CN110891565A - α-突触核蛋白的调控剂 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了由α‑突触核蛋白病引起的病况的诊断方法和治疗方法。可以将一种氨基吡唑化合物用于治疗此类病况，其通过降低受试者细胞中α‑突触核蛋白的量。

Description

α-突触核蛋白的调控剂
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2017年6月19日提交的美国临时申请号62/521,758的权益，其全部内容通过引用并入本文。
【发明领域】
本公开涉及用于经由FAF1基因和蛋白调控α-突触核蛋白(synuclein)蛋白水平的组合物和方法，以及调控α-突触核蛋白水平或聚集或修饰的FAF1活性的抑制剂，从而治疗或预防α-突触核蛋白介导的突触核蛋白病(synucleinopathy)。本公开包括相关的诊断方法和治疗方法，其使用具有调控FAF1量或活性的活性的化合物。
【背景技术】
FAF1是一种与凋亡受体Fas关联的蛋白质，即所谓的Fas相关因子1。FAF1在Fas与称为Fas配体(FasL)的配体接合后与Fas结合，并促进细胞凋亡。因此，FAF1是促凋亡蛋白。FAF1具有结合Fas的N端200个氨基酸区域(Ryu SW等，2003；Yu C等，2016)。然后，FAF1通过激活半胱天冬酶级联反应激活半胱天冬酶-8和凋亡途径。FAF1还激活JNK并结合PARP1，并以此方式刺激坏死途径(Yu C等，2016)。然而，在未激活状态下，FAF1与HSP70结合并保持为非活性形式(Kim HJ等，2005；Gao X等，2015)。据报道，FAF1在帕金森氏病患者的死后组织中过表达(Betarbet R等，2008)。
突触核蛋白病是由错误折叠的α-突触核蛋白的积累及其聚集物如路易体(LB)或路易神经突(LN)内含物引起的一组神经退行性疾病。例子包括帕金森氏病(PD)、路易体痴呆(DLB)和多系统性萎缩(MSA)(Spillantini MG和Goedert M 2000，Martí MJ等人，2003)。
α-突触核蛋白具有的基因名称为SNCA，是一种大小为14kDa的小胞质蛋白，大部分位于神经元细胞的突触小泡中，并具有信号传导和传递方面的功能(Snead D和Eliezer D2014)。该蛋白质由三个结构域构成：具有两亲性螺旋的N末端结构域，具有柔性构象的β层的中间结构域，以及具有许多酸性残基的C末端尾部(Gallegos S等人，2015)。已知该蛋白质以可溶形式作为单体或四聚体存在。然而，α-突触核蛋白错误折叠并聚集而形成寡聚体和进一步的多聚体，并且由于各种不清楚的原因，可以进一步聚集成称为路易体和路易神经突的纤维状结构。该过程包括C末端蛋白水解、第129位丝氨酸的磷酸化、单泛素化和其他修饰(Sato H等人2013，Oueslati A 2016)。α-突触核蛋白错误折叠和聚集的原因包括由于通过基因增加或降解减少而过度表达蛋白质导致的蛋白质积聚，或由于突变而导致蛋白质本身的性质改变。但是，其他非遗传原因，例如环境毒素、细胞应激(例如细胞毒性)、ER应激和氧化应激也是已知的(Rockenstein E等人，2014，Ingelsson M 2016)。此外，SNCA基因座多态性变异影响α-突触核蛋白的水平和聚集(Mata IF等人，2010)。
已经研究了α-突触核蛋白错误折叠的多聚体和路易体的毒性，且可能涉及到多种致病过程，特别是膜运输包括胞吐作用、ER向高尔基体的运输、ER应激、高尔基体内稳态、内吞作用、自噬和氧化应激中的功能障碍(Wang T和Hay JC 2016，Snead D等人2014)。此外，α-突触核蛋白毒性还可以包括线粒体毒性和炎症(Ingelsson M，2016)。α-突触核蛋白寡聚体和路易体能干扰蛋白酶体途径，并与质膜破坏和孔形成(这导致细胞中的凋亡激活)有关(Gallegos S等人，2015)。
“突触核蛋白病”是一组具有一系列临床症状的神经退行性病症，例如帕金森氏病(PD)、帕金森氏病痴呆(PDD)、路易体痴呆(DLB)、多系统性萎缩(MSA)、非典型帕金森症(Atypical parkinsonism)、非典型帕金森氏病和纯自主神经衰竭(PAF)(Spillantini MG和Goedert M 2000，Martí MJ 2003)。这些疾病是由神经元和神经胶质中的路易体或路易神经突或α-突触核蛋白聚集引起的。在临床上，根据病变的分布，它们的特征是运动、认知和自主功能的慢性和进展性衰退。
帕金森氏病是仅次于AD的第二大常见神经退行性疾病(Feng LR等，2010)，通常被认为是运动障碍。PD的病理特征是在黑质(SNc)，尤其是对运动障碍负责的中脑黑质致密部(SNpc)中多巴胺能神经元的选择性的进行性退变和丧失(Luk KC等人，2012)。然而，该症状通常伴随着自主神经、认知和精神疾病问题的出现(Jankovic J 2008)。
PD的另一个标志是在多巴胺能神经元细胞中存在称为路易体(LB)和路易神经突(LN)的胞质内含物，在超过90％的帕金森氏病患者的死后组织中观察到这种情况。LB的主要蛋白质成分是折叠错误且聚集的α-突触核蛋白(Angot E等人，2012)。
