CN110892071A - 用于功能性寡核苷酸选择的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本公开描述了用于快速选择结合和功能性寡核苷酸(DNA、RNA或这些的任何天然或合成类似物)的组合物和方法。在某些实施方案中，本文提供了流通池(例如，用于Illumina测序仪或Polonator测序仪的流通池)，所述流通池在其流动室内包含多个固定的适体簇(例如，来自本文所述的适体文库)以及任选的一个或多个靶细胞(例如，癌细胞、免疫细胞等)和/或细胞功能的可检测指示剂(例如，凋亡、细胞增殖、基因或蛋白质表达等的荧光指示剂)。在某些实施方案中，本文提供了使用这种包含适体簇的流通池(例如，在诸如Illumina测序仪的测序仪中)从适体文库中鉴定功能性适体的方法。
Description
相关申请
本申请要求保护2017年3月30日提交的美国临时专利申请序列号62/478,993(其由此通过引用整体并入)的优先权的权益。
背景技术
适体是可与特定靶分子结合的短的单链核酸寡聚物。适体在迭代过程中通常选自大的随机寡核苷酸汇集物。最近，已在体内和体外成功地在细胞中选择了适体。
适体的选择、其结构-功能关系以及其作用机理均知之甚少。尽管已解决和报道了100多种适体结构，但几乎没有鉴定出重复的结构基序。
已描述了用于鉴定能够与特定靶标结合的适体的多种不同的适体选择方法。然而，快速且方便地鉴定能够介导对目标靶标的所需功能性作用的适体的能力将对适体治疗(aptamer therapeutics)产生深远的影响。
发明内容
本文提供了与与靶标(例如，靶细胞或靶分子)结合和/或介导对所述靶标的功能性作用的适体的鉴定相关的组合物和方法。例如，在某些实施方案中，本文提供了流通池(例如，用于Illumina测序仪或Polonator测序仪的流通池)，所述流通池在其流动室内包含多个固定的适体簇(例如，来自本文所述的适体文库)和任选地，一个或多个靶细胞(例如，癌细胞、免疫细胞等)和/或细胞功能的可检测指示剂(例如，凋亡、细胞增殖、基因或蛋白质表达等的荧光指示剂)。在某些实施方案中，本文提供了使用这种含适体簇的流通池从适体文库中鉴定(例如，在诸如Illumina测序仪的测序仪中)功能性适体的方法。
在某些方面，本文提供了鉴定与靶标(例如，靶细胞、靶病毒、靶蛋白质、细胞上的外形特征)特异性结合的一种或多种适体的方法。在一些实施方案中，该方法包括(i)使固定在表面(例如，流通池表面)上的多个适体簇与靶标接触；以及(ii)鉴定与所述靶标结合的固定的适体簇。在某些实施方案中，所述方法还包括在步骤(i)之后进行洗涤步骤以从表面(例如，流通池表面)去除未结合的靶标。在一些实施方案中，将靶标可检测地标记(例如，荧光标记)。
在一些方面，本文提供了用于鉴定调节细胞(例如，原核细胞或真核细胞)特性的一种或多种适体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)使固定在表面上的多个适体簇与细胞接触；以及(ii)鉴定调节细胞性质(例如，细胞生存力、细胞增殖、基因表达、细胞形态等)的固定的适体簇。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(i)之后进行洗涤步骤以从表面(例如，流通池表面)去除未结合的靶标。在一些实施方案中，细胞包含可检测标记物(例如，荧光染料，诸如钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料)。在一些实施方案中，细胞性质的改变引起可检测标记物的性质的变化，检测所述可检测标记物的性质变化以鉴定调节细胞性质的固定的适体簇。
在一些方面，本文提供了用于鉴定具有调节靶标(例如，靶分子，诸如靶蛋白质)的功能特性(例如，酶促特性)的一种或多种适体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括(i)使固定在表面上的多个适体簇与靶标接触；以及(ii)鉴定调节所述靶标(例如，裂解靶标、诱导靶标发生化学或结构变化等)的固定的适体簇。在一些实施方案中，所述方法还包括在步骤(i)之后执行洗涤步骤以从流通池中去除未结合的靶标。
在某些实施方案中，该方法还包括产生固定的适体簇。在一些实施方案中，通过以下方式产生固定的适体簇：(a)将多个适体(例如，来自适体文库)固定在表面上；以及(b)在流通池表面上局部扩增多个固定的适体(例如，通过桥式PCR或滚环扩增)，以形成多个固定的适体簇。在一些实施方案中，所述方法还包括从所述固定的适体簇中除去互补链以提供单链的固定的适体簇。在某些实施方案中，在步骤(b)之后对固定的适体簇进行测序(例如，使用Illumina测序或Polonator测序)。在一些实施方案中，通过直接在表面上印刷适体簇(例如，来自适体文库)来产生固定的适体簇。在一些实施方案中，所述方法包括产生适体文库(例如，通过化学核酸合成)。
在某些方面，本文提供了包含适体簇(例如，成簇的适体文库)的组合物。在某些实施方案中，将适体簇固定在固体支持物(例如，流通池)上。在某些实施方案中，所述组合物还包含靶标(例如，靶细胞、靶分子、靶蛋白)。在某些实施方案中，组合物还包含可检测标记物(例如，荧光染料，诸如钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料)。在一些实施方案中，所述组合物包含104–109个适体簇(例如，至少约104、5x104、105、5x105、106、5x105、106、5x106、107、5x107或108个适体簇)。在一些实施方案中，文库中的每个簇包含103–106个适体(例如，至少约103、5x103、104、5x104、105、5x105个适体/簇)。
附图说明
图1是根据本文描述的某些实施方案的适体合成、测序和靶标鉴定工作流程的示意图。
图2是显示靶细胞(Hana细胞)与适体文库(Lib)、具有随机序列的短适体或长适体、针对特定靶细胞周期6和7(分别为Cyc6和Cyc7)的SELEX选择方法的适体输出、来自SELEX选择过程的特定适体序列(Apt1和Apt2)以及Illumina GAIIx流通池上的空白泳道(空)的结合的条形图。使细胞沿流通池泳道运行，并对结合的细胞计数(结合的对比未结合的，以分数表示，1＝100％的细胞)。
图3是与流通池上的适体结合的细胞的图像。该图显示细胞相对于表面随时间的运动。该图显示了所述细胞被固定的适体簇保留，而不是附着于表面本身，因此可以自由移动，但局限于该位置。在Illumina GAIIx上进行成像。
图4是根据本文提供的某些示例性实施方案的某些适体结构的示意图。
图5包括三个图像，并且举例说明了根据本文公开的某些实施方案的示例性适体鉴定方法。图A是基于流通池的适体检测方法的示意图。对初始适体文库进行测序，并产生流通池，其中来自文库的适体簇集在唯一坐标处。用针对一个或多个生物作用(例如凋亡)的荧光指示剂标记阳性靶标(例如肿瘤活检细胞)和阴性靶标(例如外周血)，并将其引入其上固定有适体簇的流通池的不同通道。孵育后，检测荧光并将其与其上固定有适体簇的流通池上的位置发生关联。根据有效性是/否(有效/无效)和选择性是/否(选择性/无选择性)对适体评进行分。合成得分最高的寡聚物(E+S)并进行验证。图B显示测序后流通池的照片，该照片保存在定制适配器中，用于筛选荧光显微镜。图C是在进行要求保护的方法的实施方案期间获得的荧光显微镜图像的屏幕截图，其显示了孵育后的靶细胞，其中凋亡细胞产生阳性信号。
具体实施方式
概述
本文提供了与鉴定与靶标(例如，靶细胞或靶分子)结合和/或介导对所述靶标的功能性作用的适体相关的方法和组合物。在某些实施方案中，所述方法包括使靶标与固定在表面上的多个适体簇接触。因此，在一些实施方案中，所述方法包括使包含靶标的溶液流过已经固定有适体簇的流通池的表面，并检测哪些适体簇与靶标结合、与其相互作用和/或介导对其的功能性作用。
在某些实施方案中，每个固定的适体簇的序列是已知的和/或确定的，例如，通过对适体簇进行测序或将已知序列的适体印刷在表面的预定位置上。因此，通过确定靶标在其处与适体簇结合、与其相互作用和/或受其调节的表面上的位置，可使相关作用与该位置上的适体序列发生关联。
例如，在一些实施方案中，通过使包含靶标的组合物运行通过已在其上的已知位置处固定有序列已知的适体簇的表面来鉴定与靶标结合的适体，所述靶标包含可检测标记物(例如，荧光标记物)。确定(例如，使用荧光显微镜)表面上保留靶标的位置，表明固定在那些位置上的适体与靶标结合。
在某些实施方案中，通过使包含靶标的组合物运行通过已在其上的已知位置处固定有序列已知的适体簇的表面来鉴定在功能上调节靶标的适体，所述靶标包含指示被调节的功能的可检测标记物(例如，荧光染料，诸如钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料)。确定(例如，使用荧光显微镜检查)表面上处于其处的可检测标记物指示靶标被调节的位置，表明固定在那些位置上的适体能够调节所述靶标，
在某些方面，本文还提供了与在表面上产生固定的适体簇相关的方法和组合物。在一些实施方案中，将适体(例如，来自本文公开的适体文库)固定在表面(诸如流通池表面)上。在一些实施方案中，然后执行局部扩增方法，诸如桥式扩增或滚环扩增，以产生适体簇。然后可对适体簇进行测序(例如，通过Illumina测序或Polonator测序)，以使每个适体簇的序列与表面上的位置发生关联。可以剥离互补链以产生单链适体簇。然后准备将表面(例如，流通池)用于本文提供的适体鉴定方法。
方便地，在某些实施方案中，可在Illumina测序仪(诸如Illumina GAIIx仪)中执行本文提供的方法中的所有步骤。
在某些方面，本文提供了包含适体簇(例如，在执行本文提供的方法期间产生的簇生适体文库(clustered aptamer library))的组合物。在某些实施方案中，将适体簇固定在固体支持物(例如，流通池)上。在某些实施方案中，组合物还包含靶标(例如，靶细胞、靶分子、靶蛋白)。在某些实施方案中，组合物还包含可检测标记物(例如，荧光染料，者如钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料)。在一些实施方案中，所述组合物包含104–109个适体簇(例如，至少约104、5x104、105、5x105、106、5x105、106、5x106、107、5x107或108个适体簇)。在一些实施方案中，文库中的每个簇包含103–106个适体(例如，至少约103、5x103、104、5x104、105、5x105个适体/簇)。
在一些实施方案中，靶标可以是任何类型的细胞(例如原核细胞，诸如细菌细胞，或真核细胞，诸如哺乳动物细胞)、病毒、蛋白质和/或颗粒。在一些实施方案中，将颗粒附着至靶标。
在一些实施方案中，可检测标记物是具有功能的荧光报告分子。在一些实施方案中，具有功能的荧光报告分子是细胞死亡报告分子、氧化还原电位报告分子、膜完整性报告分子。在一些实施方案中，具有功能的荧光报告分子是病毒报告分子，诸如衣壳完整性报告分子(例如，用于测量病毒的衣壳完整性和/或功能的报告分子)。在一些实施方案中，具有功能的荧光报告分子是蛋白质报告分子，诸如蛋白质完整性报告分子(即，用于测量蛋白质的结构完整性和稳定性的报告分子)或蛋白质变性报告分子(即，用于检测蛋白质变性的报告分子)。
