CN110878294B - 一种改善线粒体功能的粘红酵母去乙酰化酶蛋白4的应用 - Google Patents

一种改善线粒体功能的粘红酵母去乙酰化酶蛋白4的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种改善线粒体功能的sirtuin4蛋白的应用及阐述其作用机制，属于生物技术领域。本发明将具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的粘红酵母sirtuin4基因在哺乳动物细胞中重组表达。实验结果表明其可以激活受损线粒体自噬的相关蛋白，显著降低哺乳动物细胞的SA‑β‑gal活性水平，增强CK19、β1整合素的表达水平，降低细胞内ROS水平水平，明显提升细胞内ATP水平，改善线粒体形态，从而改善了线粒体网络和提高了细胞抵抗衰老的能力，为使用sirtuin4蛋白治疗线粒体功能障碍和预防衰老提供了新的策略。

Description

一种改善线粒体功能的粘红酵母去乙酰化酶蛋白4的应用
技术领域
本发明属菌种蛋白应用机制的生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种由哺乳动物细胞表达的粘红酵母sirtuin4蛋白的机制及其应用，其具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型的功能。
背景技术
低等真核生物Sirtuin基因与寿命有关的证据为哺乳动物Sirtuins基因影响哺乳动物寿命提供依据。多种实验已经证明SIRT1可以用来抗衰老。最近研究显示脑特异性SIRT1过表达能够延长老鼠的寿命和延缓衰老。缺失SIRT1的近交小鼠胚胎发育和产后生活受损严重。最近的一项研究证实，缺失SIRT1的远交小鼠并不能通过能量限制延长寿命。这表明内源性SIRT1是CR触发的寿命效应所必须的。SIRT2对寿命的影响尚未明确，但SIRT2可能可以预防某些与衰老相关的疾病。SIRT3是Sirtuin家族中第一个发现与哺乳动物衰老有联系的蛋白，一系列的研究报道了SIRT3作为线粒体重要的去乙酰化酶在维持线粒体功能中发挥重要作用。SIRT通过对对听力损伤的保护达到在CR下的抗衰老。此外，SIRT3能够调节ROS水平。迄今为止，还没有研究指出SIRT4或SIRT5基因与抗衰老之间的联系，但SIRT4和SIRT5调节线粒体代谢的潜在作用，不难联想到这些Sirtuins在衰老相关疾病中的潜在影响。
线粒体动力学失调和线粒体形态异常是衰老的标志，被认为是造成许多年龄相关病变的病理学原因。线粒体活力与线粒体质量控制有关，是非对称的裂变和融合的过程。重构线粒体网络促进线粒体和其他细胞器的相互作用，维持线粒体的代谢活性。Sirtuins可通过多条通路调控线粒体功能，Sir2是否直接通过对线粒体功能的调控实现机体抗衰老还未知，以及如何控制线粒体网络以实现抗衰老是需要研究的。衰老与线粒体网络稳态的丧失有关，但是与这些变化相关的生物衰老的细胞过程仍不清楚。通过融合和裂变的线粒体网络的动态重构促进了细胞稳态的维持。线粒体动力学失调和线粒体形态异常是衰老的标志，被认为是造成许多年龄相关病变的病理学原因。
线粒体一直处于不断融合和分裂的循环中，这是两个完全相反的过程，对维持线粒体的数量和质量、以及线粒体之间物质交换至关重要，另外，正常的线粒体膜电位是融合和裂变所必须的。线粒体分裂增加线粒体数量，线粒体融合完成线粒体间蛋白质互补和信息传递。随着年龄增长，细胞内积累过多的线粒体碎片，诱导疾病的发生。线粒体融合和分裂需要相关蛋白质的参与和调控。功能正常的线粒体在与另一线粒体融合的过程需要定位在外膜的融合蛋白Mfnl、Mfn2和定位在内膜的视神经萎缩因子(0PA1)的参与。特别的是，线粒体分裂是一个非选择性过程，需要动力相关蛋白1(Drpl)、Fisl、MFF和MTP18的参与。