SNCA基因的几种遗传变化，点突变和基因增加被认为导致家族性帕金森氏病(PD)或是PD的病因。这些遗传突变的显性遗传表明了功能获得机制，例如由于蛋白质特性的改变或蛋白质水平的提高而引起的聚集(Devine MJ等人，2011；Appel-Cresswell S等人，2013；Kasten M和Klein C 2013，Petrucci S等人，2016)。SNCA基因内的某些多态性或远端增强子区域的突变可能会增加其表达，从而增加聚集，并且据报道与PD有关(Mata IF等人，2010；Soldner F等人，2016)。
除了SNCA基因中的那些外，还有许多突变与帕金森氏病和相关的突触核蛋白病有关(Wang C-D和Chan P 2014，Kalinderi K等人，2016，Federoff M 2015，Nussbaum R2017)。已提出这些基因中的一些参与α-突触核蛋白的加工及其积累。例如，GBA(葡糖脑苷脂酶基因)中的突变占路易体痴呆病例的23％，PD的21％(Sidransky E等，2009；Jesus S等，2016)。据报道，GBA突变体通过改变α-突触核蛋白的加工来增加SNCA积累(Cullen V等人2011，Fernandes HJ 2016)。与疾病相关的其他已知基因是Parkin、LRRK2、DJ-1和PINK1。尽管这些基因在帕金森氏病和其他突触核蛋白病的发病机理中的作用大部分还不清楚，但这些基因在蛋白质翻译后修饰和加工(如泛素化)、膜运输、自噬和蛋白质折叠中具有功能，并且α-突触核蛋白过表达是由于这些基因中一些的突变(Walden H和Muqit MMK 2017，Galegos S 2015)。
路易体痴呆(DLB)是痴呆症的第二最常见形式，其临床症状是带有痴呆的进展性认知衰退和波动性认知，尤其是视幻觉。死后组织显示除了黑质以外在大脑皮层中还有许多路易体(LB)，且这些LB包含α-突触核蛋白(Gaser F等人2005，Goeder M等人2017)。
多系统性萎缩(MSA)是一种致命的神经退行性疾病，具有自主神经衰竭、帕金森症和小脑共济失调的不同组合的症状(Daniela Kuzdas-Wood等人，2014)。这是一种罕见病，患病率为1.9-4.9/100,000，存活为6-9年(Stefanova等，2009)，成人发病的年龄均值为57岁。病理上，观察到整个CNS中神经胶质中广泛分布的胞质内含物(GCI)(Trojanowski JQ和Revesz T 2007)，其由丝状α-突触核蛋白构成。新提出的标准是主导性的小脑共济失调，带有主导性的运动特征，以及CNSα-突触核蛋白阳性的神经胶质胞质内含物的神经病理学展现，具有纹状体或橄榄体脑桥小脑(olivopontocerebellar)结构中的神经退行性改变(Gilman S 2008)。
【附图说明】
图1例示了转染的FAF1-FLAG转基因在SH-SY5Y细胞中的过表达。
图2显示了过表达FAF1-FLAG转基因的SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白的聚集。
图3A和3B显示在过表达转染的FAF1-FLAG转基因的SH-SY5Y细胞中形成路易体样形式。图3A显示了用载体对照转染的细胞。图3B显示了用FAF1-FLAG转基因转染的细胞。DAPI-DAPI染色；α-syn-抗α-突触核蛋白抗体染色；Ps129-α-syn-用抗磷酸化α-突触核蛋白染色；合并-三个图像的叠加。
图4例示了FAF1在小鼠中脑中的过表达，该小鼠具有显微注射到中脑组织中的表达FAF1的腺病毒构建体。
图5显示在用α-突触核蛋白基因和相应的siRNA共转染的SH-SY5Y细胞中FAF1表达的减弱。
图6显示了用FAF1基因转染的SH-SY5Y细胞中p62和LC3蛋白表达的变化。
图7显示了在用FAF1-FLAG构建体转染的细胞中KM-819与FAF1的结合。
图8显示了通过KM-819在细胞提取物中对FAF1-半胱天冬酶8和FAF1-JNK复合物形成的抑制。
图9显示了通过KM-819在细胞提取物中对半胱天冬酶8活性(半胱天冬酶3裂解)和JNK磷酸化的抑制。
图10显示过表达FAF1并用KM-819处理的SH-SY5Y细胞中p62蛋白的量减少和LC3蛋白的量增加。
图11显示了在用FAF1-FLAG表达构建体和α-突触核蛋白-GFP(绿色荧光蛋白)表达构建体共转染的细胞中的蛋白α-突触核蛋白减少。
图12显示了在施用KM-819后，过表达FAF1的转基因小鼠的中脑组织中α-突触核蛋白的量和S129磷酸化的α-突触核蛋白的量减少。
图13显示了在施用KM-819后过表达FAF1的转基因小鼠的海马中α-突触核蛋白的量减少。
图14显示了在施用KM-819后过表达FAF1的转基因小鼠的大脑皮层中α-突触核蛋白的量减少。
图15显示了在施用KM-819后过表达FAF1的转基因小鼠小脑中α-突触核蛋白的量减少。
图16显示了在施用KM-819后过表达FAF1的转基因小鼠的纹状体中α-突触核蛋白的量减少。
【发明内容】
