CN110914674B - 用于量化活生物体的方法和器件以及器件的使用 - Google Patents

Abstract

公开了一种用于量化液体样品(2)中的活生物体(1、4)的方法，所述方法包括以下步骤：·将液体样品(2)引导到腔室(3)中，·分析腔室(3)内的样品(2)的图片以检测在样品中自身移动的生物体(4)的数量，·用处于紫‑蓝色光谱的至少一部分中的光照射样品(2)，同时检测在腔室(3)内的样品中发荧光的生物体(1)的数量，以及·分析腔室(3)内的样品(2)的图片，同时用处于紫‑蓝色光谱的至少一部分中的光照射样品(2)以检测自身移动且发荧光的生物体(1、4)的数量。还公开了用于量化活生物体(1、4)的器件(15)以及器件(15)的使用。

Description

用于量化活生物体的方法和器件以及器件的使用

技术领域

本发明涉及一种用于量化液体样品中的活生物体的方法，所述方法包括将液体样品引导到腔室内并且分析腔室内的样品的图片的步骤。本发明还涉及一种用于量化液体样品中的活生物体的器件以及器件的使用。

背景技术

通常需要检测和量化例如与研究、环境监控等相关的液体样品中的活生物体的数量。例如，与船舶中的压载水相关的，海洋环境保护委员会提出的批准压载水管理系统的指南规定，处理后的压载水每毫升包含10-50μm粒级的至多10个细胞，以及每立方米包含>50μm粒级的至多10个细胞。因此，在这种情况下，需要分析排放压载水。

用于量化液体样品中活生物体数量的一种明显方法是将样品置于显微镜下，并然后手动检测细胞是否存活、手动检测其尺寸以及手动量化相关细胞。然而，这样的过程既耗时又昂贵。

因此，从US 5,093,866A已知，通过在图片检测设备上对通过介质传播的光进行成像以及通过在细胞中诱导荧光并在图片检测设备上对所述光进行成像，产生有关流体介质中的细胞、细菌和颗粒的运动性和其他特征的信息。然而，该方法昂贵且不准确。

因此，本发明的目的在于提供一种经济有效的用于量化液体样品中的活生物体的技术。

发明内容

本发明提供一种用于量化液体样品中的活生物体的方法，所述方法包括以下步骤：

将液体样品引导到腔室中，

分析腔室内的样品的图片，以检测在样品中自身移动的生物体的数量，

用处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射样品，同时检测在腔室内的样品中发荧光的生物体的数量，以及

分析腔室内的样品的图片，同时用处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射样品，以检测自身移动且发荧光的生物体的数量。

例如，任何给定的压载水的水样品将容纳死亡或存活的许多不同的异养和自养生物体，它们能够自身移动或不能自身移动并且在暴露于处于紫-蓝色光谱中的光时能够发荧光或不能发荧光。

在用处于紫-蓝色光谱中的光照射生物体后，可通过生物体的荧光来检测生物体内的叶绿素，并且叶绿素的存在是活的自养细胞的指示，因为叶绿素在细胞受损后会很快消失。同样，应当认识到，能够自身移动的生物体也是活的。

因此，有利的是通过检测能动生物体的专门过程和检测发荧光生物体的另一个专门过程来量化液体样品中的活生物体。然而，某些生物体既是能动的又是发荧光的，并且因此有利的是通过另外检测这些生物体来提高方法的准确性，从而可以实现更好且更有效地量化活生物体。

应当指出，即使以给定顺序列出了方法步骤，权利要求的范围也不限于以该顺序执行的不同方法步骤。例如，检测发荧光的生物体的数量也可以在检测自身移动的生物体之前进行。

在该上下文中，术语“生物体”应被理解为任何种类的异养生物体，诸如浮游动物、原生动物、细菌等，以及任何种类的自养和杂养生物体，诸如浮游植物、蓝细菌等或者任何其他种类的单细胞或多细胞微生物体或微生物。

在该上下文中，术语“腔室”应被理解为在分析液体样品时适合容纳液体样品的任何种类的容器、小杯、空间等。由于在大多数情况下，通过位于腔室外部的装备分析样品，因此如果腔室的一侧或多侧透明是有利的。

此外，在该上下文中，术语“自身移动的生物体”应被理解为任何种类的能动生物体、自走生物体、自移动生物体或具有自发且主动地移动的能力同时在该过程中消耗能量的任何其他种类的生物体。该术语不应与移动性混淆，后者描述了物体移动的能力。