细胞死亡报告分子的实例是7-AAD和膜联蛋白V荧光团。在某些实施方案中，靶标与可检测标记物连接、被可检测标记物结合或包含可检测标记物，所述可检测标记物允许检测对靶标的生物学或化学作用。在一些实施方案中，可检测标记物是荧光染料。荧光染料的非限制性实例包括但不限于钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料和氧化还原电位染料。在一个实施方案中，用钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料标记靶标。
在某些实施方案中，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶标。在另一个实施方案中，在将适体暴露于靶标之前，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记所述靶标。
在一些实施方案中，用钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料标记靶细胞。在某些实施方案中，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、细胞凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶细胞。在另一个实施方案中，在将适体暴露于靶细胞之前，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记所述靶细胞。在一些实施方案中，在将适体暴露于靶标之后标记靶细胞。在一个实施方案中，用荧光标记的抗体或其抗原结合片段、膜联蛋白V、荧光标记的融合蛋白、荧光标记的糖或荧光标记的凝集素标记靶细胞。在一个实施方案中，在将适体暴露于细胞后，用荧光标记的抗体或其抗原结合片段、膜联蛋白V、荧光标记的融合蛋白、荧光标记的糖或荧光标记的凝集素标记靶细胞。
在一些实施方案中，将适体簇固定在流通池上(例如，将流通池用于基于图像的DNA测序，诸如Illumina仪流通池和/或Polonator测序仪流通池)。在某些实施方案中，流通池可由任何材料制成。在一些实施方案中，流通池由塑料、玻璃、聚合物或金属制成。在一些实施方案中，流通池是板、托盘或芯片。在一些实施方案中，流通池在其底部与顶部(ceiling)之间包含以下一种或多种：空气、水、水性缓冲液、培养基、血清、患者来源的样品(例如血液、血浆、血清、尿液)、基质(例如凝胶)、聚合物和/或蛋白质(例如胶原(collage)或患者来源的细胞外基质)。在一些实施方案中，流通池包含靶标(例如，靶细胞)。在一些实施方案中，流通池(例如其底部和/或其顶部)涂覆有阻断剂，诸如聚合物、蛋白质、寡核苷酸、脂质和/或化学基团。在一些实施方案中，流通池包含任何长度的锚以将靶标结合到簇附近。在一些实施方案中，所述锚是聚合物、蛋白质、寡核苷酸、脂质和/或化学基团。
在一些实施方案中，将适体簇在流通池中随机排列。在其它实施方案中，在流通池中按照特定图案排列适体簇。在一些实施方案中，流通池在任何阶段都是固定的。在一些实施方案中，组合物还包含固定剂。在一些实施方案中，流通池用于寡核苷酸选择的迭代过程。在其它实施方案中，将流通池用于寡核苷酸选择的非迭代过程。
在某些实施方案中，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶标。在另一个实施方案中，在将适体暴露于靶标之前，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记所述靶标。
定义
为方便起见，此处收集了说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语。
冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”在本文中用于指代一个或不止一个(例如，指至少一个)该冠词的语法对象。例如，“一个/种(an)元件”是指一个/种元件或不止一个/种元件。
如本文中所用，术语“适体”是指能够与蛋白质或肽靶标或靶细胞上的外形特征特异性结合的短(例如，少于200个碱基)的单链核酸分子(ssDNA和/或ssRNA)。
如本文中所用，术语“适体簇”是指具有相同序列的局部固定的适体(例如，至少10个)的集合。
术语“结合”或“相互作用”是指例如在生理条件下由于例如静电相互作用、疏水相互作用、离子相互作用和/或氢键相互作用而产生的两个分子之间(例如，适体与靶标之间)的缔合(其可以是稳定的缔合)。
如本文中所用，如果两个核酸序列在每个位置彼此碱基配对，则它们彼此“互补”或彼此之间是“互补的”。
如本文所用，如果两个核酸序列均与同一核酸序列互补，则它们彼此“对应”。
术语“调节”在用于提及功能特性或生物活性或过程(例如，酶活性或受体结合)时，是指上调(例如，激活或刺激)、下调(例如，抑制或压抑)或以其它方式改变此类特性、活性或过程的性质的能力。在某些情况下，这种调节可能取决于特定事件的发生(诸如信号转导通路的激活)，和/或可能仅在特定的细胞类型中表现出来。
如本文中所用，“特异性结合”是指适体与预定靶标结合的能力。典型地，适体以对应于约10-7M或更小、约10-8M或更小或约10-9M或更小的KD的亲和力与其靶特异性结合，并以显著小于(例如，小至至多1/2，小至至多1/5，小至至多1/10，小至至多1/50，小至至多1/100，小至至多1/500或小至至多1/1000)其对非特异性和无关靶标(例如BSA、酪蛋白或无关细胞，诸如HEK293细胞或大肠杆菌(E.coli)细胞))的结合亲和力的KD与靶标结合。
如本文中所用，两个寡核苷酸的Tm或解链温度是50％的寡核苷酸/靶标被结合且50％的所述寡核苷酸靶分子未被结合时的温度。两个寡核苷酸的Tm值是寡核苷酸浓度依赖性，并受反应混合物中一价、二价阳离子的浓度影响。Tm可凭经验确定或使用如SantaLucia,J.PNAS(USA)95:1460-1465(1998)(其由此通过引用并入)中描述的最近邻公式(nearestneighbor formula)计算。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用。它们是指具有任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物)的聚合物形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连锁分析定义的多个基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、合成多核苷酸、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸成分中断。可进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记组分缀合。
适体文库
在某些实施方案中，本文提供的方法和组合物涉及从适体文库中存在的适体中鉴定具有所需性质的适体。如本文中所用，适体文库是具有独特序列(例如，至少102、103、104、105、106或107种独特序列)的核酸分子(例如DNA和/或RNA)的集合，并且其中构建至少一个亚组的核酸分子，使得它们能够与靶蛋白、肽或细胞外形特征特异性结合。在一些实施方案中，任何潜在适体的文库可用于本文提供的方法和组合物。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的适体文库由具有根据式(I)的序列的核酸分子(例如，DNA和/或RNA)组成，和/或基本上由其组成：
P1-R-P2(I)，
其中P1是5'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；P2是3'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；并且R是包含随机定位的碱基的序列，其长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基。
在一个实施方案中，R是包含约25％的A的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的T的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的G的序列。在另一个实施方案中，R是序列包含约25％的C的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的A、约25％的T、约25％的G和约25％的C的序列。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的适体文库包含具有以下式(I)的序列的核酸分子(DNA和/或RNA)、由所述核酸分子组成和/或基本上由所述核酸分子组成：
P1-R"-P2(I)，
其中P1是5'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；P2是3'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；并且R”是长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的序列，所述序列包含来自偏向性混合物(biasedmixture)的随机定位的碱基或随机串与重复性或偏向性串的任意组合。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的适体文库包含具有根据式II的序列的核酸分子(DNA和/或RNA)(在图4A中提供了示例性示意图)，由所述核酸分子组成和/或基本上由所述核酸分子组成，
P1-S1-L1-S1*-S2-L2-S2*-P2(II)，
其中：
P1是5'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；P2是3'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；S1和S2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基)的茎区域序列；S1*为S1的互补序列；S2*为S2的互补序列；L1和L2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为1至50个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基)的环区域序列；并且S1-L1-S1*-S2-L2-S2*的总长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或总长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的适体文库包含具有根据式III的序列的核酸分子(DNA和/或RNA)(图4B中提供了示例性示意图)，由所述核酸分子组成和/或基本上由所述核酸分子组成：
P1-S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*-P2(III)，
其中：
P1是5'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；P2是3'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基，或者长度约为15至30个碱基；