通过以下令人惊讶的发现公开了本发明，即FAF1增加了神经元细胞中α-突触核蛋白的积累及其聚集。继这些之后，我们的研究证实了氨基吡唑衍生物FAF1抑制剂确实降低了α-突触核蛋白在神经元细胞中的积累及其聚集。还通过以下发现公开了本发明，即FAF1通过增加p62蛋白和减少LC3抑制自噬。而且我们的研究证实，氨基吡唑衍生物FAF1抑制剂确实逆转了FAF1活性，通过减少p62蛋白和增加LC3增强了自噬。这些发现是出乎意料的，因为FAF1是促进细胞死亡的促凋亡蛋白，而FAF1对自噬的活性是一个新发现。
本发明涉及用于经由FAF1基因和蛋白调控α-突触核蛋白蛋白水平的组合物和方法，以及调控α-突触核蛋白水平或聚集或修饰的FAF1活性的抑制剂，从而治疗或预防α-突触核蛋白介导的突触核蛋白病。本公开包括相关的诊断方法和治疗方法，其使用具有调控FAF1水平活性的化合物。
本公开总体上涉及使用改变人细胞中FAF1表达或FAF1蛋白活性的抗体、肽、核酸(如适体或反义核酸或siRNA等)、或小分子以提供停止或减慢突触核蛋白病进展的组合物和方法。因此，提供了组合物和方法以提供FAF1的修饰的基因序列和改变的蛋白表达和活性，其中所述疾病的进展受到影响。还公开了这种组合物和方法用于检测和定量样品中α-突触核蛋白的水平和/或表征突触核蛋白的形式以用于诊断或预后目的的用途。
出乎意料的是，使用基于转染细胞的测定法，我们发现FAF1以剂量依赖性方式增加细胞中α-突触核蛋白的水平。此外，通过用表达FAF1的重组腺病毒感染而在动物中增加的FAF1表达提高了α-突触核蛋白水平。此外，通过RNAi转染使FAF1减少降低了α-突触核蛋白水平。我们还公开了FAF1通过增加LC-3II和p62抑制自噬，强烈表明在体外和动物中的细胞中，α-突触核蛋白至少部分通过自噬途径被转换。
我们开发出一种FAF1抑制剂KM-819(KR-88493，美国专利7,939,550，Yoo SE等人，2016-通过引用全文并入本文并用于所有目的)。我们在本文中公开了氨基吡唑化合物KM-819，化学名称为4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑3-羧酸，是FAF1抑制剂。我们在本文中公开了氨基吡唑化合物KM-819逆转了FAF1过表达的作用，从而降低了细胞和动物中的α-突触核蛋白。综合起来，以下实施例中的实验表明，FAF1 siRNA或反义或其相关基因构建体、肽和抗体以及调节FAF1的小分子可用于调控α-突触核蛋白的量或磷酸化状态，从而治疗α-突触核蛋白诱导的突触核蛋白病。
本公开的一个方面提供了一种治疗由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，该方法包括向表现出所述突触核蛋白病的症状或处于所述突触核蛋白病的风险中的受试者施用FAF1活性的抑制剂，所述FAF1活性为增加受试者细胞中α-突触核蛋白的量或调节LC-3和p62的量。施用的有效量分别降低受试者细胞中α-突触核蛋白的量，或提高LC-3的量和/或降低p62的量。
在该方法的一些实施方式中，FAF1活性的抑制剂可以是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002325811250000071
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000072
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
在某些情况下，氨基吡唑化合物可以是4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸或其酯或酰胺。
本公开的另一方面提供了一种治疗由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，该方法包括向表现出所述突触核蛋白病的症状或处于所述突触核蛋白病的风险中的受试者施用一定量的结合FAF1蛋白的化合物，所述一定量的化合物有效地减少所述受试者的细胞中在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量。
在该方面的一些实施方式中，FAF1活性的抑制剂可以是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002325811250000081
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000082
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
在一些情况下，氨基吡唑化合物可以是4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸或其酯或酰胺。
在本公开的任何治疗方面，所述FAF1抑制剂可以口服或通过注射到脑或脑脊髓液或血液中或经由皮肤或其他常见的实用方法，例如微型泵植入来施用。最方便的途径是其中口服施用结合FAF1的化合物的途径。