此外，在该上下文中，术语“发荧光的”应被理解为当吸收了光或其他电磁辐射时能够发光的生物体。即，当这些生物体暴露于一种波长下的光时，它们或多或少会瞬时发出通常在另一种波长下的光。荧光是一种发光形式，并且当辐射源停止时，发荧光生物体立即停止发光，这与磷光不同，其是在辐射停止后继续发光一段时间。这类生物体也称为自发荧光生物体。

在本发明的方面中，通过分析腔室内的样品的一张或多张图片来检测发荧光生物体的数量。

如先前所解释的，活的发荧光生物体在暴露于处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光时会发亮。因此，在该曝光期间拍照可以使活的发荧光生物体易于识别和计数。

在本发明的方面中，通过滤光器记录图片，所述滤光器被布置为阻挡或衰减处于紫-蓝色光谱的至少所述部分中的光。

处于紫-蓝色光谱中的光也将被其他生物体反射、散射、折射等，水本身将使光折射，并且光将被样品中的其他物体等反射。因此，为了减少噪声并实现更准确的量化，有利的是通过滤光器记录图片，所述滤光器被布置为阻挡或衰减处于紫-蓝色光谱中的光，从而可以更精确地检测到来自发荧光生物体的光。

在本发明的方面中，滤光器被布置为阻挡或衰减在低于650nm、优选地低于600nm并且最优选地低于550nm波长下的光。

如果滤光器被布置为阻挡或衰减低于太高波长下的光，则滤光器将阻挡太多的光，并且如果滤光器被布置为阻挡或衰减低于太低波长下的光，则滤光器的效果将降低。因此，当前的波长水平在功能上是有利的。

在本发明的方面中，在照射样品的同时，记录用于检测自身移动的生物体的数量的图片。

通过照射样品，同时记录用于检测能动生物体的图片，将更容易检测生物体及其运动。

在本发明的方面中，在用次级光源照射样品的同时，记录用于检测自身移动的生物体的数量的图片，所述次级光源不同于产生处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光的光源。

用次级光源照射样品同时记录用于检测能动生物体的图片的优点在于，由此可以提供更适合于给定任务的照明。

在本发明的方面中，在记录用于检测发荧光的生物体的数量的图片的同时，关闭次级光源。

关闭次级光源同时检测发荧光生物体的优点在于，由此降低了次级光干扰发荧光生物体的检测的风险。

在本发明的方面中，通过白光照射样品。

用全光谱白光(例如还包含紫外光和/或红外光)照射样品同时检测能动生物体的优点在于，它可以提供更好和更对比的图片。

在本发明的一方面中，方法进一步包括以下步骤：将图片中的至少一些存储在存储器件上。

将图片中的至少一些存储在存储器件(诸如ROM、闪存驱动器、硬盘驱动器等)上的优点在于，可以由此验证和追踪量化。

在本发明的方面中，方法进一步包括以下步骤：分析用于检测自身移动的生物体的数量的图片，以检测自身移动的生物体的尺寸。

根据一些规定，给定的液体体积必须只能包含某一尺寸以上、某一尺寸以下或某一尺寸范围内的一定数量的活生物体。因此，有利的是还检测能动生物体的尺寸。

在本发明的方面中，方法进一步包括以下步骤：检测样品中的发荧光生物体的尺寸。

根据一些规定，给定的液体体积必须只能包含某一尺寸以上、某一尺寸以下或某一尺寸范围内的一定数量的活生物体。因此，有利的是还检测发荧光生物体的尺寸。

在本发明的方面中，发荧光的生物体是自发荧光生物体。

可以通过例如荧光基团的方式使生物体发荧光，但是荧光基团的处理及其对生物体的影响通常是有问题的。诸如，染色过程需要时间，因此增加了成本，并且有时生物体将不会吸收荧光基团，并且因此将不会检测到这些生物体。此外，添加的荧光基团还经常在液体中诱导荧光且从而也降低了准确性。因此，仅检测自发荧光生物体是有利的。

在本发明的方面中，紫-蓝色光谱的部分是在100nm与600nm之间、优选地在300nm与470nm之间并且最优选地在400nm与440nm之间的波长下的光。

如果紫-蓝色光的波长范围太宽，则与荧光波长一致的光的风险增加，并且如果紫-蓝色光的波长范围太窄，则未激发生物体中的荧光作用的风险增加。因此，当前的波长范围呈现出相对于功能的有利关系。

