CN110869056A - 大脑缺血的RNAi治疗 - Google Patents

Abstract

本发明提供治疗大脑缺血的新方法，其包括给予聚合物纳米胶囊或其组合物。所述纳米胶囊包括聚合物壳和RNAi(例如miRNA)分子，其中聚合物壳包括a)至少一种带正电荷的单体，b)至少一种可降解的交联剂，和c)至少一种中性单体；且所述RNAi分子为患有大脑缺血的受试者提供治疗益处。本发明还公开了所述聚合物纳米胶囊的组合物。

Description

大脑缺血的RNAi治疗

相关申请

本申请要求2016年12月30日提交的美国临时申请号62/440,882的优先权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

背景

动脉供血阻断导致的缺血可导致代谢供需严重失衡，导致下游组织的低氧和功能障碍。尤其是脑缺血是最难治疗的，造成高死亡率和致残率(为世界上第二大死亡原因和第三大致残原因)。目前对脑缺血的治疗主要集中在改善或恢复血流，改善受影响脑区的灌注，以及诱导受影响脑组织的再生。在这种情况下，溶栓药物通常通过静脉内或动脉内灌注来给予以在实际缺血性中风后的溶栓时间溶解血块。为了再生目的，在小试验中测试了神经营养药物。然而，它们的有效性仍然没有定论。虽然在静脉内移植自体骨髓细胞或脑内移植神经干细胞方面显示出了积极的结果，但这样的移植策略需要昂贵而复杂的程序。

微RNA (一类调节与血管生成、细胞生长、增殖和分化相关的细胞蛋白的表达的分子)的全身递送，在脑缺血的治疗中具有巨大前景。然而，它们的治疗有效性受到微RNA的递送效率差的限制。微RNA (miRNA)是一个具有长度为21-25个核苷酸的小的非编码RNA家族，它调控着与血管生成、细胞生长、增殖和分化相关的各种细胞蛋白的表达。给予miRNA可以增强血管生长并帮助恢复受损组织的功能，这可以为治疗缺血性疾病提供有效的策略。事实上，已经证明，在脑缺血模型中，局部给予miRNA至隔离解剖部位可以促进功能恢复；然而，这种侵入性方法需要多次注射到靶部位或解剖上不同的区域。另一方面，全身给予miRNA在临床实践中是高度可接受的，但对脑缺血的治疗仍然是无效的。迄今为止，病毒和非病毒载体(如脂类、肽、环糊精和聚合物)已被广泛探索以全身递送miRNA。然而，用于脑组织再生的miRNA的全身递送尚未被证实。

因此，非常需要一种更有效和可行的递送方法来治疗缺血和其它疾病。

概述

本发明提供了基于核酸纳米胶囊治疗疾病(包括以基因失调为特征的疾病)的组合物和疗法。所公开的组合物使它们能够有效地递送到脑中的疾病部位，例如梗死部位或其它血管损伤部位。以微RNA-21为例，静脉内注射纳米胶囊至大脑缺血的大鼠模型中，能有效地改善梗死体积、神经学缺陷和组织病理学严重性。

附图简述

图1包含两个子图，即图1A和1B，其描述了miRNA纳米胶囊的合成及其全身递送用于脑缺血治疗的示意图。miRNA纳米胶囊的合成包括用于在miRNA分子周围富集单体和交联分子的步骤I和用于在miRNA分子周围生长一个薄的聚合物壳时形成n(miRNA)的步骤I (图1A)。用于缺血治疗的n(miRNA)全身递送包括：(I) 由于血管通透性增加而在脑组织缺血区积累n(miRNA)；(II) 细胞摄取n(miRNA)并在胞质溶胶中释放miRNA；和(III) 所递送的miRNA促进神经元的再生(图1B)。

图2包含9个子图，即图2A-2I，其描述了miR-21纳米胶囊的结构、尺寸、稳定性、蛋白质吸附和降解动力学。在不同的单体/miRNA (M/R)摩尔比下合成的n(miR-21)的琼脂糖凝胶电泳(图2A)。图2B示出了用10 mg/mL肝素孵育后，在不同的M/R摩尔比下合成的Lipo/miR-21复合物和n(miR-21)的稳定性。在此显示了用6000:1的M/R比合成的n(miR-21)的透射电子显微镜(TEM)图像(图2C)、流体动力学尺寸(图2D)和ζ电位(图2E)。用散射角为173°的动态光散射(DLS)测量了流体动力学尺寸和ζ电位。比较了于37℃用小鼠全血清或RNase分别孵育2h后天然miR-21、Lipo/miR-21和n(miR-21)的残留miR-21水平(图2F)。然后用氯仿/0.1% SDS-0.5 M NaCl提取残留的miRNA并用qRT-PCR测量。数据显示为平均值± SD (n=3)。**P<0.01、***P<0.001和****P<0.0001 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。图2G中显示了在用小鼠全血清孵育后，n(miR-21)和Lipo/miR-21吸附的血清蛋白的定量测定。数据显示为平均值± SD (n=3)。**P<0.01 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。比较了在50 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)和50 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中于37℃孵育2h后n(miR-21)的相对散射光强度(I/I ₀ × 100%)变化，其中I ₀ 是初始的n(miR-21)散射光强度，和I是在不同时间点测量的散射光强度，探测角为173°(图2H)。数据被标准化，以便于直接比较，并表示为平均值± SD (n=5)。在50 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)和50 mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中于37℃孵育2h后，n(miR-21)的琼脂糖凝胶电泳如图2I所示。分别地，符号“-”表示“无1 mg/mL肝素孵育”和“+”表示“用1 mg/mL肝素孵育”。

图3包括三个子图，即图3A-3C，其显示了用不同的单体:RNA (M:R)摩尔比合成的纳米胶囊的特性，包括一系列单体:RNA摩尔比的n(miR-21)的合成参数(图3A)、尺寸分布(图3B)和ζ电位趋势(图3C)。图3B和图3C中的数据表示为平均值± SEM (n=3)。

图4四个子图，即图4A-4D，其显示了用不同mPEG/miRNA摩尔比，以6000:1的M:R比率合成的纳米胶囊的特性，包括n(miR-21)的合成参数(图4A)、琼脂糖凝胶电泳(图4B)、尺寸分布和PDI (图4C)和ζ电位趋势(图4D)。图4C和图4D中的数据表示为平均值± SEM (n=3)。

图5包括两个子图，即图5A和5B，其描绘了用miR-21和n(miR-21)处理的C6细胞(图5A)和J774A.1细胞(图5B)的荧光辅助细胞分选分析，所述miR-21和n(miR-21)用不同mPEG/miRNA摩尔比以6000:1的M:R比率合成。C6和J774A.1细胞用50 nM miRNA的样品于37℃处理4 hr。MiR-21用FITC标记。在测量前进行台盼蓝猝灭分析。

图6包括三个子图，即图6A-6C，其描述了合成的n(miR-21)的特性，包括在4℃下在PBS (pH 7.4)中以单体/miRNA摩尔比6000合成的n(miR-21)的稳定性(图6A)，在25、37和60℃的不同温度下在PBS缓冲液中n(miR-21)的温度-依赖性尺寸变化(图6B)，和在含10%血清的PBS缓冲液存在或不存在下n(miR-21)的流体动力学尺寸(图6C)。三个子图中的所有数据表示为平均值± SEM (n=3)。

图7描述了在用小鼠全血清孵育后，以M:R比率6000:1合成的n(miR-21)和以M:R比率6000:1合成但无mPEG的n(miR-21) (无-PEG n(miR-21))所吸附的血清蛋白的定量测定。数据显示为平均值±SD (n=3)。*P<0.05和*P<0.01 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。

图8包括8个子图，即图8A-8H，其描述了miRNA纳米胶囊的细胞毒性、细胞内化效率、非特异性吞噬和细胞内活性。在37℃孵育4小时后，C6细胞中的miR-21、n(miR-21)和Lipo/miR-21的细胞内分布的共焦显微照片如图8A所示。比例尺：20 µm。miR-21用FITC标记。细胞用DAPI (对于细胞核)、DiI (对于细胞膜)进行复染色。比例尺：20 µm。C6细胞在与miR-21和n(miR-21)于37℃一起孵育4小时后的荧光辅助细胞分选(FACS)分析示于图8B中。miR-21用FITC标记。在测量前进行台盼蓝猝灭分析。于37℃孵育4小时后在C6细胞中的n(miR-NC)的细胞成活力测定示于图8C中。数据显示为平均值± SD (n=5)。J774A.1小鼠巨噬细胞于37℃与n(miR-21)和Lipo/miR-21孵育1小时后的荧光图像示于图8D。MiR-21用FITC标记。细胞用Hoechst 33342染色，以供细胞核成像。比例尺：100 µm。对于与n(miR-21)和Lipo/miR-21孵育后巨噬细胞的FACS分析获得的平均荧光强度，比较直方图(图8E)。数据显示为平均值± SD (n=3)。***P<0.001 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。进行实时定量PCR分析，以比较用不同样品在无血清培养基或50%人血清培养基中处理的C6细胞中miR-21水平(图8F)。数据显示为平均值± SD (n=3)。*P<0.05和**P<0.01 (Turkey事后检验，接着普通双向ANOVA)。在样品给予后48小时，在C6细胞中蛋白质表达的蛋白质印迹分析示于图8G中。蛋白质表达水平的量化表示为通过ImageJ软件从图8G中获得的归一化灰度值(图8H)。

图9包括3个子图，即图9A-9C，其描述了J774A.1小鼠巨噬细胞经n(miR-21)处理后的特征。图9A比较了J774A.1小鼠巨噬细胞与n(miR-21)和无-PEG n(miR-21)一起孵育后1小时的荧光图像。细胞用Hoechst 33342染色，以供细胞核成像。MiR-21用FITC标记。比例尺：100 µm。与n(miR-21)、无-PEG n(miR-21)和Lipo/miR-21一起孵育后，进行J774A.1巨噬细胞的FACS分析(图9B)。进行直方图以比较在与n(miR-21)和无-PEG n(miR-21)孵育后，从巨噬细胞的FACS分析获得的平均荧光强度(图9C)。数据显示为平均值± SD (n=3)。*P<0.05 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。

图10包括3个子图，即图10A-10C，其描述C6细胞中的miR-21水平的定量实时PCR分析，C6细胞用无血清培养基或50%人血清培养基中的各种样品处理。数据显示为平均值±SD (n=3)。**P<0.01 (Turkey事后检验，接着普通双向ANOVA)。

图11包括2个子图，即图11A和11B，其描述了在样品给予后48小时C6细胞的蛋白表达的蛋白质印迹分析(图11A)和从ImageJ软件定量分析得到的归一化蛋白表达水平(图11B)。

图12包括9个子图，即图12A-12I，其描述了miRNA纳米胶囊的生物分布、药代动力学和给药途径比较。图12A显示了缺血(短暂性局灶性大脑缺血)模型大鼠或非缺血大鼠的体内荧光图像(上)，以及于静脉内(i.v.)给予剂量0.5 mg/kg miR-21的Cy5.5标记的miR-21纳米胶囊(n(Cy5.5-miR-21))后24小时采集的脑组织的离体荧光图像(下)，并给予等体积的PBS作为对照。执行采集的脑组织的荧光信号的ROI分析(图12B)和成熟的miR-21水平(图12C)。数据显示为平均值± SD (n=5)。*P<0.05和**P<0.001 (Turkey事后检验，接着普通双向ANOVA)。离体荧光图像(图12D)和荧光信号的ROI分析(图12E)显示在注射Lipo/Cy5.5-miR-21和n(Cy5.5-miR-21) (剂量为0.5 mg miR-21/kg大鼠)后24小时收集的主要器官，并给予等体积的PBS作为对照。数据显示为平均值± SD (n=5)。*P<0.05 (双尾未配对Student t-检验)。图12F比较了静脉内注射Lipo/Cy5.5-miR-21和n(Cy5.5-miR-21) (剂量为0.5 mg/kg miR-21)后大鼠中n(Cy5.5-miR-21)的血液循环概况。插图：最初2小时的放大血液循环概况，其在对数y轴上绘制。数据显示为平均值± SEM (n=5)。图12G比较了缺血模型大鼠的体内荧光图像(上)，以及在颈动脉内(i.c.)或i.v.注射不同剂量的n(Cy5.5-miR-21)后24小时收集的脑的离体图像(下)。对图12G中采集的脑组织测量荧光信号的ROI分析(图12H)和成熟的miR-21水平(图12I)。数据显示为平均值± SEM (n=5)。显著性水平是*P<0.01和**P<0.001 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。