氨基吡唑化合物4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸调控细胞中LC-3和p62水平的EC50为1nM，减少细胞中α-突触核蛋白量的EC50为20μM。因此，用于调控脑组织细胞中LC-3和p62的量的该化合物的有效量是在脑组织细胞中提供至少0.5nM，优选至少1nM、至少2nM、至少5nM或至少10nM的浓度的量，且用于减少脑组织细胞中α-突触核蛋白的量的该化合物的有效量为在脑组织细胞中提供至少10nM，优选至少20mM、至少40nM、至少100nM或至少200nM的浓度的量。
本公开的另一方面提供了一种用于在受试者中诊断突触核蛋白病或评估突触核蛋白病的风险的方法，其包括测量受试者的细胞中或取自受试者的样品中FAF1蛋白的量或抑制由LC-3和p62蛋白介导的自噬的FAF1活性的水平，其中FAF1的活性水平或蛋白水平高于正常人群中的水平表明该受试者形成了突触核蛋白病或有形成突触核蛋白病的风险。
本公开的另一方面将诊断和治疗配对以提供用于治疗受试者中由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，其包括向以下受试者施用一定量的调节LC-3和p62的量的FAF1活性的抑制剂以有效提高受试者细胞中LC3量和/或降低p62量，或一定量的结合FAF1蛋白的化合物以在受试者细胞中有效降低在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量，所述受试者在其细胞中表现出高于正常人群的FAF1蛋白的量或FAF1活性(抑制受试者细胞中由LC-3和p62蛋白介导的自噬)水平。
在本公开的该方面的一些实施方式中，结合FAF1或抑制FAF1调节LC-3和p62的量的活性的化合物可以是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002325811250000091
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000092
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
可以对脑脊髓液(CSF)取样以测定受试者中的FAF1和α-突触核蛋白水平。通过留置的脊椎导管进行时程采样，例如如T.H.Langenickel等人，Br.J.Clin Pharmacol.,vol.81,pp.878-890(2016)(通过引用整体并入本文)描述的，可用于收集CSF样品用于测定FAF1或α-突触核蛋白。
【实施例】
【1.FAF1在细胞中增加α-突触核蛋白】
通过用带Flag标签的FAF1基因转染在SH-SY5Y细胞中过表达FAF1。通过使用抗-Flag抗体和抗-FAF1抗体对细胞提取物的Western印迹确认过表达。兔抗FAF1抗体购自Proteintech,Chicago,IL,USA,货号10271-1-AP。用α-突触核蛋白基因共转染细胞。使用抗α-突触核蛋白抗体通过Western印迹监测α-突触核蛋白的水平。显然且出乎意料的是，α-突触核蛋白的水平随着FAF1的过表达而增加(图1)。注意将β-肌动蛋白水平用作内部对照。注意细胞中存在一定水平的内源FAF1蛋白。
【2.FAF1在细胞中增加α-突触核蛋白的聚集形式】
通过用带Flag标签的FAF1基因转染在SH-SY5Y细胞中过表达FAF1。用α-突触核蛋白基因共转染细胞。使用抗α-突触核蛋白抗体并长时间暴露胶片，通过Western印迹监测α-突触核蛋白的聚集形式的水平。显然且出乎意料的是，α-突触核蛋白的聚集形式的水平随着FAF1的过表达而增加(图2)。
【3.FAF1在细胞中产生α-突触核蛋白的路易体样形式】
通过用带Flag标签的FAF1基因转染在SH-SY5Y细胞中过表达FAF1。用α-突触核蛋白基因共转染细胞。使用抗α-突触核蛋白抗体通过免疫荧光染色来监测α-突触核蛋白的LB样形式。显然且出乎意料的是，FAF1过表达时观察到了α-突触核蛋白的LB样形式(图3B顶部，箭头标记)。但是，在载体对照中未观察到LB样形式(图3A顶部)，表明FAF1诱导LB样形成。
已知α-突触核蛋白在位置129的丝氨酸残基处被磷酸化，这可能是导致路易体产生的病理过程。使用抗-Ps129-α-突触核蛋白抗体通过免疫荧光染色来监测位置129处α-突触核蛋白的磷酸化形式。显然，当FAF1在LM样形式中过表达时，观察到α-突触核蛋白的S129磷酸化形式(图3B底部，箭头标记)。但是，在载体对照中未观察到这种磷酸化(图3A底部)，证实了FAF1诱导位置129的丝氨酸残基处的α-突触核蛋白磷酸化。
【4.FAF1在小鼠中增加α-突触核蛋白】
使用含有FAF1基因的重组腺病毒通过常规方法用定型注射(stereotypeinjection)到小鼠的中脑区域中来将FAF1在小鼠中过表达。通过使用抗FAF1抗体对中脑组织提取物进行Western印迹确认了过表达。中脑是具有已知会影响突触核蛋白病中的运动的黑质多巴胺能神经元的组织。向两只小鼠注射FAF1腺病毒，并且将两只未注射的小鼠用作对照。使用抗α-突触核蛋白抗体通过Western印迹监测α-突触核蛋白的水平。显然，α-突触核蛋白水平的升高与FAF1的过表达相关(图4)。
【5.通过FAF1 siRNA在细胞中减少α-突触核蛋白】