在本发明的方面中，方法进一步包括以下步骤：当已经检测到自身移动的生物体的数量并且已经检测到发荧光的生物体的数量时，将液体样品引导出腔室。

在已经检测到能动且发荧光的生物体之后将液体样品引导出腔室的优点在于，由此腔可以再用于另一测试。

在本发明的方面中，方法进一步包括以下步骤：在检测到自身移动的生物体的数量之前，使所述液体样品沉降在腔室内。

通过在图片序列中检测能动生物体的位置来检测能动生物体，并且如果将样品引导到腔室后不允许样品沉降-在检测能动生物体之前，则准确性降低。

在本发明的方面中，分析图片以通过运动追踪的方式来检测在样品中自身移动的生物体的数量。

在样品的后续图像中追踪特定生物体的位置提供了一种简单且高效的用于检测能动生物体的方法。运动追踪也称为运动分析、运动捕获等。

在本发明的方面中，通过在检测发荧光的生物体的数量的同时检测自身移动的生物体的数量，来识别自身移动且发荧光的生物体的数量。

此外，对发荧光生物体执行运动追踪是一种简单且快速的检测自身移动且发荧光的生物体的方法。

在本发明的方面中，通过将检测到的自身移动的生物体的数量与检测到的发荧光的生物体的数量相加而得到中间结果，并且然后从中间结果减去检测到的自身移动且发荧光的生物体的数量，来量化液体样品中的活生物体。

从在运动性测试期间检测到的生物体总数以及在荧光测试期间检测到的生物体总数中减去能动且发荧光的生物体的优点在于，由此可以避免重复体并且可以得到更准确数量的活生物体。

在本发明的方面中，作为两个独立的连续动作执行以下：分析腔室内的样品的图片以检测在样品中自身移动的生物体的数量的方法步骤；以及用处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射样品，同时检测在腔室内的样品中发荧光的生物体的数量的方法步骤。

检测能动生物体的过程与检测发荧光生物体的过程分开地执行的优点在于，由此可以在能够更好和/或更有效地执行每个过程的条件下(诸如照明条件、摄像机帧速和/或分辨率、滤光器等)执行每个过程。

在本发明的方面中，检测发荧光生物体以及检测自身移动且发荧光的生物体的数量在基本上相同的过程中进行。

检测发荧光生物体，同时还检测能动且发荧光的生物体提供了一种更快且更有效的方法。

本发明进一步提供一种用于量化液体样品中的活生物体的器件。该器件包括用于容纳样品的腔室，以及用于将样品引导到腔室中的引导装置。器件进一步包括被布置为记录腔室内的样品的图片的摄像机，以及被布置为分析图片以计数样品中的自身移动的生物体的数量的分析装置。器件还包括被布置为用处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射样品的紫-蓝色光源，以及被布置为计数在腔室内的样品中发荧光的生物体的数量的检测装置。此外，器件包括被布置为识别自身移动且发荧光的生物体的数量的识别装置。

形成器件使得其可以检测能动生物体、发荧光生物体以及能动且发荧光的生物体的优点在于，由此可以以简单且经济有效的方式相对准确地量化样品中的活生物体的数量。

在该上下文中，术语“引导装置”应被理解为例如与能够将液体样品引导到腔室中的一个或多个泵和/或阀关联的任何种类的导管、管、通道等。

此外，在该上下文中，术语“分析装置”应该被理解为任何种类的图片识别系统、视觉系统、视觉传感器系统、运动追踪系统(例如包括PC)，或者适合于分析液体样品的图片以计数在液体样品中自身移动的生物体的数量的任何其他种类的分析仪。

此外，在该上下文中，术语“检测装置”应被理解为任何种类的图片识别系统、视觉系统、视觉传感器系统，或者适合于计数在腔室内的液体样品中发荧光的生物体的数量的任何其他种类的检测器。

进一步地，在该上下文中，术语“识别装置”应被理解为任何种类的个人计算机、逻辑电路、电子计算系统(例如包括某种类型的数据存储设施)，或者适合于识别液体样品中自身移动且发荧光的生物体的数量的任何其他种类的识别器。