图13描绘从被处死的MCAO/R或正常大鼠获得的脑组织的代表性H&E染色图像。

图14包括6个子图，即14A-14F，其描述了miRNA纳米胶囊作为短暂性局灶性大脑缺血的治疗剂的功效。图14A比较了给予样品后短暂性局灶性大脑缺血模型大鼠的神经学功能。箭头指示样品给予的时间点。每次注射前每隔一天测试神经学缺陷评分。数据显示为平均值± SEM (n=10)。*P<0.05和**P<0.01 (Bonferroni多重比较检验，接着双向RMANOVA)。从第7天处死的大鼠获得的脑组织的TTC染色示于图14B中。从图14B测量量化的脑梗死体积(图14C)。数据显示为平均值± SEM (n=5)。*P<0.05和**P <0.01。(Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。梗死区的代表性HE染色图像示于图14D。比例尺：400 µm。测定了梗死区中miR-21的代表性荧光原位杂交检测(图14E)。蓝色表示DAPI和红色表示miR-21。比例尺：100 µm。梗死区的代表性免疫组织化学图像示于图14F中。比例尺：400 µm (上)和比例尺：150 µm (下)。

图15包括2个子图，即图15A和15B，其描述脑组织梗死区的TUNEL分析的代表性荧光图像(图15A) (蓝色表示DAPI和绿色表示FITC)和从TUNEL分析的定量分析获得的脑组织梗死区的细胞凋亡指数(图165)。数据显示为平均值± SEM (n=3)。***P<0.001 (Turkey事后检验，接着普通单向ANOVA)。

图16描述了7天处理期后主要器官的代表性H&E染色图像。

详细描述

定义

为方便起见，在说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语和短语的含义在下文提供。

如本文所用的，术语"靶标"指双链DNA或RNA的一段DNA或RNA链，其与用作转录基质的一段DNA或RNA链(包括所有转录区域)互补。靶基因，通常是有义链，是通过RNA干扰和/或微RNA有选择地抑制或沉默其表达的基因。

如本文所用的，术语"聚合物纳米胶囊"是指包含"聚合物壳"和“RNAi分子”如“微RNA分子”的组合物。

如本文所用的，术语"聚合物壳"指微RNA聚合物纳米胶囊的聚合物部分，其包含一种或多种带正电荷的聚合物单体、一种或多种交联剂以及任选一种或多种中性聚合物单体。带正电荷的单体、交联剂和中性单体的实例在美国专利申请公布号US 2015/0071999的表1、表2和表3中提供，其通过引用以其整体并入本文。

如本文所用的，术语"微RNA分子"指任何微RNA (简称“miRNA”)，其为一种小的非编码RNA分子(约含22个核苷酸)，无论是天然发现的(例如，在植物、动物和某些病毒中)，还是人为或人工合成的，在基因表达的RNA沉默和转录后调控中发挥作用(见Ambros (2004)Nature. 431:350-355; Bartel (2004) Cell 116:281-297)。虽然天然存在的miRNA通常位于细胞内，但在细胞外环境(包括各种生物液体和细胞培养基)中也发现了一些miRNA，通常称为循环miRNA或胞外miRNA。miRNA与一种或多种信使RNA (mRNA)的一部分互补。动物miRNA通常与3' UTR的位点互补，而植物miRNA通常与mRNA的编码区互补。与靶标RNA完美或接近完美的碱基配对促进RNA的切割。这是植物miRNA的典型模式。在动物中，配对通常是不完美的。miRNA有时还会引起启动子位点的DNA甲基化和组蛋白修饰，这影响靶基因的表达。在统一的数学模型中描述并组装了9种miRNA作用机制：Cap-40S起始抑制；60S核糖体单元连接抑制；延伸抑制；核糖体脱落(提前终止)；共翻译新生蛋白降解；P-体中的隔离；mRNA衰变(失稳)；mRNA裂解；和通过微RNA-介导的染色质重组的转录抑制，接着基因沉默(Morozova et al. (2012) RNA 18:1635-1655)。

如本文所用的，术语"可降解的聚合物"和"不可降解的聚合物"指本文所描述的聚合物降解成较小碎片的能力。在本发明的某些实施方案中，可降解的聚合物会在生理pH时分解。在某些实施方案中，可降解的聚合物可在大约pH 7.4时分解。在某些实施方案中，可降解的和不可降解的聚合物的混合物可产生可降解的聚合物混合物。在某些实施方案中，可降解的和不可降解的聚合物的混合物会在生理pH时分解。在某些实施方案中，可降解的和不可降解的聚合物的混合物可在大约pH 7.4时分解。

如本文所用的，术语“突变体基因”和“靶突变体基因”指相对于相应的正常、非突变细胞基因(在此称为"相应的野生型基因")，包含至少一个点突变的基因。术语突变体基因和靶突变体基因特别包括其表达与疾病或障碍有关的正常细胞基因或基因片段(如癌基因)的任何变体。

如本文所用的，术语"缀合物"或"缀合剂"或"表面缀合靶向剂"或"聚合物纳米胶囊缀合物"是指任何部分，如蛋白质或其有效部分，其与聚合物纳米胶囊缀合，并提供聚合物纳米胶囊对特定细胞类型表面的特异靶向，从而使RNAi分子(例如，微RNA)定向递送到特定的细胞类型。例如，缀合剂可结合于细胞-特异性细胞表面受体，从而使聚合物纳米胶囊直接接近靶细胞。在某些实施方案中，用于实现聚合物纳米胶囊的特异性靶向的缀合物包括CD4、CD8、CD45、CD133、aHLA和转铁蛋白。在其它实施方案中，缀合物可以是细胞-特异性抗体或其片段。用于靶向特定细胞类型的缀合物的其它实例在以下的详细描述中描述。

术语"互补RNA链" (在此也称为"反义链")指dsRNA链，其与靶基因的表达过程中形成的mRNA转录物或其加工产物互补。如本文所用的，术语"互补核苷酸序列"指互补RNA链上的区域，该区域与靶突变体基因的mRNA转录物的区域(即靶基因的"相应的核苷酸序列")互补。"dsRNA"指具有包含两个互补和反平行核酸链的双链体结构的核糖核酸分子。并非所有的dsRNA核苷酸都必须展示Watson-crick碱基对。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中核苷酸的数目。RNA链可能有相同或不同数目的核苷酸。互补RNA链的互补核苷酸区域的长度是少于25，优选19-24，更优选20-24，甚至更优选21-23，和最优选22或23个核苷酸。互补RNA链的长度是少于30，优选地少于25，更优选21-24，和最优选23个核苷酸。包含此长度的互补或反义链的dsRNA (称为"短干扰RNA"或"siRNA")在抑制靶突变体基因的表达方面是特别有效的。"引入"是指在细胞中摄取或吸收，如本领域技术人员所理解的。核酸例如微RNA的吸收或摄取可以通过细胞过程或通过辅助试剂或设备发生。例如，在体内递送时，可以将微RNA注射到组织部位中或全身给药。体外递送包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。

如本文所用的，"表达的选择性抑制"意指dsRNA和/或miRNA具有对靶突变体基因比对相应的野生型基因的表达更大的抑制作用。优选地，靶突变体基因的表达水平是少于98%，少于95%，少于90%，少于80%，少于70%，少于60%，少于50%，少于40%，少于30%，少于20%或少于10%的相应野生型基因的表达水平。

如本文所用的和本领域已知的，术语"同一性"是两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。同一性也意指多核苷酸序列之间的序列关联度，如由这些序列的字符串之间的匹配所确定的。同一性可以很容易地计算出来(见例如，Computation Molecular Biology, Lesk, A. M., eds., Oxford University Press,New York (1998)，和Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)，其二者通过引用并入本文)。虽然存在许多方法来测量两个多核苷酸序列之间的同一性，但是该术语是本领域技术人员熟知的(见例如，Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press(1987)；和Sequence Analysis Primer, Gribskov., M.和Devereux, J., eds., M.Stockton Press, New York (1991))。通常用于确定序列之间的同一性的方法包括，例如，在Carillo, H.和Lipman, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48:1073中公开的方法。如本文所用的，"基本上相同的"意指dsRNA和/或miRNA的有义链与靶基因的相应部分之间有很高程度的同源性(优选100%的序列同一性)。然而，具有大于90%或95%序列同一性的dsRNA和/或miRNA可用于本发明，因此可以容忍由于基因突变、菌株多态性或进化趋异可预期的序列变异。虽然优选100%的同一性，但dsRNA和/或miRNA可包含RNA和靶基因之间的单个或多个碱基对随机错配。

如本文所用的，术语"治疗"指对患者应用或给予治疗剂，或对来自患者的分离的组织或细胞系应用或给予治疗剂，所述患者患有障碍，例如疾病或病症、疾病症状或对疾病的易感性，目的在于医治、治愈、减轻、缓解、改变、治疗、改善、改进或影响疾病、疾病症状或对疾病的易感性。

如本文所用的，“预防”病症、障碍或疾病的治疗剂指的是一种治疗剂，如本文中描述的聚合物纳米胶囊(或包含它们的组合物)，在统计样本中其相对于未治疗的对照样本，减少了治疗样本中的障碍或病症的发生，或相对于未治疗的对照样本，延迟了障碍或病症的一个或多个症状的出现或减轻了其严重程度。

如本文所用的，"药物组合物"包括药理学有效量的治疗剂，例如miRNA，和药学上可接受的载体。如本文所用的，"药理学有效量"、"治疗有效量"或简称"有效量"指有效产生预定的药理学、治疗或预防结果的RNA的量。例如，如果当与疾病或障碍相关的可测量参数至少减少25%时给定的临床治疗被认为是有效的，那么用于治疗该疾病或障碍的药物的治疗有效量是使该参数至少减少25%所必需的量。

术语"药学上可接受的载体"指用于给予治疗剂的载体。这样的载体包括，但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。该术语特别不包括细胞培养基。对于口服给予的药物，药学上可接受的载体包括但不限于药学上可接受的赋形剂，如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、以及乳糖，而玉米淀粉和藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂，如果存在，一般是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如有需要，片剂可涂有材料例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，以延缓在胃肠道的吸收。

术语“脑缺血”指大脑缺血和/或脑血管缺血，一种其中脑血流不足以满足代谢需求的病症。这导致供氧不良或大脑缺氧，因而导致脑组织死亡或大脑梗死/缺血性中风。它是中风的一个亚型，伴随着蛛网膜下出血和大脑内出血。缺血导致脑代谢改变、代谢速率降低和能量危机。广义术语"中风"可分为3类：脑缺血、蛛网膜下出血和大脑内出血。脑缺血可根据病因进一步细分为血栓性、栓塞性和低灌注。血栓性和栓塞性一般在性质上为局灶性或多灶性的，而低灌注则影响全脑。局灶性脑缺血当血块阻塞脑血管时发生。局灶性脑缺血减少流向特定脑区的血流，增加该特定区域细胞死亡的风险。它可能是由血栓形成或栓塞引起的。当流向脑的血流停止或急剧减少时，全脑缺血发生。这通常是由心脏骤停引起的。如果在短时间内恢复足够的循环，症状可能是短暂的。然而，如果在恢复前有大量的时间过去，脑损伤可能是永久性的。虽然再灌注对保护尽可能多的脑组织是必要的，但它也可能导致再灌注损伤。再灌注损伤分为缺血组织恢复供血后接着发生的损伤。在本申请中，脑缺血的范围足够广泛，以涵盖任何血栓性、栓塞性和低灌注缺血，再加上与脑功能相关和/或影响脑功能的任何其它缺血。脑缺血的主要症状包括视力、身体运动和说话方面的损害。脑缺血的原因多种多样，从镰状细胞性贫血到先天性心脏缺陷。脑缺血的症状可包括意识不清、失明、协调问题和身体虚弱。脑缺血可能引起的其它影响为中风、心肺骤停和不可逆的脑损伤。脑血流中断超过10秒导致意识不清，而超过几分钟的血流中断通常导致不可逆的脑损伤。

本发明提供了一种通过自组装和原位聚合技术将微RNA分子封装在交联聚合物纳米胶囊中的新策略。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊的直径为大约20-100 nm。聚合物纳米胶囊的小直径最大限度地保护了RNA分子免受外部RNase攻击和血清中和。

在某些实施方案中，RNA选自调节诱导细胞凋亡减少、血管生成增加、神经发生增加或神经可塑性增加的基因的RNA。在某些实施方案中，miRNA选自调节诱导细胞凋亡减少、血管生成增加、神经发生增加或神经可塑性增加的基因的miRNA。