一组4698个可行的单基因缺失菌株进行了酵母RLS的系统分析，并鉴定了238个的单基因缺失延长寿命，提示单基因也能影响寿命。值得注意的是，敲除酿酒酵母的去乙酰化酶基因，包括SIR2，3，4，HDA1，2，3，HOS1，2，3，4，HST1，2，3，4，RPd3，SAP1，30，155，185，190，4，并不能延长寿命，说明这些基因是维持细胞活性所必需的，可能与细胞抗衰老有关。粘红酵母是已知的脂质生产者，细胞的形态变化伴随着增殖和分化，生长良好时形成大量的脂滴，细胞衰老时产油量减少，而且比酵母细胞生长期更容易被观察到，是一个很好的研究模型。经NCBI上检索发现，粘红酵母含有五个Sir2同源基因：hst3，hst4，sirtuin1，sirtuin2，sirtuin4。酵母Sir2家族与人的Sirtuins高度同源。
因此探讨酵母Sir4是否具有逆转细胞衰老表型的作用，并研究这一过程中线粒体分裂与融合、线粒体自噬以及线粒体动力学的改变对细胞活性和衰老的影响；进一步在在哺乳动物中验证。这项研究为用于预防和治疗抗衰老或代谢综合征等线粒体功能障碍的疾病提供新策略。
发明内容
本发明的目的是提供一种粘红酵母sirtuin4蛋白的应用和阐述其作用机制。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
1.质粒的构建转染与细胞处理
1.1质粒的构建
1.2 H2O2处理转染前后的HaCaT细胞
1.3质粒转染
1.4目的蛋白的鉴定
2.细胞增殖能力测定(MTT法)
2.1 SA-β-gal活性测定
2.2检测细胞CK19，β1整合素，CK10蛋白表达水平
2.3 Western Blot技术检测蛋白表达水平
2.4 RT-PCR技术检测mRNA水平
3.线粒体质量分析
3.1透射电镜分析线粒体超微结构
3.2 Mito-Tracker分析线粒体形态
3.3线粒体动力学蛋白及自噬蛋白表达水平
3.4 Western Blot技术检测线粒体融合分裂蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1，自噬相关蛋白的表达水平
3.5 RT-PCR技术检测自噬相关蛋白mRNA表达水平
3.6 DCFH-DA探针检测胞内ROS含量
3.7处理后HaCaT细胞的ATP及酶的水平
3.8 ATP试剂盒测定ATP水平变化测定
3.9试剂盒测定SOD、CAT、ATP合成酶水平
本发明公开了一种具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的粘红酵母sirtuin4基因及其作用机制，属于生物技术领域。本发明将具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的粘红酵母sirtuin4基因在人HaCat细胞中重组表达。实验结果表明其可以激活受损线粒体相关蛋白，降低哺乳动物HaCaT细胞的SA-β-gal活性水平，增强CK19、β1整合素的表达水平，降低细胞内ROS水平水平，明显提升细胞内ATP水平，改善线粒体形态，从而改善了线粒体网络和提高了细胞抵抗衰老的能力。因此，由人HaCat细胞表达的具有重构线粒体网络和改善哺乳动物衰老细胞表型功能的sirtuin4蛋白可为线粒体功能障碍和机体衰老的预防和治疗提供了一种新的可能性。粘红酵母sirtuin4的这一功能可用于制备防治与细胞线粒体功能低下相关病理过程的药物领域。
附图说明
图1为实施例中质粒构建图谱和电泳结果图，其中M：DNA Marker；1：pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2(6283bp)；2：pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4(6106bp)；3：pFlag-CMV-2(4679bp)。
图2为实施例中过氧化氢浓度与细胞存活率关系，*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normalgroup.
图3为实施例中重组质粒蛋白表达鉴定结果。
图4为实施例中HaCaT细胞存活率。
图5为实施例中HaCaT细胞半乳糖苷酶活性(bar.50μm)，*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group.
