000071
其中，I1max为I1中的最大值，I2max为I2中的最大值，Iphase归一化到[0，255]灰度区间即得到相差图像。这种由于样品的各部分生物结构的折射率差异而形成的相差图像更能更能够突出样品的内部结构。
在其他实施例中，计算模块7也可采用其他的相减算法以对第一图像的灰度值与第二图像的灰度值进行相减运算并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。具体地，由于以光轴1A为对称轴轴对称设置的第一光束和第二光束透射过样品(生物组织)时，样品的各部分生物结构基本上都是透明的，对第一光束和第二光束的光吸收差异不是很大，因而样品对光的吸收对成像(即第一图像和第二图像)影响并不明显，但样品的各部分生物结构的折射率的差异则很明显，这意味着，第一光束和第二光束通过样品的各部分生物结构的过程中，产生相反的相位差则比较显著；设第一图像的灰度值为I1＝Ia+Ib，设第二图像的灰度值为I2＝Ia-Ib，其中，Ia为所成像(包括第一图像和第二图像)上任何一个像素(x,y)处光吸收的强度，Ib为所成像(包括第一图像和第二图像)上任何一个像素(x,y)处相位差的强度，则相差图像为Ib＝1/2(I1-I2)归一化到[0，255]灰度区间得到的图像。
计算模块7可设置于显微镜1中，也可设置于与显微镜1连接的电子设备中，该电子设备可为计算机、平板电脑、手机等设备。
在本较佳实施例中，计算模块7设置于显微镜1中。计算模块7存储于显微镜1的存储器中，并被显微镜1的处理器执行，以获得相差图像。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。其中，第一光束和第二光束的光谱至少部分重叠，光源阵列3依次发射第一光束和第二光束。
在第一光束和第二光束的光谱完全重叠(即第一光束和第二光束的光谱相同)时，第一光束和第二光束可以为相同的复合光光束，也可以为相同的单色光光束。其中，该单色光为单一发光波长的光，优选选自R、G、B三原色光；由两种或两种以上的单色光复合而成的光为复合光。例如，在第一光束和第二光束的光谱完全重叠时，第一光束和第二光束可以均为R和G两种原色光复合而成的复合光光束，也可以均为R原色光光束。
在第一光束和第二光束的光谱仅部分重叠时，第一光束和第二光束可以分别为光谱部分重叠不同的复合光光束；也可以其中一方为单色光光束，另一方为复合光光束。例如，在第一光束和第二光束的光谱仅部分重叠时，第一光束为由R和G两种单色光复合而成的复合光光束，第二光束为由R和B两种原色光复合而成的复合光光束；或者，第一光束为由R和G两种原色光复合而成的复合光光束，第二光束为R或G原色光光束。
S2、图像获取模块5在显微镜1的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。
具体地，在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(单色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(单色相机)对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)，。在本实施例中，由于图像获取模块5为单色相机，因此，单色相机获取的图像的像素值即为图像的灰度值。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例二
实施例二的相差显微成像系统与实施例一的相差显微成像系统的区别仅在于：图像获取模块5为彩色相机。在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。其中，彩色相机可以采用CCD相机或CMOS相机。该彩色相机的感光光谱覆盖第一光束及第二光束的发光光谱。
对于彩色相机，每一个像素记录了R、G、B三个颜色通道的3个值。在本实施例中，图像的灰度值I与R、G、B值采用以下关系式：I＝0.2989*R+0.5870*G+0.1140*B，则第一图像的灰度值为I1＝0.2989*R1+0.5870*G1+0.1140*B1，第二图像的灰度值为I2＝0.2989*R2+0.5870*G2+0.1140*B2。
需要说明的是，在本发明中，图像的灰度值的计算方式为现有技术中常规计算方式，并不局限于上述一种计算方式；且图像的灰度值的计算方式存储于显微镜1的存储器中，并被显微镜1的处理器执行，以获得第一图像的灰度值和第二图像的灰度值。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3依次发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。其中，第一光束和第二光束的光谱至少部分重叠，光源阵列3依次发射第一光束和第二光束。
在第一光束和第二光束的光谱完全重叠(即第一光束和第二光束的光谱相同)时，第一光束和第二光束可以为相同的复合光光束，也可以为相同的单色光光束。其中，该单色光为单一发光波长的光，优选选自R、G、B三原色光；由两种或两种以上的单色光复合而成的光为复合光。例如，在第一光束和第二光束的光谱完全重叠时，第一光束和第二光束可以均为R和G两种原色光复合而成的复合光光束，也可以均为R原色光光束。