在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊是10 nm-20 nm、20-25 nm、25 nm-30 nm、30nm-35 nm、35 nm-40 nm、40 nm-45 nm、45 nm-50 nm、50 nm-55 nm、55 nm-60 nm、60 nm-65nm、70-75 nm、75 nm-80 nm、80 nm-85 nm、85 nm-90 nm、90 nm-95 nm、95 nm-100 nm或100nm-110 nm。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊的直径是大约10 nm、11 nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm、16 nm、17 nm、18 nm、19 nm、20 nm、21 nm、22 nm、23 nm、24 nm、25 nm、26nm、27 nm、28 nm、29 nm、30 nm、31 nm、32 nm、33 nm、34 nm、35 nm、36 nm、37 nm、38 nm、39nm、40 nm、41 nm、42 nm、43 nm、44 nm、45 nm、46 nm、47 nm、48 nm、49 nm、50 nm、51 nm、52nm、53 nm、54 nm、55 nm、56 nm、57 nm、58 nm、59 nm、60 nm、61 nm、62 nm、63 nm、64 nm、65nm、66 nm、67 nm、68 nm、69 nm、70 nm、71 nm、72 nm、73 nm、74 nm、75 nm、76 nm、77 nm、78nm、79 nm、80 nm、81 nm、82 nm、83 nm、84 nm、85 nm、86 nm、87 nm、88 nm、89 nm、90 nm、91nm、92 nm、93 nm、94 nm、95 nm、96 nm、97 nm、98 nm、99 nm、100 nm、101 nm、102 nm、103nm、104 nm、105 nm、106 nm、107 nm、108 nm、109 nm、110 nm、111 nm、112 nm、113 nm、114nm、115 nm、116 nm、117 nm、118 nm、119 nm或120 nm。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊的直径是120 nm-130 nm、130 nm-140 nm、140 nm-150 nm、150 nm-160 nm、160 nm-170nm、170 nm-180 nm、180 nm-190 nm、190 nm-200 nm、200 nm-210 nm、220 nm-230 nm、230nm-240 nm、240 nm-250 nm或大于250 nm。

在某些实施方案中，本文公开的聚合物纳米胶囊包括非靶向和靶向能力、更高的效率和/或较低的不良免疫反应。例如，更高的效率可能是增加摄取和更加定向递送的结果。

此外，当纳米结构的聚合物壳在内体和溶酶体中降解时，保护性纳米胶囊内的高度稳定的微RNA分子就能完全释放出来。在某些实施方案中，非靶向聚合物包封的微RNA分子可以在体外转导到原代细胞例如PBMC中，与脂质体转导的低效率和高毒性相比具有更高效率和更低细胞毒性。在某些实施方案中。

重要的是，通过选择和设计合适的聚合物电荷，可以调节为特定目的递送微RNA分子的方法(例如，通过将部分缀合至本文描述的聚合物纳米胶囊来靶向)。

在某些实施方案中，可降解的交联剂与不可降解的交联剂的比率是1:1、1:2、2:1、1:3、2:3、3:1、3:2、4:1、1:4、4:3、3:4、5:1、1:5、2:5、5:2、5:3、3:5、4:5、5:4、6:1、1:6、1:7、7:1、2:7、7:2、3:7、7:3、4:7、7:4、5:7、7:5、6:7、7:6、8:1、1:8、3:8、8:3、5:8、8:5、7:8、8:7、9:1、1:9、2:9、9:2、4:9、9:4、5:9、9:5、7:9、9:7、8:9、9:8、10:1、1:10、3:10、10:3、7:10、10:7、9:10、10:9或本领域技术人员知道采用的任何其它比率。在某些实施方案中，可降解的交联剂和带正电荷的单体的摩尔比是至少约2:1、1:1、1:2或更高，优选至少约1:1。在某些实施方案中，带正电荷的单体和中性单体的摩尔比是至少约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:20或更高，优选至少约1:10或约1:11。

在某些实施方案中，miRNA选自增加VEGF、GFAP、CD31、CD34、BCL-2、NeuN、溴脱氧尿苷、巢蛋白、PSA-NCAM、双皮质素、Pax6、GAP-43、AKT或HIF1-α中至少一个的表达的miRNA。在某些实施方案中，miRNA选自减少半胱天冬酶3或PTEN的表达的miRNA。

一些示例性可降解的交联剂和不可降解的交联剂列于US 2015/0071999的表2中。

在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊被设计成在1小时，或2小时，或3小时，或4小时，或5小时，或6小时，或7小时，或8小时，或9小时，或10小时，或11小时，或12小时，或13小时，或14小时，或15小时，或16小时，或17小时，或18小时，或19小时，或20小时，或21小时，或22小时，或23小时，或1天，或2天，或3天，或4天，或5天，或6天，或1周，或2周，或3周，或1个月或其任何组合内降解。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊被设计成在生理pH下以任何以上速率降解。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊被设计成在给予有需要的受试者后以任何以上速率降解。

在某些实施方案中，微RNA分子可以有效地递送到体内特定位点。在某些实施方案中，靶向剂(即，缀合物或缀合剂)与聚合物纳米胶囊缀合。在某些实施方案中，缀合防止了靶向剂与聚合物粒子的离解。在某些实施方案中，环糊精和/或金刚烷可用于靶向剂缀合。

在某些实施方案中，使用非靶向和靶向聚合物纳米胶囊微RNA分子递送来实施本发明，对于体外试验和通过静脉内注射体内靶向特定组织和器官，具有高效率和低毒性。

由交联聚合物包封的RNAi/miRNA分子的提高的稳定性还确保其在到达靶向位点之前在体内的长期循环。总之，如本文所述的微RNA分子的递送可以提供显著的效率、增强的稳定性和最小的毒性。

单体和交联剂

不同单体和交联剂可用于通过原位聚合，例如在本说明书中教导的那些和本领域熟知的其它方法，包封RNAi分子(如，微RNA)。

在某些实施方案中，总单体和miRNA的摩尔比是至少约1000:1、约2000:1、约3000:1、约4000:1、约5000:1、约6000:1、约7000:1、8000:1、约9000:1、约10000:1或更高，优选至少约4000:1，或约5000:1。

聚合物纳米胶囊缀合物

在某些实施方案中，使用在优化的纳米胶囊上的表面-缀合的靶向剂，将微RNA分子靶向递送到细胞中。特别感兴趣的是，聚合物纳米胶囊缀合物可被用于靶向免疫细胞、肺部细胞、肺细胞、眼细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、中枢神经系统细胞、周围神经系统细胞、心脏细胞、癌症细胞、增殖细胞、病毒感染或逆转录病毒感染细胞、干细胞、皮肤细胞、肠道细胞和/或听细胞。在某些实施方案中，靶向剂将聚合物纳米胶囊递送至选自内皮细胞、小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的细胞类型。

在某些实施方案中，用于实现聚合物纳米胶囊的特异性靶向的缀合物包括CD4、CD8、CD45、CD133、aHLA和转铁蛋白。在某些实施方案中，用于实现聚合物纳米胶囊的特异性靶向的缀合物包括任何一种或多种分化簇或指定簇(CD)标记。例如，CD标记包括CDX，其中X可以是1-340的任何一个。如本文描述的，术语"CD1"，例如，意指所有CD1变体和亚型。这适用于在此描述的所有CD标记。

在某些实施方案中，用于实现聚合物纳米胶囊的特异性靶向的缀合物包括AFP、β-联蛋白、BMI-1、BMP-4、c-kit、CXCL12、SDF-1、CXCR4、核心蛋白多糖、E-钙黏着蛋白、钙黏着蛋白1、EGFR、ErbB1、Endoglin、EpCAM、TROP-1、Fc ε RI A、FCER1A、L1CAM、LMO2、Nodal、Notch-1、PDGFRB、Podoplanin、PTEN、Sonic Hedgehog、STAT3、Syndecan-1、转铁蛋白受体和波形蛋白中的任何一个或多个。

在某些实施方案中，用于实现聚合物纳米胶囊的特异性靶向的缀合物包括ALK、AFP、B2M、β-hCG、BCR-ABL、BRAF、CA15-3、CA19-9、CA-125、降钙素、CEA (癌胚抗原)、CD20、嗜铬粒蛋白A、细胞角蛋白或其片段、EGFR、雌激素受体、孕酮受体、纤维蛋白、纤维蛋白原、HE4、HER2/neu、IgG变体、KIT、乳酸脱氢酶、核基质蛋白22、PSA、甲状腺球蛋白、uPA、PAI-1和Oval的任何一个或多个。

在某些实施方案中，靶向剂选自TAT (人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转导结构域)肽、白喉毒素、破伤风毒素、Tet1、G23、狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽、阿片样肽、谷胱甘肽、硫胺素、瘦素、angiopep、低密度脂蛋白、胰岛素、黑素转铁蛋白和转铁蛋白。

在此描述的或本领域技术人员可接受的任何标记可单独使用，或与一种或多种另外的标记结合使用，以实现特定细胞的期望靶向。

本领域技术人员已知的所有其它的细胞和/或组织特异性标记通过引用并入本文。

治疗由靶基因的表达引起的疾病的方法

在一个实施方案中，本发明涉及一种治疗患有由靶突变体基因的表达引起的疾病或面临发生所述疾病的风险的受试者的方法。在某些实施方案中，在此描述的聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防一或多种细胞增殖和/或分化病症。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防一或多种免疫或免疫缺陷病症。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防病毒复制或病毒感染。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗一或多种神经性病症或神经退行性病症。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防癌症。

在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防中风或缺血性疾病或病症，特别是脑缺血。

在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防晚期癌症、先天性厚甲症、老年-相关性黄斑变性、脉络膜新生血管、转移性黑色素瘤、无CNS转移的转移性黑色素瘤、慢性髓系白血病、实体瘤、晚期实体瘤、视神经萎缩、非-动脉前部缺血性视神经病变、胰腺癌、胰管腺癌、糖尿病性黄斑水肿、高胆固醇血症、结直肠癌伴肝转移、胰腺癌伴肝转移、胃癌伴肝转移、乳腺癌伴肝转移、卵巢癌伴肝转移、先兆子痫、神经母细胞瘤、眼高压、开角型青光眼、青光眼、眼痛、干眼综合征、肾损伤、急性肾衰竭、移植功能延迟、肾移植并发症、TBX3过度表达和糖尿病性视网膜病变。

在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防病毒感染。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防逆转录病毒感染。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于治疗或预防HIV或AIDS感染。在特定实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于抑制逆转录病毒感染。在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊可用于阻止、防止或下调逆转录病毒或病毒复制。在某些实施方案中，给予聚合物纳米胶囊诱导选自抗细胞凋亡、神经发生和血管生成的生理过程。

在某些实施方案中，在此描述的聚合物纳米胶囊可通过玻璃体内注射、肠胃外、静脉内、通过注射到一只脚底部的胼胝中、通过口服、皮下或通过任何其它的药物给药方式给予。

在某些实施方案中，该方法包括给予受试者本发明的药物组合物，以使靶突变体基因的表达被沉默或下调。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，如人类。由于本发明的聚合物纳米胶囊的高特异性，它们可特异性地靶向染病细胞和组织的突变体基因，如本文所述。

在疾病的预防中，靶基因可能是引发或维持疾病所必需的基因，或已被鉴定为与感染疾病的较高风险有关的基因。在疾病的治疗中，聚合物纳米胶囊可以与显示疾病的细胞或组织接触。作为一个非-限制性实例，聚合物纳米胶囊可以递送基本上与癌症相关突变基因的全部或部分相同的RNA或miRNA，或者在肿瘤细胞中以高水平表达的RNA或miRNA可以与癌细胞或肿瘤基因接触或引入到癌症细胞或肿瘤基因中。作为另一个非-限制性实例，聚合物纳米胶囊可以递送基本上与病毒性或逆转录病毒性疾病相关突变基因的全部或部分相同的RNA或miRNA。特别地，可用在此描述的聚合物纳米胶囊治疗的逆转录病毒性疾病的非-限制性实例是HIV。

细胞增殖和/或分化病症的非-限制性实例包括癌症，例如癌、肉瘤、转移性病症或造血肿瘤病症，例如白血病。转移瘤可由多种原发肿瘤类型引起，包括但不限于前列腺、结肠、肺、乳腺和肝脏来源的肿瘤。如本文所用的，术语"癌症"、"过度增殖"和"肿瘤"指具有自主生长能力的细胞，即以快速增殖细胞生长为特征的异常疾病状态。这些术语意欲包括所有类型的癌症生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不论侵袭性的组织病理学类型或阶段如何。增殖性病症还包括造血肿瘤病症，包括与造血来源的增生/肿瘤细胞有关的疾病，例如由髓系、淋巴系或红血球系或其前体细胞引起的疾病。

