CN110862946B - 双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针、系统、生物传送带及传输方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针、系统、生物传送带及传输方法，属于细胞生物学和细胞纳米技术领域。本发明所述双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针前端的外周面为抛物线型，且所述光纤探针的前端一体拉伸有圆柱形尖端。本发明所述光纤探针能够基于自然细胞组装形成的生物传送带，实现对纳米颗粒和生物细胞的双向传输，克服以往方案应用于生物系统的痛点，同时还有望应用于活体血管之中。本发明仅使用两根光纤探针，避免了复杂的材料制备和系统集成。

Description

双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针、系统、生物传送带及传 输方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学和生物纳米技术领域，具体涉及双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针、系统、生物传送带及传输方法。

背景技术

实现细胞的双向输运对于细胞生物学和生物纳米技术领域意义重大，可用来研究细胞与细胞间的相互作用，细胞粘附，精准的细胞筛选以及单细胞转染等。除了细胞以外，实现纳米颗粒的有效传输对于构建复杂的纳米结构，生物分析以及药物靶向输运等纳米医疗领域也发挥着至关重要的作用。截至目前，人们基于不同物理原理提出了多种实现微粒和细胞的传输方案，包括介电泳，磁泳，声泳，微流控及光学传送带等。

基于介电泳、磁泳、声泳及微流控的方案通常需要精心制作的电极、磁控管、超声装置或特殊设计的微流系统，系统庞大，造价昂贵，不利于进一步的光电集成。此外，以上操作技术分别对于微粒的电导率、磁感应系数、声学特性等要求苛刻，故仅可应用于特定纳米颗粒的定向输运。相比以上技术，光力可实现对微纳颗粒的非接触和无损伤操控，且无需对样品进行特异性标记，故而引起研究人员的极大兴趣和关注。截至目前，多种近场光捕获技术已被研制并应用于纳米颗粒的捕获和定点释放，包括等离激元，窄带波导，纳米光纤及光学谐振腔等，称之为“光学传送带”。然而，由于对金属及介电材料的依赖及复杂的制作工艺，其生物兼容性和可降解性较差，因而当应用于细胞输运等生物系统时面临严峻挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针、系统、生物传送带及传输方法。本发明所述光纤探针能够基于自然细胞组装形成的生物传送带，实现对纳米颗粒和生物细胞的双向传输，克服以往方案应用于生物系统的痛点，同时还有望应用于活体血管之中。本发明仅使用两根光纤探针，避免了复杂的材料制备和系统集成。

本发明提供了双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针，所述光纤探针前端的外周面为抛物线型，且所述光纤探针的前端一体拉伸有圆柱形尖端，所述光纤探针数量为2个。

优选的是，所述抛物线型的轴线与所述圆柱形的轴线在一条直线上，且圆柱形尖端根部的任一点与所述光纤探针前端的抛物面之间的切线与所述光纤探针轴线的夹角为40°～45°。

优选的是，所述光纤探针的抛物线型前端的直径在11.25μm的长度内由6.3μm下降到1.8μm；所述圆柱形尖端的直径为0.6μm，长度为1.8μm。

本发明还提供了上述技术方案所述光纤探针的制备方法，包括以下步骤：

去掉单模光纤的表面涂覆层，得到裸光纤；将裸光纤外套一根玻璃毛细管，置于火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，沿轴向进行第一拉伸，拉伸速度为2.5mm/s，将第一拉伸后的光纤移开火焰上方，沿轴向进行第二拉伸并拉断，拉伸速度为10mm/s，得到含圆柱形尖端的光纤探针。

优选的是，所述单模光纤的包层直径为125μm，所述第一拉伸后，光纤直径在3mm的长度内减至6.3μm。

本发明还提供了双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针系统，所述光纤探针系统包括上述技术方案所述光纤探针或上述技术方案所述制备方法得到的光纤探针、光纤激光器、三维调节架、二维位移台、载玻片、显微镜、电荷耦合元件和电脑。