S1和S2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基)的茎区域序列；S1*是S1的互补序列；S2*是S2的互补序列；
L1和L2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为1至50个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基)的环区域序列；以及
S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*的总长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基长度和/或总长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的适体文库包含具有根据式IV的序列的核酸分子(DNA和/或RNA)(图4C中提供了示例性示意图)，由所述核酸分子组成和/或基本上由所述核酸分子组成：
P1-Lib-M1/M2-D-M1/M2*-Lib-P2(IV)，
其中：
P1是5'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；P2是3'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；
Lib是具有选自以下的式的序列：(i)R；(ii)R"；(iii)S1-L1-S1*-S2-L2-S2*以及(iv)S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*；
R是包含长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的随机定位的碱基的序列；
R”是长度约为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的序列，其包含来自偏向性混合物的随机定位的碱基或随机串与重复性或偏向性串的任意组合；
S1和S2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基)的茎区域序列；S1*是S1的互补序列；S2*是S2的互补序列；
L1和L2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为1至50个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基)的环区域序列；
其中S1-L1-S1*-S2-L2-S2*的总长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或总长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基；
D是包含至少一个碱基(例如，长度约为1至20个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基)的间隔子序列；
M1是长度约为10至18个碱基或长度为10、11、12、13、14、15、16、17或18个碱基的形成多聚体的结构域序列，所述结构域序列使得该序列的一条链能够与另一条包含互补结构域的链相互作用；以及
M2是M1的互补结构域，其包含与M1序列的链相互作用的链。
在一些实施方案中，本文提供的方法和组合物中使用的适体文库包含具有根据式V的序列的核酸分子(DNA和/或RNA)(图4D中提供了示例性示意图)，由所述核酸分子组成和/或基本上由所述核酸分子组成：
P1-Lib-T*-Lib-P2(V)，
其中：
P1是5'引物位点序列，长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；P2是3'引物位点序列，其长度约为10至100个碱基，长度约为10至50个碱基，长度约为10至30个碱基，长度约为15至50个碱基或长度约为15至30个碱基；
Lib是具有选自以下的式的序列：(i)R；(ii)R"；(iii)S1-L1-S1*-S2-L2-S2*以及(iv)S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*；
R是包含长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的随机定位的碱基的序列；
R”是长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的序列，其包含来自偏向性混合物的随机定位的碱基或随机串与重复性或偏向性串的任意组合；
S1和S2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基)的茎区域序列；S1*是S1的互补序列；S2*是S2的互补序列；
L1和L2各自独立地是至少一个碱基(例如，长度约为1至50个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基)的环区域序列；
其中S1-L1-S1*-S2-L2-S2*的总长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或总长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基；
T是通过Watson/Crick或Hoogsteen碱基配对与Lib序列的任何部分或T*结合的第二条链，其中该链任选地在其5'和3'末端包含未配对的结构域(例如，以促进功能性部分与适体连接)；以及
T*是专用结构域序列(例如，长度约为4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基)。
在上述式的一些实施方案中，R是长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的来自任何随机混合物(例如，对于规范碱基，25％A、25％T、25％G、25％C)的随机定位的碱基。
在上述式的一个实施方案中，R是包含约25％的A的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的T的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的G的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的C的序列。在另一个实施方案中，R是包含约25％的A、约25％的T、约25％的G和约25％的C的序列。
在上述式的一些实施方案中，R”是包含来自偏向性混合物(例如，对于规范碱基，每种碱基偏离25％的任何混合物)的随机定位的碱基的序列。在一些实施方案中，R”是包含约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的A的序列。在一些实施方案中，R"是包含约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的T的序列。在一些实施方案中，R"是包含约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的C的序列。在一些实施方案中，R"是包含约0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的G的序列。在一些实施方案中，R"是包含随机串(串是包括单个碱基的任何序列)与重复串或偏向性串的任意组合的序列。
在上述式的一些实施方案中，R”是来自偏向性混合物(例如，对于规范碱基，每种碱基偏离25％的任何混合物)的随机定位的碱基；或长度约为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个碱基和/或长度不超过约120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55或50个碱基的随机串(串是包括单个碱基的任何序列)与重复性或偏向性串的任意组合。
在上述式的一些实施方案中，S1是至少1个碱基或更多碱基的茎区域序列。在其它实施方案中，S1是长度为约4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基的茎区域序列。
在上述式的一些实施方案中，S2是至少1个碱基或更多碱基的茎区域序列。在其它实施方案中，S2是长度为约4至40个碱基或长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基的茎区域序列。
在上述式的一些实施方案中，L1是至少一个碱基的环区域序列。在其它实施方案中，L1是长度约为1至50个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基的环区域序列。
在上述式的一些实施方案中，L2是至少一个碱基的环区序列。在其它实施方案中，L2是长度约为1至50个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碱基的环区域序列。
在上述式的一些实施方案中，T可在其5’和3’末端包括未配对的结构域，或者其可以是挂锁尾部(padlocktail)(例如，与所述文库配对的两个结构域之间的环)。
本公开的适体可包含任何数量的茎和环，以及由茎和环组成的其它结构(例如，发夹、凸出(bulges)等)。在一些实施方案中，适体中的环包含为了形成稳定的环-环WC配对(其形成与主文库轴正交的茎)而植入的碱基。在其它实施方案中，适体中的两个环一起形成正交茎。在其它实施方案中，适体中的环包含为了与沿主文库轴存在的茎形成稳定的Hoogsteen配对而植入的碱基。在其它实施方案中，适体中的环可与适体中的任何茎形成Hoogsteen配对。
在上述式的一些实施方案中，适体序列还包含一个或多个形成多聚体的结构域。
在上述式的一些实施方案中，适体序列还包含一个或多个间隔子(例如，长度约为1至20个碱基或长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基)。
本公开的适体可以以多种方式制备。在一实施方案中，通过化学合成制备适体。在另一个实施方案中，通过酶促合成制备适体。在一个实施方案中，可使用可在模板存在或不存在的情况下添加核苷酸以延长引物的任何酶来进行酶促合成。在一些实施方案中，通过将k-聚体(例如，k≥2个碱基)组装在一起来制备适体。
在一些实施方案中，本公开的适体可包含DNA、RNA及其天然和/或合成类似物的任意组合。在一实施方案中，适体包含DNA。在一个实施方案中，适体包含RNA。
在其它实施方案中，本公开的适体可在5'末端、3'末端或内部包含任何修饰。适体的修饰包括但不限于间隔子、磷酸化、接头、缀合化学、荧光团、猝灭剂、光反应性和经修饰的碱基(例如，LNA、PNA、UNA、PS、甲基化、2-O-甲基、卤化、超碱基、异-dN、反向碱基(inverted bases)、L-核糖、其它糖类为主链等)。
在一些实施方案中，可将本公开的适体在5'端、3'端或内部与外部非核酸分子缀合。非核酸分子的非限制性实例包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、小分子药物、单糖和多糖、脂质、抗体和抗体片段或其组合。