直接或间接控制细胞生长和分化的细胞基因突变被认为是导致癌症的主要原因。大约有30个称为癌基因的基因家族，与人类肿瘤的形成有牵连。一个这样的家族——RAS基因家族的成员在广泛的真核生物中携带，并经常被发现在人类肿瘤中发生突变。本发明的聚合物纳米胶囊可用于靶向这样的癌基因，以敲减或阻止它们的表达。

除癌基因外，本发明的方法和组合物还可应用于具有点突变的其它与疾病有关的靶基因。基因突变已经在1000多个不同的人类基因中被报道。有关这些突变及其相关表型的数据已被整理，并可通过两个主要数据库联机获取：Online Mendelian Inheritance inMan in Baltimore和Human Gene Mutation Database in Cardiff。例如，由于5'甲基-胞嘧啶的脱氨作用，人类基因组中CG至TG或CA突变的频率很高。在人类中，少于20个核苷酸的短缺失或插入也是非常常见的突变。见例如，Antonarakis, S. E., Eur. Pediatr.(2000) 159(3):5173-8。

此外，Sachidanandam等描述了包含142万个单核苷酸多态性的人类基因组序列变异图谱，这对于鉴定对诊断和治疗有生物医学重要意义的基因很有帮助(Sachidanandam,R., et al., Nature (2001) 409(6822):821-2和Nature (2001) 409(6822):822-3)。该图谱将所描述的基因的所有可公开获得的SNP和其他基因组特征集成在一起。估计有60,000个SNP落入外显子(编码和非翻译区)内，和85%的外显子在最近的SNP的5 kb之内。Clifford等提供由癌症基因组解剖项目鉴定的单核苷酸多态性的基于表达的遗传/物理图谱(Clifford, R., et al., Genome Res (2000) 10(8):1259-65)。除了SNP图谱，Sachidanandam等还提供含有在乳腺、结肠、肾脏、肝脏、肺或前列腺组织中表达的基因的SNP的图谱。

因此，本发明的微RNA分子聚合物纳米胶囊可用于靶向这样的突变体基因，以敲减或阻止它们的表达。

在某些实施方案中，治疗方法包括给予额外的治疗。在某些实施方案中，额外的治疗选自抗凝治疗、抗血小板治疗或溶栓治疗。

抑制突变体基因表达的方法

在又一个方面，本发明涉及一种抑制受试者中突变体基因表达的方法。该方法包括给予受试者本发明的组合物，以致与相应的野生型基因相比，突变体基因的表达被沉默。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是人类。

由于本发明的miRNA纳米胶囊的高特异性，它们可特异性地靶向靶突变体基因的RNA (初级或加工的)，且剂量低得令人吃惊。使用聚合物纳米胶囊抑制靶基因表达的组合物和方法可如本文所述进行。

在某些实施方案中，本发明包括给予包含聚合物纳米胶囊的组合物，其中聚合物纳米胶囊包括核苷酸序列，如靶向突变体基因的miRNA。当被治疗的受试者是哺乳动物，如人类时，组合物可以通过本领域已知的任何方法给予，包括但不限于口服或胃肠外途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、直肠、阴道和局部(包括含服和舌下)给予。在某些优选的实施方案中，组合物通过静脉内或腹膜内(intraparenteral)输注或注射给予。

抑制靶基因表达的方法可应用于任何想要沉默的突变体基因，从而选择性地抑制其表达。可用于靶向沉默的人类基因的非限制性例子包括癌基因细胞分裂素基因、独特型蛋白基因、朊蛋白基因、表达诱导血管生成的分子的基因、编码粘附分子的基因、编码细胞表面受体的基因、参与转移和/或侵袭过程的蛋白质的基因、蛋白酶以及调节细胞凋亡和细胞周期的分子的基因、表达EGF受体的基因、编码多药抗性1基因(MDR1基因)的基因、允许病毒摄取和复制的基因、导致神经退行性病症的基因、导致蛋白质聚集和/或积聚的基因、导致激素上调或下调的基因、导致神经学病症的基因、导致心脏病症的基因以及导致心理障碍的基因。本领域技术人员将理解哪些基因包含在上面描述的示例性基因的广泛类别中。

制备方法

在某些实施方案中，在此描述的聚合物纳米胶囊是为了达到特定的尺寸，靶向用于基因下调的特定位点，以及下调特定基因而制备的。在此描述的聚合物纳米胶囊的尺寸可根据如本文描述的聚合物:交联剂比率确定。例如，可以使用附着(即，缀合)在本文中描述的聚合物纳米胶囊的外部的缀合剂，实现靶向递送。此外，在此描述的聚合物纳米胶囊的RNAi分子对特定基因的特异性结合(从而降低特定基因表达)可通过使用本领域技术人员已知的方法设计RNAi分子来实现。见例如，Birmingham et al., "A protocol for designingsiRNAs with high functionality and specificity", Nature Protocols, 2007; 2(9):2068-78。此外，通过调整如本文描述的可降解的:不可降解的聚合物比率，可以优化和确定聚合物纳米胶囊将RNAi分子递送到靶标位点的能力。

给予方法

本发明涵盖的药物组合物可通过本领域已知的任何方法给予，包括但不限于口服或胃肠外途径，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、经皮、气道(气雾剂)、直肠、阴道和局部(包括含服和舌下)给予。在某些优选的实施方案中，药物组合物通过静脉内或腹膜内(intraparenteral)输注或注射来给予。

考虑给予的"受试者"这一术语包括但不限于人类(即任何年龄组的男性或女性，例如儿童受试者(例如婴儿、儿童、青少年)或成人受试者(例如，年轻成人、中年成人或老年成人)和/或其他灵长类动物(例如，食蟹猴、恒河猴)；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫和/或狗；和/或鸟类，包括与商业有关的鸟类，例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑和/或火鸡。优选的受试者是人类。

在某些实施方案中，所公开的组合物以每天一次，至每周一次，至每两周一次，至每月一次的范围经鼻给予。在优选的实施方案中，微粒和组合物经鼻给予。如本文所用的，术语“经鼻”或“经鼻给予”是指将微粒递送到受试者的鼻粘膜，使微粒的内容物直接被吸收到鼻组织中。

在某些实施方案中，聚合物纳米胶囊、微粒及包含它们的组合物是供全身给予的。

在某些实施方案中，给予聚合物纳米胶囊增加VEGF、GFAP、CD31、CD34、BCL-2、NeuN、双皮质素、巢蛋白、PSA-NCAM、双皮质素、Pax6、GAP-43、AKT或HIF1-α的至少一个的表达。在某些实施方案中，给予聚合物纳米胶囊减少半胱天冬酶3或PTEN的至少一个的表达。

实施例

实施例1：用于实施例2的材料和方法

1. 材料

所有化学品均购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)且除另有说明外，按原样使用而无需进一步纯化。N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APM)购自Polysciences Inc(Washington, PA)。DiI、DAPI、Hoechst 33342、Lipofectamine 2000和Trizol购自Invitrogen。聚偏氟乙烯(PVDF)膜购自MilLipore, Inc。血液化学分析ELISA试剂盒、ABC-过氧化物酶和二氨基联苯胺(DAB)和miRNA原位杂交试剂盒购自Boster Biotechnology,Inc。具有表1中列出的序列的RNA寡核苷酸、FITC-标记的miR-21、Cy5.5-标记的miR-21和Hairpin-it miRNA qPCR Quantitation Kit是从GenePharma, Inc.订购的。

2. 设备

用DU730光谱仪(Beckman Coulter, Inc.)获得UV-可见光谱。在配备有10 mW氦氖激光器(λ=632.8 nm)和热电温控器的Zetasizer Nano仪器(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)上进行纳米胶囊的动态光散射(DLS)研究。在具有120 kV加速电压的H-600型透射电子显微镜(Hitachi, Tokyo)上获得透射电子显微镜(TEM)图像。用Synergy 2Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA)测量荧光强度。观察细胞并用Carl ZeissAxio Observer倒置荧光显微镜拍摄。使用BD LSRFortessa细胞分析仪进行流式细胞术分析。使用CRI体内成像系统(Maestro, USA)获得体内近光学荧光图像。

3. miRNA纳米胶囊和Lipofactamine/miRNA复合物的合成

将丙烯酰胺(AAM)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)和平均Mn为2000 Da的聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG))制备为在脱氧无RNase水中的10% (w/v)储备液，并将甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)制备为在无水DMSO中的10% (w/v)储备液。然后将特定量的以上单体和交联剂加入到miRNA溶液中，和AAM/APM/mPEG/GDMA的摩尔比可经调节，用于筛选合成参数。通过加入过硫酸铵(总单体的1/10摩尔比)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺(APS的2-倍重量比)引发聚合并于4℃保持2 hr。用脱氧无RNase水稀释，将最终的miRNA浓度调节到5 μM。聚合后，溶液用10 kDa膜对10 mM PBS进行透析，以去除未反应的单体和副产物。通过类似的方案但不使用mPEG，合成无-PEG n(miR-21)。使用UV凝胶图像系统(G:BOX F3, Syngene,UK)，用琼脂糖凝胶电泳分析来观察miRNA或纳米胶囊的阻滞作用。用Zetasizer (Nano ZS,Malvern, UK)测定纳米胶囊的粒径和ζ电位。用透射电子显微术(Hitachi, Tokyo, Japan)观察纳米胶囊的形态。

根据生产商的方案制备了Lipofectamine/miRNA复合物(Lipo/miRNA)。简单地说，将等量的Lipofectamine(1mg/mL)和miR-21 (0.16 μg/μL)充分混合并于4℃孵育15 min，供以后使用。

4. miRNA纳米胶囊的特征鉴定

4.1. 琼脂糖凝胶电泳分析

在2% (w/v)琼脂糖凝胶中，在1 × TAE缓冲液中，在恒压80V下，进行凝胶阻滞分析20min。然后，琼脂糖凝胶用0.5 mg/ml溴化乙锭溶液染色30 min。最后，使用UV凝胶图像系统(SIM135A, SIMON)在365 nm处显示miRNA条带。

4.2. 透射电子显微术(TEM)

通过在碳包覆的铜栅上滴涂5 μL纳米胶囊制备TEM样品。5 min后，除去过量的样品。然后冲洗栅格，在pH 7.0下用1%磷钨酸钠染色。用H-600透射电子显微镜(Hitachi, Tokyo)观察栅格。

4.3. 动态光散射(DLS)

DLS实验采用配备有10-mW氦氖激光器(λ = 632.8 nm)和热电温控器的ZetasizerNano仪器(Malvern Instruments Ltd., United Kingdom)进行。在25℃进行90°散射角的测量。通过对至少三个测量值求平均值，得到了n(miR-21)的尺寸和标准偏差。

4.4. ζ电位测量

使用Zetasizer Nano仪器(Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK)，通过光子关联光谱学测定n(miR-21)的ζ电位。于25℃，以90°的检测角进行测量，随后使用Zetasizer软件包的累积分析，将原始数据与Z平均值的平均大小相关联。

5. mPEG链密度对纳米胶囊的尺寸分布、ζ电位和递送性能的影响

为了解mPEG密度对纳米胶囊的尺寸分布、ζ电位和递送性能的影响，以6000:1的M:R比，以范围从50至500的不同mPEG/miRNA摩尔比，合成纳米胶囊(图4A)。DLS被用于测量这些纳米胶囊的尺寸和ζ电位，采用荧光活化细胞分选(FACS)评价其在模型胶质瘤细胞(C6细胞、大鼠胶质瘤细胞)中的内化效率和通过模型巨噬细胞(J774A.1、小鼠巨噬细胞)的低非-特异性吞噬。

6. n(miR-21)的稳定性研究

6.1. n(miR-21)在生理离子强度下的稳定性

为确保n(miR-21)的体内稳定性，在生理离子强度下检查它们的尺寸变化是至关重要的。在PBS溶液中透析后的不同时间，采用实时DLS测量对n(miR-21)的尺寸变化进行监测。对n(miR-21)的尺寸进行168小时的记录。

6.2. 在不同温度下的n(miR-21)的稳定性

为了解n(miR-21)的热稳定性，采用实时DLS测量来监测n(miR-21)于25、37和60℃，在PBS中的尺寸变化。在每种情况下，在数据采集之前，样品在给定温度下平衡15 min。

