CN110914447A - 包括水性样品稳定化的测定执行系统 - Google Patents

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Abstract

测定执行系统可包括配置成储存水性样品板、进行水性样品的液滴产生或乳化以及执行热循环和液滴读取功能的模块。在热循环之前，可将一种或多种样品乳化并以乳化状态储存较长的时间。相应地，测定执行系统可包括材料运送系统和适应储存功能的方法。

Description

包括水性样品稳定化的测定执行系统
交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2017年1月26日提交的美国临时申请序列号第62/451,004号的权益，出于所有目的，该申请的全部内容以参考的方式纳入本文。
出于所有目的，以下相关申请和材料全部纳入本文：美国专利第7,041,481号；美国专利第9,089,844号；美国专利第9,156,010号；2010年7月8日公布的美国专利申请公布第2010/0173394 A1号；2012年7月26日公布的美国专利申请公布第2012/0190032 A1号；2012年8月2日公布的美国专利申请公布第2012/0194805 A1号；2012年6月21日公布的美国专利申请公布第2012/0152369 A1号；以及Joseph R.Lakowicz的PRINCIPLES OFFLUORESCENCE SPECTROSCOPY(荧光光谱原理)(1999年第2版)。
背景技术
许多生物医学应用依赖于与试剂联合的样品的高通量测定。例如，在研究和临床应用中，使用靶标特异性试剂的高通量遗传测试可提供与用于药物发现、生物标志物发现和临床诊断等的样品有关的高质量信息。作为另一示例，感染病检测通常需要就多重遗传靶标筛选样品，以产生高可信度结果。
趋势是趋于减小的体积以及检测更多靶标。但是，创建和混合更小的体积可能需要更复杂的仪器，这会增加成本。因此，需要改进的技术以允许以更高的速度、更低的成本和/或减小的仪器复杂度来测试更多数量的样品以及样品与试剂的组合。
乳液使得高通量测定的革新具有很大前景。乳化技术可以产生数十亿个水性液滴，其作用为用于生化反应的独立反应室。例如，可以将水性样品(例如，200微升)划分成多个液滴(例如，各50皮升的四百万个液滴)，以允许以大规模高通量方式离散研究、处理以及操纵个体亚组分(例如，细胞、核酸、蛋白质)。
将样品分成多个液滴提供了许多优点。可以使用小的反应体积(皮升至纳升)，从而通过提高反应速率并形成更浓缩的产物来允许更早的检测。此外，与在微升规模上执行的常规大块体积反应相比，可以对样品进行数量多得多的独立测量(数千至数百万)。因此，可以更准确地(即，相同测试的更多重复)并且更深入地(即，更多数量的不同测试)分析样品。此外，小的反应体积使用较少的试剂，从而降低了每次测试耗材的成本。此外，微流体技术可以提供对用于产生、混合、孵育、分裂、分选和检测液滴的过程的控制，以实现可重复的基于液滴的测量。
可将水性液滴悬浮在油中以产生油包水乳液(W/O)。可以借助表面活性剂来稳定乳液，以减少或防止在加热、冷却和输送期间液滴的聚结，从而使得能够执行热循环。因此，乳液已用于通过使用聚合酶链式反应(PCR)进行液滴中核酸靶标分子的单拷贝扩增。
乳液液滴中核酸靶标的单分子的区室化减轻了在较大样品体积扩增中遇到的问题。具体而言，液滴可以促进来自含有复杂异源性核酸群的样品的靶标的更有效且均一的扩增，这是因为每个液滴中的样品复杂度降低。可以通过液滴区室化来使导致大块体积扩增偏差的因素的影响最小化，这些因素比如是扩增效率、G+C含量和扩增子退火。无偏差扩增对于检测稀有物质(比如病原体或癌细胞)可能是至关重要的，这些稀有物种的存在可能被复杂临床样品中的高浓度背景物质所掩盖。
尽管它们具有吸引力，但基于乳液的测定对高通量测试提出了技术挑战，其可能需要创建数十、数百、数千甚至数百万个体样品和样品/试剂组合。因此，需要用于液滴的产生、混合、孵育、分裂、分选和检测的改进技术。在等待处理的同时，水性样品的长时间储存可能导致不太理想的反应稳定性。因此，需要包括改进样品稳定化的方法和系统。
发明内容
本公开提供了与包括水性样品稳定化的测定执行系统相关的系统、装置和方法。
特征、功能和优点可在本公开的各种实施例中独立地实现，或者可以在其他实施例中组合，其进一步的细节可参考以下描述和附图看出。
附图说明
图1是流程图，列出了根据本公开的各方面可在使用基于液滴的测定的样品分析方法中执行的示意性步骤。
图2是用于执行图1的测定的示例性系统的示意图。
图3是根据本公开的各方面适用于执行测定的示意性测定执行系统的轴测图，其包括水性样品稳定化。
图4是流程图，示出了根据本公开的各方面用于执行测定的示意性方法的各步骤，其包括样品稳定化。
图5是在室温下以液滴(分图A)或大块体积(分图B)形式储存20小时的样品上采集的扩增数据的图。
图6是在转化成液滴然后立即热循环(分图A)或在室温下储存20小时然后热循环(分图B)的样品上采集的扩增数据的图。
具体实施方式
包括水性样品稳定化的测定执行系统的各个方面和示例以及相关方法在下文中描述并在相关联的附图中示出。如下文所描述的，一些或全部测定执行系统可能是自动化的。除非另有说明，否则根据本公开的各方面的测定执行系统和/或其各种部件可以但不需要包含本文中所描述、所示出和/或所纳入的结构、部件、功能和/或变型例中的至少一者。此外，结合本教导，本文中所描述、所示出和/或所纳入的处理步骤、结构、部件、功能和/或变型例可以但不需要被包括在其他类似的测定执行系统和方法中。以下对各种示例的描述本质上仅是示意性的，而决不旨在限制本公开、其应用或用途。此外，由下面描述的示例和实施例提供的优点本质上是示意性的，且并非所有示例和实施例都提供相同的优点或相同程度的优点。
该具体实施方式部分包括紧接于此的以下部分：(1)定义；(2)概述；(3)示例、部件和替代方式；(4)示意性组合和附加示例；(5)优点、特征和益处；以及(6)总结。示例、部件和替代方式部分进一步分为A至F小节，每个小节都被相应地标记。
定义
除非另有说明，否则以下定义适用于本文。
“基本上”表示或多或少地符合由该术语修饰的特定尺寸、范围、形状、概念或其他方面，符合的程度是特征或部件不需要精确地符合。例如，“基本上圆柱形”的物体表示物体类似于圆柱体，但是可具有与真实圆柱体的一项或多项偏差。
“包括”、“包含”和“具有”(及其变形)可互换地用来表示包括但不必限于，并且它们是开放式术语，其并不旨在排除额外的未列举的元件或方法步骤。
诸如“第一”、“第二”和“第三”之类的术语用于区分或识别组之类概念中的各种成员，并且不旨在表示连续或数字的限制。
“联接”表示永久或可释放地连接，而无论是直接连接还是通过中介部件间接连接。
“AKA”表示“也称为”，并且可以用于表示对于给定的一个或多个元件的替代或对应术语。
本公开中使用的技术术语具有本领域技术人员普遍认识的含义。但是，以下术语可能具有额外的含义，如下所述。
乳液：包括液滴的组合物，所述液滴处于同为液态的不混溶的载体流体中。载体流体、也称为背景流体形成连续相，其可以称为载体相、载体和/或背景相。液滴(例如，水性液滴)由至少一种液滴流体形成，该流体也称为前景流体，其为液态并形成液滴相(可称为分散相或不连续相)。液滴相与连续相是不混溶的，这意味着液滴相(即液滴)和连续相(即载体流体)不会混合以获得同质性。液滴被连续相彼此隔离，并被连续相包封(即封闭/包围)。
乳液液滴在连续相中可具有任意均匀或不均匀的分布。如果不均匀，则液滴的浓度可变化，以在连续相中提供具有较高液滴密度的一个或多个区域和具有较低液滴密度的一个或多个区域。例如，液滴可在连续相中下沉或漂浮，可沿着通道聚集在一个或多个包组(packet)中，可朝向流动流的中心或周界聚集等等。当液滴被描述为“悬浮在背景流体中”时，这旨在涵盖所有这些可能性。
