CN110865057A - 一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器，包括：非均匀TDC电路基于延时线的原理，通过延时单元量化输入的start信号和stop信号之间的时间间隔，输出一组温度计码t；非均匀TDC电路实现的关键是延时单元延时值的分配，具体为：将荧光信号出现概率为0.84的这部分等概率划分为4部分，每一部分对应一个时间大小，之后将4部分都各自均分为3小部分，每一小部分对应为一个延时单元的延时值，共得到12个延时单元的延时值；且非均匀TDC电路中采用了压控差分反相器作为延时单元，差分的结构使延时单元具有抗干扰能力，延时值压控可调的特性使得非均匀TDC电路采用一种结构的延时单元就能实现所需延时大小。

Description

一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器

技术领域

本发明涉及时间数字转换器领域，尤其涉及一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器。

背景技术

生物医学是当今最为活跃的研究领域之一，其研究领域涉及生命个体、器官、组织、细胞、乃至基本分子。在生物体中，稳定的微环境是保持细胞正常增殖、代谢以及其他功能活动最为重要的条件。目前，通常使用荧光物质来标记待测样本，通过研究样本激发的荧光特性来分析样本及其所处环境的特征。传统的基于荧光强度的探测方法很容易受到激发激光强度、样本淬灭和荧光染料溶度分布等因素的影响，难以做到定量测量。而荧光寿命则是绝对的，仅与样本自身特性和其所处的环境特性有关，因此对待测样本进行荧光寿命成像(Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy,FLIM)可以准确地获得样本所处的微环境的理化特征。基于此优点，荧光寿命成像技术被广泛应用在了细胞生物学、分子研究、药物动力分析等领域。

目前时域下的时间相关单光子计数法(Time Correlated Single PhotonCounting,TCSPC)因其优秀的灵敏度、稳定性和时间空间分辨率取代了直接测量荧光强度的方法，成为还原荧光寿命大小最常用的手段。其通过时间数字转换器(Time to DigitalConverter,TDC)测量光子的出现时间，构建出荧光光子在时间轴上的概率分布曲线，进而得到荧光寿命信息。时间数字转换器的性能直接关系到荧光寿命成像结果的优劣。

传统的基于延时单元的TDC，其延时单元的大小都是均匀的(文中将其简称为均匀TDC)，可以实现固定大小的时间分辨率。但对于出现概率和时间服从指数分布的荧光光子而言，均匀的延时单元对荧光光子出现概率高和低的部分赋予了相同的权重，使得TDC的分辨率以及测量精度没有被充分的利用，这种TDC需要测量更多次的荧光信号才能还原出正确的荧光衰减曲线。所以，设计一款针对荧光寿命成像应用的TDC具有重要的理论现实意义。

发明内容

本发明提供了一种基于非均匀延时单元的用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器(文中将其简称为非均匀TDC)，本发明充分利用了荧光信号的出现概率随时间指数减小这一先验条件，在荧光信号出现概率较大地方采用较小的延时单元，确保TDC整体较高的时间分辨率，而在荧光信号出现概率小的地方采用较大的延时单元，适当的放弃一些小概率的事件，以保证TDC整体较大的动态范围，在延时链长度和动态范围不变的情况下，使用非均匀的延时布局实现更高的等效精度，详见下文描述：

一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器，所述时间数字转换器包括：非均匀TDC电路和编码电路两个部分，

非均匀TDC电路基于延时线的原理，通过延时单元量化输入的start信号和stop信号之间的时间间隔，输出一组温度计码t；

编码电路完成温度码到二进制码的转换，输出最终的时间间隔T；

非均匀TDC电路实现的关键是延时单元延时值的分配，具体为：

将荧光信号出现概率为0.84的这部分等概率划分为4部分，每一部分对应一个时间大小，之后将4部分都各自均分为3小部分，每一小部分对应为一个延时单元的延时值，共得到12个延时单元的延时值；

且非均匀TDC电路中采用了压控差分反相器作为延时单元，差分的结构使延时单元具有抗干扰能力，延时值压控可调的特性使得非均匀TDC电路采用一种结构的延时单元就能实现所需延时大小。