在第一光束和第二光束的光谱仅部分重叠时，第一光束和第二光束可以分别为光谱部分重叠不同的复合光光束；也可以其中一方为单色光光束，另一方为复合光光束。例如，在第一光束和第二光束的光谱仅部分重叠时，第一光束为由R和G两种单色光复合而成的复合光光束，第二光束为由R和B两种原色光复合而成的复合光光束；或者，第一光束为由R和G两种原色光复合而成的复合光光束，第二光束为R或G原色光光束。
S2、图像获取模块5在显微镜1的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例三
实施例三的相差显微成像系统与实施例一的相差显微成像系统的区别仅在于：第一光束和第二光束的光谱不重叠。在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(单色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(单色相机)对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。该单色相机的感光光谱覆盖第一光束及第二光束的发光光源光谱。
具体地，第一光束和第二光束可以选用不同波长的单色光光束，其中，单色光优选选自R、G、B三原色光；或者，第一光束和第二光束其中一方为单色光光束，另外一方为复合光光束，且该复合光光束不包括该单色光光束的光谱(例如：所述第一光束为R、G、B三原色光光束中的任意一种，第二光束为R、G、B三原色光中其余两种原色光形成的复合光光束，例如，第一光束为R原色光光束，第二光束为G和B原色光的复合光光束)；或者，第一光束和第二光束选用不同光谱的复合光光束。在本实施例中，优选地，第一光束和第二光束选用不同波长的单色光光束。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。第一光束和第二光束的光谱不重叠，光源阵列3依次发射第一光束和第二光束。
S2、图像获取模块5在显微镜1的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(单色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(单色相机)对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。在本实施例中，由于图像获取模块5为单色相机，因此，单色相机获取的图像的像素值即为图像的灰度值。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例四
实施例四的相差显微成像系统与实施例三的相差显微成像系统的区别仅在于：图像获取模块5为彩色相机，光源阵列3可以用于依次发射第一光束和第二光束，或也可以用于同时发射第一光束和第二光束。其中，彩色相机可以采用CCD相机或CMOS相机。该彩色相机的感光光谱覆盖第一光束及第二光束的发光光谱。
第一光束和第二光束依次发射：在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。
第一光束和第二光束同时发射：在光源阵列3发射第一光束和第二光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第一光束和第二光束拍摄一张图像，并从该图像中获取对应第一光束的第一图像以及对应第二光束的第二图像。由于图像获取模块5为彩色相机，且第一光束和第二光束的光谱不重叠，因此，可以该图像中提取出对应第一光束的第一图像以及对应第二光束的第二图像。需要说明的是，从光谱不重叠的第一光束和第二光束成像的图像中提取第一图像和第二图像的方法为常规的图像处理手段，在此不作详细描述。
其中，彩色相机可以采用CCD相机或CMOS相机。该彩色相机的感光光谱覆盖第一光束及第二光束的发光光谱。
对于彩色相机，每一个像素记录了R、G、B三个颜色通道的3个值。在本实施例中，图像的灰度值I与R、G、B值采用以下关系式：I＝0.2989*R+0.5870*G+0.1140*B，则第一图像的灰度值为I1＝0.2989*R1+0.5870*G1+0.1140*B1，第二图像的灰度值为I2＝0.2989*R2+0.5870*G2+0.1140*B2。
需要说明的是，在本发明中，彩色图像的灰度值的计算方式为现有技术中常规计算方式，并不局限于上述一种计算方式；且图像的灰度值的计算方式存储于显微镜1的存储器中，并被显微镜1的处理器执行，以获得第一图像的灰度值和第二图像的灰度值。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。第一光束和第二光束的光谱不重叠，光源阵列3可以依次发射第一光束和第二光束，也可以同时发射第一光束和第二光束。
S2、图像获取模块5在显微镜1的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。在光源阵列3依次发射第一光束和第二光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)以及对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)；在光源阵列3发射第一光束和第二光束时，图像获取模块5(彩色相机)对应第一光束和第二光束拍摄一张图像，并从该图像中获取对应第一光束的第一图像以及对应第二光束的第二图像。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例五