在本发明的方面中，器件进一步包括滤光器，所述滤光器包括阻挡或衰减处于紫-蓝色光谱的至少所述部分中的光的装置。

通过阻挡或衰减处于紫-蓝色光谱的至少所述部分中的光，可以更准确地检测发荧光生物体。

在本发明的方面中，滤光器被布置在摄像机和腔室之间。

由此实现本发明的有利实施例。

在本发明的方面中，引导装置包括泵。

将引导装置形成为具有至少一个泵的优点在于，由此可以快速且有效地将样品引导到腔室。

在本发明的方面中，器件包括控制装置，所述控制装置被布置为响应于检测装置来控制紫-蓝色光源。

响应于检测装置来控制紫-蓝色光源是有利的，因为由此可以控制紫-蓝色光源仅在检测装置处于活动状态时才亮起，从而降低了紫-蓝色光对生物体造成伤害的风险。

在本发明的方面中，器件包括次级光源。

为装置提供次级光源的优点在于，由此可以用具有其他特性(例如，更适合于运动追踪)的光照射样品。

在本发明的方面中，器件包括控制装置，所述控制装置被布置为响应于分析装置来控制次级光源、紫-蓝色光源和/或检测装置。

提供被布置为响应于分析装置来控制光源和/或检测装置的控制装置的优点在于，其实现更快且有效地计数在样品中自身移动的生物体。

在本发明的方面中，识别装置包括用于同时检测自身移动且发荧光的生物体的装置。

提供用于同时检测自身移动且发荧光的生物体的识别装置的优点在于，其实现快速且有效的检测。

在本发明的方面中，器件进一步包括量化装置，所述量化装置被布置为将检测到的自身移动的生物体的数量与检测到的发荧光的生物体的数量相加，并且减去识别装置识别的数量。

从分析装置和检测装置检测到的生物体的总数中减去识别装置识别的生物体的优点在于，由此可以避免重复体并且可以得到更准确数量的活生物体。

在该上下文中，术语“量化装置”应该被理解为任何种类的个人计算机、逻辑电路、电子计算系统(例如包括某种类型的数据存储设施)，或者适合于将检测到的自身移动的生物体数量与检测到的发荧光的生物体的数量相加并减去识别装置识别的生物体的数量的任何其他种类的量化器。

在本发明的方面中，根据摄像机和/或光学器件的视场来成形腔室。

形成腔室以使得腔室的至少一些侧面对应于摄像机和/或光学器件的视场的扩展的优点在于，这将使得能够通过摄像机看到腔室内的基本上整个样品，从而可以一次测试整个样品。

在本发明的方面中，通过根据先前讨论的方法中的任一种的方法来量化活生物体。

此外，本发明提供了根据先前描述的器件中任一个的器件用途，用于量化船舶的压载水的液体样品中的活生物体。

压载水通常包含许多不同类型和尺寸的生物体，并且因此通过根据本发明的器件来量化压载水中的活生物体是特别有利的。

附图说明

下面将参考附图描述本发明，在附图中

图1示出了从顶部观察的用于量化液体样品中的活生物体的器件的简化实施例，

图2示出了从侧面观察的检测发荧光生物体的器件，

图3示出了从侧面观察的检测能动生物体的器件，以及

图4示出了从侧面观察的腔室的特殊实施例。

具体实施方式

图1示出了从顶部观察的用于量化液体样品2中的活生物体1、4的器件15的简化实施例。

在该实施例中，器件包括液体容器17，在所述液体容器中填充特定量的待测试液体。然而，在另一个实施例中，可以直接从来源(即水箱、湖泊、海洋或将要控制的其他来源)抽取液体。

通过引导装置9从液体容器17将液体引导到腔室3，在该实施例中，所述引导装置9包括确保腔室3的快速且有效填充的管道和泵。在当前图示中，腔室3相对于液体容器17的尺寸是不正确的。在优选实施例中，液体容器17的体积比腔室3的体积大许多倍。

在该实施例中，首先在腔室3中通过产生白光的次级光源6照射液体样品2，同时摄像机10正在记录由分析装置11“即时”分析的多个连续图片以检测并计数样品中的能动生物体4的数量。然而，在另一个实施例中，次级光源6可以是另一种类型，或者可以省略次级光源6，并且可以在自然光(即日光)下执行运动追踪。