6.3. n(miR-21)在10%血清中的稳定性

为了解在血清的存在下n(miR-21)的稳定性，利用DLS测量来观察n(miR-21)在血清和PBS的混合物(1:9, V/V)中的尺寸变化。在每种情况下，在数据采集之前，样品在室温下保持168 h (补充图3c)。

6.4.肝素稳定性

为了解n(miR-21)在肝素的存在下的稳定性，使n(miR-21)和Lipo/miR-21与10 mg/mL肝素一起于室温下孵育15 min。然后在2%琼脂糖凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳并用UV凝胶图像系统(G:BOX F3, Syngene, UK)成像。

6.5. 包封的miR-21的血清稳定性和RNase稳定性

为了解n(miR-21)在血清的存在下的稳定性，进行实时PCR以测量用血清对miR-21制剂处理前后残留的miR-21的相对定量(Shi et al. (2013) Angew Chem Int Ed Engl52:3901-3905)。天然miR-21、n(miR-21)和Lipo/miR-21 (含有1µg miR-21)分别于37℃、在50%胎牛血清中孵育1小时。然后分别用氯仿/ 0.1% SDS-0.5 M NaCl提取miRNA并用无RNase水重新构成至100 µL (Yan et al. (2012) J Am Chem Soc 134:13542-13545)。使用Hairpin-it miRNA qPCR Quantitation Kit (GenePharma)合成cDNA。使用从cDNA标准曲线导出的扩增效率，对残留的miR-21水平进行相对定量。数据用DNA Engine Opticon 2Two-Color Real-time PCR Detection System (Bio-Rad)进行分析，并归一化为未处理的天然miR-21的表达(倍数变化, 2^-δCT)。所有RT-PCR反应按一式三份执行。对于核酸酶稳定性研究，在1 mg/mL RNase A的存在下，将天然miR-21、n(miR-21)和Lipo/miR-21 (含有1 µg miR-21)在10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM EDTA中于37℃孵育1小时。然后，miRNA用氯仿/ 0.1% SDS-0.5 M NaCl提取并用无RNase水重新构成至100 µL (Yan et al. (2012),同上)。miR-21水平的相对量化用在血清稳定性研究中描述的方法检测。

7. 蛋白质吸附分析

蛋白质吸附使用BCA Protein Assay (Thermo Scientific)量化(Liang et al.(2016) Nano Research 9:1022-1031)。简言之，分别将10 µL PBS (阴性对照)、无-PEG n(miR-21)、n(miR-21)和Lipo/miR-21与30 µL小鼠全血清混合并于37℃孵育30 min。孵育后，以离心过滤(分子量截止值MWCO = 100 kDa)过滤样品并用PBS洗涤3次，以去除任何未被吸附的血清蛋白。用50 µL PBS重新构成后，根据制造商的指示，采用BCA Protein Assay测量每个样品的总蛋白浓度。样品在37℃下与工作试剂反应30 min，然后在562 nm处测定吸光度。各个值与牛血清白蛋白标准曲线比较。吸附的蛋白量使用总蛋白浓度和未吸附的血清蛋白浓度计算。

8. 降解动力学及miRNA释放研究

在50 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.4)和50mM PBS缓冲液(pH 7.4)中研究miRNA纳米胶囊的降解。纳米胶囊的降解动力学通过DLS技术，使用散射光强度比率 I/I ₀定量，其中I ₀表示初始纳米胶囊散射光强度和I表示时间-依赖性纳米胶囊散射光强度(Liu et al. (2015)Adv Mater 27:292-297; Gu et al. (2009) Nano Lett 9:4533-4538)。然后，miR-21从n(miR-21)中的释放在它们与或不与1 mg/mL肝素一起孵育后经琼脂糖凝胶电泳分析来研究，然后通过UV凝胶图像系统成像。

9. 体外研究

9.1. 细胞系和细胞培养

从美国典型培养物保藏中心(ATCC, Rockville, MD)获得经鉴定的J774A.1细胞和胶质瘤C6细胞，对支原体污染进行检测并在孵育器(Thermo Scientific)内，在补充有10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)、4 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM, Gibco)中，于37℃，在5% CO₂气氛和90%相对湿度下培养。用于该研究的所有细胞处于对数生长期。

9.2. 细胞成活力分析

纳米胶囊的毒性通过MTT分析进行评价，使用天然miR-NC作为对照。在暴露于纳米胶囊前一天，在96-孔板上接种C6细胞(2000个细胞/孔)。miR-NC纳米胶囊、Lipo/miR-NC复合物和miR-NC (具有各种miRNA浓度)与细胞一起孵育4小时，从混合物中去除，并与新鲜培养基一起孵育另外48小时。将MTT溶液(20 μL)加入到各孔中并孵育4 hr。然后除去培养基并将150 μL DMSO加入各孔。将板放在摇床上，经150 rpm 5 min以充分混合该溶液，然后使用Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader (BioTek, USA)，在560 nm处测量吸光度读数。未处理的细胞被用作100%细胞成活力对照。

9.3. 细胞内转运和吞噬研究

将C6 (2 × 10⁵个细胞)分别接种于在孔中含有盖玻片的6-孔板中，并进行贴壁培养。将FITC-标记的天然miR-21和n(miR-21)以最终浓度50nM miRNA加入各孔中，以供于37℃孵育4 h。然后，根据生产商的方案，用5 μg DiI染色细胞。细胞在室温下用在PBS中的4%甲醛固定20 min，然后用PBS洗涤3次。最后，用20 μL水性封固剂，将盖玻片置于载玻片上。然后用FluoView共聚焦激光扫描显微镜-FV1000 (Olympus, Tokyo, Japan)观察玻片。

用荧光活化细胞分选(FACS)测定n(miR-21)的细胞摄取效率。C6细胞被以2 ×10⁵个细胞/孔的密度接种到6-孔板上并贴壁培养。然后，将50 nM FITC-标记的天然miR-21、Lipofectamine复合的miR-21 (表示为Lipo/miR-21)和n(miR-21)于37℃转导4 hr。孔中的细胞经胰蛋白酶消化并离心收集后，用含1% (w/v)肝素的PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后重悬浮于含40μg/ml台盼蓝的0.3ml PBS缓冲液中进行流式细胞仪分析(EPICS XL,Beckman Coulter)。

为评估吞噬活性，将1 × 10⁵个J774A.1细胞接种到6-孔板上并允许贴壁和生长。48小时后，将细胞与n(miR-21)、无-PEG n(miR-21)和Lipo/miR-21 (剂量50 nM miRNA)一起孵育，然后孵育另外2小时以供吞噬。细胞用标记有Hoechst 33342的PBS洗涤两次10分钟并使用Carl Zeiss Axio Observer倒置荧光显微镜分析。用与C6细胞相似的方案通过FACS分析荧光强度的进一步定量。

9.4. 定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析

定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)被用来定量比较纳米胶囊与Lipofectamine的miRNA调节能力。将C6细胞以2 × 10⁵个细胞/孔的密度接种到6-孔板上24小时。然后，在无血清培养基或50%人血清培养基中，用最终浓度50 nM的miRNA纳米胶囊或miRNA Lipofectamine复合物在37℃下处理细胞4小时。培养基后来改为含10%胎牛血清的DMEM。24小时后，根据生产商的指示，用Trizol从培养的细胞分离总RNA。为检测miR-21，采用Hairpin-it miRNAqPCR定量试剂盒(GenePharma)，按照制造商的指示进行茎-环逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)。通过采用对成熟miRNA序列的正向引物和通用接头反向引物(miR-21-R: GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACtcaaca (SEQ ID NO:1)；和miR-21- F:GCCGCTAGCTTATCAGACTGATGT (SEQ ID NO:2))的SYBR绿色检测执行实时PCR (Liu et al.(2015), 同上)。用比较性CT (阈值循环)方法评价miR-21的相对表达，并将其归一化为U6小RNA的表达。从GenePharma (Shanghai, China)获得对miR-21和U6的引物。所有RT-PCR反应以一式三份进行。

9.5. 蛋白质印迹分析

在蛋白质印迹分析中，用n(miRNA)转导C6细胞48小时。总蛋白质产量用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)量化。蛋白裂解物用SDS-PAGE分离，然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(MilLipore, Billerica, MA, USA)。将膜与针对PTEN (1:1000, Santa CruzBiotechnology, #sc-7974)、AKT (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, #sc-81434)、HIF 1-α (1:1000, Cell Signaling Technology, #14179)和VEGF (1:1000, Santa CruzBiotechnology, #sc-507)的第一抗体一起孵育，接着与HRP-缀合的第二抗体(1:5000,Promega Corporation)一起孵育。GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, #sc-47724)被设置为加载对照。

10. 体内研究

10.1.体内成像研究

在诱导缺血后，将Cy5.5标记的Lipo/miR-21或n(miR-21)以0.5mg miRNA/kg大鼠的剂量注射到动物(n=3)的尾静脉中。给予对照大鼠等量的PBS。然后，在注射后0.08333、0.25、0.5、1、2、4、12和24小时，从尾静脉收集20 μL血液，随后，在荧光测量前，用30 μL PBS在96-孔微量滴定板中稀释。Cy5.5荧光强度测量在VARIAN Cary Eclipse荧光分光荧光计上执行，使用678 nm的激发波长，以690-750 nm的波长范围记录发射和扫描速率为125 nm min^-1。在收集血液后，麻醉大鼠并用CRI体内成像系统(Maestro, USA)成像。然后，处死动物，切除器官(包括肝、脾、心、肺、肾和脑)进行近光荧光成像，以检查荧光纳米粒子的积聚。利用LIVING IMAGE光学成像软件(Maestro)，按总光子/秒和最大光子/秒/cm²/球面度，选取、测量和分析来自感兴趣区域(ROI)的成像信号强度。体内成像分析后，切除的脑被冷冻在液氮中，然后精细地磨碎。根据生产商的指示，用Trizol分离总RNA，接着使用qRT-PCR方法定量测量脑组织中的miR-21表达水平。

10.2. 颈动脉内和静脉内给予途径之间的递送效率比较

为更好地估计在全身递送后，n(miR-21)递送到缺血脑的效率，在产生缺血后一天，将Cy5.5标记的n(miR-21)通过颈动脉内(i.c.)注射(剂量0.1mg miRNA/kg大鼠)，静脉内(i.v.)注射(剂量0.5mg miRNA/kg大鼠，或0.1mg miRNA/kg大鼠)给予动物(n=3)。注射后24小时，麻醉大鼠并用CRI体内成像系统(Maestro, USA)成像。然后，处死动物，切除脑组织进行近光荧光成像，以检查荧光纳米粒子的积聚。在体内成像后，也进行qRT-PCR分析以在切除的脑中检查miR-21水平。

10.3. 血液化学分析

通过测量血清酶参数来评估肝功能。简言之，样品注射后24h，分别用毛细管从眼角静脉取血样2.0 mL。在室温下，以300 r/min离心血样，然后收集上部的血清，用ELISA试剂盒进行血清生化分析。这项试验包括检测各种酶如天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白和白蛋白(TP)的水平。

10.4. 通过荧光原位杂交检测miR-21

根据生产商的方案，脑组织中的定量miR-21表达通过荧光原位杂交用原位杂交试剂盒(Boster, Wuhan, China)检测。Cy3-抗生物素蛋白以0.5 mg/mL的浓度用于标记miR-21。细胞核用DAPI复染色，并用Carl Zeiss Axio Observer倒置荧光显微镜观察。

10.5. 组织学和免疫组织化学

石蜡-包埋的组织切片被用于HE染色和VEGF (1:100, Santa Cruz Biotechnology, #sc-507)、CD31 (1:100, Santa Cruz Biotechnology, #sc-1506)、HIF 1-α (1:100, CellSignaling Technology, #14179)和GFAP (1:100, Cell Signaling Technology, #3670)表达的检测。切片在4℃时与第一抗体孵育过夜，然后用生物素标记的第二抗体(1:100,Zhongshan Bio Corp)在37℃下孵育1h，然后与ABC-过氧化物酶和二氨基联苯胺(DAB) (1:100, Zhongshan Bio Corp, #SP-9000-D)一起孵育，用苏木精复染色，最后用光学显微术观察。

10.6. 细胞凋亡分析

石蜡-包埋的组织切片用于检查IBD中的细胞凋亡。根据生产商的方案，使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche)进行TUNEL分析。然后切片用Carl Zeiss Axio Observer倒置荧光显微镜成像。定量分析使用ImageJ软件(NIH)进行。