图6为实施例中HaCaT细胞CK19，CK10，β1整合素蛋白表达水平，其中1：Normal；2：H2O2；3：Empty；4：co-sirtuin
图7为实施例中HaCaT细胞CK19，CK10，β1整合素mRNA表达水平，*p＜0.05，**p＜0.01 vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group.
图8为实施例中DCFH-DA检测胞内ROS水平(bar.20μm)。*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group.
图9为实施例中HaCaT细胞ATP水平，*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group.
图10为实施例中HaCaT细胞线粒体质量评估(200×)。
图11为实施例中HaCaT细胞Mfn1，Mfn2和Drp1蛋白表达水平，其中1：Normal；2：H2O2；3：Empty；4：co-sirtuin；5：Rt-sirtuin4；6：Rt-sirtuin2。
图12为实施例中HaCaT细胞LC3-II，LC3-I，PINK1蛋白表达水平，其中1：Normal；2：H2O2；3：Empty；4：co-sirtuin；5：Rt-sirtuin2；6：Rt-sirtuin4；7：co-sirtuin+3MA。
图13为实施例中HaCaT细胞LC3，PINK1 mRNA表达水平，*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group，Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01vs.H2O2+co-sirtuin group.
图14为实施例中线粒体Parkin和细胞质Parkin蛋白表达，其中1：Normal；2：H2O2：3：Empty；4：co-sirtuin；5：Rt-sirtuin2；6：Rt-sirtuin4；7：co-sirtuin+3MA
图15为实施例中HaCaT细胞SOD、CAT和ATP合成酶活性检测，*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group，Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01vs.H2O2+co-sirtuin group.
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例粘红酵母Sir2同源基因sirtuin4对衰老HaCaT细胞表型及线粒体重构的影响
1.实验材料
1.1菌株、质粒和细胞
大肠杆菌E.coliDH5α，表皮角质形成细胞HaCaT均为实验室保藏；质粒为pFlag-CMV-2和pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2和pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4由上海吉凯基因公司构建。
主要试剂
实验主要试剂如表1所示
表1实验试剂
鼠抗Anti-Flag单抗，Mfn1、2，DRP1，Parkin，LC3 I/II，PINK1，anti-CK19，anti-β1，anti-CK10等单克隆抗体购自上海爱必信生物科技公司，SOD试剂盒，CAT试剂盒，ATPase试剂盒，SA-β-gal检测试剂盒购自上海索莱宝生物科技有限公司。
主要仪器
本论文中主实验仪器如表2所示：
表2实验仪器
1.4主要溶液及培养基
(1)LB液体培养基：在100mL容量瓶中加入1.0g NaCl，1.0g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，定容后，调节PH为7.2，使用高压蒸汽灭菌法灭菌20～30min，之后置于4℃保存。如果是配置固体培养基再加入10％～15％的琼脂。