本文中公开的任何乳液可能是单分散的，即包含至少大致均一尺寸的液滴，或者可能是多分散的，即包含不同尺寸的液滴。如果是单分散的，则乳液液滴可例如在体积上变化的标准偏差小于平均液滴体积的约正负100％、50％、20％、10％、5％、2％或1％。从孔口产生的液滴可以是单分散的或多分散的。
乳液可具有任何合适的组成。乳液的特征可在于每相中的主要液态化合物或液态化合物的类型。乳液中主要液态化合物可能是水和油。“油”是与水不混溶并且具有高碳含量的任何液态化合物或液态化合物的混合物。在一些示例中，油还可具有高含量的氢、氟、硅、氧或其任意组合等。例如，本文中公开的任何乳液可能是油包水(W/O)乳液(即，连续油相中的水性液滴)。油可例如是或包括至少一种硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合等。任何其他合适的组分可存在于任何乳液相中，比如至少一种表面活性剂、试剂、样品(即其分部)、其他添加剂、标记物、颗粒或其任意组合。
当它们以密积状态(例如，每个液滴靠近相邻的液滴)被加热时(例如，加热至高于60℃的温度)，乳液可能变得不稳定，这是因为热通常会降低界面张力，从而导致液滴聚结。因此，密积的乳液可能无法在高温反应(比如PCR)期间保持其完整性，除非各乳液滴彼此保持不接触或使用添加剂(例如，其他油基、表面活性剂等)来改变稳定性条件(例如，界面张力、粘度、位阻等)。例如，可使液滴以单行排布并且沿着通道彼此间隔开，以允许热循环，以便执行PCR。然而，遵循该方法使用典型乳液不允许高密度的液滴，从而大大限制了基于液滴的测定中的通量。
本文中公开的任何乳液可能是热稳定乳液。热稳定乳液是在加热至至少50℃时能抵抗聚结的任何乳液。热稳定乳液可以是PCR稳定乳液，其是在整个PCR的热循环中能抵抗聚结的乳液(例如，以允许执行数字PCR)。因此，当加热至至少80℃或90℃等时，PCR稳定乳液可抵抗聚结。由于热稳定性，与标准乳液不同，PCR稳定的乳液使得PCR测定能够在整个热循环中在保持基本上单分散的液滴中进行。因此，使用PCR稳定乳液的数字PCR测定可比使用标准乳液定量性好得多。可通过例如适当选择载体流体和表面活性剂等将乳液配制成PCR稳定的。用于产生用于流通式测定的PCR稳定乳液的示例性油配方如下：(1)DowCorning(道康宁)的5225C Formulation Aid(配制助剂)(十甲基环五硅氧烷中的10％活性成分)－20％w/w、2％w/w最终浓度活性成分，(2)Dow Corning 749流体(十甲基环五硅氧烷中的50％活性成分)－5％w/w、2.5％w/w活性成分，以及(3)聚(二甲基硅氧烷)Dow Corning
Figure BDA0002216311500000061
流体、粘度5.0cSt(25℃)－75％w/w。用于产生用于批量式测定的PCR稳定乳液的示例性油配方如下：(1)Dow Corning(道康宁)的5225C Formulation Aid(配制助剂)(十甲基环五硅氧烷中的10％活性成分)－20％w/w、2％w/w最终浓度活性成分，(2)Dow Corning 749流体(十甲基环五硅氧烷中的50％活性成分)－60％w/w、30％w/w活性成分，以及(3)聚(二甲基硅氧烷)Dow Corning
Figure BDA0002216311500000062
流体、粘度5.0cSt(25℃)－20％w/w。还可使用其他合适的配方。例如，基于氟化油化学的合适配方公开于美国专利申请第12/976,827号中，出于所有目的，该文献全部纳入本文。
分部：大块体积的分开的部分。分部可能是从形成大块体积的样品(比如制备的样品)产生的样品分部。从大块体积产生的分部可在尺寸上基本均一，或者可具有不同的尺寸(例如，具有两个或更多个离散均一尺寸的分部的组)。示例性分部是液滴。各分部也可在尺寸上连续变化，且具有预定尺寸分布或随机尺寸分布。
液滴：小体积的液体，典型地具有球状，且由诸如连续乳液相之类的不混溶的流体包封。液滴的体积和/或乳液中液滴的平均体积可例如小于约一微升(即，“微液滴”)(或在约一微升至一纳升之间或在约一微升至一皮升之间)、小于约一纳升(或在约一纳升至一皮升之间)、或小于约一皮升(或在约一皮升至一飞升之间)等。液滴(或乳液滴)的直径(或平均直径)可小于约1000、100或10微米，或为约1000至10微米等。液滴可是球形或非球形。液滴可以是简易液滴或复合液滴，复合液滴即至少一个液滴包封至少一个其他液滴的液滴。
表面活性剂：表面活性试剂，其能够降低其中溶解有它的液体的表面张力，和/或与另一相的界面张力。表面活性剂、另外或者替代地可描述为洗涤剂和/或润湿剂包含亲水部分和疏水部分，它们共同赋予表面活性剂双重亲水－亲油特性。表面活性剂可依据亲水－亲脂平衡(HLB)值表征，它是表面活性剂亲水性与其亲油性相比的量度。HLB值的范围为0－60，并定义表面活性剂对水和油的相对亲和力。非离子表面活性剂的HLB值通常为0－20，离子表面活性剂的HLB值可高达60。亲水性表面活性剂的HLB值大于约10，且比起对油，对水的亲和力更大。亲油性表面活性剂的HLB值小于约10，且比起对水，对油的亲和力更大。本文中公开的乳液和/或其任何相可包括至少一种亲水性表面活性剂、至少一种亲油性表面活性剂、或其组合。替代地或附加地，本文中公开的乳液和/或其任何相可包含至少一种非离子(和/或离子)洗涤剂。此外，本文中公开的乳液和/或其任何相可包括含有聚乙二醇、聚丙二醇或吐温20(Tween 20)等的表面活性剂。
包组：设置在连续相的体积区域或相同连续体积中的一组液滴或其他隔开的分部。因此，包组可例如构成乳液的所有液滴，或者可在沿着通道的位置处构成这种液滴的隔离组分。典型地，包组是指液滴的集合，当以部分或全部进行分析时，这些液滴提供统计学相关的取样，以对初始液滴包组来源的整个起始样品的性质进行定量预测。液滴包组还指示通道中包组的第一个与最后一个液滴之间的空间接近度。
与信息技术类似，每个液滴用作信息的“位(bit)”，其可包含来自起始样品内的靶标分析物的序列特定的信息。液滴包组则是所有这些信息“位”的总和，它们一起提供关于来自起始样品的感兴趣的分析物的统计相关信息。与二进制计算机一样，液滴包组类似于位的连续序列，其包括可应用有意义的计算的最小二进制数据单元。液滴包组可相对于同样以连续相(比如在流动流中)布置的其他包组在时间上和/或空间上进行编码，和/或可附加有其他编码信息(光学、磁性等)，相对于其他包组，这些信息唯一地标识该包组。
测试：用于表征样品的操作和/或反应，以及从操作和/或反应中获得的任何信号、值、数据和/或结果。测试也可描述为测定。示例性的基于液滴的测定是使用水性测定混合物的生物化学测定。更具体地，基于液滴的测定可能是酶测定和/或结合测定等。例如，酶测定可确定单个液滴是否含有酶的底物分子(例如，核酸靶标)的拷贝和/或酶分子的拷贝。基于这些测定结果，可估计样品中底物和/或酶的浓度和/或拷贝数量。
反应：化学反应、结合相互作用、表型变化、或其组合，其通常提供指示反应发生和/或发生程度的可检测信号(例如，荧光信号)。示例性反应是酶反应，其涉及酶催化的底物向产物的转化。
可在本文中公开的基于液滴的测定中执行任何合适的酶反应。例如，反应可由以下酶催化：激酶、核酸酶、核苷酸环化酶、核苷酸连接酶、核苷酸磷酸二酯酶、聚合酶(DNA或RNA)、异戊二烯基转移酶、焦磷酸酶、报告酶(例如，碱性磷酸酶、β－半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、葡萄糖醛酸酶、辣根过氧化物酶、荧光素酶等)、逆转录酶、拓扑异构酶等。