通过用siRNA(序列：GUGUUGUGGCACAAACCAU)处理SH-SY5Y细胞减弱了FAF1表达，并使用抗FAF1抗体通过细胞提取物的Western印迹确认FAF水平的降低。用α-突触核蛋白基因共转染细胞。使用抗α-突触核蛋白抗体通过Western印迹监测α-突触核蛋白的水平。显然，用FAF1 siRNA处理降低了α-突触核蛋白的水平(图5)。另一方面，用对照siRNA(scRNA，简并序列)处理不降低α-突触核蛋白水平。
【6.FAF1是自噬的抑制剂】
已知α-突触核蛋白会被细胞中的各种途径降解，包括蛋白酶体、自噬和分子伴侣介导的自噬(Sampaio-Marques B和Ludovico P 2015)。通过在SH-SY5Y细胞中转染过表达FAF1，并且通过Western印迹分析了牵涉蛋白质降解途径的各种蛋白质(图6)。
如图6所示，随着FAF1的过表达，p62蛋白增加，LC3减少，表明FAF1抑制自噬。注意到所有其他蛋白质均未改变。该变化如描述的(Sampaio-Marques B和Ludovico P 2015)介导自噬。这些数据证实FAF1通过抑制自噬途径增加α-突触核蛋白。
【7.KM-819(KR-33493)是FAF1抑制剂】
KM-819(KR-33493，4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸)是在现有技术中描述用于缺血性细胞死亡抑制剂的氨基吡唑衍生物(美国专利7,939,550，Yoo SE等人2016)。KM-819对FAF1的抑制通过KM-819与FAF1的结合确认，如所述的和图7所示的。而且，通过对细胞中FAF1下游靶标(包括凋亡路径蛋白半胱天冬酶8和JAK)的抑制，确认了KM-819对FAF1的抑制(图8)。在缺血性细胞死亡的测定中，该化合物在10μM显示出对凋亡的70％的抑制，该凋亡即脱氧葡萄糖诱导的缺氧介导的凋亡(美国专利7,939,550)。
KM-819与FAF1的结合通过如描述的(Yoo SE等人2016)使用生物素标记的KM-819在SH-SY6H细胞提取物中的下拉测定法确认。用带flag标签的FAF1转染细胞。使用抗生物素蛋白包被的琼脂糖沉淀形成的FAF1-KM-819复合物。使用抗-Flag抗体通过Western印迹法测量复合物中沉淀的FAF1。显然，当通过过氧化氢应激细胞由此激活FAF1时，FAF1结合KM-819。注意将全细胞提取物(WCL)中的总FAF1水平作为对照进行测量。
FAF1经由激活半胱天冬酶级联反应和坏死来激活多种刺激所致的凋亡应激，如描述的(Yu C等人2016)。在这两个途径中，FAF1的直接靶标分别是半胱天冬酶8和JNK。并且该激活的步骤是形成这些复合物，随后激活下游靶标。
通过常规免疫沉淀测定法确认了KM-819对FAF1-半胱天冬酶8和FAF1-JNK的复合物形成的抑制，其使用半胱天冬酶8DED抗体和JNK抗体，并通过使用抗FAF1抗体的Western印迹测量结合和沉淀的FAF1。显然，KM-819有效抑制了复合物的形成，在0.1μM时有约80％的抑制(图8)。
通过分别测定半胱天冬酶8底物半胱天冬酶3的裂解和JNK的自磷酸化确认了KM-819对半胱天冬酶8和JNK激活的抑制(图9)。如所示，用不同浓度的KM-819处理细胞，并分别使用抗-半胱天冬酶3抗体和抗-磷酸化JNK抗体通过Western印迹测量裂解的半胱天冬酶3和JNK自磷酸化形式的水平。显然，KM-819抑制半胱天冬酶8的活性和JNK激活(图9)。KM-819对半胱天冬酶8激活的IC50为0.73μM，KM-819对JNK激活的IC50为0.25μM。
【8.KM-819增强自噬】
已知α-突触核蛋白可以通过细胞中的各种途径降解，包括通过蛋白酶体、自噬和分子伴侣介导的自噬(Sampaio-Marques B和Ludovico P 2015)。FAF1抑制自噬。
为确认FAF1抑制剂抑制FAF1介导的自噬抑制的活性，如指示的用KM-819处理过表达FAF1的SH-SY5Y细胞，并通过Western印迹测量LC3和p62水平(图10)。KM-819降低p62蛋白并增加LC3，证明KM-819促进自噬途径。KM-819对自噬促进的EC50为1nM。
【9.通过FAF1抑制剂在细胞中减少α-突触核蛋白】
为了确认FAF1抑制剂是否降低细胞中的α-突触核蛋白水平，用FAF1抑制剂KM-819(KR-88493，美国专利7,939,550，Yoo SE等人2016)处理SH-SY5Y细胞。用编码带Flag标签的FAF1和带GFP标签的α-突触核蛋白的基因共转染细胞。使用抗GFP抗体通过细胞提取物的Western印迹测量α-突触核蛋白水平。使用抗-Flag抗体通过细胞提取物的Western印迹测量FAF1水平。显然，用FAF1抑制剂处理后，α-突触核蛋白的水平降低(图11)。IC50为20nM，在10μM时抑制超过95％。与现有技术中测量的凋亡抑制活性(在10μM时70％抑制)相比，其功效要高得多。注意到FAF1水平本身不被使用FAF1抑制剂处理改变。
【10.通过FAF1抑制剂在小鼠中脑中减少α-突触核蛋白】