10.7. 主要器官的组织病理学分析

如上所述进行组织病理学分析。石蜡-包埋的切片用苏木精和伊红染色，以供组织病理学评价。对损伤进行显微镜检查，以寻找细胞损伤和炎症的证据。

11. 统计学分析

除非另有说明，否则所有定量结果均来自至少3个单独的实验(一式三份进行)。用Graphpad Prism 6软件，采用双尾未配对Student t-检验(两组比较)、方差分析(两组以上比较)以及对多重比较校正进行显著性评价。所有数据均符合统计检验的假设，并计算出方差在比较的各组之间相似。如果P<0.05或更小，则结果被认为是有显著意义的。

12. miRNA纳米胶囊的合成和表征

丙烯酰胺(AAM)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)和聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG) (平均Mn 2000)的储备液在脱氧无RNase水中制备(10% w/v)。将甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)制备为在无水DMSO中的10% (w/v)储备液。然后，将特定量的上述单体和交联剂加入到miRNA溶液中，和AAM/APM/mPEG/GDMA的摩尔比可为筛选目的而调整。通过加入过硫酸铵(总单体的1/10摩尔比)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺(APS的2-倍重量比)起始聚合并于4℃保持2 hr。通过用脱氧无RNase水稀释，将最终的miRNA浓度调节至5 μM。聚合后，溶液用10 kDa膜对10 mM PBS进行透析，以去除未反应的单体和副产物。无-PEG n(miR-21)通过类似的方案但不使用mPEG合成。用UV凝胶图像系统(G:BOX F3, Syngene, UK)，使用琼脂糖凝胶电泳分析观察miRNA或纳米胶囊的阻滞。纳米胶囊的粒径和ζ电位通过Zetasizer (NanoZS, Malvern, UK)测定。透射电子显微术(Hitachi, Tokyo, Japan)被用于观察纳米胶囊的形态。发明人所用的miRNA的序列列于表1中。

表1 本研究使用的miRNA序列

13. 短暂性局灶性大脑缺血大鼠模型

将雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(体重260-280 g)随机分配到实验组，并在开始实验方案之前确保了体重匹配。除非另有说明，研究人员在研究期间不会对处理组采用盲法。如前所述(Liu et al. (2013) Biomaterials 34, 817-830)，通过大脑中动脉阻塞再灌注(MCAO/R)诱导短暂性局灶性大脑缺血大鼠模型。简言之，SD大鼠用10%水合氯醛(350 mg/kg, 腹膜内(i.p.))麻醉。监测体温并维持于37℃。在颈腹侧做中线切口，肌肉被轻轻拉到旁边，然后仔细解剖右颈总动脉以及颈内动脉和颈外动脉的交界处。结扎颈外动脉并烧灼。尖端经在火焰附近加热而变圆的外科尼龙单丝(直径0.234 mm)通过颈外残端的缺口插入颈内动脉，以阻断大脑中动脉的起源。缺血1小时后，拉出细丝以再灌注。

在MCAO/R后24小时对神经学评分进行评估，以确认成功建立短暂性局灶性大脑缺血模型(Liu et al. (2013), 同上)。对实验组盲目的检查员进行行为评估。神经学缺陷依据如下描述进行评分：0，无缺陷；1，对侧前肢全伸困难；2，不能伸展对侧前肢；3，轻度盘绕至对侧；4，严重盘绕；和5，倒向对侧。神经学缺陷评分范围为1-3的大鼠被选择作为模型。在评价神经学评分后，麻醉处死大鼠，取脑切片进行HE染色，以证实成功建立短暂性局灶性大脑缺血模型。

14. 体内处理效果

将30只短暂性局灶性大脑缺血模型大鼠随机分为3组。每两天将n(miR-NC)和n(miR-21)以0.5 mg miRNA/kg大鼠的剂量注射到模型大鼠的尾静脉中，共3次；将等量的PBS给予对照大鼠。每次注射前用上述方法评估神经学评分。在第7天(最后一次注射后两天)，在最后一次评价神经学缺陷评分后处死动物。迅速摘除脑，以1 mm的间隔进行冠状切片，并通过在活体染料(2%) 2,3,5-三苯基四唑鎓盐酸盐(TTC)中浸泡染色。梗死体积通过汇总所有切片的梗死面积，并乘以总切片厚度来计算。为避免水肿对梗死体积值的潜在影响，将梗死体积除以同侧半球总体积，计算表示为梗死百分比的梗死体积(Pignataro et al. (2009)FEBS J 276:46-57)。用ImageJ软件(NIH, Bethesda, MD)从扫描的数字图像中评估梗死面积，并以百分比表示。脑冠状切片用4%多聚甲醛固定，脱水，然后用石蜡包埋以供组织化学分析。

实施例2. 用于治疗脑缺血的微RNA的全身递送

本文描述了一种基于微RNA纳米胶囊的平台技术，这能使其有效地递送到脑中的疾病部位。以微RNA-21为例，在大脑缺血的大鼠模型中静脉内注射纳米胶囊，能有效地改善脑梗死体积、神经学缺陷和组织病理学严重性。示例性纳米封装技术，其中miRNA分子通过原位聚合被封装在一个薄的网络-聚合物壳内，在图1A中示出。简言之，miRNA首先与混合的单体和可降解的交联剂甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)一起孵育。混合的单体包括丙烯酰胺(AAM)、聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)和带正电荷的单体N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)。由非共价相互作用(例如，带负电荷的miRNA和APM之间的静电相互作用)驱动，单体和交联剂在miRNA分子周围富集(步骤I)。随后，启动自由基聚合以在miRNA核心周围形成薄的聚合物层，得到miRNA纳米胶囊(表示为n(miRNA))。GDMA分子交联聚合物链，形成围绕核心miRNA的网络结构(步骤II)。GDMA在中性pH下是稳定的，但在酸性环境下是可降解的(Yanet al. (2010) Nat Nanotechnol 5:48-53)。纳米胶囊(聚合物壳)在生理条件下(pH 7.4)是稳定的；当进入具有酸性环境(pH 5.5)的内体时，GDMA交联剂被裂解和壳被降解，使miRNA货物释放。如图1B所示，在静脉内注射后，缺血组织中血管通透性增加(Kim et al.(2011) Nano Lett 11:694-700; England et al. (2016) Biomaterials 100:101-109)允许纳米胶囊在缺血组织中的外渗和积累，这使得n(miRNA)能够递送至靶部位(I)。当纳米胶囊被细胞内化时，miRNA被释放到细胞质中(II)，诱导缺血组织的血管生成和再生(III)。

结果

miRNA纳米胶囊的合成

MiR-21，一种在多种疾病中表现出血管生成和抗细胞凋亡活性的miRNA (Buller et al. (2010) FEBS J 277:4299-4307; Chan et al. (2005) Cancer Res 65:6029-6033)，被用作有效递送miRNA用于脑组织再生的证明。图2A显示了使用500:1、1000:1、2000:1、4000:1、6000:1、8000:1和10000:1的各种单体:miR-21摩尔比(M/R)以及54:5:1:6的固定的AAM:APM:mPEG:GDMA摩尔比合成的miR-21纳米胶囊(n(miR-21))的凝胶电泳(图3A)。用低于4000:1的M/R比率制备的样品呈现出天然的miR-21带，表明miR-21的包封不完全。当M/R比率高于4000:1时，样品显示没有天然的miR-21带，并向阳极方向迁移，表明miR-21在阳离子聚合物壳内被完全包封。这一观测结果与通过动态光散射测量(DLS, 图3C)得到的其ζ电位是一致的。

为进一步证实miR-21分子被包封在聚合物壳内，Lipofectamine/miR-21复合物(Lipo/miR-21)和按4000至10000的M/R比率制备的n(miR-21)与10 mg/mL肝素一起孵育。Lipo/miR-21通过非共价相互作用将带负电荷的miR-21与带正电荷的Lipofectamine组装而形成，其在带电生物分子如肝素的存在下是不稳定的。如预期的，凝胶电泳显示当复合物在肝素存在下分解时，从Lipo/miR-21中提取miR-21。相反，对于n(mir-21)，miR-21被包封在聚合物壳网络中，和在肝素孵育后，从n(miR-21)中没有观察到miR-21提取，表明了一种高度稳定的包封结构(图2B)。

按从4000:1到10000:1的M/R比率合成的纳米胶囊显示流体动力学直径从~28 nm略微下降到~18 nm (图3B)，和ζ电位从~6.9 mV增加至~13.8 mV (图3C)。在6000:1的固定M/R比率下，用不同的mPEG/miRNA比率(50:1、100:1、250:1和500:1，图4A和图4B)也合成了n(miR-21)，其显示~30 nm的相似的流体动力学直径(图4C)。然而，随着mPEG百分比增加，ζ电位从~11.2 mV减少至~4.6 mV (图4D)。根据模型胶质瘤细胞(C6细胞，大鼠胶质瘤细胞)中相对高的内化效率和模型巨噬细胞(J774A.1，小鼠巨噬细胞)的低非特异性吞噬(图5)，使用M/R比率6000:1和mPEG/miRNA比率100:1合成的纳米胶囊被用于进一步的研究。这样的纳米胶囊具有直径~25 nm的球形形态和~10 mV的表面电荷，这可经透射电子显微术(TEM)(图2C)和DLS (图2D和图2E)证实。

miRNA纳米胶囊的贮存稳定性、RNase稳定性、非-特异性蛋白质吸附和释放动力学

为检测n(miR-21)的贮存稳定性，n(miR-21)的流体动力学直径在不同条件下通过DLS测量来监测：(i) 于4℃在生理盐浓度存在下的不同贮存时间；(ii) 不同贮存温度(25℃、37℃和60℃)；和(iii) 在10%血清的存在和不存在下贮存。结果表明纳米胶囊于4℃在PBS溶液中稳定一周(图6A)，而10%血清的存在诱导纳米胶囊在一周贮存期间聚集(图6C)。此外，贮存温度的变化未导致n(miR-21)尺寸的变化(图6B)。

纳米胶囊显示出对核糖核酸酶(RNase)的增强的稳定性，并且使蛋白质的非特异性吸附最小化。在与RNase A和小鼠血清一起孵育2 hr后，miRNA从Lipo/miR-21和n(miR-21)二者中提取，接着经实时PCR定量。如在图2F中所示，比较天然miR-21和Lipo/miR-21，n(miR-21)显示出包封的miR-21对RNase和血清的更有效的保护作用。此外，纳米胶囊上的mPEG链使蛋白的非-特异性吸附最小化。如在图2G中所示，在与小鼠血清于37℃孵育30 min后，n(miR-21)表现出最少的蛋白质吸附，而Lipo/miR-21显示出明显的蛋白质吸附。为了验证纳米胶囊壳上的mPEG链是减少蛋白质吸附的原因，合成了不含mPEG (仅含AAM和APM单体)的比较的纳米胶囊(称为无-PEG n(miR-21))，其显示出明显的血清蛋白质吸附(图7)。蛋白质的减少的非-特异性吸附对于延长蛋白质的循环寿命至关重要(Gref et al.(1995) Adv Drug Deliv Rev 16:215-233)。

n(miR-21)在酸性环境(如，pH 5.5，类似于内体环境)中的降解动力学通过使用DLS测量散射光强度来动态监测(Gu et al. (2009), 同上; Liu et al. (2015), 同上)。如在图2H中所示，在模拟内体的环境(pH 5.5)下，在37℃孵育2小时内，相对散射光强度从100%下降到~40%，证明了n(miR-21)的降解，而在pH 7.4下未观察到相对散射光强度的显著变化。琼脂糖凝胶电泳被用来进一步确认在其降解时从纳米胶囊中释放miRNA。如在图2I中所示，在pH 5.5时，在1 mg/mL肝素存在下，观察到miR-21的明显提取，而在pH 7.4时未观察到从n(miR-21)中提取miR-21。

miRNA纳米胶囊的细胞内化效率、非-特异性吞噬、细胞毒性和生物活性

为了估计递送效率，首先用异硫氰酸荧光素(FITC)标记miR-21，并将其包封在纳米胶囊中。n(miR-21)的细胞内化使用C6细胞评价。C6细胞在与miR-21、n(miR-21)和Lipo/miR-21一起孵育4-hr后的荧光图像示于图8A。n(miR-21)和Lipo/miR-21都显示miR-21在C6细胞中的有效内化。基于流式细胞仪定量的FITC的强度，在C6细胞中，N(miR-21)的内化效率达到~60% (图8B)。

n(miR-21)和Lipo/miR-21的非-特异性吞噬在J744A.1小鼠巨噬细胞中评价。与Lipo/miR-21比较，n(miR-21)显示出1/10的非-特异性吞噬(图8D、图8E和图9)。此外，杂乱的miRNA (miR-NC)被用于合成n(miR-NC)和Lipo/miR-NC以研究细胞毒性。Lipo/miR-NC显示出随着剂量增加而增加的毒性，而n(miR-NC)显示出与miR-NC本身相当的细胞成活力，表示来自n(miR-NC)的聚合物壳的最小毒性(图8C)。