样品：来自任何合适来源的感兴趣的化合物、组合物和/或混合物。样品是对于测试而言感兴趣的一般对象，该测试分析样品的某一方面，比如是与样品中可能存在的至少一种分析物相关的方面。样品可以其被采集时天然的状态和/或改变的状态被分析，改变的状态例如是由以下事项所导致的：储存、保存、提取、裂解、稀释、浓缩(浓集)、纯化、过滤、与一种或多种试剂混合、预扩增(例如，通过在PCR之前对样品执行PCR的有限循环(例如，<15)来实现靶标富集)、去除扩增子(例如，在PCR之前用尿嘧啶－d－糖基化酶(UDG)处理，以消除由先前产生的扩增子带来的任何遗留污染(即，扩增子可用UDG来消化，这是因为它是用dUTP而不是dTTP产生的))、划分或其任意组合等。临床样品可包括鼻咽冲洗物、血液、血浆、无细胞血浆、血沉棕黄层、唾液、尿液、粪便、痰液、黏液、伤口拭子、组织活检物、乳汁、流体抽吸物、拭子(例如，鼻咽拭子)和/或组织等。环境样品可包括水、土壤、气溶胶和/或空气等。研究样品可包括培养细胞、原代细胞、细菌、孢子、病毒、小生物体、上面列出的任何临床样品等。其他样品可包括食物、武器组分(weapons components)、为生物威胁剂测试的生物防御样品、可疑污染物等。
可收集样品，以用于诊断目的(例如，诸如感染性物质之类的临床分析物的定量测量)或用于监测目的(例如，以确定诸如生物威胁剂之类的感兴趣的环境分析物已超过预定阈值)。呈液体形式或已混合到液体中的样品可称为样品流体。
分析物：在测试中分析的样品的组分或潜在组分。分析物是测试中感兴趣的特定对象，其中，样品是感兴趣的一般对象。分析物可例如是：核酸、蛋白质、肽、酶、细胞、细菌、孢子、病毒、细胞器、大分子组装体、候选药物、脂质、碳水化合物、代谢物或其任意组合等。可测试分析物在样品和/或其分部中的存在、活性和/或其他特征。分析物的存在可涉及样品中或其一个或多个分部中的分析物的绝对或相对数量、浓度、二元评估(例如，存在或不存在)等。在一些示例中，样品可经划分使得分析物的拷贝不存在于所有分部中，比如以约0.0001至10000、0.001至1000、0.01至100、0.1到10，或1拷贝/分部的平均浓度存在于这些分部中。
试剂：与样品组合的化合物、成组化合物和/或组合物，以对样品执行特定的测试。试剂可能是靶标特异性试剂，其是使测试中的特定靶标或分析物针对检测具有特异性的任何试剂组合物。可选地，试剂可包括化学反应物和/或用于测试的结合伴侣。试剂可例如包括：至少一种核酸、蛋白质(例如，酶)、细胞、病毒、细胞器、大分子组装体、潜在药物、脂质、碳水化合物、无机物质或其任意组合，并且可以是水性组合物等。在示例性实施例中，试剂可以是扩增试剂，其可包括用于扩增核酸靶标的至少一种引物或至少一对引物、使得能够检测扩增的至少一种探针和/或染料、聚合酶、核苷酸(dNTP和/或NTP)、二价镁离子、氯化钾、缓冲剂或其任意组合等。
核酸：包括核苷酸单体链的化合物。核酸可以是单链或双链(即，与另一种核酸形成碱基对)等。核酸链可包含任何合适数量的单体，比如至少约十个或一百个等。一般地，核酸链的长度对应于其来源，合成核酸(例如，引物和探针)通常较短，而通过生物学方式/通过酶促方式产生的核酸(例如，核酸分析物)通常较长。
核酸可具有天然或人工结构，或其组合。具有天然结构的核酸、即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)通常具有包括交替的戊糖基团和磷酸基团的主链。每个戊糖基团与核碱基(例如，嘌呤(比如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(T))或嘧啶(比如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)))链接。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物，并且可例如通过改变天然主链的戊糖和/或磷酸基团来产生。示例性人工核酸包括甘油核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、苏糖核酸(TNA)等。
核酸的序列由核碱基沿主链布置的顺序限定。该序列通常确定核酸通过氢键特异地结合伴侣链(或形成分子内双链体)的能力。特别地，腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。通过与另一种核酸形成这种碱基对的连续串而能以反平行方式与另一种核酸结合的核酸被称为“互补的”。
复制：形成核酸或其区段的拷贝(即，直接拷贝和/或互补拷贝)的过程。复制通常涉及酶，比如聚合酶和/或连接酶等。所复制的核酸和/或区段是用于复制的模板(和/或靶标)。
扩增：随时间重复发生复制以形成模板分子的至少一个区段的多个拷贝的反应。随着扩增的进行，扩增可产生拷贝数量的指数或线性增加。典型的扩增产生拷贝数量和/或信号超过1000倍的增加。用于本文中公开的基于液滴的测定的示例性扩增反应可包括聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应，每个反应均由热循环驱动。基于液滴的测定附加地或替代地可使用可等温地执行的其他扩增反应，比如分支探针DNA测定、级联－RCA、依靠解旋酶的扩增、环介导等温扩增(LAMP)、基于核酸的扩增(NASBA)、切口酶扩增反应(NEAR)、PAN－AC、Q－β复制酶扩增、滚环复制(RCA)、自持序列复制、链置换扩增等。扩增可使用线性或环形模板。
可用任何合适的试剂执行扩增。可在扩增混合物中执行扩增或测试扩增的发生，扩增混合物是能够在组合物中产生核酸靶标分子(如果存在的话)的多个拷贝的任何组合物。扩增混合物可包括至少一种引物或引物对、至少一种探针、至少一种复制酶(例如，至少一种聚合酶，比如是至少一种DNA和/或RNA聚合酶)和三磷酸脱氧核苷酸(和/或核苷酸)(dNTP和/或NTP)的任意组合等。本文其他地方描述了能够在同一液滴中进行多重扩增和检测两种或更多种靶标物质的测定混合物和检测策略的其他方面。
PCR：依赖于加热和冷却的交替循环(即热循环)以实现连续复制循环的核酸扩增。PCR可通过两个或更多个温度设定点之间的热循环来执行，两个或更多个温度设定点比如是较高的解链(变性)温度和较低的退火/延伸温度，或者PCR可通过三个或更多个温度设定点之间的热循环来执行，三个或更多个温度设定点比如是较高的解链温度、较低的退火温度以及中间的延伸温度，等等。PCR可用热稳定聚合酶来执行，热稳定聚合酶比如是Taq DNA聚合酶(例如，野生型酶、Stoffel片段、FastStart聚合酶等)、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶或其组合等。PCR通常在连续循环中产生产物扩增子的量的指数增加。
在本文中公开的基于液滴的测定中可使用任何合适的PCR方法或方法的组合，这些方法比如是：等位基因特异性PCR、组装PCR、不对称PCR、数字PCR、端点PCR、热启动PCR、原位PCR、交叉序列特异性PCR、反向PCR、指数后线性PCR、连接介导PCR、甲基化特异性PCR、微引物PCR、依赖多重连接的探针扩增、多重PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、聚合酶循环组装体、定性PCR、定量PCR、实时PCR、RT－PCR、单细胞PCR、固相PCR、热不对称交错PCR、降落PCR(touchdown PCR)或通用快速PCR等。