本公开的适体可包含具有生物功能的任何结构域。本文描述的适体的生物功能的非限制性实例包括但不限于充当RNA转录的模板、与蛋白质结合、识别蛋白质和/或调节蛋白质的活性、与转录因子、专门的核酸结构(例如，Z-DNA、H-DNA、G-quad等)结合以及充当限制酶、特异性外切核酸酶和内切核酸酶的酶促底物、重组位点、编辑位点或siRNA。在一实施方案中，适体调节至少一种蛋白质的活性。在另一个实施方案中，适体抑制至少一种蛋白质的活性。在另一个实施方案中，适体抑制至少一种蛋白质的活性。
在其它实施方案中，本公开的适体可包含用于整合到通过几种已知方法(Shih等，Nature 427:618-621(2004)；Rothemund,Nature 440:297-302(2006)；Zheng等，Nature461:74-77(2009)；Dietz等，Science 325:725-730(2009)；Wei等，Nature 485:623-626(2012)；Ke等，Science 338:1177-1183(2012)；Douglas等，Science 335:831-834(2012)，每一篇所述文献由此通过引用并入)中的任一种构建的核酸纳米结构中的任何结构域。在其它实施方案中，本公开的适体可包含在分子逻辑和计算中起作用的任何结构域(Seelig等，Science 314:1585-1588(2006)；Macdonald等，Nano Lett 6:2598-2603(2006)；Qian等，Nature 475:368-372(2011)；Douglas等，Science 335:831-834(2012)；Amir等，NatNanotechnol9:353-357(2014)，每一篇所述文献由此通过引用并入)。
在一些实施方案中，本公开的适体相对于靶标(例如，真核或原核细胞、病毒或病毒颗粒、分子、组织或整个生物体、体内或离体)经历一轮或多轮负选择。在其它实施方案中，本发明的适体相对于靶标(例如，真核或原核细胞、病毒或病毒颗粒、分子、组织或整个生物体、体内或离体)经历一轮或多轮正选择。
本公开的适体可存在于溶液中或附着于固相(例如，表面、颗粒、树脂、基质等)。在一些实施方案中，适体附着于表面。在一实施方案中，所述表面是流通池表面。
在一些实施方案中，在适体文库中合成本公开的适体。本公开的适体文库可以多种方式制备。在一实施方案中，通过化学合成制备适体文库。在另一个实施方案中，通过酶促合成制备适体文库。在一个实施方案中，可使用在模板存在或不存在的情况下可添加核苷酸以延长引物的任何酶来进行酶促合成。
在一些实施方案中，在适体文库中合成的适体可包含DNA、RNA及其天然和/或合成类似物的任意组合。在一个实施方案中，在适体文库中合成的适体包含DNA。在一个实施方案中，在适体文库中合成的适体包含RNA。
在一些实施方案中，在适体文库中合成的适体是具有10K个种类(K≥2)的核酸(例如，DNA、RNA、天然或合成碱基、碱基类似物或其组合)集合，其中每个种类具有Z个拷贝(1≤Z≤K-1)。
在其它实施方案中，在本公开的适体文库中合成的适体可在5'末端、3'末端或内部包含任何修饰。适体的修饰包括但不限于间隔子、磷酸化、接头、缀合化学、荧光团、猝灭剂、光反应性修饰和经修饰的碱基(例如，LNA、PNA、UNA、PS、甲基化、2-O-甲基、卤化、超碱基、异-dN、反向碱基、L-核糖、其它糖类为主链)。
在一些实施方案中，可将在适体文库中合成的适体在5'末端、3'末端或内部与外部非核酸分子缀合。非核酸分子的非限制性实例包括但不限于氨基酸、肽、蛋白质、小分子药物、单糖和多糖、脂质、抗体和抗体片段或其组合。
在适体文库中合成的适体可包含具有生物功能的任何结构域。本文描述的适体的生物功能的非限制性实例包括但不限于充当RNA转录的模板、与蛋白质结合、识别蛋白质和/或调节蛋白质的活性、与转录因子、专门的核酸结构(例如，Z-DNA、H-DNA、G-quad等)结合、充当限制酶、特定外切核酸酶和内切核酸酶的酶促底物、重组位点、编辑位点或siRNA。在一个实施方案中，在适体文库中合成的适体调节至少一种蛋白质的活性。在另一个实施方案中，在适体文库中合成的适体抑制至少一种蛋白质的活性。在另一个实施方案中，在适体文库中合成的适体抑制至少一种蛋白质的活性。
在其它实施方案中，在适体文库中合成的适体可包含用于整合到通过几种已知方法(Shih等，Nature 427:618-621(2004)；Rothemund,Nature 440:297-302(2006)；Zheng等，Nature 461:74-77(2009)；Dietz等，Science 325:725-730(2009)；Wei等，Nature 485:623-626(2012)；Ke等，Science 338:1177-1183(2012)；Douglas等，Science 335:831-834(2012)，每一篇所述文献由此通过引用并入)。在其它实施方案中，本公开的适体可包含在分子逻辑和计算中起作用的任何结构域(Seelig等，Science 314:1585-1588(2006)；Macdonald等，Nano Lett 6:2598-2603(2006)；Qian等，Nature 475:368-372(2011)；Douglas等，Science 335:831-834(2012)；Amir等，Nat Nanotechnol9:353-357(2014)，每一篇所述文献由此通过引用并)。
在一些实施方案中，在适体库中合成的适体相对于靶标(例如，真核或原核细胞、病毒或病毒颗粒、分子、组织或整个生物体、体内或离体)经历一轮或多轮负选择。在其它实施方案中，本公开的适体相对于靶标(例如，真核或原核细胞、病毒或病毒颗粒、分子、组织或整个生物体、体内或离体)经历一轮或多轮正选择。
在适体文库中合成的适体可存在于溶液中或附着于固相(例如，表面、颗粒、树脂、基质等)。在一些实施方案中，在适体文库中合成的适体附着于表面。在一实施方案中，该表面是流通池表面。
固定的适体簇
在某些方面，本文提供了用于通过使包含靶标的样品流过固定在表面上的多个适体簇(例如，来自本文提供的适体文库的适体簇)来鉴定与靶标结合和/或调节靶标的适体的方法。在某些实施方案中，所述表面可以是任何固体支持物。在一些实施方案中，所述表面是流通池的表面。在一些实施方案中，所述表面是载玻片或芯片(例如，基因芯片的表面)。在一些实施方案中，表面是珠粒(例如，顺磁性珠粒)。
在某些实施方案中，可使用本领域已知的任何方法在表面上产生固定的适体簇。在一些实施方案中，将适体簇直接印刷在表面上。例如，在一些实施方案中，将适体簇用细尖针印刷到载玻片上，使用光刻法印刷、使用喷墨打印印刷，或者通过电化学印刷在微电极阵列上。在一些实施方案中，将至少约102、103、104、105、106或107个不同的适体簇印刷在表面上。在一些实施方案中，每个适体簇包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个相同的适体分子。有利地，微阵列的直接印刷允许将序列已知的适体特异性地固定在表面上的预定位置，因此随后的测序可能是不必要的。
在某些实施方案中，通过首先将适体(例如，来自本文公开的适体文库)固定在表面上(例如，其中每个适体被固定的位置是随机的)来产生表面固定的适体簇。在一些实施方案中，将至少约102、103、104、105、106、107、108、109或1010个不同的适体固定在表面上。适体固定之后，然后进行局部扩增方法(例如，桥式扩增或滚环扩增)以产生位于原始固定适体的固定位点附近的每个固定适体的拷贝簇。在某些实施方案(例如，进行滚环扩增的实施方案)中，适体簇被容纳在表面上的纳米坑或孔中，而不是直接被固定在表面上。在一些实施方案中，扩增导致每个适体簇包含至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个相同的适体分子。在某些实施方案中，然后对适体簇进行测序(例如，通过Illumina测序或Polonator测序)，以使每个适体簇的序列与其在表面上的位置发生关联。如果存在的话，可通过在不适合链杂交的条件下(例如，由于盐浓度和/或温度)洗涤表面，从适体簇上剥离互补链，以产生单链适体簇。然后表面(例如流通池)可随时用于本文提供的适体鉴定方法。在一些实施方案中，在一个仪器上制备固定的适体簇和/或对其进行测序，然后将其转移至单独的仪器中以鉴定适体。在其它实施方案中，在用于适体鉴定的同一仪器上制备适体簇和/或对其进行测序。
在上述方法的一些实施方案中，适体或适体簇(例如，来自适体文库)包含衔接子，其将使适体达到表面高度(例如，在表面不平坦的情况下，例如在包括孔的流通池中)。在一个实施方案中，将适体或适体簇固定在流通池表面上的孔内部，并且使用衔接子将适体结合至表面，以使适体达到表面高度。在一些实施方案中，衔接子是核酸衔接子(例如，长度为至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个碱基的序列)。在一些实施方案中，在适体筛选之前，将与衔接子序列互补的序列与衔接子杂交。在一些实施方案中，衔接子是化学衔接子(例如，将适体连接到表面的聚合物)。
适体文库筛选
在某些方面，本文提供了用于鉴定与靶特异性结合和/或调节靶标的一种或多种适体的方法，该方法通常包括：(i)使固定在表面上的多个适体簇与靶标接触；以及(ii)鉴定与靶特异性结合和/或调节靶标的固定的适体簇。因为每个适体簇的序列与表面上的特定位置相关(例如，根据本文提供的方法确定的)，所以鉴定负责结合/调节的适体的序列以及可确定结合和/或调节靶标的位置可。
在一些实施方案中，靶标用可检测标记物进行标记和/或包含可检测标记物。可以直接(例如，通过直接的化学接头)或间接(例如，使用可检测地标记的靶特异性抗体)地可检测地标记靶。在靶标是细胞的实施方案中，可通过在可检测标记物被细胞内化的条件下将靶细胞与所述可检测标记物一起孵育来标记对其进行标记。在一些实施方案中，在进行本文所述的适体筛选方法之前，对靶标进行可检测地标记。在一些实施方案中，在执行本文提供的适体筛选方法期间标记靶标。在一些实施方案中，在将靶标与适体簇结合之后对其进行标记(例如，通过使结合的靶标与可检测地标记的抗体接触)。在一些实施方案中，可使用任何可检测标记物。可检测标记物的实例包括但不限于荧光部分、放射性部分、顺磁性部分、发光部分和/或比色部分。在一些实施方案中，本文所述的靶与荧光部分连接，包含荧光部分和/或被荧光部分结合。荧光部分的实例包括但不限于别藻蓝蛋白、荧光素、藻红蛋白、多甲藻叶绿素(Peridinin-chlorophyll)蛋白复合物、Alexa Fluor 350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor 514、AlexaFluor 532、AlexaFluor 546、AlexaFluor 555、AlexaFluor 568、AlexaFluor 594、AlexaFluor 633、AlexaFluor 635、AlexaFluor 647、AlexaFluor 660、AlexaFluor 680、AlexaFluor 700、AlexaFluor 750、AlexaFluor 790、EGFP、mPlum、mCherry、mOrange、mKO、EYFP、mCitrine、Venus、YPet、Emerald、Cerulean和CyPet。
靶标可以是非分子或超分子靶标。本公开的适体可以结合和/或调节的靶标的非限制性实例包括但不限于细胞、细菌、真菌、古细菌、原生动物、病毒、病毒体颗粒、合成和天然存在的微观察颗粒和脂质体。在一些实施方案中，引入流通池的靶标是活的/天然的。在其它实施方案中，引入流通池中的靶标被固定在任何溶液中。