(2)抗体稀释液：在200mL TBST缓冲液中溶解10g BSA，配制成5％BSA溶液，4℃下备用。
(3)TBST缓冲液：在5000mL容量瓶中加入400g NaCl、121g Tris-Base调节PH至8.0，用蒸馏水溶解并定容，配置成10×TBS缓冲液母液，室温下备用。如若要配置成1×的工作液，则用蒸馏水稀释10倍，再从稀释的溶液中量取500mL，在其中加入0.5mL吐温-20。
(4)转膜缓冲液：14.5g甘氨酸、29g Tris、1.85g SDS和1000mL甲醇在4000mL蒸馏水中溶解完全，4℃备用。
(5)封闭缓冲液：在200mL TBST缓冲液中溶解脱脂奶粉10g，4℃备用。
(6)SDS-PAGE电泳缓冲液：5×母液：在1000mL蒸馏水中加入并溶解甘氨酸93.85g、SDS 5g、Tris 15.15g，4℃温度下备用。将母液稀释5倍后使用。
实验方法
2.1质粒的构建转染与细胞处理
2.1.1质粒的构建
pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2和pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4由上海吉凯基因公司构建。
处理转染前后的HaCaT细胞
(1)H2O2构建衰老模型浓度确定
1)将HaCaT细胞按9×104个/ml的密度接种于六孔板，用含10％FBS的高糖DMEM培养基于5％CO2、37℃培养箱中培养24h。
2)细胞贴壁后，用PBS清洗3次，去掉培养液。
3)用无血清无双抗的DMEM配制不同浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L)的H2O2。
4)每孔中加入100μL不同浓度的H2O2，培养箱培养2h。
5)除去上清，用PBS洗涤细胞3遍后重新用新鲜的培养基继续培养24h。
6)MTT法检测细胞存活率，确定处理细胞的H2O2终浓度。
(2)细胞最终处理方案
细胞实验共分4组，分别为：正常对照组(Normal)，H2O2组，H2O2转染空质粒组(Empty)，H2O2转染Rt-sirt2组(Rt-sirtuin2)，H2O2转染sirt4组(Rt-sirtuin4)，H2O2共转染Rt-sirt2与Rt-sirt4组(co-sirtuin)
2.1.3质粒转染
按照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒操作步骤：
(1)在24孔板加入中500μL不含抗生素和血清的DMEM培养基，并且在每孔接种0.5～2×105个细胞，细胞融合在转染时达到90％左右。
(2)将质粒DNA稀释通过量取50μLOpti-ME I培养基(不含血清)。在50μL Opti-MEI中加入适量Lipofectamine 2000稀释，室温处理5min。
(3)在室温中将Lipofectamine 2000和上述DNA混合，静置20min。
(4)在24孔板中的每个孔中加100μL的转染液。
(5)培养转染后的细胞4～6h，更换新鲜培养基继续培养24h，结束后将细胞裂解，检测目的基因的表达。
目的蛋白的鉴定
(1)提取总蛋白
1)细胞用PBS溶液清洗3遍。
2)在37℃下，量取2mL胰蛋白水解酶(0.025％)处理5～8min，直至大部分细胞可以浮动时，消化终止，转速为900rpm离心5min，取沉淀。
3)量取RIPA裂解酶20μL，将离心管放入震荡涡旋仪中，完全震荡裂解，放在冰上10min，每隔5min震荡30s。
4)将离心管放入95℃水浴锅中加热5min，随后重复上一步和这一步2次。
5)将高速离心机转速设定为12000g，温度为4℃，离心15min。吸取清液到EP管中，即为总蛋白。
(2)通过Western blotting来检测目的蛋白的表达情况，具体操作步骤如下：
1)制胶：首先将分离胶倒入电泳玻璃板的间隙，直到距离上边缘1.5～2cm时停止添加，再用75％乙醇封层；等到胶变为固体状态后，将乙醇倒掉后添加配置好的浓缩胶，插入梳子等待胶干透。