为了观察FAF1抑制剂对动物中α-突触核蛋白水平的影响，用FAF1抑制剂KM-819处理过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠。该转基因动物是在Prion基因启动子下具有人类α-突触核蛋白突变基因A53T的小鼠品系(携带人突触核蛋白的家族性帕金森氏病(Lee MK等，2002)。
给三个月大的小鼠口服施用KM-819，剂量为1、5和10mg/kg/天，共9天。两只非转基因小鼠(非Tg)被用作对照，而三只转基因小鼠(α-syn A53T Tg)仅施用媒介物而无KM-819。且对KM-819的每种给药使用两只小鼠。处死动物，分离中脑组织并制备提取物。分别使用抗α-突触核蛋白抗体、P-α-syn抗体和FAF1抗体，通过Western印迹测量α-突触核蛋白、S129磷酸化形式的α-突触核蛋白和FAF1。显然，用FAF1抑制剂KM-819处理后，α-突触核蛋白及其磷酸化形式的水平均降低，证明FAF1抑制剂降低了动物中α-突触核蛋白的积累(图12)。注意到FAF1水平本身不被使用FAF1抑制剂处理改变。注意将β-肌动蛋白水平用作内部对照。
【11.通过FAF1抑制剂在小鼠海马中降低α-突触核蛋白】
为了观察FAF1抑制剂对动物中α-突触核蛋白水平的影响，用FAF1抑制剂KM-819处理过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠。该转基因动物是在Prion基因启动子下具有人类α-突触核蛋白突变基因A53T的小鼠品系(携带人突触核蛋白的家族性帕金森氏病(Lee MK等，2002)。
给三个月大的小鼠口服施用KM-819，剂量为1、5和10mg/kg/天，共9天。将三只非转基因(非Tg)小鼠用作对照，并且两只转基因小鼠(α-synA53T Tg)仅施用媒介物而无KM-819。且KM-819的每种给药使用两只小鼠。处死动物，分离海马组织并制备提取物。分别通过使用抗α-突触核蛋白抗体和FAF1抗体的Western印迹法测量α-突触核蛋白和FAF1。显然，用FAF1抑制剂KM-819处理后，α-突触核蛋白的水平降低，这证明FAF1抑制剂降低了动物中α-突触核蛋白的积累(图13)。
【12.通过FAF1抑制剂在小鼠皮层中减少α-突触核蛋白】
为了观察FAF1抑制剂对动物中α-突触核蛋白水平的影响，用FAF1抑制剂KM-819处理过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠。该转基因动物是在Prion基因启动子下具有人α-突触核蛋白突变基因A53T的小鼠品系(携带人突触核蛋白的家族性帕金森氏病(Lee MK等，2002)。
给三个月大的小鼠口服施用KM-819，剂量为1、5和10mg/kg/天，共9天。两只非转基因小鼠(非Tg)被用作对照，并且两只转基因小鼠(α-synA53T Tg)仅施用媒介物而无KM-819。且KM-819的每种给药使用两只小鼠。处死动物，分离皮层组织并制备提取物。使用抗α-突触核蛋白抗体通过Western印迹测量α-突触核蛋白。显然，用FAF1抑制剂KM-819处理后，α-突触核蛋白的水平降低，这证明FAF1抑制剂降低了动物中α-突触核蛋白的积累(图14)。
【13.通过FAF1抑制剂在小鼠小脑中减少α-突触核蛋白】
为了观察FAF1抑制剂对动物中α-突触核蛋白水平的影响，用FAF1抑制剂KM-819处理过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠。该转基因动物是在Prion基因启动子下具有人α-突触核蛋白突变基因A53T的小鼠品系(携带人突触核蛋白的家族性帕金森氏病(Lee MK等，2002)。
给三个月大的小鼠口服施用KM-819，剂量为1、5和10mg/kg/天，共9天。将三只非转基因小鼠(非Tg)用作对照，并且两只转基因小鼠(α-synA53T Tg)仅施用媒介物而无KM-819。且KM-819的每种给药使用两只小鼠。处死动物，分离小脑组织并制备提取物。分别使用抗α-突触核蛋白抗体和FAF1抗体通过Western印迹测量α-突触核蛋白和FAF1。显然，用FAF1抑制剂KM-819处理后，α-突触核蛋白的水平降低，表明FAF1抑制剂降低了动物中α-突触核蛋白的积累(图15)。
【14.通过FAF1抑制剂在小鼠纹状体中降低α-突触核蛋白】
为了观察FAF1抑制剂对动物中α-突触核蛋白水平的影响，用FAF1抑制剂KM-819处理过表达α-突触核蛋白的转基因小鼠。该转基因动物是在Prion基因启动子下具有人类α-突触核蛋白突变基因A53T的小鼠品系(携带人突触核蛋白的家族性帕金森氏病(Lee MK等，2002)。
给三个月大的小鼠口服施用KM-819，剂量为1、5和10mg/kg/天，共9天。将三只非转基因(非Tg)小鼠用作对照，并且两只转基因小鼠(α-synA53T Tg)仅施用媒介物而无KM-819。且KM-819的每种给药使用两只小鼠。处死动物，分离纹状体组织并制备提取物。分别通过使用抗α-突触核蛋白抗体和FAF1抗体的Western印迹测量α-突触核蛋白和FAF1。显然，用FAF1抑制剂KM-819处理后α-突触核蛋白水平降低，证明FAF1抑制剂降低了动物中α-突触核蛋白的积累(图16)。
【实施方式】