在一些实施方案中，靶标是细胞。在一些实施方案中，细胞是原核细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌细胞。细菌的非限制性实例包括曲霉菌属(Aspergillus)、布鲁格丝虫属(Brugia)、念珠菌属(Candida)、衣原体属(Chlamydia)、球菌属(Coccidia)、隐球菌属(Cryptococcus)、恶丝虫属(Dirofilaria)、淋球菌属(Gonococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、克雷伯菌属(Klebsiella)、军团菌属(Legionella)、利什曼原虫属(Leishmania)、脑膜炎球菌属(Meningococci)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体(Mycoplasma)、草履虫属(Paramecium)，百日咳(Pertussis)、疟原虫属(Plasmodium)，肺炎球菌属(Pneumococcus)、肺囊虫属(Pneumocystis)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次体属(Rickettsia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、弓形虫属(Toxoplasma)和霍乱弧菌属(Vibriocholerae)。示例性物种包括淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhea)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白色念珠菌(Candida albicans)、热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)、阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)、阴道嗜血菌(Haemophilusvaginalis)、B群链球菌属某种(Group B Streptococcus sp)、人型支原体(Microplasmahominis)、杜氏嗜血菌(Hemophilus ducreyi)、腹股沟肉芽肿(Granuloma inguinale)、腹股沟淋巴肉芽肿(Lymphopathia venereum)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、牛布鲁氏菌(Brucellasuis)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、胎儿弯曲菌(Campylobacter fetus)、胎儿肠弯曲杆菌(Campylobacter fetus intestinalis)、波蒙那钩端螺旋体(Leptospira pomona)、单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、绵羊布鲁氏菌(Brucella ovis)、鹦鹉衣原体(Chlamydiapsittaci)、牛毛滴虫(Trichomonasfoetus)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、马驹放线杆菌(Actinobacillus equuli)、羊流产沙门菌(Salmonella abortusovis)、马流产沙门菌(Salmonella abortusequi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、马棒杆菌(Corynebacterium equi)、化脓棒杆菌(Corynebacterium pyogenes)、精液放线杆菌(Actinobaccilus seminis)、牛生殖道支原体(Mycoplasma bovigenitalium)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、分枝犁头霉(Absidia ramosa)、马媾疫锥虫(Trypanosoma equiperdum)、驽巴贝斯虫病(Babesiacaballi)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)和肉毒梭菌(Clostridium botulinum)。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是动物细胞(例如，哺乳动物细胞)。在一些实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞来自非人类动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、猪、牛(例如，母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、美洲驼羊、鸡、猫、狗、雪貂或灵长类动物(例如狨猴、恒河猴)。在一些实施方案中、所述细胞是寄生虫细胞(例如，疟疾细胞、利什曼原虫细胞、隐孢子虫细胞或变形虫细胞)。在一些实施方案中、所述细胞是真菌细胞，诸如，例如巴西副球菌(Paracoccidioides brasiliensis)。
在一些实施方案中，细胞是癌细胞(例如，人癌细胞)。在一些实施方案中，细胞来自任何癌性或癌前肿瘤。癌细胞的非限制性实例包括来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠道、树胶、头、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌细胞。另外，所述癌症可以具体地是以下组织学类型(尽管不限于这些)：肿瘤(恶性的)、癌、癌、未分化巨细胞癌和梭形细胞癌、小细胞癌、乳头状癌、鳞状细胞癌、淋巴上皮癌、基底细胞癌、毛基质癌、移行细胞癌、乳头状移行细胞癌、腺癌、胃泌素瘤、恶性胆管癌、肝细胞癌、混合型肝细胞-胆管癌(combined hepatocellular carcinoma andcholangiocarcinoma)、小梁性腺癌、腺样囊性癌、腺瘤性息肉内腺癌、腺癌、家族性结肠息肉病、实体癌、类癌瘤(恶性的)、细支气管腺泡状腺癌、乳头状腺癌、嫌色细胞癌、嗜酸细胞癌、嗜酸性腺癌、嗜碱细胞癌、透明细胞腺癌、颗粒细胞腺癌、滤泡腺癌、乳头状和滤泡状腺癌、非包围性硬化性癌、肾上腺皮质细胞癌、内膜样癌、皮肤附属器癌、大汗腺腺癌、皮脂腺癌、盯眝腺腺癌、粘液表皮样癌、囊腺癌、乳头状囊腺癌、乳头状重度囊腺癌、粘液性囊腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌、浸润性导管癌、髓样癌、小叶癌、炎性癌、佩吉特病(乳房的)、腺泡细胞癌、腺鳞癌、腺癌w/鳞状化生、胸腺瘤(恶性的)、卵巢基质肿瘤(恶性的)、泡膜细胞瘤(恶性的)、粒层细胞瘤(恶性的)、睾丸母细胞瘤(恶性的)、塞托利细胞癌、莱迪希细胞瘤(恶性的)、脂质细胞瘤(恶性的)、副神经节瘤(恶性的)、乳房外副神经节瘤(恶性的)、嗜铭细胞瘤、血管球肉瘤、恶性黑素瘤、无黑色素性恶性黑素瘤、浅表扩散性黑素瘤、巨大色素痣中的恶性黑素瘤(malig melanoma in giantpigmentednevus)、上皮样细胞黑素瘤、蓝痣(恶性的)、肉瘤、纤维肉瘤、纤维组织细胞瘤(恶性的)、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、环胎性横纹肌肉瘤(embryonal rhabdomyosarcoma)、小泡型横纹肌肉瘤、基质肉瘤、混合瘤(恶性的)、米勒混合瘤、肾胚细胞瘤、肝母细胞瘤、癌肉瘤、间充质瘤(恶性的)、布伦纳瘤(恶性的)、叶状肿瘤(恶性的)、滑膜肉瘤、间皮瘤(恶性的)、无性细胞瘤、胚胎癌性细胞、畸胎瘤(恶性的)、卵巢甲状腺肿样瘤(恶性的)、绒毛膜癌、中肾瘤(恶性的)、血管肉瘤、血管内皮瘤(恶性的)、卡波西肉瘤、血管外皮细胞瘤(恶性的)、淋巴管肉瘤、骨肉瘤、近皮质骨髓瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤(恶性的)、间质软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、尤因肉瘤、牙源性肿瘤(恶性的)；成釉细胞牙肉瘤、成釉细胞瘤(恶性的)、成釉细胞纤维肉瘤、松果体瘤(恶性的)、脊索瘤、胶质瘤(恶性的)、室管膜瘤、星形细胞瘤、原浆性星形细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、星形母细胞瘤、成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、成少突神经胶质细胞瘤、原始神经外胚层、小脑肉瘤、成神经节细胞瘤、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、嗅神经源性肿瘤、脑膜瘤(恶性的)、神经纤维肉瘤、神经鞘瘤(恶性的)、颗粒细胞瘤(恶性的)、恶性淋巴瘤、霍奇金氏病、霍奇金氏淋巴瘤、类肉芽肿(paragranuloma)、恶性淋巴瘤(小淋巴细胞性)、恶性淋巴瘤(大细胞弥漫性)、恶性淋巴瘤(滤泡性)、蕈样肉芽肿病(mycosis fungoides)、其它规定的非霍奇金氏淋巴瘤、恶性组织细胞增多病、多发性骨髓瘤、肥大细胞肉瘤、免疫增殖性小肠疾病、白血病、淋巴样白血病、浆细胞性白血病、红白血病、淋巴肉瘤细胞性白血病、髓样白血病、嗜碱细胞性白血病、嗜酸细胞性白血病、单核细胞性白血病、肥大细胞白血病、巨核母细胞白血病、髓样肉瘤和毛细胞性白血病。
在一些实施方案中，靶标是病毒。例如，在一些实施方案中，病毒是HIV病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒(例如，HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、Epstein Barr病毒)、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革热病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒或埃博拉病毒。