进一步地，获取一条动态范围为3.665ns，延时链长度为12的非均匀的抽头延时线。

其中，所述压控差分反相器的结构为：

In+和In-是两个差分输入端，输入两个状态相反的差分信号，Out+和Out-是信号输出端，输出信号同样是状态相反的差分信号。

进一步地，所述压控差分反相器的工作过程为：

当In+输入高电平，In-输入低电平时，M₃导通，M₄截止，而M₅和M₈在Vbias的控制下始终处于导通状态，Out-输出低电平，M₂导通，Out+输出高电平；

M₆和M₇增大尾电流，扩大电路的可调延时范围，在M₅和M₈的偏置电压失调时保证电路正常工作。

本发明提供的技术方案的有益效果是：

1、对随机产生的三万个荧光信号重复测量一万次，计算所得到的一万个荧光寿命的方差，对比可得，基于非均匀TDC得到的荧光寿命具有更小的方差，意味着在相同数量样本的前提下，非均匀TDC在测量荧光寿命时，具有更好的稳定性和更低的测量误差；

2、对随机产生的三万个荧光信号进行测量，通过计算实际时间间隔和测得的时间间隔的均方根误差，来确定TDC的测量精度，仿真结果显示，和均匀TDC相比，非均匀TDC的测量精度提升约47％；

3、本发明设计的非均匀TDC使用专用集成电路(Application SpecificIntegrated Circuit,ASIC)设计的方式实现，与标准CMOS工艺兼容，可实现同一芯片上TDC电路和其读出电路的单片集成，从而降低成本，增强功能。

附图说明

图1是非均匀TDC系统框图；

图2是非均匀TDC电路结构；

图3是压控差分反相器的结构示意图及电路图；

其中，(a)为压控差分反相器的结构示意图；(b)为压控差分反相器的电路图。

图4是TSPC触发器的电路结构；

图5是荧光寿命成像的原理图；

图6是时间相关单光子计数的原理；

图7是非均匀TDC延时单元的划分原理；

图8是非均匀TDC可行性验证的结果图；

其中，(a)为荧光信号的概率积分直方图；(b)为荧光信号的概率分布直方图；(c)为荧光信号概率分布直方图的拟合曲线；(d)为拟合曲线的参数。

表1两种TDC多次还原荧光寿命值的方差对比；

表2两种TDC多次还原荧光寿命值的精度对比。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。

图1为非均匀TDC的系统框图。所述系统主要包括：TDC电路和编码电路两个部分。TDC电路通过延时单元量化输入的start信号和stop信号之间的时间间隔，输出一组温度计码t。编码电路完成温度码到二进制码的转换，输出最终的时间间隔T，完成整个测量过程。

图2为非均匀TDC的电路结构，此TDC基于延时线的原理实现。其中，start信号沿着上面的延时链传播，而stop信号连接D触发器的时钟端对延时后的start信号进行采样，在stop信号追上start信号之前，D触发器输出为1，一旦stop追上start信号，D触发器的输出就会变为0。最终触发器会输出一组从1变为0的温度计码，通过分析输出温度码中最后一个1的位置就可以得到start信号和stop信号之间的时间间隔。边沿校准电路的作用是产生压控差分反相器所需的无相位差的差分信号，延时校准单元的作用是补偿边沿校准电路引入的额外延时，消除测量误差。

图3(a)给出了压控差分反相器的结构示意图。其中In+和In-是两个差分输入端，输入两个状态相反的差分信号，Out+和Out-是信号输出端，输出信号同样是状态相反的差分信号，所以多个压控差分反相器串联时，上一级的差分输出刚好可以作为下一级的差分输入。相对于最简单的反向器来说，虽然输入信号由原来的一个变成了两个，但差分结构提供了更强的抗干扰能力。

图3(b)是压控差分反相器的电路结构，可以看到每个单元仅有8个晶体管，保证了小的芯片面积。其工作过程为：当In+输入高电平，In-输入低电平时，M₃导通，M₄截止，而M₅和M₈在Vbias的控制下始终处于导通状态，所以Out-输出低电平，M₂导通，Out+输出高电平。M₆和M₇可以增大尾电流，扩大电路的可调延时范围，同时也能起到一定的电路保护作用，在M₅和M₈的偏置电压失调时确保电路仍能正常工作。In+输入低电平，In-输入高电平时分析同上，这里不再赘述。