实施方式1：一种用于治疗由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，其包括向表现出所述突触核蛋白病的症状或处于所述突触核蛋白病的风险中的受试者施用有效量的提高α-突触核蛋白量的FAF1活性的抑制剂或有效量的调节LC-3和p62量的FAF1活性的抑制剂。
实施方式2：实施方式1的方法，其中所述FAF1活性的抑制剂是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002325811250000161
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000162
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
实施方式3：实施方式1的方法，其中所述氨基吡唑化合物为4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸或其酯或酰胺。
实施方式4：一种用于治疗由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，其包括向表现出所述突触核蛋白病的症状或处于所述突触核蛋白病的风险中的受试者施用一定量的结合FAF1蛋白的化合物，所述一定量的化合物对于减少所述受试者的细胞中的在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量而言是有效的。
实施方式5：实施方式4的方法，其中所述结合FAF1蛋白的化合物是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002325811250000171
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000172
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
实施方式6：实施方式4的方法，其中所述氨基吡唑化合物为4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸或其酯或酰胺。
实施方式7：实施方式1～3之任一项的方法，其中所述FAF1抑制剂经口服或通过注射到脑或血液中或经由皮肤施用。
实施方式8：实施方式4～6之任一项的方法，其中所述结合FAF1蛋白的化合物经口服或通过注射到脑或血液或经由皮肤或其他常用实践方法施用。其中所述结合FAF1的化合物是口服施用的。
实施方式9：一种用于在受试者中诊断突触核蛋白病或评估突触核蛋白病的风险的方法，其包括测量受试者的细胞或来自受试者的任何其他样品中的抑制包含LC-3和p62蛋白的自噬的FAF1活性或FAF1水平，其中高于正常人的FAF1的活性水平或蛋白质水平表明形成了突触核蛋白病或受试者有形成突触核蛋白病的风险。
实施方式10：一种用于治疗受试者中由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，其包括向在所述受试者的细胞中表现出FAF1活性或FAF1水平(受试者细胞中抑制包含LC-3和p62蛋白的自噬)的受试者施用一定量的结合FAF1蛋白的化合物，其中FAF1的活性水平或蛋白水平高于正常人表明形成了突触核蛋白病或受试者有形成突触核蛋白病的风险，所述一定量的化合物对于减少所述受试者的细胞中在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量而言是有效的。
实施方式11：实施方式10的方法，其中施用式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002325811250000181
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000182
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A为CH或N。
实施方式12：一种用于制备药物的方法，其包括将式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体混合：
Figure BDA0002325811250000191
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000192
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A为CH或N。
实施方式13：实施方式12的方法，其中所述药物用于治疗受试者中由突触核蛋白病引起的疾病或病况。
实施方式14：式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐用于治疗受试者中由突触核蛋白病引起的疾病或病况的用途：
Figure BDA0002325811250000201
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure BDA0002325811250000202