2)上样：待测蛋白沸水浴3min，将新现配的电泳液倒入电泳槽，量取8μL和5μL蛋白maker，分别倒入两边泳道，再量取1×蛋白上样缓冲液2μL和5μL，分别加入刚才倒入蛋白marker的泳道，填补到10μL，剩余泳道加10μL样品，电泳时电压设为50V。
3)转膜：停止后，将滤纸剪成11cm×8cm的形状，另取0.22μm的PVDF膜，用一定量的甲醇溶液将膜处理5min，组装转印夹层的顺序为“海绵-6层滤纸-凝胶-PVDF膜-6层滤纸-海绵”，之后转移至转膜槽，电流调为200mA处理60min。
4)孵育抗体：停止转膜后，膜用TBS液清洗5min，再封闭1h，TBST液洗三次膜，每次5min，加入一抗稀释液，4℃条件下过夜孵育；洗三次膜，加二抗稀释液室温孵育1h。
5)发光检测：膜用TBST液清洗后用发光液处理3min，吸干，将胶片和膜一起压片，持续1分钟再显影30秒，用水清洗干净，等待烘干再进一步扫描。用ImajeJ2x测定内参照基因和目的基因的灰度值。
细胞增殖能力测定(MTT法)
(1)上述细胞培养板，吸去H2O2，PBS清洗3次去掉培养液，在每孔加入20μL MTT溶液，放入培养箱培养4h。
(2)吸尽除去各孔MTT溶液，每孔加入150μL DMSO溶液，低速震荡10min。
(3)在490nm波长处检测吸光值，OD测定组/OD对照组×100％计算细胞存活率。
β-gal活性测定
PBS溶液冲洗细胞爬片后，在室温下用甲醛2％/戊二醛0.2％固定3～5min，用PBS清洗，在37℃无CO2条件下用新鲜配制的SA-β-gal染色液孵育2～4h，不可超过12～16h，然后封片，光镜下100～200倍观察。
检测细胞CK19，β1整合素，CK10蛋白表达水平
2.3.1Western Blot技术检测蛋白表达水平
细胞经质粒孵育48h后，进行后续实验。一抗使用CK19，β1，CK10孵育。
技术检测mRNA水平
(1)设计引物
根据CK19，β1，CK10的核苷酸序列，设计三个基因的引物分别如表3-3所示。
表3 PCR引物
(2)细胞总RNA的提取
1)待细胞大约长至八成满，用PBS溶液清洗3次后吸干净以免溶液残余。
2)量取Trizol裂解液1mL，加到细胞培养皿中，吹打细胞直至全部掉下并溶于裂解液。
3)取15mL的离心管，加入裂解液，震荡1min以使细胞完全裂解，放在室温下，静置10min，将离心管中的液体转移到新的EP管。
4)在上述新的EP管中加氯仿0.2mL，先晃动30s使其混匀，在室温下放置15min，温度4℃转速为12000rpm离心15min，结束后液体分为上中下三层，吸取上层液体到新EP管中。
5)在4)最后的EP管中加入异丙醇500μL，摇动使液体混合均匀，室温下放置15min，温度4℃转速为12000rpm离心10min，去除上清液，再加入75％的C2H5OH试剂1mL并充分混合均匀，温度4℃转速为12000rpm离心5min。
6)将上清液去除，沉淀干燥5min，将沉淀充分溶解在20μL的DEPC水中，这时得到的就是总RNA。
7)将超微量分光光度计读数调零，并用滤纸吸干校正液DEPC水。
8)滴1μL总RNA，测定其的浓度，过程中应控制OD260/OD280＞1.9。
(3)反应体系参照T试剂盒操作说明。
(4)RT-PCR进行扩增及琼脂糖凝胶电泳。
线粒体质量分析
2.4.1透射电镜分析线粒体超微结构
细胞处理后，在1000rpm条件下离心，5min后停止离心，取沉淀，并用适量PBS溶液洗涤2次，用滤纸吸干残留的PBS溶液，再加入戊二醛固定液(2.5％)1mL，经过脱水、干燥、导电等处理，用透射电镜在80KV电压下观察线粒体。
分析线粒体形态
使用线粒体红色荧光探针，实验方法如下：
(1)使用无水DMSO配置Mito-Tracker Red至终浓度为1mM的储存液，在-20℃或-80℃的温度下避光保存。
(2)1mM的Mito-Tracker Red储存液按照1∶20000的比例量取后加入到细胞培养液中，使其终浓度为50nM。