一旦该运动检测结束，则在摄像机10正在记录由检测装置12“即时”分析的至少一张图片的同时，关闭次级光源6并打开被布置为发射处于紫-蓝色光谱的光的紫-蓝色光源7，所述检测装置12检测并计数样品2中发荧光的生物体1的数量。然而，在另一个实施例中，检测能动生物体4以及检测发荧光生物体1可以以相反的顺序进行。

在该实施例中，器件15还包括识别装置13，所述识别装置13被布置为在关闭次级光源6并打开紫-蓝色光源7的同时，通过对发荧光生物体1执行运动追踪来识别能动且发荧光的生物体1、4的数量，即，在该实施例中，与检测发荧光生物体1基本上同时进行。然而，在另一个实施例中，用于检测和计数能动且发荧光的生物体1、4的过程可以相对于检测和计数在样品2中发荧光的生物体1的数量的过程，作为单独且连续的过程以任何顺序进行。

在该实施例中，紫-蓝色光源7是能够发射具有380-450纳米波长的强光的LED。然而，在另一个实施例中，紫-蓝色光源7的波长范围可以更窄或至少更宽一些，和/或光源可以是另一种类型，诸如白炽灯泡、氖管等，和/或器件15可以包括多于一个紫-蓝色光源7。

同样地，在该实施例中，次级光源6是能够发射具有380和760纳米之间的整个可见光谱内的波长的强白光的LED。然而，在另一个实施例中，次级光源6的波长范围可以更窄，或者它可以包括红外范围、紫外范围和/或其他范围中的至少一些，和/或光源6可以是另一种类型，诸如白炽灯泡、氖管等，和/或器件15可以包括多于一个次级光源6。

在该实施例中，器件15还包括量化装置14，所述量化装置14被布置为通过将检测到的自身移动的生物体4的数量与检测到的发荧光的生物体1的数量相加，并且然后减去识别装置13识别的数量，来量化液体样品中的活生物体1、4。

在该实施例中，引导装置9还包括管道和泵，所述管道和泵被布置为当已经量化活生物体1、4时将液体样品2引导出腔室3。

在该实施例中，器件15还包括控制装置16，所述控制装置16被布置为响应于摄像机10和分析装置11、检测装置12、识别装置13、量化装置14来控制紫-蓝色光源7、次级光源6以及引导装置9的泵。即，在该实施例中，由控制装置16控制基本上整个量化过程，但是在另一个实施例中，过程中的一些将是自主的和/或它们将相互控制，和/或控制将被分到若干个控制装置16上，和/或过程中的至少一些将是手动控制的。

在该实施例中，分析装置11、检测装置12、识别装置13、量化装置14和控制装置16全部通过计算机来启用，即，呈在连接到摄像机10、引导装置9和光源6、7的计算机上运行的一个或多个软件程序的形式。然而，在另一个实施例中，分析装置11、检测装置12、识别装置13、量化装置14和控制装置16执行的过程中的至少一些可以通过其他电子器件启用，例如分析装置11、检测装置12和/或识别装置13可以由集成在摄像机10中的处理器启用，以实现更快且更有效的分析，和/或引导装置9和光源6、7的操作可以由图1中所示的单独开关箱控制。

此外，在另一个实施例中，例如，如果分析装置11、检测装置12、识别装置13、量化装置14被布置为相对于摄像机10遥远，则将不即时分析图片中的至少一些，而是存储并随后分析。

本方法涉及使用适当尺寸的光学器件18在光学腔室3中观察生物体1、4。在该实施例中，10μm-50μm生物体1、4的部分将需要使用1600×1200像素的高分辨率摄像机10的2倍放大。典型的摄像机10具有4.4μm的像素尺寸，这意味着每个像素跨度大约为2.2μm，并且视场为3.5mm×2.6mm。通过选择孔径可以将景深设置为0.7mm，并且这样得到6μl的腔室容积。检测极限是单个细胞1、4，并且统计结果取决于腔室容积的分析次数。用于观察>50μm的生物体部分的光学腔室3的尺寸大约为70mm×50mm×20mm(长×宽×高)，从而得到70ml的腔室容积。使用与上述相同的摄像机分辨率，像素尺寸为40μm，并且检测极限也为单个细胞1、4。为了检测低至10/m³的浓度，通过50μm掩模(未示出)进行过滤以实现1000倍的浓度可能是有利的，但是本方法仍然实现测试未过滤的样品2。对于两种尺寸部分，可以从同一样品3中分析多个腔室容积，以提供统计上更准确的结果。即，在本发明的实施例中，较小生物体1、4的量化将在较小腔室3中执行，并且较大生物体1、4的量化将在较大腔室3中执行。