实施例五的相差显微成像系统与实施例四的相差显微成像系统的区别在于：彩色相机具有RGBIR感光元件，RGBIR感光元件可以同时记录可见光和红外光信号；第一光束为红外光光束，第二光束为复合光光束或单色光光束。
由于第一光束和第二光束的光谱不重叠，因此，第一光束和第二光束可以依次发射，也可以同时发射。具体如下，
第一光束和第二光束依次发射：在光源阵列3发射第一光束时，图像获取模块5(具有RGBIR感光元件的彩色相机)对应第一光束拍摄一张图像；在光源阵列3发射第二光束时，图像获取模块5(具有RGBIR感光元件的彩色相机)对应第二光束拍摄一张图像。
第一光束和第二光束同时发射：在光源阵列3同时发射第一光束和第二光束时，图像获取模块5(具有RGBIR感光元件的彩色相机)拍摄一张图像，并从该图像中获取对应第一光束的第一图像以及对应第二光束的第二图像。
在本实施例中，优选地，光源阵列3同时发射第一光束和第二光束。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。其中，第一光束为红外光光束，第二光束为复合光光束或单色光光束；光源阵列3可以同时发射第一光束和第二光束，也可以依次发射第一光束和所述第二光束。
S2、图像获取模块5在显微镜2的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。在光源阵列3依次发射第一光束和第二光束时，图像获取模块5(具有RGBIR感光元件的彩色相机)对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)以及对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)；在光源阵列3发射第一光束和第二光束时，图像获取模块5(具有RGBIR感光元件的彩色相机)对应第一光束和第二光束拍摄一张图像，并从该图像中获取对应第一光束的第一图像以及对应第二光束的第二图像。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例六
请参阅图5，实施例六的相差显微成像系统与实施例三的相差显微成像系统的区别在于：图像获取模块5包括第一相机51、第二相机53及分光元件55，分光元件55设于显微镜1的像侧，且分光元件55将第一光束和第二光束分成两个光路，其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束，第一相机51和第二相机53分别设置在两个光路上。第一相机51的感光光谱覆盖第一光束的发光光源光谱，第二相机53的感光光谱覆盖第二光束的发光光源光谱。在本实施例中，第一相机51和第二相机53均为单色相机，单色相机获取的图像的像素值即为图像的灰度值。
由于第一光束和第二光束的光谱不重叠，因此，第一光束和第二光束可以依次发射，也可以同时发射。具体如下，
第一光束和第二光束依次发射：在光源阵列3发射第一光束时，分光元件55将第一光束分在第一相机51所在的光路上，第一相机51对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，分光元件55将第二光束分在第二相机53所在的光路上，第二相机53对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。
第一光束和第二光束同时发射：分光元件55将第一光束和第二光束分成两个光路，其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束，第一相机51对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)，第二相机53对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。
在本实施例中，优选地，第一光束和第二光束选用不同波长的单色光光束，光源阵列3同时发射第一光束和第二光束。
由于分光元件55将第一光束和第二光束分成两个光路(其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束)只是一种理想状态，为了获取100％“纯净”的理想波长的光以保证获取图像的质量，因此，在本实施例中，图像获取模块5还包括设于第一相机51与分光元件55之间的第一滤光片57及设于第二相机53与分光元件55之间的第二滤光片59，其中，第一滤光片57用于过滤第二光束的光谱，第二滤光片59用于过滤第一光束的光谱。这样可以保证进入第一相机51的第一光束和进入第二相机53的第二光束更“纯净”。
在本实施例中，分光元件55为二向色镜，如图5所示，二向色镜在45度放置的情况下，将入射光(光谱不重叠的第一光束和第二光束)分成两个光路(其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束)。例如，以第一光束为R原色光束、第二光束为B原色光束及二向色镜为短通二向色镜(短通二向色镜的透光曲线是350nm-550nm)为例，短通二向色镜对B原色光束(波长为460nm)高透；对R原色光束(波长为610nm)高反，从而使得分光元件55将第一光束和第二光束分成两个光路(其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束)。其中，第一滤光片57可以采用中心波长为612nm且带宽为69nm的带通滤光片，该第一滤光片57对611nm的R原色光高透，同时可以进一步过滤掉460nm的B原色光；滤光片59可以采用中心波长为460nm且带宽为80nm的带通滤光片对460nm的B原色光高透，同时可以进一步过滤掉610nm的R原色光。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。