在一些实施方案中，靶标是蛋白质。在某些实施方案中，当筛选蛋白质靶标时，将它们固定在珠粒(例如，可检测地标记的珠粒)上。在一些实施方案中，将蛋白质靶标连接至可检测部分。靶蛋白的非限制性实例包括糖蛋白IIb/IIIa、TNF-α、TNFα受体，CD52、IL-2Rα、B细胞活化因子，VEGF、CD30、IL-1β、表皮生长因子受体、CD38、RANK配体、补体蛋白C5、CD11a、CD20、CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD3、α-4整联蛋白、IgE、RSVF蛋白、IL-6R、ErbB2、IL-12和IL-23。在一些实施方案中、靶蛋白是癌症相关抗原。与癌症相关的抗原的例子包括但不限于：亲脂蛋白、AIM-2、ALDH1A1、α-辅肌动蛋白-4、-甲胎蛋白(“AFP”)、ALK、ANKRD30A、ARTC1、B-RAF、BAGE-1、BCLX(L)、BCR-ABL融合蛋白b3a2、β-连环蛋白、BING-4、BIRC7、CA-125、CA9、CALCA、癌胚抗原(“CEA”)、CALR、CASP-5、CASP-8、CCR5、CD19、CD20、CD22、CD27、CD274、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD45、CD52、CD56、CD79、Cdc27、CDK12、CDK4、CDKN2A、CEA、CLEC12A、CLPP、COA-1、CPSF、CSNK1A1、CTAG1、CTAG2、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白A1、dek-can融合蛋白、DKK1、EFTUD2、EGFR、EGFR变体III、延伸因子2、ENAH(hMena)、Ep-CAM、EpCAM、EphA2、EphA3、上皮肿瘤抗原(“ETA”)、ERBB3、ERBB4、ETV6-AML1融合蛋白、EZH2、FCRL3、FGF5、FLT3-ITD、FN1、FOLR1、G250/MN/CAIX、GAGE-1,2,8、GAGE-3,4,5,6,7、GAS7、glypican-3、GnTV、gp100/Pmel17、GPNMB、GM3、GPR112、IL3RA、HAUS3、Hepsin、HER-2/neu、HERV-K-MEL、HLA-A11、HLA-A2、HLA-DOB、hsp70-2、IDO1、IGF2B3、IL13Ralpha2、肠羧酸酯酶、K-ras、激肽释放酶4、KIF20A、KIT、KK-LC-1、KKLC1、KM-HN-1、KMHN1(也称为CCDC110)、KRAS、LAGE-1、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、Lengsin、LGR5、LMP2、M-CSF、MAGE-A1、MAGE-A10、MAGE-A12、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A9、MAGE-C1、MAGE-C2、苹果酸酶、乳腺珠蛋白-A、MART2、MATN、MC1R、MCSP、mdm-2、ME1、Melan-A/MART-1、Meloe、Midkine、MMP-2、MMP-7、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC5AC、MUC16、粘蛋白、MUM-1、MUM-2、MUM-3、肌球蛋白、I类肌球蛋白、N-raw、NA88-A、neo-PAP、NFYC、NY-BR-1、NY-ESO-1/LAGE-2、OA1、OGT、OS-9、OX40、P多肽、p53、PAP、PAX3、PAX5、PBF、PLAC1、PMEL、pml-RARalpha融合蛋白、多态性上皮粘蛋白(“PEM”)、PPP1R3B、PRAME、PRDX5、PRLR、PSA、PSMA、PTPRK、RAB38/NY-MEL-1、RAGE-1、RBAF600、RET、RGS5、RhoC、RNF43、ROR1、RU2AS、SAGE、SART1、SART3、分离蛋白1、SIRT2、SLAMF7、SLC39A6、SNRPD1、SOX10、Sp17、SPA17、SSX-2、SSX-4、STEAP1、STEAP2、存活素、SYT-SSX1或-SSX2融合蛋白、TAG-1、TAG-2、端粒酶、TERT、TGF-βRII、Thompson-nouvelle抗原、TMPRSS2、TNFRSF17、TPBG、TRAG-3、磷酸丙糖异构酶、TRP-1/gp75、TRP-2、TRP2-INT2、酪氨酸酶、酪氨酸酶(“TYR”)、UPK3A、VEGF、VTCN1、WT1和XAGE-1b/GAGED2a。在一些实施方案中，靶蛋白是新抗原。
在一些实施方案中，被调节的细胞的性质是细胞活力、细胞增殖、基因表达、细胞形态、细胞活化、磷酸化、钙动员、脱粒、细胞迁移和/或细胞分化。在某些实施方案中，靶标与可检测标记物连接、被可检测标记物结合或包含可检测标记物，所述可检测标记物允许检测对靶标的生物或化学作用。在一些实施方案中，可检测标记物是荧光染料。荧光染料的非限制性实例包括但不限于钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料和氧化还原电位染料。在一个实施方案中，用钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料标记靶标。
在某些实施方案中，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶标。在另一个实施方案中，在将适体暴露于靶标之前，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶标。
在一些实施方案中，在将适体暴露于靶标之后标记靶标。在一个实施方案中，用荧光标记的抗体、膜联蛋白V、抗体片段和基于人工抗体的构建体、融合蛋白、糖类或凝集素标记靶标。在另一实施方案中，在将适体暴露于靶标之后，用荧光标记的抗体、膜联蛋白V、抗体片段和基于人工抗体的构建体、融合蛋白、糖类或凝集素标记靶标。
在一些实施方案中，用荧光染料标记靶细胞。荧光染料的非限制性实例包括但不限于钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料和氧化还原电位染料。
在一些实施方案中，用钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料标记靶细胞。在某些实施方案中，用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物，凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶细胞。在另一个实施方案中，在将适体暴露于细胞之前用活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物标记靶细胞。在一些实施方案中，在将适体暴露于靶标之后标记靶细胞。在一个实施方案中，用荧光标记的抗体或其抗原结合片段、膜联蛋白V、荧光标记的融合蛋白、荧光标记的糖或荧光标记的凝集素标记靶细胞。在一个实施方案中，在将适体暴露于细胞后，用荧光标记的抗体或其抗原结合片段、膜联蛋白V、荧光标记的融合蛋白、荧光标记的糖或荧光标记的凝集素标记靶细胞。
可使用本领域已知的任何方法(包括例如荧光显微镜检查)来确定可检测标记物在表面上的位置
图1提供了举例说明本文提供的方法的某些实施方案的示例性工作流程。所述工作流程始于所选择和准备的初始适体文库(例如，本文提供的适体文库)，就如针对Illumina测序一样。所述文库可以是例如新合成的，或者是先前选择过程的输出。该过程可以组合地和顺序地涉及一轮或多轮正选择、一轮或多轮负选择或两者。
将制备的文库安装在Illumina流通池上的衔接子上。桥式PCR扩增将初始文库中的每个单一序列转化为约100,000个拷贝的相同序列的簇。然后对该文库进行Illumina测序。该过程产生将来自文库的每个序列与流通池表面上的一组特定坐标链接的作图。
通过多种方法(例如，去污剂、变性剂等)中的任一种剥离在边合成边测序的过程中添加的来自文库的那些链的互补链。然后将与Illumina衔接子和PCR引物互补的寡核苷酸链泵入流通池，仅留下单链适体区。当将RNA适体作为文库的一部分进行合成时，可通过多种方法中的任一种(例如，结合有Ter的Tus蛋白或结合有生物素的链霉亲和素蛋白)来启动和终止转录。
升高流通池温度，然后冷却，以使表面上的所有寡核苷酸均呈现其适当的3D结构，并根据折叠方案进行折叠。在这种状态下，寡核苷酸文库折叠并准备好与靶标接合。
使用仪器的硬件将包含靶标的溶液运行至流通池中。为了报告对靶标的生物或化学作用，可在将靶标引入具有荧光染料的流通池/仪器之前对其进行标记。将靶标孵育一定时间以使作用发生。然后可将用于报告生物或化学作用(例如，细胞活化、凋亡等)的荧光染料或标记物泵入流通池中。(见图1)
通过图像分析识别受影响的靶标(命中)，并分析相应的序列。合成提取的序列并分别测试其结合和功能。
实施例
实施例1-适体文库的制备
使用Illumina高通量测序平台样品制备试剂盒制备适体文库，所述试剂盒包括附接样品序列侧翼上的衔接子DNA序列至已附接到流通池表面的互补链。将制备的文库安装在Illumina流通池表面上的衔接子上。
为了制备适体文库，使用两步“尾部”PCR过程附接衔接子。PCR反应混合物包含表1中所示的以下组分：
表1：
| 组分 | 以μl计的量 |
| HerculaseII融合DNA聚合酶 | 0.5 |
| 缓冲剂 | 10 |
| Dntp(各10mM) | 1.25 |
| 正向尾部引物 | 1 |
| 反向尾部引物 | 1 |
| upw | 35.25 |
| 样品 | 1 |
以使衔接子相对于样品序列具有特定取向的方式设置引物。这样做是为了在单个读取运行中将正向适体序列保持在簇中。
第一次PCR反应中使用的引物序列：
TruSeq p7侧刺(side stab)正向引物
GTCACATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTGATCCAGAGTGACGCAGCA[SEQ ID NO:1]；和
TruSeq p5侧刺反向引物
CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTAAGCCACCGTGTCCA[SEQ ID NO:2]
在本文下面的表2中显示了用于第一个反应的PCR程序：
表2:
第一个PCR反应(PCR 1)的产物是第二个PCR反应的输入。
第二个PCR反应中使用的引物序列：
TruSeq p7侧起始
GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCTCGTATGCCG[SEQ ID NO:3]；以及
TruSeq p5侧起始
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACACACTCTTTCCCTACACGACG[SEQ ID NO:4]。
本文下面的表3中显示了用于第二个反应的PCR程序：
表3:
完整的文库经历质量控制(其包括浓度的qbit检查和tapstation/片段分析仪)以检查文库大小和副产物。根据测序平台和Illumina方案进行簇的产生和测序。在测序过程之后，变性以单链形式提供簇。然后将衔接子和引物封闭，并将适体在其折叠缓冲液中折叠至其3d构象。
簇的产生和测序
使用桥式PCR扩增将起始文库中的每个单一序列转变成约100,000个拷贝的相同序列的簇。然后对簇库进行Illumina测序。该过程产生了将来自文库的每个序列与流通池表面上的一组特定坐标链接的作图。
剥去在边合成边测序过程中添加的来自文库的那些链的互补链，并将与Illumina衔接子和PCR引物互补的寡核苷酸链泵至流通池，仅保留单链的适体区域。在RNA适体的情况下，可通过多种方法中的任何一种(例如结合有Ter的Tus蛋白或结合有生物素的链霉亲和素蛋白)来启动和终止转录。
升高流通池温度，然后冷却，以使流通池表面上的所有寡核苷酸在适当的折叠缓冲液中均呈现其适当的3D构象。例如，所使用的一种折叠缓冲液配方(cellselex纸)包括1升PBS、5ml的1M MgCl2和4.5g葡萄糖