大多数异养细胞1、4以及几乎所有鞭毛虫和纤毛虫都是能动的。该观察结果适用于两种尺寸部分。在该实施例中，通过连接摄像机10的计算机11、12、13、14，以每秒10至25帧的时基实时地分析腔室3的内容物。分析每个帧并检测和测量各个细胞1、4。通过计算机11、12、13、14随着时间的推移逐帧地追踪每个细胞的移动。通过这种方式，可以确定每个细胞1、4是否在尺寸范围内以及是能动的还是不是能动的。在该实施例中，序列也作为视频文件保存在计算机硬盘驱动器上，以用于后续文档。

一些自养细胞1、4含有叶绿素并且是非能动的，而一些自养细胞含有叶绿素并且也是能动的。单独存在的叶绿素是活的自养细胞的指示，因为叶绿素在细胞受损后会很快消失。在该实施例中，在用波长大约为420ηm的紫光刺激生物体1之后，通过观察荧光来检测细胞1、4内的叶绿素。在腔室3和摄像机10之间插入大约>500ηm的高通滤波器形式的滤光器5意味着通过摄像机10基本上仅观察到荧光。叶绿素均匀地分布在整个细胞1中，使得细胞尺寸可以由叶绿素细胞器的整体尺寸来确定，所述叶绿素细胞器相互融合形成单个发荧光物体。>50μm的自养菌种相对较少，因此该方法与10-50μm部分最相关。该方法还通过对发荧光生物体1执行运动追踪来允许检测仍处于黑暗背景下的细胞并确定其尺寸，以及检测能动发荧光细胞1。

根据不同国家的不同规定，需要分析一定量的液体(即若干个样品)，以提供相对于液体总量更高的统计确定性。为了实现这一点，在该实施例中，引导装置9设置有泵，所述泵位于液体容器17(例如，含有总量的待测液体)与腔室3之间，以便快速且有效地填充腔室3，以及再次在出口19处以从腔室3快速且有效地排出测试的样品。

在该实施例中，样品流与分析之间的同步通过由计算机启用的控制装置16执行。

系统15可以检测单个细胞1、4，但是测量的准确性取决于：

腔室3的体积

对于给定液体量分析的腔室3的数量

应检测的生物体1、4的浓度

在该实施例中，针对10-50μm部分的分析类似于泊松过程(Poisson process)，其中从较大的体积中随机抽取小体积，并且每个腔室中预期的生物体1、4的数量至多为一个。针对10-50μm部分的每个小体积，实际的腔室分析次数在50左右，在这种情况下，假设腔室体积为6μl，则测量规格为10±10(±100％)，其置信度为95％。在每个小体积较大的腔室尺寸(以及较高分辨率的摄像头10和光学器件18)和/或较高分析次数的情况下，该准确性得到改进。作为示例，将腔室容积增加5倍并且将分析次数增加2倍，得出10±32％的测量规格，其置信度为95％。所有统计估计值均基于其中单个体积测量中的检测概率为C.V的模拟，其中C为生物体浓度并且V为体积。随后基于给定数量的体积上随机生成的检测事件进行模拟。然后，将每个模拟重复1000次或更多次，以呈现可以找到95％置信区间的分布。

可以针对>50μm部分分析一升或更多的液体。在每次填充和后续分析之间完全排空腔室3，因此实际上是分析了一升液体的全部体积。与较小部分的统计结果相比，这得到了不同的统计结果，并且准确性更多地取决于如何收集和过滤样品。希望通过50μm的过滤器将1m³的液体体积浓缩1000倍。过滤还将通过光学系统提高准确性，因为在该实施例中的分辨率使得小于50μm的细胞1、4(其将以其他方式存在)可以被检测到但是不能被准确地测量。

图2示出了从侧面观察的检测发荧光生物体1的器件15。

在该实施例中，用紫-蓝色光源7照射腔室3内的样品2，使得发荧光生物体1将发光并发射通常在600-800nm之间的波长下的光。

因此，在该实施例中，器件15还设置有滤光器5，所述滤光器5被设计为基本上阻挡低于500nm的波长的光，并且摄像机10因此将基本上仅看到样品2中发荧光生物体1，从而使得易于量化这些生物体1，这是因为基本上已经清除了所有噪音。