具体实现时，例如：可以通过控制M₅和M₈的栅压可以调整单元延时值的大小，栅压越大，延时值越小，从而保证延时链良好的线性度，减小测量误差。

图4为TSPC触发器的电路结构。其工作过程为：当CLK为低电平时，第一级反相器在节点X上采样输入信号IN的反相值，第二级反相器处于预充电状态，将节点Y充电至电源电压，第三级反相器处于保持状态，即Z点的电位保持不变，输出OUT保持原来的值；当CLK变为高电平时，第二级反相器开始工作，如果X节点在CLK上升沿来临时是高电平，那么Y节点放电，否则Y节点的值保持原来的状态，由于CLK为高电平时第三级反相器正常工作，Y节点的值传送至输出端OUT。

从判别精度来讲，TSPC触发器的建立时间是第一级反相器的延时，保持时间是第二级反相器的延时，例如：可通过调整这两级反相器中晶体管的宽长比实现尽可能小的建立保持时间，避免数据采样出现错误，进一步提高了系统的精度。

非均匀TDC实现的关键是其中延时单元延时值的分配，下面将介绍非均匀延时值的实现原理与具体步骤。

图5所示为荧光寿命成像的原理图，对待测样本进行荧光激发，产生的荧光光子其光强会随着时间指数衰减，光强衰减到初始值1/e所用的时间就定义为此样本的荧光寿命(τ)，测量荧光寿命即可得到样本和其所处环境的特征。荧光光子的衰减函数一般表示为：

N(t)＝N₀exp(-t/τ) (1)

其中，N₀为荧光强度的初始值，τ为样本的荧光寿命。

图6所示为时间相关单光子计数的原理，在单光子的测量条件下，某时刻能检测到荧光光子的概率和此时刻的荧光强度成正比。据此，经过大量的重复测量，记录荧光信号的出现时间，并在时间轴上记录频次，构建出所激发的荧光光子在时间轴上的概率分布曲线，即得到了荧光衰减曲线。之后根据相应的算法，即可得到荧光寿命值。由公式(1)可知，某时刻检测到荧光信号的概率为：

P(t)＝A×N₀exp(-t/τ) (2)

其中，A为某时刻荧光光子出现概率和此时荧光强度的比例系数。

此函数需要满足条件：

计算可知，A×N₀＝1/τ，所以公式(2)变为：

为了方便描述和进行后续的对比实验，本文取τ＝2。

图7给出了非均匀TDC延时单元的划分原理，由于应用领域为测量荧光寿命τ，时间τ之前荧光信号出现的概率为：

理论来说，只需提取出时间τ之前的部分节点，之后进行曲线拟合，再根据曲线的函数就能计算出所需的荧光寿命值，但为了确保测量的准确度，综合考虑了延时单元实现的同时舍弃了一些无用信息，选择荧光信号出现概率为0.84的时间范围进行划分。即：

对应t＝3.6652ns。

首先将荧光信号出现概率为0.84的这部分等概率划分为4大部分，每一部分对应这一个时间大小，之后再将这4大部分都各自均分为3小部分，每一部分对应为一个延时单元的延时值，共得到12个延时单元的延时值，其具体数值如图中所示。按照这种划分方式，得到了一条动态范围为3.665ns，延时链长度为12的非均匀的抽头延时线。

均匀TDC的电路结构与计时原理和非均匀TDC相同，不同的是均匀TDC中，所有延时单元的延时大小都是相同的，非均匀TDC中，不同位置的延时单元，其延时大小不同。所以均匀TDC的参数为动态范围是3.665ns，延时链长度为12，时间分辨率为305ps。

图8给出了非均匀TDC在Matlab中的可行性验证结果。具体实现过程为：在Matlab中生成三万个服从函数P(t)＝(1/2)exp(-t/2)分布的随机数，并统计它们在时间轴上出现的频次，据此可以得到荧光信号在对应的时间间隔上的概率积分直方图，如图8(a)所示。将图8(a)中每一个柱状图的纵坐标都除以其对应的时间间隔，可以近似的得到荧光信号在时间轴上的概率分布直方图，如图8(b)所示。最后取图8(b)中每一个柱状图顶端的中点坐标进行曲线拟合，可以得到近似的荧光寿命衰减曲线，如图8(c)所示。由图8(d)给出了图8(c)中曲线的参数，所拟合曲线对应的荧光寿命值为0.4934，约等于所设置的荧光寿命大小0.5，证明非均匀TDC可以准确还原荧光寿命的大小。

下面进行均匀TDC和非均匀TDC的性能仿真。

表1给出了荧光测量结果的方差比较。具体实现过程为：分别使用两种TDC，对前面生成的三万个荧光信号重复测量一万次，从而各自得到了一万个荧光寿命，之后分别计算这一万个荧光寿命的方差，可以看到在相同数量的测量样本下，非均匀TDC在还原荧光寿命值时，方差更小，具有更好的稳定性，意味着误差产生的概率更小。