本发明还提供了基于上述技术方案所述光纤探针或上述技术方案所述制备方法得到的光纤探针或上述技术方案所述光纤探针系统的生物传送带，所述生物传送带的制备方法包括以下步骤：

在含生物细胞的溶液中，调节两根光纤探针轴向对准，在两根光纤探针的末端分别输入相同波长的激光，控制含生物细胞的溶液垂直光轴流动，增大两根光纤探针的间距和激光的功率，得到串联的生物细胞传送带。

优选的是，所述生物细胞包括大肠杆菌细胞、乳酸杆菌细胞或红细胞。

优选的是，所述激光的波长为980nm，且所述激光的功率在120毫瓦以内。

本发明还提供了上述技术方案所述生物传送带传送细胞或纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

通过调节两根光纤探针末端输入激光的功率，实现一个或多个细胞或者纳米颗粒的双向传送；细胞或纳米颗粒的移动方向朝向功率小的一端。

本发明提供了双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针。本发明所述光纤探针为具有特殊纳米圆柱探针尖端的抛物线型光纤光镊，能够结合出射激光组装成长度可控的生物传送带，且利用此生物传送带，能够实现纳米颗粒和/或生物细胞的双向传输。

附图说明

图1为本发明提供的光纤探针前端结构示意图；

图2为本发明提供的生物传送带实验原理图及光纤探针、大肠杆菌细胞和聚苯乙烯纳米颗粒的光学显微图片；

图3为本发明提供的实验装置示意图；

图4为本发明提供的生物传送带制备过程图；

图5为本发明提供的生物传送带传输单个和多个纳米颗粒过程图；

图6为本发明提供的生物传送带传输生物细胞的过程图；

图7为本发明提供的生物传送带传输单个纳米颗粒模型图。

具体实施方式

本发明提供了双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针，所述光纤探针前端的外周面为抛物线型，且所述光纤探针的前端一体拉伸有圆柱形尖端，所述光纤探针数量为2个。本发明所述光纤探针前端结构示意图如图1所示(由于图1为后期制图，故尺寸比例上还是以实物图(图2b)更为精准，同理，本发明后续提供的图2a、图5a、图6a和图7由于为模型图，所述模型的各个尺寸与实际形状尺寸也有出入，均以图2b为准即可)。在本发明中，所述抛物线型的轴线与所述圆柱形的轴线在一条直线上。在本发明中，所述圆柱形尖端根部的任一点与所述光纤探针前端的抛物面之间的切线与所述光纤探针轴线的夹角优选为40°～45°，更优选为42.5°。本发明所述光纤探针易于制备和光电集成，避免了其余方案制备电极及磁控管等的复杂工艺，可操作性和推广性强。

在本发明中，所述光纤探针的抛物线型前端的直径在11.25μm的长度内由6.3μm下降到1.8μm。在本发明中，所述圆柱形尖端的直径为0.6μm，长度为1.8μm。在本发明中，所述圆柱形尖端的尺寸优选与组成生物传送带的细胞的尺寸相近，如本发明所述特定尺寸的圆柱形尖端尺寸与单个大肠杆菌尺寸相似，后续能够通过光纤探针的出射激光更加高效的耦合进入组装的大肠杆菌串列之中。

本发明还提供了上述技术方案所述光纤探针的制备方法，包括以下步骤：

去掉单模光纤的表面涂覆层，得到裸光纤；将裸光纤外套一根玻璃毛细管，置于火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，沿轴向进行第一拉伸，拉伸速度为2.5mm/s，将第一拉伸后的光纤移开火焰上方，沿轴向进行第二拉伸并拉断，拉伸速度为10mm/s，得到含圆柱形尖端的光纤探针。