(3)去除培养液，加入染色液，37℃下孵育40分钟。
(4)去除染色液，加入预温37℃的细胞培养液。
(5)观察并拍照。
线粒体动力学蛋白及自噬蛋白表达水平
2.5.1Western Blot技术检测线粒体融合分裂蛋白Mfn1、Mfn2、Drp1，自噬相关蛋白的表达水平
一抗分别使用Mfn1、Mfn2、Drp1，Beclin，Parkin，PINK1，LC3 I，LC3II孵育。
技术检测自噬相关蛋白mRNA表达水平
表4 PCR引物
2.6DCFH-DA探针检测胞内ROS含量
(1)每个样品用PBS缓冲液洗1次后，加入含有5μmol/L DCFH-DA的PBS溶液，充分混匀，37℃培养箱培养30min。
(2)用PBS缓冲液清洗两次，去除未进入细胞内的探针，加入培养基，37C培养箱培养30min。
(3)用8000rpm离心2min，收集细胞，PBS缓冲液洗两遍，再用1ml PBS缓冲液重悬细胞。
(4)用流式细胞仪检测各管的荧光强度(激发波长为488mn、发射波长为530mn)，计数10000个细胞，求其平均荧光强度。
(5)在荧光显微镜下用紫外光(激发波长380nm，吸收波长420nm)激发后，观察。
检测3-MA处理后HaCaT细胞的ATP及酶的水平
后续实验细胞共分为5组，细胞实验共分4组，分别为：正常对照组(Normal)，H2O2组，H2O2转染空质粒组(Empty)，H2O2共转染Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4组(co-sirtuin)，自噬抑制剂3-MA组(co-sirtuin+3MA)。
试剂盒测定ATP水平变化测定
参照ATP测定试剂盒说明书：
(1)低温溶解试剂，将ATP标准溶液稀释至浓度梯度为0.1、1、10μM/L，绘制标准曲线。
(2)在细胞培养皿中加入200μL裂解液，吹打细胞至细胞裂解后，温度4℃转速为12000条件离心10min，得到上清液为所需。
(3)将ATP检测工作液稀释，在每一个实验孔中加ATP检测工作液100μL，在室温下静置5min，待消耗掉本地ATP之后，在实验孔中加上100μL待测样品或标准样品，混合均匀后，随即用生物发光仪测量CMP值。根据公式并结合标准曲线计算待测样品中ATP浓度。
试剂盒测定SOD、CAT、ATP合成酶水平
根据测定试剂盒说明书操作
(1)实验结束后，用PBS清洗3次，去掉培养液，收集细胞，在4℃条件下8000rpm离心5min，弃上清。
(2)再用PBS清洗，在4℃条件下8000rpm离心5min。
(3)加入1ml 1％的Triton X-100，充分混匀后，4℃条件下8000rpm离心10min，收集上清。
(4)分别按照试剂盒的说明测量不同处理组上清液中SOD，CAT，ATPase活性。
统计学处理
采用SPSS18.0软件分析数据，两组比较作t检验，多组均数间比较采用One-wayANOVA分析，显著性差异用p＜0.05或者p＜0.01表示。
实验结果
3.1质粒的鉴定
质粒构建图谱如图1所示，我们将构建好的质粒通过电泳验证，条带所在的位置符合表达质粒pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2为6283bp，质粒pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4为6106bp，和质粒pFlag-CMV-2为4679bp的片段大小，初步确定为本实验所需质粒。另外通过酶切测序，测序结果为目的基因的大小。提取的质粒A260/A280比值在1.9左右，A260/A230大于2.0，说明所提取的质粒纯度较高。
过氧化氢浓度的选择
为构建合理的氧化损伤所致的衰老模型需要对H2O2的浓度进行选择，本实验选择0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L、800μmol/L的H2O2，与HaCaT细胞接触后，测定细胞存活率。如图2显示，在0～800μmol/L范围内随着过氧化氢的浓度增加，HaCaT细胞活力逐渐降低。H2O2浓度高于100μmol/L显著降低细胞存活率。经200μmol/L H2O2处理后细胞存活率为69.5％。细胞呈现衰老表征。因此，选择200μmol/L H2O2处理2小时作为模型构建方案。