S2、图像获取模块5在显微镜2的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例七
实施例七的相差显微成像系统与实施例六的相差显微成像系统的区别仅在于：第一相机51和第二相机53中至少一方为彩色相机。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。
S2、图像获取模块5在显微镜2的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例八
请参阅图2和图6，实施例八的相差显微成像系统与实施例三的相差显微成像系统的区别在于：图像获取模块5为相机，相机包括第一感光元件5a、第二感光元件5b及分光元件5c，分光元件5c将第一光束和第二光束分成两个光路，其中一光路为所述第一光束，另一光路为所述第二光束，第一感光元件5a和第二感光元件5c分别设置在两个光路上。第一感光元件5a的感光光谱覆盖第一光束的发光光源光谱，第二感光元件5b的感光光谱覆盖第二光束的发光光源光谱。在本实施例中，第一感光元件5a和第二感光元件5b均为黑白感光元件。相机获取的图像的像素值即为图像像素的灰度值。
由于第一光束和第二光束的光谱不重叠，因此，第一光束和第二光束可以依次发射，也可以同时发射。具体如下，
第一光束和第二光束依次发射：在光源阵列3发射第一光束时，分光元件55将第一光束分在第一感光元件5a所在的光路上，第一感光元件5a对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)；在光源阵列3发射第二光束时，分光元件55将第二光束分在第二感光元件5c所在的光路上，第二感光元件5c对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。
第一光束和第二光束同时发射：分光元件55将第一光束和第二光束分成两个光路，其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束，第一感光元件5a对应第一光束拍摄一张图像(即第一图像)，第二感光元件5c对应第二光束拍摄一张图像(即第二图像)。
在本实施例中，优选地，第一光束和第二光束选用不同波长的单色光光束，光源阵列3同时发射第一光束和第二光束。
在本实施例中，分光元件55为分光棱镜，如图6所示，分光元件55对第一光束高透；对第二光束高反，从而使得分光元件55将第一光束和第二光束分成两个光路(其中一光路为第一光束，另一光路为第二光束)。
请参阅图7，本发明还提供一种相差显微成像系统的成像方法，所述成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。
S2、图像获取模块5在显微镜2的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
实施例九
实施例九的相差显微成像系统与实施例八的相差显微成像系统的区别在于：第一感光元件5a和第二感光元件5b中至少一方为彩色感光元件。
请参阅图7，本发明还提供一种上述所述的相差显微成像系统的成像方法，所述成像方法包括以下步骤：
S1、光源阵列3发射关于光轴1A轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜11进入显微镜1。其中，第一光束和第二光束透过样品后与光轴形成有限角度。
S2、图像获取模块5在显微镜2的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像。
S3、计算模块7将第一图像的灰度值与第二图像的灰度值相减并归一化到[0，255]灰度区间获得相差图像。
本发明提供的相差显微成像系统及其成像方法的有益效果在于：光源阵列发射关于光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，第一光束和第二光束透过样品并自物镜进入显微镜，而第一光束和第二光束透过样品后会发生相位变化，相位变化会引起传播方向的局部变化，由于第一光束和第二光束以光轴为对称轴轴对称设置，因此第一光束和第二光束成像后存在对称的相位差，因此，通过图像获取模块在显微镜的像侧获取对应第一光束的第一图像和对应第二光束的第二图像，并通过计算模块对第一图像与第二图像进行相减运算以获得相差图像。这样的相差显微成像系统不仅结构简单且成本低廉，而且使用该相差显微成像系统的成像方法简单易操作。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些改进均属于本发明的保护范围。

Claims (15)

1.一种相差显微成像系统，包括具有光轴的显微镜，所述显微镜包括物镜和载玻片，其特征在于，所述相差显微成像系统还包括：