如果仅检测到发荧光生物体1，则原则上用摄像机拍摄单张图片是足够的，因为可以通过简单地计数图片上发光点的数量来检测活的发荧光生物体1的数量。然而，在该实施例中，还必须检测能动且发荧光的生物体1、4的数量，因此，在该实施例中，摄像机10将继续记录，使得还可以识别通过其自身运动而移动的发荧光生物体1、4。

图3示出了从侧面观察的检测能动生物体4的器件15。

在该实施例中，已经关闭了紫-蓝色光源7并且现在用次级光源6照射腔室3内的样品2，使得可以通过摄像机10看到样品中的基本上所有生物体1、4(至少所有特定尺寸内的生物体4)，从而对后续图像的分析将使得能够识别活的能动生物体4的数量。

图4示出了从侧面观察的腔室3的特殊实施例。

例如，关于压载水中的生物体1、4的量化，根据一些国家的一些规定，例如要求抽取一定百分比体积或固定体积(例如1立方米)，并且然后必须测试全部这些百分比体积或固定体积，以确定/估计整个体积中的活生物体1、4的数量。这可能存在问题，因为将要检测的能动生物体4中的一些将趋向于寻找腔室3的边缘，在这里摄像机10可能无法检测它们。

因此，根据本发明的实施例，根据摄像机10和光学器件18的视场的扩展来成形腔室3。即，在该实施例中，腔室3的侧面形成为倾斜，以便非常精确地与当前摄像机10和光学器件18设计的视场对应。

上文已经参考腔室3、光源6、7、用于量化活生物体的器件15等的具体示例对本发明进行了举例说明。然而，应当理解，本发明不限于上述特定示例，而是可以在如权利要求书所指定的本发明的范围内以多种变型来设计和改变。

列表

1、发荧光生物体

2、液体样品

3、腔室

4、能动生物体

5、滤光器

6、次级光源

7、紫-蓝色光源

8、存储器件

9、引导装置

10、摄像机

11、分析装置

12、检测装置

13、识别装置

14、量化装置

15、用于量化活生物体的器件

16、控制装置

17、液体容器

18、光学器件

19、出口

Claims (30)

1.一种用于量化液体样品(2)中的活生物体的方法，所述方法包括以下步骤：

将所述液体样品(2)引导到腔室(3)中，

分析所述腔室(3)内的所述液体样品(2)的图片，以检测在所述液体样品(2)中自身移动的能动生物体(4)的数量，

用处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射所述液体样品(2)，同时检测在所述腔室(3)内的所述液体样品(2)中发荧光的荧光生物体(1)的数量，其中通过分析所述腔室(3)内的所述液体样品(2)的一张或多张图片来检测所述荧光生物体(1)的数量，通过滤光器(5)记录所述一张或多张图片，所述滤光器(5)被布置为阻挡或衰减处于所述紫-蓝色光谱的至少所述部分中的光，以及

分析所述腔室(3)内的所述液体样品(2)的图片，同时用处于所述紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射所述液体样品(2)，以检测自身移动且发荧光的生物体的数量，

通过将所述检测到的自身移动的能动生物体(4)的数量与所述检测到的发荧光的荧光生物体(1)的数量相加而得到中间结果，并且然后从所述中间结果减去所述检测到的自身移动且发荧光的生物体的数量，来量化所述液体样品(2)中的所述活生物体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述滤光器(5)被布置为阻挡或衰减在低于650nm波长下的光。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述滤光器(5)被布置为阻挡或衰减在低于600nm波长下的光。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述滤光器(5)被布置为阻挡或衰减在低于 550nm波长下的光。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在照射所述液体样品的同时，记录用于检测自身移动的能动生物体(4)的数量的所述图片。