靶标引入
使用机器的硬件，将靶标(例如，细胞、细菌、颗粒、病毒、蛋白质等)在根据靶标所使用的环境(例如，人血清、PBS、1b)的所需结合缓冲液中引入系统。一般结合缓冲液配方的一种选择是(cellselsex纸)：1升PBS、5ml的1MMgCl2、4.5g葡萄糖、100mg tRNA和1g BSA。在引入流通池/机器之前或之后标记靶标，并将其孵育一定时间以使作用发生。
可使用适合平台激发源和发射滤光器的不同荧光团标记靶标。可通过靶标上可用的任何可能的对接位点进行标记。标记试剂的实例包括但不限于DiI、抗HLA+二级Dylight650、抗HLAPE-Cy5和Dylight650。
为了筛选功能性适体，可使用荧光报告分子使作用可视化。例如，将7AAD引入流通池可用于标记靶标以筛选细胞死亡，或者可将膜联蛋白V荧光团缀合物用于标记靶标以筛选凋亡。报道试剂、其浓度、孵育时间和具体配方方案应根据具体作用筛选进行调整。
用于对初始文库进行测序，随后进行靶细胞引入以及获得功能性寡核苷酸簇的代表性方法
将80μl的“掺入混合物缓冲液(Incorporation Mix Buffer)”以250μl/分钟的速率泵入流通池。然后将温度设置为55℃。将60μl的“掺入混合物”以250μl/分钟的速率泵入流通池，并且80秒后以250μl/分钟的速率将10μl的“掺入混合物”泵入流通池。211秒后，将温度设置为22℃，并以250μl/分钟的速率将60μl的“掺入混合物缓冲液”泵入流通池。然后将75μl的“扫描混合物(ScanMix)”以250μl/分钟的速率泵入流通池。
然后校准该方法以聚焦至簇的平面并将显微镜与流通池平面对齐。将100μl的“掺入混合物缓冲液”以250μl/分钟的速率泵入流通池。重复上述掺入步骤99次。
关闭温度控制，并以250μl/分钟的速率将125μl的“裂解缓冲液”泵入流通池。然后将温度设置为55℃，并以250μl/分钟的速率将75μl的“裂解混合物”泵入流通池。80秒后，以250μl/分钟的速率将25μl的“裂解混合物”泵入流通池。再过80秒后，以250μl/分钟的速率将25μl的“裂解混合物”泵入流通池。80秒后，将温度设置为22℃。然后关闭温度控制，并以250μl/分钟的速率将60μl的“掺入混合物缓冲液”泵入流通池。然后检查每个水管中剩余的体积，以验证正确的递送。
然后发生变性，接着封盖。对于变性步骤，则将温度设置为20℃持续120秒。以60μl/分钟的速率将75μl的“洗涤缓冲液”泵入流通池，然后以60μl/分钟的速率将75μl的“变性溶液”泵入流通池，以及以60μl/分钟的速率将75μl的“洗涤缓冲液”泵入流通池。
对于封盖步骤，以60μl/分钟的速率将75μl的“洗涤缓冲液”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续120秒。然后以80μl/分钟的速率将80μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续30秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续60秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续90秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续120秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续150秒。
以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续180秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续210秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续240秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“5'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续270秒。以60μl/分钟的速率将75μl的“洗涤缓冲液”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续120秒。
对于3'帽，以80μl/分钟的速率将80μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续30秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续60秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续90秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续120秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续150秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续180秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续210秒。以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续240秒。
以13μl/分钟的速率将10μl的“3'帽”泵入流通池，并将温度设置为85℃持续270秒。以60μl/分钟的速率将75μl的“洗涤缓冲液”泵入流通池。并将温度设置为0℃。以250μl/分钟的速率将200μl的“折叠缓冲液(冷冻的)”泵入流通池，然后以40μl/分钟的速率将160μl的“折叠缓冲液(冷冻的)”泵入流通池，并将温度设置为0℃持续600秒。
将温度升高至37℃持续120秒。之后进行结合步骤。
对于结合步骤，以250μl/分钟的速率将80μl的“结合缓冲液”泵入流通池，并将温度设置为37℃。以100μl/分钟的速率将80μl的“靶标#1”泵入流通池，并将温度设置为37℃持续300秒。再次以13μl/分钟的速率将10μl的“靶标#1”泵入流通池，并将温度设置为37℃持续300秒。最后，以13μl/分钟的速率将10μl的“靶标#1”泵入流通池，并将温度设置为37℃持续2700秒。
随后进行三个连续的掺入步骤和洗涤步骤，以除去由掺入物组成的未结合的靶标，以13μl/分钟的速率将80μl的“结合缓冲液”泵入流通池，掺入，以80μl/分钟的速率将80μl的“结合缓冲液”泵入流通池，掺入，以200μl/分钟的速率将80μl的“结合缓冲液”泵入流通池并掺入。
重复上述变性、加帽、结合、掺入和洗涤步骤，直至完成测序和靶标引入。然后添加各种靶标并评价与适体的结合和/或适体活性。
图3显示结合至流通池的Hana细胞移动的延时图像。结果表明，细胞实际上由附接于表面的序列本身而不是表面本身所结合，并因此可以自由移动，但仅限于该位置。
实施例2–功能性适体鉴定
本文提供的方法的实施方案用于鉴定在新鲜分离的(12hr)人三阴性乳腺癌细胞中诱导凋亡的适体。
将本文所述的适体文库固定在流通池上，并在Illumina仪中进行桥接PCR，以产生集簇文库。在扩增过程中，根据Illumina方案对集簇文库进行测序，所不同的是，在测序过程结束时使用PBS代替漂白试剂，以便测序后不会破坏流通池。已知的探针占文库的0.1-1％，使得可将所得的测序图与以后生成的荧光显微镜图像进行比对。
在最后一次PBS洗涤后，将流通池加载到具有温度控制的荧光显微镜上，并对簇进行相位成像以查看簇，并在绿色荧光通道中查看凋亡指示剂。已知探针序列的坐标用于将显微镜生成的图像与测序仪在测序过程中生成的序列簇图进行比对。
在含有1％白蛋白和1mM Mg2+的PBS中，以106个细胞/mL的浓度制备从骨髓抽吸物新鲜分离的人乳腺癌细胞，以在流通池的室底达到每100μm2约1个的平均细胞密度。按照制造商的说明，向靶细胞加载绿色荧光半胱天冬酶3/7活性报告染料，并洗涤。使用注射泵将细胞泵入流通池。
在t＝0时在相位和绿色通道中对流通池进行成像，然后在37℃下孵育并再次以30分钟的间隔成像。当靶细胞被功能性适体结合时，通过绿色荧光检测适体诱导的凋亡。在递增的泵压下用相同的缓冲液洗涤细胞，并对其进一步成像以鉴定对靶细胞具有更高亲和力的功能性适体。
使用外周血单核细胞作为流通池的不同泳道中的反靶标(counter-target)，使用同一已测序的文库重复集簇适体文库分析，以鉴定靶特异性适体序列。进行计算分析以对结合于适体簇结合并经历凋亡的靶细胞或反靶细胞所处的坐标进行转换，以鉴定相对于在反靶细胞中优先在靶细胞中介导凋亡功能的适体序列。从文库中成功鉴定出多于1,000种能够特异性介导对来自特定供体的肿瘤细胞的靶选择性凋亡的适体。
实施例3–在Illumina测序仪中进行功能性适体鉴定
本文提供的方法的实施方案用于鉴定在新鲜分离的(12hr)人肿瘤细胞中诱导凋亡的适体。
将如本文所述的适体文库固定在流通池上，并在Illumina仪中进行桥式PCR以产生集簇文库。在扩增过程中，根据Illumina方案对集簇文库进行测序，所不同的是，在测序过程结束时使用PBS代替漂白试剂，以便测序后不会破坏流通池。
在最后一次PBS洗涤后，将簇在Illumina仪中于绿色荧光通道中成像，以查看凋亡指示剂。在含有1％白蛋白和1mM Mg2+的PBS中，以106个细胞/mL的浓度制备从骨髓抽吸物新鲜分离的人乳腺癌细胞，以在流通池的室底达到每100μm2约1个的平均细胞密度。按照制造商的说明，向靶细胞加载绿色荧光半胱天冬酶3/7活性报告染料，并洗涤。使用Illumina仪将细胞泵入流通池。
在对流通池进行成像的过程中，将运行另一轮测序。根据细胞特异性荧光信号的存在来确定靶细胞在流通池中的位置。通过在与一个或多个适体簇相关的流通池坐标处出现荧光信号来检测适体诱导的凋亡。细胞对于测序仪显示为几个簇的“斑点”。根据活性报告染料的荧光发射鉴定经历凋亡的靶细胞。
使用非肿瘤细胞作为流通池的不同泳道中的反靶标，使用同一已测序的文库重复集簇适体文库分析，以鉴定靶特异性适体序列。进行计算分析来对结合于适体簇并经历凋亡的靶细胞或反靶细胞所处的坐标进行转换，以鉴定相对于在反靶细胞中优先在靶细胞中介导凋亡功能的适体序列。从文库中鉴定出能够特异性介导对来自特定供体的肿瘤细胞的靶选择性凋亡的适体。
通过引用并入
本文提及的所有出版物、专利和专利申请均由此通过引用整体并入，如同每个单独出版物、专利和专利申请具体地且单独地表示为通过引用并入。在有冲突的情况下，以本申请(包括本文中的任何定义)为准。
等同方案
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。
Claims (97)
1.一种包括流动室的流通池，其中多个适体簇被固定在所述流动室内的固体表面上。
2.如权利要求1所述的流通池，所述流通池包含至少约106个不同的适体簇。
3.如权利要求2所述的流通池，所述流通池包含106至109个适体簇。
4.如权利要求1至3中任一项所述的流通池，其中每个适体簇包含至少约104个拷贝的适体。
5.如权利要求1至4中任一项所述的流通池，其中每个适体簇包含104至106个拷贝的适体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的流通池，所述流通池还包含在所述流通池内的靶细胞。