数字PCR：对样品的某些部分执行PCR以基于有多少样品部分支持靶标的扩增来确定样品中核酸靶标的存在/不存在、浓度和/或拷贝数量、或DNA区段的连接。数字PCR可(或可不)以端点PCR形式进行。数字PCR可(或可不)对于每个分部以实时PCR形式进行。
PCR理论上导致来自样品的核酸序列(分析物)的指数扩增。通过测量达到扩增阈值水平所需的扩增循环数(如在实时PCR中)，理论上可计算核酸的起始浓度。然而，在实践中，有许多因素使PCR过程非指数化，这些因素比如是变化的扩增效率、起始核酸的低拷贝数量以及与背景污染核酸的竞争。数字PCR通常对这些因素不敏感，这是因为它不依赖于PCR过程是指数化的假设。在数字PCR中，将单个核酸分子从初始样品划分进入多个分部，然后扩增至可检测水平。于是，每个分部提供关于每个分部内每个单独核酸分子的存在或不存在的数字信息。当使用该技术测量足够的分部时，可合并数字信息以针对样品中的核酸靶标(分析物)对起始浓度进行统计相关的测量。
除了核酸之外，数字PCR的概念可扩展到其他类型的分析物。特别地，可利用信号放大反应来允许对单个液滴中分析物分子的单个拷贝的检测，从而允许对其他分析物的液滴信号进行数据分析(例如，使用基于泊松统计的算法)。允许对液滴中其他类型分析物的单个拷贝的检测的示例性信号放大反应包括酶反应。
定性PCR：基于PCR的分析，其确定样品中是否存在靶标，一般不对靶标的存在进行任何实质性定量。在示例性实施例中，定性的数字PCR可通过确定液滴的包组包含至少预定百分比的阳性液滴(阳性样品)还是不包含至少预定百分比的阳性液滴(阴性样品)来执行。
定量PCR：基于PCR的分析，其确定样品中靶标的连接程度或浓度和/或拷贝数量。
RT－PCR(逆转录－PCR)：利用通过RNA逆转录产生的互补DNA模板的PCR。RT－PCR允许通过以下步骤来分析RNA样品：(1)形成RNA的互补DNA拷贝(比如借助逆转录酶)和(2)使用互补DNA作为模板的PCR扩增。在一些实施例中，相同的酶、比如Tth聚合酶可用于逆转录和PCR。
实时PCR：基于PCR的分析，其中，在反应期间、比如在反应的最终热循环之前完成一个或多个热循环之后测量扩增子形成。实时PCR一般基于靶标扩增的动力学来提供靶标的定量。
端点PCR：基于PCR的分析，其中，在热循环完成后测量扩增子形成。
扩增子：扩增反应的产物。扩增子可能是单链或双链、或其组合。扩增子对应于核酸靶标的任何合适的区段或整个长度。
引物：能够和/或用于引发核酸模板复制的核酸。因此，引物是较短的核酸，其与较长的模板互补。在复制期间，引物基于模板序列延伸，以产生更长的核酸，其是模板的互补拷贝。引物可能是DNA、RNA、其类似物(即人工核酸)、或其任意组合。引物可具有任何合适的长度，比如至少约10、15、20或30个核苷酸。示例性引物是化学合成的。引物可以至少一对引物的形式提供，用于扩增至少一个核酸靶标。成对引物可能是正义引物和反义引物，其共同限定所得扩增子的相对端(以及因此限定所得扩增子的长度)。
探针：与至少一种标记物、比如至少一种染料连接的核酸。探针可以是核酸靶标和/或扩增子的序列特异性结合伴侣。探针可设计成能够基于荧光共振能量转移(FRET)检测靶标扩增。用于本文中公开的核酸测定的示例性探针包括与成对染料连接的一种或多种核酸，所述染料在彼此接近时共同表现出荧光共振能量转移(FRET)。该成对染料可提供第一和第二发射体，或发射体和猝灭体等。当各染料彼此分离时、比如通过在引物延伸期间探针的裂解(例如，5’核酸酶测定，比如采用TAQMAN探针)，或当探针与扩增子杂交时(例如，分子信标探针)，来自染料对的荧光发射变化。
探针的核酸部分可具有任何合适的结构或来源，例如，该部分可是锁核酸、通用探针库的成员或类似物。在其他情形中，探针和引物对中的引物之一可在同一分子中组合(例如，AMPLIFLUOR引物或SCORPION引物)。例如，引物－探针分子可在其3’端处包括引物序列，且在其5’端处包括分子信标型探针。通过这种排列，用不同染料标记的相关引物－探针分子可用于具有相同逆向引物的多重测定中，以定量由单个核苷酸区别的各靶标序列(单核苷酸多态性(SNP))。用于基于液滴的核酸测定的另一示例性探针是Plexor引物。
标记物：连接或结合到任何实体中的识别和/或区别标志物或标识物，比如化合物、生物颗粒(例如，细胞、细菌、孢子、病毒或细胞器)或液滴。例如，标记物可能是使实体可光学检测和/或可光学区分的染料。用于标记的示例性染料是荧光染料(荧光团)和荧光猝灭剂。
报告物：报告情况、比如反应程度的化合物或化合物组。示例性报告物包括至少一种染料、比如荧光染料或能量转移对，和/或至少一种寡核苷酸。用于核酸扩增测定的示例性报告物可包括探针和/或嵌入染料(例如，SYBR Green、溴化乙锭等)。
代码：用于区分组中不同成员的机制。用于区分不同类型的液滴的示例性代码可包括：不同的液滴尺寸、染料、染料的组合、一种或多种染料的量、包封的代码颗粒、或其任意组合等。例如，代码可用于区分不同的液滴包组、或包组内的不同类型的液滴等。
结合伴侣：彼此结合的成对成员中的成员。每个成员可能是化合物或生物颗粒(例如，细胞、细菌、孢子、病毒、细胞器等)等。结合伴侣可彼此特异地结合。特异性结合可通过小于约104、106、108或1010M的解离常数来表征。示例性特异性结合伴侣包括生物素和亲和素/链霉亲和素、有义核酸和互补反义核酸(例如，探针和扩增子)、引物及其靶标、抗体和对应的抗原、受体和其配体等。
概述
通常，根据本教导的测定执行系统可包括一个或多个自动化步骤和/或测定执行组件。发明人已经发现，即使在相对高的温度下，这种系统中涉及的至少一些大块体积水性样品也可通过乳化来稳定，而不是以大块体积形式储存。该结果与以下期望相反：随着时间的推移，乳液的水相的一种或多种组分可被招募到乳化液滴表面。如果要发生这种情况，则由液滴界面提供的表面积的量对于存在的水相体积而言相对较大。取决于招募到液滴表面的组分，可能发生对反应(比如PCR)的显著抑制。因此，即使是对于在处理之前常规以大块体积形式被储存或排列的样品，本文中公开的方法的各方面和系统也可在测定过程的早期阶段引入乳化。
本公开提供用于执行测定的系统，包括装置和方法。这些系统可涉及：(A)制备一个或多个样品，比如临床或环境样品，以供分析；(B)通过将样品划分成液滴或其他分部来分离样品的组分，每个液滴或部分仅包含约一种组分(比如单拷贝核酸靶标(DNA或RNA)或感兴趣的其他分析物)；(C)扩增或以其他方式使液滴内的组分反应；(D)检测扩增或反应的组分或其特征；和/或(E)分析结果数据；等等。以此方式，可将复杂样品转化为多个更简单、更容易分析的样品，且伴有背景的减少和测定时间的缩短。
示例、部件和替代方式
以下部分描述了示例性测定执行系统的选定方面，以及相关的系统和/或方法。这些部分中的示例旨在用于示意，而不应被解释为限制本公开的整个范围。每个部分可包括一个或多个不同的实施例或示例、和/或上下文或相关信息、功能和/或结构。
A、示意性测定方法
如图1中所示，该部分描述了示意性测定方法10。图1是流程图，示出了在示意性方法中执行的步骤，并且可不记载有该方法的完整过程或所有步骤。尽管下文描述并且在图1中描绘了方法10的各个步骤，但是这些步骤不一定全部被执行，并且在一些情形中，可同时被执行或以与所示顺序不同的顺序被执行。
图1示出了用于执行基于液滴或分部的测定的示例性方法/系统10。简而言之，方法10可包括样品制备12、划分或液滴产生14、反应(例如，扩增)16、检测18和数据分析20。该系统可用于执行数字PCR(聚合酶链式反应)分析。针对方法10呈现的步骤可以任何合适的顺序并以任何合适的组合来执行。此外，这些步骤可与本公开或交叉引用中的材料的任何其他合适的步骤、方面和/或特征组合和/或由这些步骤、方面和/或特征来修改。