重组质粒蛋白表达鉴定
由于粘红酵母Sir2蛋白目前没有特异性的抗体。因此，我们构建了带有Flag标签的质粒pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2和pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4，以真核表达质粒和空质粒分别单独转染和共转染HaCaT细胞后的裂解液作为上样样品，经过Western blot分析，在anti-Flag特异性抗体检测下，发现Rt-sirtuin2在45KDa有目的条带，Rt-sirtuin4在40KDa有目的条带，共转染在45KDa和40KDa均有目的条带(图3)。因此鉴定了质粒pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin2和pFlag-CMV-2-Rt-sirtuin4可以在HaCaT细胞内正常表达。
共转染两组基因对HaCaT细胞衰老水平的影响
3.4.1质粒转染前后细胞存活率的改变
在质粒稳定转染并在HaCaT细胞内表达后，使用200μmol/L H2O2处理细胞，并观察Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4基因对细胞存活率的影响。实验使用MTT法检测了HaCaT细胞的存活率，发现Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4基因治疗能够不同程度恢复细胞的存活率但不及共转染组，如图4所示。因此，我们后续衰老水平的检测选共转染组作为研究对象。
β-gal活性检测细胞衰老水平
β-半乳糖苷酶染色试剂盒是一种基于衰老时SA-β-gal活性水平上调从而对衰老的细胞或组织进行染色检测的试剂盒。在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会有深蓝色的产物生成，光学显微镜下很容易观察到变成蓝色或深蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。
实验结果如图5所示，共转染Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4组细胞染色水平降低，结果表明粘红酵母Rt-sirtuin基因治疗能够显著降低哺乳动物HaCaT细胞的衰老水平。
细胞角质蛋白CK19，CK10，β1整合素水平
已分化成熟的表皮细胞可以从“年老的”分化状态返回到“年轻的”不完全分化、甚至具有表皮干细胞特征的幼稚状态，从而达到表皮细胞衰老表征的逆转。已知CK19、β1整合素水平随着细胞的增殖分化而降低，相反，CK10作为终末分化的标志随着表皮细胞衰老而表达增加。我们检测了表皮细胞角蛋白的蛋白质和mRNA表达水平。实验结果分别如图6、7所示，共转染Rt-sirtuin组的CK19、β1的表达增强，而作为终末分化的标志CK10的表达明显降低，结果更一步确定粘红酵母Sir2基因能够改善哺乳动物衰老细胞表型。
细胞ROS水平测定
利用DCFH-DA探针通过荧光显微镜和细胞流式检测胞内ROS水平，观察到H2O2诱导能够显著增加细胞内ROS水平，共转染质粒后的HaCaT细胞内荧光强度明显降低，且低于空质粒转染组(图8)。结果表明粘红酵母Sir2基因能够显著降低细胞的氧化应激水平。3.6.1细胞ATP产生的影响
如图9，发现Rt-sirtuin2和RL-sirtuin4基因共转染HaCaT细胞后，胞内ATP水平明显增加，表明粘红酵母Sir2基因能显著增强细胞代谢，激活线粒体功能。
*p＜0.05，**p＜0.01vs.Normal group，#p＜0.05，##p＜0.01vs.H2O2 group.