表2给出了两种TDC测量精度的比较结果。因为非均匀TDC中延时单元的延时值不同，即使用时间分辨率来衡量其性能是没有意义的。这里引入测量精度，TDC的测量精度的计算方法为：输入一个已知的时间间隔，观察TDC的输出结果，之后计算测量结果的偏差，多次测量后，计算时间偏差的标准差，就是TDC的测量精度，可以表示为：

这个值越小，说明TDC测量时间间隔的偏差就越小，TDC的精度越高。使用两种TDC对Matlab中三万个随机信号的时间间隔进行测量并计算它们的测量精度。可以看到，相比于均匀TDC，非均匀TDC在测量荧光信号的出现时间时，具有更高的测量精度，性能提升大约为47％。

表1两种TDC多次还原荧光寿命值的方差对比

表2两种TDC多次还原荧光寿命值的精度对比

本发明所提出的非均匀TDC基于延时线结构实现。延时单元使用压控差分反相器实现，保证延时单元之间良好的匹配度，以及压控可调的延时单元可以方便的实现所需要的非均匀延时大小；使用真单相时钟触发器(True single phase clocked,TSPC)来判决开始和停止信号相位的先后关系，保证了触发器有尽可能小的建立保持时间。

非均匀TDC的实现关键是对延时单元的延时大小进行合理划分，为此本发明进行了以下工作：

1、本发明提出一种“两步法”的思路对非均匀TDC中延时单元的大小进行合理划分，并进行可行性验证保证非均匀TDC能正确应用于荧光寿命成像领域。

2、在Matlab中对非均匀TDC和均匀TDC进行性能仿真，对比两种TDC的性能差异，验证非均匀TDC在荧光寿命成像中的优势。

综上所述，本发明针对荧光寿命成像应用领域，充分的利用了荧光光子出现概率服从指数分布的先验条件，针对传统基于均匀延时单元的抽头延时线型TDC进行了改进，重新对延时单元的大小进行了划分，使得TDC的性能被更加充分的利用。

仿真结果表明，相比于传统均匀延时单元的TDC，非均匀的TDC在多次还原荧光寿命时，具有更小的方差，意味着更高的测量稳定性和更小的样本需求量；非均匀TDC在测量荧光光子的出现时间时，测量精度提升了大约47％，有效的提高了系统的性能。

本发明实施例对各器件的型号除做特殊说明的以外，其他器件的型号不做限制，只要能完成上述功能的器件均可。

本领域技术人员可以理解附图只是一个优选实施例的示意图，上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器，其特征在于，所述时间数字转换器包括：非均匀TDC电路和编码电路两个部分，

非均匀TDC电路基于延时线的原理，通过延时单元量化输入的start信号和stop信号之间的时间间隔，输出一组温度计码t；

编码电路完成温度码到二进制码的转换，输出最终的时间间隔T；

非均匀TDC电路实现的关键是延时单元延时值的分配，具体为：

将荧光信号出现概率为0.84的这部分等概率划分为4部分，每一部分对应一个时间大小，之后将4部分都各自均分为3小部分，每一小部分对应为一个延时单元的延时值，共得到12个延时单元的延时值；

且非均匀TDC电路中采用了压控差分反相器作为延时单元，差分的结构使延时单元具有抗干扰能力，延时值压控可调的特性使得非均匀TDC电路采用一种结构的延时单元就能实现所需延时大小。

2.根据权利要求1所述的一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器，其特征在于，获取一条动态范围为3.665ns，延时链长度为12的非均匀的抽头延时线。

3.根据权利要求1所述的一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器，其特征在于，所述压控差分反相器的结构为：

In+和In-是两个差分输入端，输入两个状态相反的差分信号，Out+和Out-是信号输出端，输出信号同样是状态相反的差分信号。

4.根据权利要求3所述的一种应用于荧光寿命成像的非均匀时间数字转换器，其特征在于，所述压控差分反相器的工作过程为：

当In+输入高电平，In-输入低电平时，M₃导通，M₄截止，而M₅和M₈在Vbias的控制下始终处于导通状态，Out-输出低电平，M₂导通，Out+输出高电平；

M₆和M₇增大尾电流，扩大电路的可调延时范围，在M₅和M₈的偏置电压失调时保证电路正常工作。

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