更具体地，样品制备12可涉及收集样品(比如临床或环境样品)、处理样品以释放相关的核酸、以及形成涉及核酸的反应混合物(例如，用于扩增靶标核酸)。样品的制备可包括对样品的任何合适的操作，比如收集、稀释、浓缩(浓集)、纯化、冻干、冷冻、提取、与一种或多种测定试剂的组合、执行至少一种初步反应以制备用于测定中的一个或多个反应的样品、或这些操作的任意组合等。样品的制备可包括使样品有能力随后执行一个或多个反应，比如一个或多个酶催化反应和/或结合反应。
在一些实施例中，样品的制备可包括将样品与用于扩增以及用于报告是否发生扩增的试剂组合。此类试剂可包括针对靶标的引物(例如，每个靶标的正向引物和反向引物)、用于检测靶标的扩增的报告物(例如，探针)、dNTP和/或NTP、至少一种酶(例如，聚合酶、连接酶、逆转录酶或其组合，其中每一种可以是或可以不是热稳定的)的任意组合等。因此，样品的制备可使样品(或其分部)能够扩增样品(或其分部)中的一个或多个靶标(如果存在的话)中的每一个。
划分14可涉及将样品的任何合适的部分(或全部)分离或分配到各分部。每个分部可包括与其他分部的流体体积隔离的流体体积。各分部可由载体流体(比如乳液的连续相)、由固相(比如容器的至少一个壁)、或其组合等彼此隔离。在一些实施例中，分部可能是设置在连续相中的液滴，从而液滴和连续相共同形成乳液。这种形式的划分可称为液滴产生。液滴产生可涉及将核酸包封在液滴中，例如，每个液滴具有每个靶标核酸的约一个拷贝，其中，液滴悬浮在不混溶的载体流体(比如油)中，以形成乳液。
分部可通过任何合适的程序以任何合适的方式形成，并具有任何合适的性质。例如，分部可借助诸如移液管之类的流体分配器、借助液滴产生器，通过搅拌样品(例如，摇动、搅拌、超声处理等)等来形成。因此，各分部可依次、平行或成批地形成。分部可具有任何合适的一种或多种体积。各分部可具有大致均匀的体积或可具有不同的体积。具有大致相同体积的示例性分部是单分散液滴。分部的示例性体积包括：小于约100、10或1μL；小于约100、10或1nL；或小于约100、10或1pL等的平均体积。
当形成时，分部可有能力在分部中执行一个或多个反应。替代地，可在形成分部之后将一种或多种试剂添加到这些分部中，以使它们有能力进行反应。可通过任何合适的机制来添加试剂，这些机制比如是流体分配器、液滴融合等。任何试剂可在宏观流体或微流体环境中与分部(或体相样品)组合。
在诸如DNA扩增系统之类的系统中，可能期望使用部分或完全一次性的装置来产生含有样品的液滴。这可通过配置成产生液滴的一次性盒实现，这作为一系列样品制备步骤的一部分，一系列样品制备步骤还可包括裂解、纯化和浓缩等。然而，在其他情形中，可能期望提供一种部分或完全一次性的装置，其配置成执行液滴产生而不执行大量额外的样品制备步骤。例如，当DNA扩增系统配置成分析通常在另一个场所制备或由实际操作者制备的样品时，这可能是所期望的。在这些情况下，专用的液滴产生系统可能是最简单且最经济的方案。
本文中所描述的液滴产生系统的部件可包括：例如，基板、井(即贮存器)、通道、管等，其可例如以单件盒的形式组装。这些部件可通过本领域已知的任何合适的方法制造，例如通过注塑、机加工、热压和/或类似方法。在一些情形中，根据本教导公开的液滴产生系统的所有部件可能是专有的。在其他情形中，所公开的系统的一个或多个部件可作为现成的部件可购得，其可在有或没有修改的情况下与其他部件集成。
液滴产生器的许多配置可适合作为根据本教导的液滴产生成系统的部件。例如，合适的液滴产生器包括对接管、钻有或以其他方式形成有交叉通道的管、部分或完全插入其他管内部的管、以及具有多个孔的管等，其中，“管”表示具有任何横截面形状的细长中空结构。合适的流体贮存器包括移液管尖端、旋转柱、井(单独的或呈板阵列的)、管和注射器等。
反应16可涉及使液滴经受合适的一个或多个反应、比如热循环(thermalcycling)(也称为热循环(thermocycling))，以引发PCR扩增，从而扩增液滴内的靶标核酸(如果有的话)而形成附加的拷贝。所执行的每个反应可仅在分部的子集中选择性地(和/或实质性地)发生，分部的子集比如是少于分部的约二分之一、四分之一或十分之一等。反应可涉及靶标，其可例如是反应中的模板和/或反应物(例如底物)和/或结合伴侣。反应可在含有靶标的至少一个拷贝的分部中选择性地发生(或选择性地不发生)。
该反应可能是或可能不是酶催化的反应。在一些示例中，反应可能是扩增反应，比如PCR和/或连接酶链式反应。因此，可在各分部中同时执行多个靶标的多个扩增反应。
执行反应可包括使分部经受促进反应发生的一个或多个条件。这些条件可包括在高于室温的温度下加热分部和/或培养分部。在一些示例中，这些条件可包括使分部热循环，以促进聚合酶链式反应和/或连接酶链式反应。
检测18可涉及检测来自液滴的一些信号，这些信号指示是否存在扩增。最后，数据分析20可涉及基于发生扩增的液滴的百分比来估计样品中靶标核酸的浓度。
B、原理示意性测定系统
如图2的示意图中所示，该部分描述了用于执行图1中的测定的示意性系统50。系统50包括用于储存和/或运送样品的队列部分52、呈液滴产生器54(“DG”)形式的划分组件、呈热循环器56(“TC”)形式的热孵育组件、检测组件(检测器)58(“DET”)以及数据处理组件60(“PROC”)(也称为处理器)，可能还包括其他。这些部件和仪器中的一个或多个或全部可被容纳于一个或多个分组或组件或以其他方式组装成一个或多个分组或组件。例如，所有部件和仪器可形成单个测定执行组件62，如图2中所示。在其他示例中，系统50可分成预热循环、热循环和后热循环子组件。
数据处理器60可以是控制器或可包括在控制器中，该控制器与组件或子组件的任意合适组合通信并控制其运行。组件之间的箭头表示可选的、且在一些情形中自动的移动或转移，比如是流体(例如，乳液的连续相)和/或分部(例如，液滴)或信号/数据的移动或转移。例如，具有流体和/或乳液的孔(well)或贮存器的盒或板可在各仪器之间自动地或手动地转移。在一些示例中，可通过同一(例如，多功能)仪器或组件在这样的盒上执行关于图1描述的一个或多个操作。组件的任何合适组合可操作地彼此连接，和/或组件中的一个或多个可不连接到其他组件，从而例如材料/数据由人工传输。
系统50通常操作如下。一个或多个盒或其他含有样品的接收容器被装载到队列部分52中。从队列部分52起，盒(或多个盒)例如自动地、比如通过拾放装置、传送工具、转盘或其他合适的装置被转移到液滴产生器54。液滴产生器54形成设置在载体流体、比如连续相中的液滴，大致如以上参考图1所描述的。然后可将盒输送到热循环器，或者在某些情形中，输送回队列部分。用热循环器56使液滴热循环，以促进液滴中靶标的扩增。利用检测器58从液滴检测复合信号。通过处理器60处理信号以计算靶标的水平。
在一些示例中，可将含有水性样品和/或载体流体的多个盒或板一次装载到队列部分52中。例如，队列部分52之后的设备和仪器可能是部分自动或全自动的。因此，多个板可由用户或操作员装载到系统50中，然后循环通过系统50的操作或组成仪器而无需进一步干预。在一些示例中，使用热循环器56的热循环通常可能是系统50中的瓶颈、制约或速率限制步骤。热循环可比其他操作耗费长得多的时间，例如约两个小时。为此，加载到系统50中的板可能需要在热循环之前等待若干小时(例如，当装载十个板时为二十个小时或更久)。与大块体积储存相比，液滴的产生增强了反应稳定性。因此，在加载系统时，盒可基本上立即循环通过液滴产生器54。下文参考图3更详细地描述相关方法。
可能适用于本文中公开的方法和系统的样品制备、液滴产生、测定、试剂、反应、热循环、检测和数据处理等的其他方面在下文中和上文列于交叉引用部分的文献中描述。附加的方面在2011年9月29日公布的PCT专利申请公布第WO 2011/120006 A1以及PCT专利申请公布第WO 2011/120024 A1中公开，其全部内容通过参考被纳入。