3.7Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4基因对HaCaT细胞线粒体网络的影响
3.7.1HaCaT细胞线粒体质量评估
利用线粒体Mito-Tracker Red红色荧光探针标记线粒体并在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图10：对照组中，HaCaT细胞的线粒体大部分相互连接形成网络状；而在H2O2处理组中，呈现片段化的线粒体(小环状或点状)，线粒体网络被破坏；经共转染Rt-sirtuin基因治疗缓解了线粒体网络破坏，恢复线粒体质量。
另外，图10中，我们用透射电镜观察了线粒体形态学的改变。正常情况下线粒体形态呈杆状或椭圆形，线粒体膜光滑完整，脊完整。H2O2培养后，线粒体出现形态异常，外膜增厚出现空泡样，脊断裂或消失。而共转染Rt-sirtuin组线粒体形态一定程度的恢复。
线粒体动力学蛋白表达水平
上面的实验证实了粘红酵母Sir2基因能够缓解H2O2诱导的HaCaT细胞衰老，并且这一过程能够影响线粒体质量，线粒体的网络形态与能量和代谢需求以及生存能力密切相关，而线粒体动力学的改变影响线粒体网络。因此我们接下来检测线粒体动力学相关蛋白：融合和裂变蛋白——Mfn1，Mfn2和Drp1的表达水平。
如图11所示，在H2O2处理组中，线粒体Mfn1、Mfn2、Drp1表达显著降低，经转染Rt-sirtuin基因后，融合蛋白Mfn1，Mfn2和分裂蛋白Drp1的表达水平不同程度的升高，共转染组增加水平最明显，有趣的是：单独转染Rt-sirtuin2组较单独转染Rt-sirtuin4组融合和分裂蛋白增加更显著。结果说明，共转染Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4基因能够恢复线粒体网络，促进线粒体的融合和分裂，维持线粒体质量，而Rt-sirtuin2相比于Rt-sirtuin4作用更明显。3.7.3线粒体自噬蛋白表达水平
实验检测了自噬相关蛋LC3-II，LC3-I，PINK1的蛋白质水平(图12)和mRNA水平(图13)来评估线粒体自噬水平。结果发现，共转染组LC3-II/LC3-I比值及PINK1蛋白表达略高于H2O2组，加入线粒体自噬抑制剂3-MA能降低自噬相关蛋白的表达。有趣的是，与线粒体融合分裂蛋白的结果不同，单独转染Rt-sirtuin4组较单独转染Rt-sirtuin2组自噬相关蛋白增加更显著。另外，LC3和PINK1 mRNA水平在诱导衰老后降低，共转染sirtuin2和sirtuin4能够显著升高LC3和PINK1的mRNA水平，Rt-sirtuin4组较单独转染Rt-sirtuin2组作用更强。
我们发现，自噬在这一过程中起到重要的作用，与线粒体的融合和分裂共同构成了线粒体网络稳态的平衡。PINK1依次激活Parkin，使其聚集到线粒体外膜上，可将受损的线粒体及时清除，因此，我们评估了线粒体Parkin(mito-Parkin)和细胞质Parkin(cyto-Parkin)的蛋白表达水平。如图14所示，H2O2诱导后mito-Parkin表达降低，cyto-Parkin表达升高，共转染Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4逆转了这种变化，提示线粒体自噬激活以清除衰老细胞内受损的线粒体。单独转染Rt-sirtuin4组的作用比单独转染Rt-sirtuin2组更强。
破坏线粒体网络稳态对线粒体抗氧化酶及ATP合酶的影响
先前的实验观察到：共转染质粒组的自噬蛋白表达水平升高，提示Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4基因抗细胞衰老伴随着重构线粒体，不仅促进线粒体更新，也促进了细胞对缺陷线粒体的清除，这两者共同构成了线粒体网络稳态。我们加入线粒体自噬抑制剂3-MA，抑制自噬，使有缺陷的线粒体无法清除，正常的线粒体无法更新，破坏线粒体网络，检测细胞线粒体功能。
将空质粒和Rt-sirtuin2和Rt-sirtuin4基因表达质粒单独或共转染至衰老模型HaCaT细胞后检测胞内抗氧化物酶和ATP合成酶的活性。实验结果如图15，相对于正常HaCaT细胞，氧化损伤所致衰老的HaCaT细胞内SOD、CAT和ATPase活性较低，共转染质粒后，衰老细胞内的抗氧化酶和ATP合成酶的活性显著升高，单独转染两种质粒的效果没有共转染显著。而3-MA抑制剂组无法恢复正常线粒体功能，上述指标没有改变。

Claims (1)

1.一种来自粘红酵母的具有增强线粒体动力蛋白和改善线粒体功能障碍的sirtuin4蛋白在制备预防和/或治疗改善细胞衰老表型的药品中的应用。
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