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基。
实施方式15：实施方式14的用途，其中所述氨基吡唑化合物有效抑制FAF1活性以提高受试者细胞中或来自受试者的样品的细胞中α-突触核蛋白的量，或有效增加受试者细胞中或来自受试者的样品的细胞中通过LC-3和p62蛋白介导的自噬，或有效减少受试者细胞中或来自受试者的样品的细胞中在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量。
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Claims (11)

1.治疗由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，该方法包括向表现出所述突触核蛋白病的症状或处于所述突触核蛋白病的风险中的受试者施用有效量的增加α-突触核蛋白量的FAF1活性的抑制剂，或有效量的调节LC-3和p62量的FAF1活性的抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述FAF1活性的抑制剂是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002325811240000011
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure FDA0002325811240000012
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
3.权利要求1的方法，其中所述氨基吡唑化合物为4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸或其酯或酰胺。
4.治疗由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，该方法包括对表现出所述突触核蛋白病的症状或处于所述突触核蛋白病的风险中的受试者施用一定量的结合FAF1蛋白的化合物，所述一定量的化合物对于减少所述受试者的细胞中的在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量而言是有效的。
5.权利要求4的方法，其中所述FAF1活性的抑制剂是式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002325811240000021
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure FDA0002325811240000022
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A是CH或N。
6.权利要求4的方法，其中所述氨基吡唑化合物为4-[2-(4-溴-苯硫烷基)-乙酰氨基]-1-苯乙基-1H-吡唑-3-羧酸或其酯或酰胺。
7.权利要求1的方法，其中所述FAF1抑制剂经口服或通过注射到脑或血液中或通过皮肤或其他常用实践方法施用。
8.权利要求4的方法，其中所述FAF1抑制剂经口服或通过注射到脑或血液中或通过皮肤或其他常用实践方法施用。其中所述结合FAF1的化合物是口服施用的。
9.在受试者中诊断突触核蛋白病或评估突触核蛋白病的风险的方法，其包括测量受试者细胞中抑制包含LC-3和p62蛋白的自噬的FAF1活性或FAF1水平，其中FAF1的活性水平或蛋白水平大于正常人表明受试者形成了突触核蛋白病或有形成突触核蛋白病的风险。
10.治疗受试者中由突触核蛋白病引起的疾病或病况的方法，其包括向在所述受试者的细胞中表现出受试者细胞中抑制包含LC-3和p62蛋白的自噬的FAF1活性或FAF1水平的受试者施用一定量的结合FAF1蛋白的化合物，其中FAF1的活性水平或蛋白水平高于正常人表明受试者形成了突触核蛋白病或有形成突触核蛋白病的风险，所述一定量的化合物对于减少所述受试者的细胞中在氨基酸S129处磷酸化的α-突触核蛋白的量而言是有效的。
11.权利要求10的方法，其中施用式1的氨基吡唑化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002325811240000031
其中R1是-CO2R3、-CH2OR3、-CONR3R4或
Figure FDA0002325811240000032
其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；R2是-(CH2)2-苯基；B为H、苯基或C1～C3烷基或卤素取代的苯基；n是0～2的整数；Y为S、O、CH2、SO、SO2或NR3R4，其中R3和R4彼此独立地为H或直链、支化或环状的C1～C6烷基；Z为H、卤素、OCH3、NO2、NH2或直链、支化或环状的C1～C3烷基；且A为CH或N。
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