C、示意性测定系统
如图3中所示，该部分描述了用于执行图1中的测定的示意性系统100。系统100是上文描述的系统50的示例。
系统100包括单个测定执行组件，其中，若干子组件或工位包含在共同的壳体102中。壳体102包括主壳体104和枢转门部段106，枢转门部段106配置成打开以供接近系统100的内部子组件，如图3中所示。枢转门106可配置成提供对系统100的两个或更多个子组件的同时接近。在该示例中，枢转门106提供对所有子组件的选定的同时接近，并且还包括内壁106A和106B，以保持输入和输出队列与其他子组件分开。
如图3中从右到左所示，在壳体102内的是以下子组件：队列或寄宿部分106(对应于队列部分52)、液滴产生器部分108(对应于DG 54)、热循环器部分110(对应于TC 56)、检测部分112(对应于检测器58)以及输出队列部分114。显示器116安装到系统100，用于提供图形用户界面(GUI)118，其被配置为允许用户与系统100及其处理器(未示出)交互。
在该示例中，将含有样品的接收容器(AKA盒)装载入寄宿部分106并保留在其中的架子上。自动运送器120(也称为拾放运送器)在系统100的各子组件之间输送盒。运送器120包括可伸展的夹持器部分122，其被配置成水平地移入和移出每个工位，并且在竖直柱124上上下移动(例如，由机动导螺杆驱动)。柱124配置成在成对的水平轨道126上水平移动(例如，通过带驱动)。由此，运送器120可在所有三个维度上移动盒进出系统100的每个工位。
从寄宿部分106起，盒(或多个盒)被运送器120自动转移到液滴产生器108。液滴产生器108形成设置在载体流体、比如连续相中的液滴，大致如以上参考图1所描述的。通过运送器120将盒自动转移到热循环器110，在热循环器110处，液滴热循环(例如，多次)以促进液滴中靶标的扩增。然后，通过运送器120将盒自动转移到检测器部分112，在检测器部分112处，从液滴中检测复合信号。通过系统100的处理器来处理信号以计算靶标的水平。在检测和处理之后，接着，将每个盒转移到输出队列部分114以供附加处理或丢弃。在一些示例中，如下文所描述的，例如，当第一盒在热循环时，运送器120可将多个盒从寄宿部分106输送到液滴产生器108并输送回寄宿部分。然后，当轮到这些盒时，这些盒将直接从寄宿部分移动到DG部分，并接着如上所述移动到其他工位。
在一些示例中，壁106A和/或106B可选择性地可缩回，以允许运送器在需要时自由行进。换句话说，内壁中的任一者或两者在延伸配置与缩回配置之间可转变，在延伸配置中，壁将输入队列与液滴产生模块分开，在缩回配置中，壁枢转以允许自动样品板输送装置(在该示例中为运送器)的自由移动。在一些示例中，运送器或其他输送装置配置为使内壁在延伸配置与缩回配置之间转变。例如，内壁可朝向延伸配置偏置(例如，通过铰链安装的扭转弹簧)，并且当需要接近输入队列或输出队列时，运送器通过将壁推向外侧来克服该偏置。
D、包括样品稳定化的示意性测定执行方法
该部分描述了用于执行测定的示意性方法的步骤，该方法包括稳定样品；参见图4。上文描述的测定执行系统、比如系统50和/或100的各方面均可用于下文所描述的方法步骤中。在适当时，可参考先前描述的可用于执行每个步骤的部件和系统。这些参考用于示意，而不是用于限制执行该方法的任何特定步骤的可能方式。
图4是流程图，示出了在示意性方法中执行的步骤，并且可能未记载该方法的完整过程或所有步骤。尽管下文描述并且在图4中描绘了方法200的各个步骤，但是这些步骤不一定全部被执行，并且在一些情形中，可同时被执行或以与所示顺序不同的顺序被执行。
在步骤202，自动测定执行系统(例如，系统50或100)可将多个样品板接收到仪器输入队列中。例如，可将多个(例如，七个)含有样品的盒或板装载到系统50的队列部分52中。该队列部分可包括任何合适的储存区划或布置，比如架子、转盘、容器和/或类似物，或其任意组合。寄宿部分106是队列部分的合适示例。
在步骤204，样品板中的第一个样品板可循环通过液滴产生(DG)模块或仪器(例如，DG 54或108)。例如，装载入系统50中的第一盒可自动转移到DG组件54，在DG组件54处执行乳化。例如，盒可由运送器120自动转移。
在步骤206，将第一个样品板装载到热循环模块(例如，TC 56或110)中并开始热循环。例如，含有乳化剂/液滴的盒可自动装载入热循环组件56或110中(例如，通过运送器120)。如上所述，热循环可能花费超过一个小时来完成(例如，约两个小时)。
在步骤208，在等待第一个样品板的热循环完成的同时，可使剩余的样品板循环通过液滴产生模块并返回到输入队列或寄宿部分。例如，如果在步骤202中装载了七个盒，则步骤208可包括当盒一处于TC过程中时在DG组件54中的盒二至七上执行液滴的产生，然后将每个盒返回到队列部分52。在一些示例中，该步骤包括依次将每个盒(AKA样品板)放入DG模块中并执行液滴的产生。在一些示例中，可在多个盒或板上并行地执行液滴的产生。
在步骤210，当完成第一乳化样品的热循环时，将第一个样品板转移至液滴读取器(DR)模块(例如DR 58或112)。例如，第一盒可从TC组件56或110自动地转移到检测组件58或112(例如，通过运送器120)。该操作在热循环器中为下一个板或盒提供空间。
在步骤212，使下一个板循环通过热循环模块。例如，第二盒可从队列部分52自动地转移到TC组件56以进行循环。该第二盒可能已经储存了约两个小时。注意，后续盒的等待时间将以热循环周期时间的倍数上升。例如，第三盒可能在热循环之前等待四个小时，第四盒可能等待六个小时，依此类推，直到七个盒中的最后一个将等待至少约十二个小时。这突出了早期液滴产生/乳化的重要性，使得水性样品可在很长的等待时间内稳定。
在步骤214，当步骤212的热循环完成时，TC模块中的板可循环通过液滴读取器(例如，模块58或112)并进入输出队列(或简单地循环到输出)(例如，输出队列114)。例如，第二盒可完成热循环，然后自动转移到系统50的检测组件58，并接着离开系统。基本上，因为系统的制约是TC模块，所以一旦下一个盒或板完成热循环，就可执行每个后续/下游操作。因此，后续的板将依次完成步骤212和214，如图4所示。
尽管已将稳定化结合或“内置”到通过方法200描述的系统中，但水性样品的稳定化可在其他系统中或出于其他目的被执行。
E、示意性数据
该部分描述了为证明本文中所描述的系统和方法的功效和性能益处而进行的示例性实验。简而言之，这些实验表明，在热循环之前储存在液滴中的样品比大块体积储存的样品更稳定。这种改进的稳定性提高了从样品中采集的数据的质量，这进而又提高了对样品执行的测定和从这些测定中所得出的结论的准确性。使用各种样品(例如，金黄色葡萄球菌、富含GC的测定和富含AT的测定)、荧光团(例如，EvaGreen、FAM和HEX)、温度(例如，4℃、室温和37℃)以及储存时间(例如，无、过夜和20小时)进行实验。
图5是在室温下以液滴(分图A)或大块体积(分图B)形式储存20小时的样品上采集的扩增数据的图。然后使液滴样品热循环并对其分析。然后将大块体积样品转化为液滴，使其热循环并对其分析。两组样品均包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)和EvaGreen。样品阳性的液滴具有更高的振幅；样品阴性的液滴具有较低(例如，为零)的振幅。在这些实验中，来自以液滴形式储存的样品的数据比来自在大块体积中储存的样品的数据更紧密地聚集并且噪声更小。因此，当必须储存样品时，最好在液滴形成后储存。