7.如权利要求6所述的流通池，其中所述靶细胞是原核细胞。
8.如权利要求6所述的流通池，其中所述靶细胞是真核细胞。
9.如权利要求8所述的流通池，其中所述真核细胞是人细胞。
10.如权利要求9所述的流通池，其中所述人细胞是癌细胞。
11.如权利要求9所述的流通池，其中所述人细胞是免疫细胞。
12.如权利要求11所述的流通池，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞或树突细胞。
13.如权利要求1至12中任一项所述的流通池，所述流通池还包含在所述流通池内的细胞功能的报告分子。
14.如权利要求13所述的流通池，其中所述细胞功能的报告分子是当所述细胞进行细胞功能时发荧光的染料。
15.如权利要求14所述的流通池，其中所述细胞功能是凋亡。
16.如权利要求14所述的流通池，其中所述染料是半胱天冬酶-3/7活性的检测器。
17.如权利要求14所述的流通池，其中所述细胞功能是增殖。
18.如权利要求14所述的流通池，其中所述细胞功能是基因表达。
19.如权利要求14所述的流通池，其中所述细胞功能是细胞因子表达。
20.如权利要求1至19中任一项所述的流通池，其中所述适体簇来自适体簇文库。
21.一种用于鉴定与靶标特异性结合的一种或多种适体的方法，所述方法包括：(i)使固定在表面上的多个适体簇与所述靶标接触；以及(ii)鉴定与所述靶标特异性结合的所述固定的适体簇。
22.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(a)将来自适体文库的多个适体固定在表面上；以及
(b)在所述流通池表面上局部扩增多个固定的适体，以形成所述多个固定的适体簇。
23.如权利要求22所述的方法，其中通过桥式PCR扩增或滚环扩增进行所述扩增。
24.如权利要求22或权利要求23所述的方法，其中所述方法还包括从所述固定的适体簇中除去所述互补链，以提供单链的固定的适体簇。
25.如权利要求21至24中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之前对所述固定的适体簇进行测序。
26.如权利要求25所述的方法，其中通过Illumina测序或Polonator测序进行所述测序。
27.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括通过将来自适体文库的适体印刷到所述表面上来产生所述多个固定的适体簇。
28.如权利要求21至27中任一项所述的方法，其中将至少108个不同的适体固定在所述表面上。
29.如权利要求21至28中任一项所述的方法，其中每个适体簇包含至少50个相同的适体。
30.如权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述表面是流通池表面。
31.如权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在步骤(i)之后执行洗涤步骤以从流通池中去除未结合的靶标。
32.如权利要求21至31中任一项所述的方法，其中所述固定的适体中的每一个具有根据式II或式III的序列：
P1-S1-L1-S1*-S2-L2-S2*-P2(II)，或
P1-S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*-P2(III)，
其中：
P1是5'引物位点序列；
P2为3’引物位点序列；
S1和S2各自独立地是至少一个碱基的茎区域序列；
S1*是S1的互补序列；
S2*是S2的互补序列；以及
L1和L2各自独立地是至少一个碱基的环区域序列。
33.如权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述靶标是细胞。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞是原核细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述靶标是细菌。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
38.如权利要求21-32中任一项所述的方法，其中所述靶标是病毒。
39.如权利要求21-32中任一项所述的方法，其中所述靶标是蛋白质。
40.如权利要求21至39中任一项所述的方法，其中所述靶标被可检测地标记。
41.一种用于鉴定调节细胞的性质的一种或多种适体的方法，所述方法包括：(i)使固定在表面上的多个适体簇与所述细胞接触；以及(ii)鉴定调节所述细胞的性质的经固定的适体簇。
42.如权利要求41所述的方法，所述方法还包括以下步骤：
(a)将来自适体文库的多个适体固定在表面上；以及
(b)在所述流通池表面上局部扩增多个固定的适体，以形成所述多个固定的适体簇。
43.如权利要求42所述的方法，其中通过桥式PCR扩增或滚环扩增进行所述扩增。
44.如权利要求42或权利要求43所述的方法，其中所述方法还包括从所述固定的适体簇中除去所述互补链以提供单链的固定的适体簇。
45.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中在步骤(i)之前对所述固定的适体簇进行测序。
46.如权利要求45所述的方法，其中通过Illumina测序或Polonator测序进行所述测序。
47.如权利要求41所述的方法，所述方法还包括通过将来自适体文库的适体印刷在所述表面上来产生所述多个固定的适体簇。
48.如权利要求41至47中任一项所述的方法，其中将至少108个不同的适体固定在所述表面上。
49.如权利要求41至48中任一项所述的方法，其中每个适体簇包含至少50个相同的适体。
50.如权利要求41至49中任一项所述的方法，其中所述表面是流通池表面。
51.如权利要求41至50中任一项所述的方法，其中所述固定的适体中的每一个具有根据式II或式III的序列：
P1-S1-L1-S1*-S2-L2-S2*-P2(II)，或
P1-S1-L1-S2-L2-S2*-L1-S1*-P2(III)，
其中：
P1是5'引物位点序列；
P2为3’引物位点序列；
S1和S2各自独立地是至少一个碱基的茎区域序列；
S1*是S1的互补序列；
S2*是S2的互补序列；以及
L1和L2各自独立地是至少一个碱基的环区域序列。
52.如权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述原核细胞是细菌。
54.如权利要求41至51中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。
56.如权利要求41至55中任一项所述的方法，其中在使所述适体与所述靶标接触之前，用可检测标记物标记所述细胞。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述可检测标记物是荧光染料。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述荧光染料是钙敏感染料、细胞示踪染料、亲脂性染料、细胞增殖染料、细胞周期染料、代谢产物敏感染料、pH敏感染料、膜电位敏感染料、线粒体膜电位敏感染料或氧化还原电位染料。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述可检测标记物是活化相关标志物、氧化应激报告分子、血管生成标志物、凋亡标志物、自噬标志物、细胞活力标志物或离子浓度标志物。
60.如权利要求56所述的方法，其中用荧光标记的抗体或其抗原结合片段、膜联蛋白V、荧光标记的融合蛋白、荧光标记的糖或荧光标记的凝集素标记所述细胞。
61.如权利要求41至60中任一项所述的方法，其中在将适体暴露于所述细胞之后，可检测地标记所述细胞。
62.如权利要求41至61中任一项所述的方法，其中被调节的所述细胞的性质是细胞活力、细胞增殖、基因表达、细胞形态、细胞活化、磷酸化、钙动员、脱粒或细胞迁移、细胞分化。
63.如权利要求21至62中任一项所述的方法，所述方法还包括合成所述适体文库。
64.一种适体，其根据权利要求21至63中任一项所述的方法鉴定。
65.一种包含多个适体簇、靶标和荧光报告分子的组合物。
66.如权利要求65所述的组合物，所述组合物包含至少约106个适体簇。
67.如权利要求66所述的组合物，所述组合物包含106至109个适体簇。
68.如权利要求65至67中任一项所述的组合物，其中每个适体簇包含至少约104个拷贝的适体。
69.如权利要求65至67中任一项所述的组合物，其中每个适体簇包含104至106个拷贝的适体。
70.如权利要求65至69中任一项所述的组合物，其中所述靶标是靶细胞。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述细胞是原核细胞。
72.如权利要求70所述的组合物，其中所述细胞是真核细胞。
73.如权利要求72所述的组合物，其中所述真核细胞是人细胞。
74.如权利要求73所述的组合物，其中所述人细胞是癌细胞。
75.如权利要求65至69中任一项所述的组合物，其中所述靶标是靶病毒。
76.如权利要求65至69中任一项所述的组合物，其中所述靶标是靶蛋白。
77.如权利要求65至74中任一项所述的组合物，其中所述荧光报告分子是细胞死亡报告分子。
78.如权利要求65至74中任一项所述的组合物，其中所述荧光报告分子是氧化还原电位报告分子。
79.如权利要求65至74中任一项所述的组合物，其中所述荧光报告分子是膜完整性报告分子。
80.如权利要求65至75中任一项所述的组合物，其中所述荧光报告分子是衣壳完整性报告分子。
81.如权利要求65至76中任一项所述的组合物，其中所述荧光报告分子是蛋白质完整性报告分子。
82.如权利要求65至76中任一项所述的组合物，其中所述荧光报告分子是蛋白质变性报告分子。
83.如权利要求65至82中任一项所述的组合物，其中用荧光标记物标记所述适体簇。
84.如权利要求65至83中任一项所述的组合物，其中用允许在光学显微镜下可见的元件标记所述适体簇。
85.如权利要求84所述的组合物，其中所述元件是纳米颗粒。
86.如权利要求65至85中任一项所述的组合物，其中用反义链标记所述适体簇。
87.如权利要求86所述的组合物，其中所述反义链在结合靶标后被置换或去除。
88.如权利要求65至87中任一项所述的组合物，所述组合物还包含酶。
89.如权利要求88所述的组合物，其中所述酶是连接酶、聚合酶、核酸酶、编辑酶和/或限制酶。
90.如权利要求65至89中任一项所述的组合物，其中所述适体簇被固定在固体支持物上。
91.如权利要求90所述的组合物，其中所述固体支持物是流通池。
92.如权利要求91所述的组合物，其中所述流通池由塑料、玻璃、聚合物或金属制成。
93.如权利要求91或92所述的组合物，其中所述流通池是板、托盘或芯片。
94.如权利要求91至93中任一项所述的组合物，其中所述流通池包括底部和顶部，其中所述底部和所述顶部在其间包括可填充空间。
95.如权利要求94所述的组合物，其中所述可填充空间填充有空气、水、水性缓冲液、培养基、血清、患者来源的样品、基质、聚合物或蛋白质。
96.如权利要求95所述的组合物，其中所述患者来源的样品是血液、血清和/或尿液。
97.如权利要求95所述的组合物，其中所述基质是凝胶。
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