光源阵列，设置在所述载玻片远离所述物镜的一侧，并用于发射关于所述光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束透过样品并自所述物镜进入所述显微镜，其中，第一光束和第二光束透过样品后与所述光轴形成有限角度；
图像获取模块，设置在所述显微镜的像侧，并用于获取对应所述第一光束的第一图像和对应所述第二光束的第二图像；
计算模块，用于将所述第一图像的灰度值与所述第二图像的灰度值相减，并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。
2.根据权利要求1所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述第一光束和所述第二光束的光谱至少部分重叠，所述光源阵列用于依次发射所述第一光束和所述第二光束。
3.根据权利要求1所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述第一光束和所述第二光束的光谱不重叠，所述光源阵列用于依次发射所述第一光束和所述第二光束。
4.根据权利要求1所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述第一光束和所述第二光束的光谱不重叠，所述光源阵列用于同时发射所述第一光束和所述第二光束。
5.根据权利要求2或3所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述图像获取模块为单色相机。
6.根据权利要求2或3或4所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述图像获取模块为彩色相机。
7.根据权利要求6所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述彩色相机具有RGBIR感光元件，所述第一光束为红外光光束，所述第二光束为复合光光束或单色光光束。
8.根据权利要求3或4所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述图像获取模块包括第一相机、第二相机及分光元件，所述分光元件设于所述显微镜的像侧，且所述分光元件将所述第一光束和所述第二光束分成两个光路，其中一光路为所述第一光束，另一光路为所述第二光束，所述第一相机和所述第二相机分别设置在所述两个光路上。
9.根据权利要求8所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述图像获取模块还包括设于所述第一相机与所述分光元件之间的第一滤光片及设于所述第二相机与所述分光元件之间的第二滤光片，其中，所述第一滤光片用于过滤所述第二光束的光谱，所述第二滤光片用于过滤所述第一光束的光谱。
10.根据权利要求8所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述第一相机和所述第二相机均为单色相机，或者，所述第一相机和所述第二相机中至少一方为彩色相机。
11.根据权利要求3或4所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述图像获取模块为相机，所述相机包括第一感光元件、第二感光元件及分光元件，所述分光元件将所述第一光束和所述第二光束分成两个光路，其中一光路为所述第一光束，另一光路为所述第二光束，所述第一感光元件和所述第二感光元件分别设置在所述两个光路上。
12.根据权利要求11所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述第一感光元件和所述第二感光元件均为黑白感光元件，或者，所述第一感光元件和所述第二感光元件中至少一方为彩色感光元件。
13.根据权利要求1所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述光源阵列包括用于分别发射所述第一光束和所述第二光束的两个光源组，所述光源组包括发光光源，一所述光源组中的所述发光光源与另一所述光源组中的所述发光光源关于所述光轴轴对称设置。
14.根据权利要求1所述的相差显微成像系统，其特征在于，所述光源阵列包括用于分别发射所述第一光束和所述第二光束的两个光源组，所述光源组包括光纤和发光光源，所述发光光源发出的光通过所述光纤传导到所述载玻片上，且一所述光源组中的所述光纤的出射端与另一所述光源组中的所述光纤的出射端关于所述光轴轴对称设置。
15.一种利用权利要求1-14中任一项所述的相差显微成像系统的成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
光源阵列发射关于光轴轴对称设置的第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束透过样品并自物镜进入显微镜，其中，第一光束和第二光束透过样品后与所述光轴形成有限角度；
图像获取模块在所述显微镜的像侧获取对应所述第一光束的第一图像和对应所述第二光束的第二图像；
计算模块将所述第一图像的灰度值与所述第二图像的灰度值相减，并归一化到[0，255]灰度区间以获得相差图像。
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