通过qRT-PCR定量比较两种递送系统在C6细胞中的miR-21表达，以检测它们的生物活性。miR-NC首先被两个系统递送以监测其miR-21表达的中断。两者均未表现出对miR-21表达的明显影响(图10)。进一步比较了n(miR-21)和Lipo/miR-21之间的miR-21转染效率。如在图8F中所示，无血清时，Lipo/miR-21和n(miR-21)分别将miR-21的表达上调至19-倍和12-倍。然而，在有血清存在时，n(miR-21)仍上调表达至8-倍以上，而Lipo/miR-21仅上调miR-21表达至约5-倍，失去其容量的75%。反义miR-21 (AS-miR-21)也用于比较这两种方法的miRNA转染能力。在无血清条件下，n(AS-miR-21)和Lipo/miR-21分别有效地下调miR-21表达至26%和18%。此外，在血清的存在下，n(AS-miR-21)仍然显著地将miR-21表达敲减到32%，而Lipo/miR-21只保持56%的沉默效果(图10)。这些结果证实纳米胶囊-递送系统对于调节细胞内miRNA水平是安全而有效的。

为进一步评价从纳米胶囊中释放的mir-21的活性，通过蛋白质印迹测定来分析与血管生成、缺氧和细胞凋亡有关的其下游蛋白的调节。结果显示出n(miR-21)的递送有效地增加AKT、HIF1-α和VEGF的表达，同时减少PTEN的表达(图8G和图11A)。同时，n(AS-miR-21)相反地调节这些蛋白质。此外，n(miR-NC)或者n(AS-miR-NC)都不干扰上述任何蛋白质的表达(图11B)，进一步表明这类纳米胶囊的安全性和有效性。

静脉内给予miRNA纳米胶囊的生物分布、药代动力学、肝毒性和递送效率

由大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO/R)诱导的短暂性局灶性大脑缺血的大鼠模型中证实miRNA纳米胶囊用于脑缺血治疗的体内应用(图13)。用Cy5.5标记的miR-21 (Cy5.5-miR-21)用于合成Lipo/miR-21和n(miR-21)。然后，在缺血损伤后1天，将这两种样品分别以0.5mg/kg miR-21的剂量进行静脉内注射。在给予后24小时，使用荧光成像和qRT-PCR二者分析缺血和非-缺血脑中样品的积累。

用n(miR-21)给予的缺血性和非-缺血性大鼠均显示出在头部和分离的脑组织中荧光强度比使用Lipo/miR-21的那些更强(图12A)。由n(miR-21)或Lipo/miR-21递送的miR-21的辐射效率在缺血性和非-缺血性大鼠中进行定量比较。如在图12B中所示，在缺血性大鼠中，n(miR-21)的辐射效率分别是Lipo/miR-21和PBS对照的辐射效率的2-倍和3.5-倍，表明n(miR-21)更有效地递送到缺血性脑组织。在递送后，用qRT-PCR进一步比较了缺血性和非-缺血性脑组织中miR-21的表达(图12C)。用n(miR-21)处理的缺血性大鼠脑中的miR-21的水平显示为由Lipo/miR-21处理的那些的2.7-倍。在使用Lipo/miR-21或n(miR-21)处理的非缺血性脑中观察到miR-21水平的不显著变化，表明n(miR-21)与Lipo/miR-21相比，增强了缺血性脑组织中的调节。

收集主要器官(包括肝、脾、肾、心和肺)，以通过离体成像进行生物分布研究。在与网状内皮系统(RES)相关的器官(如肝脏和脾脏)中可检测到来自n(miR-21)的最小信号，而在RES器官中观察到明显的Lipo/miR-21累积(图12D)。进一步量化的器官辐射效率表明，Lipo/miR-21在肝脏、脾脏和肾脏中的累积分别是n(miR-21)的5倍、3倍和3.5倍(图12E)。通过定量测定血浆中Cy5.5的强度，还评价了Lipo/miR-21和n(miR-21)的药代动力学特征。如预期的那样，n(miR-21)显示出与Lipo/miR-21相比增强的血液持久性(图12F)。浓度-时间曲线采用二室模型拟合，所得到的PK参数列于表2。n(miR-21)的浓度-时间曲线下面积、消除半衰期(t_1/2)和平均停留时间显著高于Lipo/miR-21的那些，表明给予n(miR-21)导致在延长的寿命内在系统循环中更高的miR-21浓度。

表2 lipo/miR-21和n(miR-21)的药代动力学参数

^a 消除半衰期

^b 血浆miRNA浓度与时间曲线下的面积

^c 平均停留时间

与Lipofectamine-介导的递送比较，提供的结果表明，纳米胶囊导致递送到缺血性脑的效率提高，在RES器官中的累积减少，和在血液中的半衰期延长。此外，由于急性肝毒性是全身递送纳米药物的主要关注，因此还评估了静脉内给予纳米胶囊后24小时反映肝脏功能的血液化学参数(表3)。与注射PBS的大鼠相反，在用Lipo/miR-21注射的大鼠中观察到明显的肝功能障碍，而对于n(miR-21)，甚至以高达0.5 mg/kg的剂量也未观察到明显的肝毒性。由于严重的肝毒性，在进一步体内研究中未研究Lipo/miR-21。

表3. 全身给予lipo/miR-21和n(miR-21) 24-h后通过ELISA测定的经处理的大鼠的血液化学分析。数据显示为平均值± SEM (n=5)。

颈动脉内(i.c.)注射已被认为是一种有效的策略，以避免胶体药物积聚在RES内，并最大限度地提高给予药物的生物利用度。然而，它还需要手术经验并用有限的剂量和给药频率(Chen et al. (2015) Adv Drug Deliv Rev 81:128-141; Kim et al. (2011),同上)。在这方面，静脉内(i.v.)注射实际上更容易被接受。图12G对i.c.或i.v.注射n(miR-21)后完整和切除的脑的荧光图像进行比较。在低n(miR-21)剂量(0.1 mg/kg)时，经i.v.注射的大鼠显示出比经i.c.注射的大鼠在脑组织中更低的荧光强度。在较高的注射剂量(0.5mg/kg)下，荧光强度相似(图12H)；进一步的qRT-PCR结果证实对i.v.注射和i.c.注射二者的相似疗效(图12I)，提示i.v.注射纳米胶囊可能是治疗脑缺血的一种有效的给药策略。

miRNA-21纳米胶囊在具有短暂性局灶性大脑缺血的模型大鼠中的治疗效果

在MCAO/R诱导的短暂性局灶性大脑缺血的大鼠模型中检查了n(miR-21)的治疗效果。建立缺血后24小时，每隔一天将n(miR-NC)和n(miR-21)分别注入尾静脉，持续3次，剂量为0.5 mg/kg miRNA，以等量的PBS用作阴性对照。n(miR-21)的治疗益处主要根据它们的神经功能和缺血性脑梗死体积来确定。每次注射前，根据双盲测试，对神经学结果进行评估并按五点量表评分。

如在图14A中所示，用PBS或n(miR-NC)处理的大鼠的平均神经学缺陷评分随着时间的推移仅略有改善，而用n(miR-21)治疗的大鼠则表现出明显改善的性能。于第7天收集脑组织，以通过2,3,5-三苯基四唑鎓盐酸盐(TTC)染色评价梗死体积。如在图14B和图14C中所示，与用PBS或n(miR-NC)处理的大鼠比较，n(miR-21)-治疗的大鼠的TTC-染色的脑表现出明显减少的梗死体积(~45%)。缺血性脑经苏木精-伊红(H&E)染色的进一步组织病理学分析显示，由MCAO/R诱导的短暂性局灶性大脑缺血导致缺血核心和半影中明显的神经元坏死，其在H&E染色切片上作为嗜酸性神经元出现(图14D)。与PBS组和n(miR-NC)组相反，给予n(miR-21)显著保护神经元免于坏死并改善了病理症状。

为了最终证实miR-21的治疗效果，还采用了原位杂交和免疫组织化学以分析在缺血边界区(IBZ)中miR-21和下游蛋白的表达水平。如在图14E中所示，IBZ中的miR-21表达由Cy3标记并在代表性的显微照片中直接显现。来自用n(miR-21)治疗的脑中的miR-21的红色荧光强度比用PBS或n(miR-NC)处理的那些更强，提示n(miR-21)有效地调节IBZ中的miR-21水平。

递送的miR-21还调节与血管生成或神经保护相关的蛋白质。如免疫组织化学结果证实的，HIF-1α(一种控制血管内皮生长因子(VEGF)表达的转录因子) (Oladipupo et al.(2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108:13264-13269; Semenza (2000) J Clin Invest106:809-812)的表达在从n(miR-21)-治疗的大鼠收集的脑组织中显著增加(与n(miR-NC)处理的那些比较) (图14F)。VEGF是血管存活和血管生成的重要调节因子，具有神经保护和再生的明显潜力(Oladipupo et al. (2011), 同上)。CD31 (一种用于血管生成的重要标记) (Deshpande et al. (2011) Radiology 258: 804-811)的表达，以及神经胶质酸性蛋白(GFAP) (其是神经损伤的标记)的水平，在n(miR-21)-治疗大鼠的脑组织中增加，提示VEGF的促血管生成作用和n(miR-21)在体内的良好生物活性。

此外，在大脑缺血/再灌注损伤中，延迟的神经元死亡与细胞凋亡有关，尤其是在缺血半影中(Lee et al. (2000) J Clin Invest 106:723-731)。在该研究中，TUNEL分析被用于检测神经元细胞的凋亡。在n(miR-21)-治疗大鼠的脑切片中，观察到显著更少的绿色荧光，表明IBZ中神经元细胞的凋亡较少(图15)。与以前的报道一致，上调miR-21减少神经元的死亡(Buller et al. (2010) FEBS J 277:4299-4307)。此外，在7-天治疗后，主要器官的H&E染色在n(miR-21)-治疗的大鼠中既未显示出可检测的病理作用，也未显示心肌损伤(图16)，表明n(miR-21)的良好的治疗效果及满意的安全性。

总之，已经开发了一种平台技术，用于有效全身递送miRNA。这项技术为脑缺血(一种死亡和致残的主要原因的疾病)以及其它疾病提供了新的疗法。

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通过引用结合

本文提及的所有出版物和专利通过引用以其全文结合到本文中，如同各个单独的出版物和专利特别地和单独地指明通过引用结合到本文中一样。在有抵触的情况下，以本申请，包括本文的任何定义为准。

等同物

虽然已经讨论了本发明的特定实施方案，但上述说明书是说明性而不是限制性的。本发明的许多变化在本领域技术人员审查本说明书和以下的权利要求书后，将变得显而易见。本发明的全部范围应通过参考权利要求书，连同它们的等同物的全部范围，以及说明书，连同此类变化来确定。

Claims (77)

1.一种聚合物纳米胶囊，其包括聚合物壳和微RNA (miRNA)分子，其中聚合物壳包括a)至少一种带正电荷的单体，b) 至少一种可降解的交联剂，和c) 至少一种中性单体。

2.权利要求1的聚合物纳米胶囊，其中聚合物壳进一步包括至少一种不可降解的交联剂。

3.权利要求1或2的聚合物纳米胶囊，其中至少一种可降解的交联剂包括选自甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)、1,3-甘油二甲基丙烯酸酯、甘油1,3-二甘油醇酸二丙烯酸酯、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、双[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酸酯和双丙烯酰化多肽的交联剂。

4.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中至少一种可降解的交联剂包括甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)。

5.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中至少一种带正电荷的单体选自N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、丙烯-精胺、二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、(3-丙烯酰氨基丙基)三甲铵盐酸盐、(3-丙烯酰氨基丙基)三甲铵盐酸盐、N-(3-((4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基)丙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)丙烯酰胺、N-(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)甲基丙烯酰胺、N-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)丙烯酰胺、N-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)甲基丙烯酰胺、N-(哌嗪-1-基甲基)丙烯酰胺、N-(哌嗪-1-基甲基)甲基丙烯酰胺、N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)丙烯酰胺和N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)甲基丙烯酰胺。