图6是在转化成液滴然后立即热循环(分图A)或在室温下储存20小时然后热循环(分图B)的样品上采集的扩增数据的图。定性地，这些数据看起来基本相同。定量地，这些数据基本相同：阳性液滴对所有液滴的分数对于立即热循环为49.4％且对于储存20小时后的热循环为49.2％。因此，以液滴储存的样品非常稳定。该结果适用于不同的样品、不同的荧光团和不同的储存条件(例如，冷却、室温和温热)。
附加数据在2017年1月26日提交的美国临时专利申请序列号第62/451,004号中提出，该申请以参考的方式纳入本文。
F、示意性组合和附加示例
该部分描述了本公开的测定执行系统和方法的附加的方面和特征，其无限制地呈现为一系列段落，其中的一些或全部可为了清楚和效率起见而通过字母数字来标示。这些段落中的每一段可能以任何合适的方式与一个或多个其他段落组合，和/或与本申请中其他部分的公开内容组合，这些公开内容包括交叉引用部分中通过参考纳入的材料。以下一些段落明确提及并进一步限制其他段落，从而无限制地提供一些合适组合的示例。
A0、一种进行测定的方法，该方法包括：(1)将多个包含水性样品的样品板接收到输入队列中；(2)通过使第一个样品板自动循环通过液滴产生模块，使第一个样品板上的水性样品稳定；(3)将第一个样品板自动装载入热循环模块，并开始第一个样品板的热循环；(4)当第一个样品板在热循环时，通过使剩余的样品板自动循环通过液滴产生模块并将每个剩余样品板自动返回到输入队列，从而稳定在所有剩余样品板上的水性样品；(5)当完成第一个样品板的热循环时，使第一个样品板自动循环通过液滴读取器模块；以及(6)响应于第一个样品板的热循环完成，依次使每个剩余样品板自动循环通过热循环模块和液滴读取器模块。
A1、根据A0的方法，其中，多个样品板包括少于十个样品板。
A2、根据A1的方法，其中，输入队列具有多达七个样品板的空间。
A3、根据A0的方法，其中，热循环模块花费大约两个小时来使每个样品板热循环。
A4、根据A0的方法，还包括将第一个样品板从输入队列自动输送到液滴产生器。
A5、根据A4的方法，其中，使用自动拾放样品板运送器来执行自动输送第一个样品板。
A6、根据A0的方法，其中，输入队列、液滴产生模块、热循环模块和液滴读取器模块都包含在共同的壳体中。
A7、根据A6的方法，其中，共同的壳体具有单个可枢转门，其配置成同时提供用户接近输入队列、液滴产生模块、热循环模块和液滴读取器模块。
A8、根据A6的方法，其中，可枢转门包括内壁，内壁在延伸配置与缩回配置之间可转变，在延伸配置中，壁将输入队列与液滴产生模块分开，在缩回配置中，壁枢转以允许自动样品板输送装置的自由移动。
A9、根据A8的方法，其中，自动样品板输送装置配置为使内壁在延伸配置与缩回配置之间转变。
A10、根据A8的方法，其中，内壁朝向延伸配置偏置。
B0、一种进行测定的方法，该方法包括：(1)将多个包含水性样品的样品板接收到测定执行组件的输入队列中，该测定执行组件具有自动的样品板输送装置；(2)通过使用样品板输送装置将第一个样品板自动输送到测定执行组件的液滴产生模块并使第一个样品板循环通过液滴产生模块以在第一个样品板中产生乳液来稳定第一个样品板上的水性样品；(3)使用样品板输送装置将第一个样品板自动装载入测定执行组件的热循环模块中，并开始第一个样品板的热循环；(4)当第一个样品板在热循环时，使用样品板输送装置通过使剩余的样品板自动循环通过液滴产生模块并将每个剩余样品板自动返回到输入队列，从而稳定在所有剩余样品板上的水性样品；(5)当完成第一个样品板的热循环时，使用样品板输送装置使第一个样品板自动循环通过测定执行组件的液滴读取器模块；以及(6)响应于第一个样品板的热循环完成，使用样品板输送装置依次使每个剩余样品板自动循环通过热循环模块和液滴读取器模块。
B1、根据B0的方法，其中，自动将每个剩余样品板返回到输入队列包括：重新定位测定执行组件的可缩回内壁，以允许接近输入队列。
B2、根据B1的方法，其中，通过与样品板输送装置的相互作用重新定位可缩回内壁。
B3、根据B0的方法，其中，输入队列具有多达七个样品板的空间。
B4、根据B0的方法，其中，热循环模块花费大约两个小时来使每个样品板热循环。
B5、根据B0的方法，其中，输入队列、液滴产生模块、热循环模块和液滴读取器模块都包含在共同的壳体中。
B6、根据B5的方法，其中，共同的壳体具有单个可枢转门，其配置成同时提供用户接近输入队列、液滴产生模块、热循环模块和液滴读取器模块。
C0、一种执行测定的方法，该方法包括：(1)制备水性样品；(2)通过产生乳化来稳定水性样品，所述乳化包括划分由载体流体包围的水性样品；(3)等待至少两个小时，同时允许乳化达到不超过约33摄氏度的温度；以及(4)通过热循环乳化促进聚合酶链反应。
C1、根据C0的方法，其中，等待步骤包括：等待超过约十个小时。
C2、根据C0的方法，其中，载体流体包括油。
C3、根据C0的方法，其中，使用液滴产生器执行乳化。
D0、一种稳定大块体积水性样品的方法，该方法包括：(1)通过使用载体流体乳化样品来划分水性样品；以及(2)将乳化样品保存超过约两个小时。
D1、根据D0的方法，其中，乳化样品储存超过约十个小时。
E0、一种进行测定的方法，该方法包括：(1)将多个包含水性样品的样品板接收到仪器输入队列中；(2)通过使第一个样品板循环通过液滴产生模块，使第一个样品板上的水性样品稳定；(3)将第一个样品板装载入热循环模块，并开始第一个样品板的热循环；(4)当第一个样品板在热循环时，通过使所有剩余的样品板循环通过液滴产生模块并将每个剩余样品板返回到输入队列，从而稳定在所有剩余样品板上的水性样品；(5)当完成第一个样品板的热循环时，使第一个样品板循环通过液滴读取器模块；以及(6)响应于第一个样品板的热循环完成，依次使每个剩余样品板循环通过热循环模块和液滴读取器模块。
E1、根据E0的方法，其中，多个样品板包括约十个样品板。
E2、根据E0的方法，其中，仪器输入队列具有多达十个样品板的空间。
E3、根据E0的方法，其中，热循环模块花费大约两个小时来使每个样品板热循环。
F0、一种用于执行测定的系统，该系统包括：(1)用于接收多个水性样品盒的输入队列部分；(2)用于乳化样品盒中含有的水性样品的液滴产生器；(3)用于使乳化样品热循环以促进聚合酶链式反应(PCR)的热循环器；(4)用于检测指示PCR步骤成功的标志物的检测装置；以及(5)联接到队列部分且配置成自动地将盒从输入队列部分转移到液滴产生器并从液滴产生器转移到输入队列部分的盒运送系统。
F1、根据F0的系统，还包括与液滴产生器、热循环器、检测装置和盒运送系统通信的控制器，使得控制器引起样品盒在各系统之间的转移。
F2、根据F1的系统，其中，控制器配置成在第一盒循环通过热循环器的同时使每个剩余的水性样品盒循环通过液滴产生器。
F3、根据F0的系统，还包括至少七个能够同时储存在队列部分中的水性样品盒。
G0、反应可设置如下：
G1、将所有组分解冻至室温。通过以最大速度使管涡旋30秒来剧烈混合以确保均匀性，因为在-20℃储存期间可能形成浓度梯度。短暂离心以收集管底部的内容物。
G2、在设置反应混合物之前，以所需浓度制备样品。
H0、样品盒可设置如下：
H1、将20μl带有样品的反应混合物移取并装载入盒的样品孔中。
H2、用板密封器(例如，Bio-Rad的PX1PCR板密封器，目录号1814000)和箔密封来密封盒。
H2A、将PX1PCR板密封器的密封条件设定为180℃持续0.5秒。
H2B、触摸按钮打开抽屉。
H2C、在抽屉中放置一个块。
H2D、将盒放入块中。
H2E、将密封件放在盒上。
H2F、触摸按钮关闭抽屉。
H2G、达到设定温度并且密封按钮为绿色时，触摸“密封”按钮。密封完成时，抽屉将自动打开。
H2H、移出盒，留下块。将盒旋转180°并将盒再次放入块中。
H2I、触摸按钮关闭抽屉并触摸密封按钮。