6.根据权利要求1所述的方法，其中在用次级光源(6)照射所述液体样品(2)的同时，记录用于检测自身移动的能动生物体(4)的数量的所述图片，所述次级光源(6)不同于产生处于所述紫-蓝色光谱的至少一部分中的光的紫-蓝色光源(7)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中在记录用于检测荧光生物体(1)的数量的所述图片的同时，关闭所述次级光源(6)。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中通过白光照射所述液体样品(2)。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：将所述图片中的至少一些存储在存储器件(8)上。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：分析用于检测自身移动的能动生物体(4)的数量的所述图片，以检测自身移动的所述能动生物体(4)的尺寸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：检测所述液体样品(2)中的所述荧光生物体(1)的尺寸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中发荧光的所述荧光生物体(1)是自发荧光生物体。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述紫-蓝色光谱的所述部分是在100nm与600nm之间的波长下的光。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述紫-蓝色光谱的所述部分是在300nm与470nm之间的波长下的光。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述紫-蓝色光谱的所述部分是在400nm与440nm之间的波长下的光。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：当已经检测到所述自身移动的能动生物体(4)的数量并且已经检测到所述发荧光的荧光生物体(1)的数量时，将所述液体样品(2)引导出所述腔室(3)。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤：在检测到所述自身移动的能动生物体(4)的数量之前，使所述液体样品(2)沉降在所述腔室(3)内。

18.根据权利要求1所述的方法，其中分析所述图片以通过运动追踪的方式来检测在所述液体样品(2)中自身移动的能动生物体(4)的数量。

19.根据权利要求1所述的方法，其中通过在检测所述液体样品(2)中所述发荧光的荧光生物体(1)的数量的同时检测自身移动的能动生物体(4)的数量，来识别所述自身移动且发荧光的生物体。

20.根据权利要求1所述的方法，其中作为两个独立的连续动作执行以下：分析所述腔室(3)内的所述液体样品(2)的图片以检测在所述液体样品(2)中自身移动的能动生物体(4)的数量的所述方法步骤；以及用处于所述紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射所述液体样品(2)，同时检测在所述腔室(3)内的所述液体样品(2)中发荧光的荧光生物体(1)的数量的所述方法步骤。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光生物体(1)的所述检测以及所述自身移动且发荧光的生物体的数量的所述检测在基本上相同的过程中进行。

22.一种用于量化液体样品(2)中的活生物体的器件(15)，所述器件(15)包括：

腔室(3)，用于容纳所述液体样品(2)，

引导装置(9)，用于将所述液体样品(2)引导到所述腔室(3)中，

摄像机(10)，被布置为记录所述腔室(3)内的所述液体样品(2)的图片，

分析装置(11)，被布置为分析所述图片以计数在所述液体样品(2)中自身移动的能动生物体(4)的数量，

紫-蓝色光源(7)，被布置为用处于紫-蓝色光谱的至少一部分中的光照射所述样品(2)，

检测装置(12)，被布置为计数在所述腔室(3)内的所述液体样品(2)中发荧光的荧光生物体(1)的数量，

识别装置(13)，被布置为识别自身移动且发荧光的生物体的数量，

所述器件进一步包括量化装置(14)，所述量化装置(14)被布置为将所述检测到的自身移动的能动生物体(4)的数量与所述检测到的发荧光的荧光生物体(1)的数量相加，并且减去所述识别装置(13)识别的所述数量；

所述器件(15)进一步包括滤光器(5)，所述滤光器(5)包括用于阻挡或衰减处于所述紫-蓝色光谱的至少所述部分中的光的装置。

23.根据权利要求22所述的器件(15)，其中所述滤光器(5)被布置在所述摄像机(10)和所述腔室(3)之间。

24.根据权利要求22至23中任一项所述的器件(15)，其中所述引导装置(9)包括泵。

25.根据权利要求22所述的器件(15)，其中所述器件(15)包括控制装置(16)，所述控制装置(16)被布置为响应于所述检测装置(12)来控制所述紫-蓝色光源(7)。

26.根据权利要求22所述的器件(15)，其中所述器件(15)包括次级光源(6)。

27.根据权利要求26所述的器件(15)，其中所述器件(15)包括控制装置(16)，所述控制装置(16)被布置为响应于所述分析装置(11)控制所述次级光源(6)、所述紫-蓝色光源(7)和/或所述检测装置(12)。

28.根据权利要求22所述的器件(15)，其中所述识别装置(13)包括用于同时检测自身移动且发荧光的生物体的装置。

29.根据权利要求22所述的器件(15)，其中通过根据权利要求1至18中任一项所述的方法来量化所述活生物体。

30.根据权利要求22至29中任一项所述的器件(15)的用途，用于量化船舶的压载水的液体样品(2)中的活生物体。

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