6.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中至少一种带正电荷的单体是N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)。

7.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中至少一种中性单体选自丙烯酰胺(AAM)和聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)。

8.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其包括至少两种中性单体。

9.权利要求8的聚合物纳米胶囊，其包括丙烯酰胺(AAM)和聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)作为单体。

10.权利要求1的聚合物纳米胶囊，其包括甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)作为可降解的交联剂，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)作为带正电荷的单体，和丙烯酰胺(AAM)和/或聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)作为中性单体。

11.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中可降解的交联剂和总单体的摩尔比是至少约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10或更高，优选至少约1:10。

12.权利要求1-10的任一项的聚合物纳米胶囊，其中可降解的交联剂和带正电荷的单体的摩尔比是至少约2:1、1:1、1:2或更高，优选至少约1:1。

13.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中带正电荷的单体和中性单体的摩尔比是至少约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:20或更高，优选至少约1:10或约1:11。

14.权利要求12的聚合物纳米胶囊，其中APM:mPEG的摩尔比是至少约5:1、约5:2、约5:3、约5:4、约5:5或更高，优选至少约5:1或约5:2。

15.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中总单体和miRNA的摩尔比是至少约1000:1、约2000:1、约3000:1、约4000:1、约5000:1、约6000:1、约7000:1、8000:1、约9000:1、约10000:1或更高，优选至少约4000:1或约5000:1。

16.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中miRNA选自调节基因的miRNA，所述基因诱导减少的细胞凋亡、增加的血管生成、增加的神经发生或增加的神经可塑性。

17.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中miRNA选自增加VEGF、GFAP、CD31、CD34、BCL-2、NeuN、溴脱氧尿苷、巢蛋白、PSA-NCAM、双皮质素、Pax6、GAP-43、AKT或HIF1-α中至少一个的表达的miRNA。

18.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中miRNA选自减少半胱天冬酶3或PTEN的表达的miRNA。

19.权利要求1-15的任一项的聚合物纳米胶囊，其中miRNA是miR-21。

20.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊的直径是约18nm-约250 nm，或直径是约18 nm-约28 nm。

21.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其与没有至少一种中性单体、优选mPEG的对照纳米胶囊相比，具有减少的非特异性蛋白质吸附。

22.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊在中性pH下是稳定的，和在酸性pH、优选约pH 5.5下是可降解的。

23.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊在晚期内体中是可降解的。

24.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其进一步与试剂、优选标记剂和/或靶向剂缀合。

25.权利要求24的聚合物纳米胶囊，其中标记剂选自荧光剂和/或放射性同位素。

26.权利要求24的聚合物纳米胶囊，其中靶向剂选自TAT (人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转导结构域)肽、白喉毒素、破伤风毒素、Tet1、衣壳蛋白G23、狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽、阿片样肽、谷胱甘肽、硫胺素、瘦素、angiopep、低密度脂蛋白、胰岛素、黑素转铁蛋白和转铁蛋白。

27.权利要求24的聚合物纳米胶囊，其中靶向剂将聚合物纳米胶囊递送至选自内皮细胞、小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的细胞类型。

28.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其进一步包含药学上可接受的载体。

29.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其具有至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少大于70%或优选至少约60%的内化效率。

30.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊的给予诱导选自降低的细胞凋亡、增加的神经发生、增加的神经可塑性或增加的血管生成的生理过程。

31.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊的给予增加VEGF、GFAP、CD31、CD34、BCL-2、NeuN、溴脱氧尿苷、巢蛋白、PSA-NCAM、双皮质素、Pax6、GAP-43、AKT或HIF1-α的至少一个的表达。

32.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊的给予减少半胱天冬酶3或PTEN的至少一个的表达。

33.前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊，其用于给予以治疗大脑或脑缺血/再灌注损伤。

34.一种药物组合物，其包含前述权利要求的任一项的聚合物纳米胶囊。

35.权利要求34的药物组合物，其以约0.1 mg/kg、约0.2 mg/kg、约0.3 mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5 mg/kg、约0.6 mg/kg、约0.7 mg/kg、约0.8 mg/kg、约0.9 mg/kg、约1.0 mg/kg、约1.5 mg/kg、约2.0 mg/kg、超过2.0 mg/kg的剂量，或优选约0.5 mg/kg的剂量给予。

36.权利要求34或35的任一项的药物组合物，其中所述组合物适用于静脉内和/或颈动脉内给予。

37.一种治疗以基因失调为特征的疾病的方法，其包括给予权利要求1-33的任一项的聚合物纳米胶囊或权利要求34-36的任一项的药物组合物，其中miRNA分子敲减或减少过表达基因的表达和/或增加否则其表达被减少或抑制的基因的表达，从而治疗所述疾病。

38.一种治疗大脑缺血、脑缺血或再灌注损伤的方法，其包括给予一种聚合物纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊包括聚合物壳和RNAi分子；其中聚合物壳包括a) 至少一种带正电荷的单体，b) 至少一种可降解的交联剂，和c) 至少一种中性单体；和RNAi敲减或减少过表达基因的表达和/或增加否则其表达被减少或抑制的基因的表达，从而治疗大脑缺血、脑缺血或再灌注损伤。

39.权利要求38的方法，其中聚合物壳进一步包括至少一种不可降解的交联剂。

40.权利要求38或39的方法，其中聚合物壳包括至少一种可降解的交联剂，其包括选自甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)、1,3-甘油二甲基丙烯酸酯、甘油1,3-二甘油醇酸二丙烯酸酯、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、双[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酸酯和双丙烯酰化多肽的交联剂。

41.权利要求38-40的任一项的方法，其中聚合物壳包括至少一种可降解的交联剂，其包括甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)。

42.权利要求38-41的任一项的方法，其中聚合物壳包括至少一种带正电荷的单体，其选自N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐、丙烯-精胺、二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、(3-丙烯酰氨基丙基)三甲铵盐酸盐、(3-丙烯酰氨基丙基)三甲铵盐酸盐、N-(3-((4-((3-氨基丙基)氨基)丁基)氨基)丙基)甲基丙烯酰胺、N-(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)丙烯酰胺、N-(3-((4-氨基丁基)氨基)丙基)甲基丙烯酰胺、N-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)丙烯酰胺、N-(2-((2-氨基乙基)(甲基)氨基)乙基)甲基丙烯酰胺、N-(哌嗪-1-基甲基)丙烯酰胺、N-(哌嗪-1-基甲基)甲基丙烯酰胺、N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)丙烯酰胺和N-(2-(双(2-氨基乙基)氨基)乙基)甲基丙烯酰胺。

43.权利要求38-42的任一项的方法，其中聚合物壳包括至少一种带正电荷的单体，其为N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)。

44.权利要求38-43的任一项的方法，其中聚合物壳包括至少一种选自丙烯酰胺(AAM)和聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)的中性单体。

45.权利要求38-44的任一项的方法，其中聚合物壳包括至少两种中性单体。

46.权利要求38-45的任一项的方法，其中聚合物壳包括丙烯酰胺(AAM)和聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)作为单体。

47.权利要求38的方法，其中聚合物壳包括甘油二甲基丙烯酸酯(GDMA)作为可降解的交联剂，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(APM)作为带正电荷的单体，和丙烯酰胺(AAM)和/或聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(mPEG)作为中性单体。

48.权利要求38-47的任一项的方法，其中可降解的交联剂和总单体的摩尔比是至少约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10或更高，优选至少约1:10。

49.权利要求38-47的任一项的方法，其中可降解的交联剂和带正电荷的单体的摩尔比是至少约2:1、1:1、1:2或更高，优选至少约1:1。

50.权利要求38-49的任一项的方法，其中带正电荷的单体和中性单体的摩尔比是至少约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:20或更高，优选至少约1:10或约1:11。

51.权利要求49的方法，其中APM:mPEG的摩尔比是至少约5:1、约5:2、约5:3、约5:4、约5:5或更高，优选至少约5:1或约5:2。

52.权利要求38-51的任一项的方法，其中总单体和miRNA的摩尔比是至少约1000:1、约2000:1、约3000:1、约4000:1、约5000:1、约6000:1、约7000:1、8000:1、约9000:1、约10000:1或更高，优选至少约4000:1或约5000:1。

53.权利要求38-52的任一项的方法，其中RNAi选自调节基因的RNAi，所述基因诱导减少的细胞凋亡、增加的血管生成、增加的神经发生或增加的神经可塑性。

54.权利要求38-53的任一项的方法，其中RNAi选自增加VEGF、GFAP、CD31、CD34、BCL-2、NeuN、溴脱氧尿苷、巢蛋白、PSA-NCAM、双皮质素、Pax6、GAP-43、AKT或HIF1-α中至少一个的表达的RNAi。

55.权利要求38-54的任一项的方法，其中RNAi选自减少半胱天冬酶3或PTEN的表达的miRNA。

56.权利要求38-55的任一项的方法，其中RNAi分子包括至少一种选自微RNA (miRNA)、反义微RNA (AS-miRNA)、小干扰RNA (siRNA)和小发夹RNA (shRNA)的RNAi。

57.权利要求56的方法，其中RNAi分子包括至少一种miRNA或一种AS-miRNA。

58.权利要求38-53的任一项的方法，其中miRNA是miR-21。

59.权利要求38-58的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊的直径是约18 nm-约250nm，或优选直径是约18 nm-约28 nm。

60.权利要求38-59的任一项的方法，其中与没有至少一种中性单体、优选mPEG的对照聚合物纳米胶囊相比，聚合物纳米胶囊具有降低的非特异性蛋白质吸附。

61.权利要求38-60的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊在中性pH下是稳定的，和在酸性pH、优选约pH 5.5下是可降解的。

62.权利要求38-61的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊在晚期内体中是可降解的。

63.权利要求38-62的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊进一步与试剂、优选标记剂和/或靶向剂缀合。

64.权利要求63的方法，其中标记剂是荧光剂和/或放射性同位素。

65.权利要求63的方法，其中靶向剂选自TAT (人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的转导结构域)肽、白喉毒素、破伤风毒素、Tet1、G23、狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽、阿片样肽、谷胱甘肽、硫胺素、瘦素、angiopep、低密度脂蛋白、胰岛素、黑素转铁蛋白和转铁蛋白。

66.权利要求63的方法，其中靶向剂将聚合物纳米胶囊递送至选自内皮细胞、小胶质细胞、神经元和星形胶质细胞的细胞类型。

67.权利要求38-66的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊具有至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少大于70%或优选至少约60%的内化效率。

68.权利要求38-67的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊进一步包括药学上可接受的载体。

69.权利要求38-68的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊作为药物组合物给予。

70.权利要求69的方法，其中药物组合物包含剂量为约0.1 mg/kg、约0.2 mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4 mg/kg、约0.5 mg/kg、约0.6 mg/kg、约0.7 mg/kg、约0.8 mg/kg、约0.9 mg/kg、约1.0 mg/kg、约1.5 mg/kg、约2.0 mg/kg、超过2.0 mg/kg，或优选剂量为约0.5 mg/kg的聚合物纳米胶囊。

71.权利要求38-70的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊的给予诱导选自减少的细胞凋亡、增加的神经发生、增加的神经可塑性和增加的血管生成的生理过程。

72.权利要求38-71的任一项的方法，其中在给予后，VEGF、GFAP、CD31、CD34、BCL-2、NeuN、溴脱氧尿苷、巢蛋白、PSA-NCAM、双皮质素、Pax6、GAP-43、AKT或HIF1-α的至少一个的表达增加。

73.权利要求38-72的任一项的方法，其中在给予后，半胱天冬酶3或PTEN的至少一个的表达减少。

74.权利要求38-73的任一项的方法，其中聚合物纳米胶囊或药物组合物经胃肠外，例如静脉内给予。

75.权利要求38-74的任一项的方法，其中所述方法进一步包括给予额外的治疗。

76.权利要求75的方法，其中额外的治疗选自抗凝治疗、抗血小板治疗和溶栓治疗。

77.制备权利要求1-33的任一项的聚合物纳米胶囊的方法，其包括：a) 使miRNA分子溶于无RNase的水中；b) 使至少一种带正电荷的单体、至少一种中性单体和至少一种可降解的交联剂溶于脱氧和去离子水中，以创建单体混合物；c) 将步骤a)的溶解的miRNA分子与步骤b)的单体混合物合并；d) 将过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺加入步骤c)的产物中，和e) 在无血清的介质中孵育步骤d)的产物。

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