H2J、从块中移出墨盒。从抽屉中移出块。
H2K、将盒以1000转/分离心30秒。
H3、将密封的盒装载入PCR系统(例如，QX ONE ddPCR系统)。
优点、特征和益处
本文中描述的测定执行系统和方法的不同实施例和示例提供了优于已知方案的若干优点。例如，与大块体积储存相比，本文中所描述的示意性实施例和示例使用乳化(即，液滴产生)来增强所储存样品的反应稳定性。
另外，除了其他益处之外，本文中所描述的示意性实施例和示例允许高达约33C的温度(如果不是更高的话)反应的增强的稳定性。因此，可在通用储存之前乳化大块体积样品。
另外，除了其他益处之外，本文中所描述的示意性实施例和示例允许液滴形成的另一个益处，这一定与DG盒的几何形状等有关。例如，DG盒可包括所谓的吸管或其他管，其配置成在DG过程中抽吸样品和/或载体流体。因为这些吸管具有小直径，所以毛细作用可能导致流体被吸入吸管而无需施加外部真空或压力源。因此且尤其是随着时间的推移，由于毛细作用，可能发生非期望的和/或未控制的或非预期的组分的混合。出于该原因，在储存之前乳化样品也是有利的。
尚没有已知的系统或装置能够执行这些功能。然而，并非本文中所描述的所有实施例和示例都提供相同的优点或相同程度的优点。
总结
以上阐述的公开内容可涵盖具有独立效用的多个不同示例。尽管这些中的每一个都以其优选形式公开，但是本文中公开和说明的其具体实施例不应被视为具有限制意义，因为可能有许多变型。就本公开内容中使用的部分的标题而言，这些标题仅用于文章结构的目的。本公开的主题包括本文中公开的各种元件、特征、功能和/或性质的所有新颖且非显而易见的组合和子组合。以下权利要求特别指出了被认为是新颖且非显而易见的某些组合和子组合。特征、功能、元件和/或性质的其他组合和子组合可在要求本申请或相关申请的优先权的申请中要求保护。无论是与原始权利要求的范围相比更宽、更窄、相同或不同，这些权利要求都被认为包括在本公开的主题内。

Claims (19)

1.一种用于执行测定的方法，所述方法包括：
将多个包含水性样品的样品板接收到输入队列中；
通过使第一个样品板自动循环通过液滴产生模块，使所述第一个样品板上的水性样品稳定；
将所述第一个样品板自动装载入热循环模块，并开始所述第一个样品板的热循环；
当所述第一个样品板在热循环时，通过使剩余的样品板自动循环通过液滴产生模块并将每个剩余样品板自动返回到输入队列，以使所有剩余样品板上的水性样品稳定；
当所述第一个样品板的热循环完成时，使所述第一个样品板自动循环通过液滴读取器模块；以及
响应于所述第一个样品板的热循环完成，使每个剩余样品板依次自动循环通过所述热循环模块和所述液滴读取器模块。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述输入队列具有多达七个样品板的空间。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将所述第一个样品板从所述输入队列自动输送到液滴产生器。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，使用自动拾放样品板运送器来执行自动输送所述第一个样品板。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述输入队列、所述液滴产生模块、所述热循环模块和所述液滴读取器模块都包含在共同的壳体中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，共同的壳体具有单个可枢转门，所述可枢转门配置成同时提供用户接近所述输入队列、所述液滴产生模块、所述热循环模块和所述液滴读取器模块。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述可枢转门包括内壁，所述内壁能在延伸配置与缩回配置之间转变，在所述延伸配置中，所述壁将所述输入队列与所述液滴产生模块分开，在所述缩回配置中，所述壁枢转以允许自动样品板输送装置的自由移动。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述自动样品板输送装置配置为使所述内壁在所述延伸配置与所述缩回配置之间转变。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内壁朝向所述延伸配置偏置。
10.一种用于执行测定的方法，所述方法包括：
将多个包含水性样品的样品板接收到测定执行组件的输入队列中，所述测定执行组件具有自动化样品板输送装置；
通过使用所述样品板输送装置将第一个样品板自动输送到所述测定执行组件的液滴产生模块并使所述第一个样品板循环通过所述液滴产生模块以在所述第一个样品板中产生乳液来使所述第一个样品板上的水性样品稳定；
使用所述样品板输送装置将所述第一个样品板自动装载入所述测定执行组件的热循环模块中，并开始所述第一个样品板的热循环；
当所述第一个样品板在热循环时，使用所述样品板输送装置以通过使剩余的样品板自动循环通过所述液滴产生模块并将每个剩余样品板自动返回到所述输入队列，以使所有剩余样品板上的水性样品稳定；
当所述第一个样品板的热循环完成时，使用所述样品板输送装置使所述第一个样品板自动循环通过所述测定执行组件的液滴读取器模块；以及
响应于所述第一个样品板的热循环完成，使用所述样品板输送装置使每个剩余样品板依次自动循环通过所述热循环模块和所述液滴读取器模块。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，自动将每个剩余样品板返回到所述输入队列包括：重新定位所述测定执行组件的可缩回内壁，以允许接近所述输入队列。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过与样品板输送装置的相互作用重新定位所述可缩回内壁。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述输入队列具有多达七个样品板的空间。
14.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述输入队列、所述液滴产生模块、所述热循环模块和所述液滴读取器模块都包含在共同的壳体中。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，共同的壳体具有单个可枢转门，所述可枢转门配置成同时提供用户接近所述输入队列、所述液滴产生模块、所述热循环模块和所述液滴读取器模块。
16.一种用于执行测定的系统，所述系统包括：
输入队列部分，所述输入队列部分用于接收多个水性样品盒；
液滴产生器，所述液滴产生器用于乳化所述样品盒中含有的水性样品；
热循环器，所述热循环器用于使乳化的样品热循环以促进聚合酶链式反应(PCR)；
检测装置，所述检测装置用于检测指示PCR步骤成功的标志物；以及
盒运送系统，所述盒运送系统联接到所述队列部分且配置成自动地将盒从所述输入队列部分转移到所述液滴产生器并从所述液滴产生器转移到所述输入队列部分。
17.根据权利要求16所述的系统，其特征在于，还包括与所述液滴产生器、所述热循环器、所述检测装置和所述盒运送系统通信的控制器，使得所述控制器引起样品盒在各系统之间的转移。
18.根据权利要求17所述的系统，其特征在于，所述控制器配置成在第一盒循环通过所述热循环器的同时使每个剩余的水性样品盒循环通过所述液滴产生器。
19.根据权利要求16所述的系统，其特征在于，还包括至少七个能够同时储存在所述队列部分中的水性样品盒。
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