在本发明中，加热前，在裸光纤外套一根玻璃毛细管，能够防止后续试验操作中光纤探针的断裂和弯曲。

本发明所述光纤探针优选由单模光纤经熔融拉伸法制备而成。具体的，在本发明中，所述单模光纤的包层直径优选为125μm，连接头优选为FC/PC，所述第一拉伸后，光纤直径在3mm的长度内减至6.3μm，即所述第一拉伸后的光纤抛物线型前端的直径为6.3μm。

本发明还提供了双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针系统，所述光纤探针系统包括上述技术方案所述光纤探针或上述技术方案所述制备方法得到的光纤探针、光纤激光器、三维调节架、二维位移台、载玻片、显微镜、电荷耦合元件和电脑。本发明所述激光优选通过光纤激光器提供，本发明对所述光纤激光器的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售光纤激光器即可。本发明所述调节，优选借助三维调节架进行操作，优选使用三维调节架SAM,KohzuPrecision Co.,Ltd.，以实现步进精度为50nm的调节。本发明对于观察用显微镜没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规型号显微镜即可，如显微镜(Union,HISOMET II-DH II)。本发明所述显微镜优选通过一台电荷耦合元件(CCD,SonyiCY-SHOT,DXC-S500)与电脑相连，实现图像的实时获取和视频记录。

本发明还提供了基于上述技术方案所述光纤探针或上述技术方案制备方法得到的光纤探针的生物传送带，所述生物传送带的制备方法包括以下步骤：

在含生物细胞的溶液中，调节两根光纤探针轴向对准，在两根光纤探针的末端分别输入相同波长的激光，控制含生物细胞的溶液垂直光轴流动，增大两根光纤探针的间距和激光的功率，得到串联的生物细胞传送带。在本发明中，所述生物细胞包括大肠杆菌细胞、乳酸杆菌细胞或红细胞。在本发明中，所述激光的波长为980nm，在本发明设定的波长下，细胞溶液对该波长吸收较少，能避免产生较大的温度增量影响生物细胞的活性和操控稳定性。此外为获得较大的倏逝场梯度，波长应大于传送带的直径(大肠杆菌细胞首尾相连组成了生物传送带，故传送带直径即为大肠杆菌直径)，也即500nm。在本发明中，所述激光的功率在120毫瓦以内，否则会对生物细胞造成损失。本发明所述生物传送带能够通过功率大小的调节实现长度的控制。本发明使用自然存在的生物细胞组装形成长度可控的传送带，相对于其他报道的光学传送带策略，避免了对金属及介电材料的依赖，具有良好生物兼容性和可降解性。在本发明中，为保证良好的操控环境，生物细胞的浓度优选设定为1×10⁵个/mL，而纳米颗粒的浓度限定为1×10⁴个/mL。在本发明中，所述含生物细胞的溶液优选置于载玻片上进行操作，所述溶液的厚度优选控制在15～25μm以内，以提供良好的操控环境和高清成像性能。

本发明还提供了基于上述技术方案所述生物传送带传送细胞或纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

通过调节两根光纤探针末端输入激光的功率，实现一个或多个细胞或者纳米颗粒的双向传送；细胞或纳米颗粒的移动方向朝向功率小的一端。本发明通过调控激光功率可实现对传输速度和方向的动态控制，而无需进行复杂的系统参数调整和修改。本发明对所述细胞和纳米颗粒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规生物细胞和纳米颗粒即可。本发明传输的生物细胞优选还包括酵母菌细胞、小球藻细胞和人体红细胞等。本发明所述纳米颗粒的尺寸优选为200nm至1μm。纳米颗粒传输模型图如图7所示。

本发明所述生物传送带的原理是基于光纤光镊技术及波导表面倏逝波——一种沿波导方向传播且沿垂直波导方向指数衰减的传输光波模式。具体实验原理如图2所示：两根具有圆柱形尖端的抛物线型光纤探针(具有完全相同的前端结构)相对置于混合有大肠杆菌细胞和聚苯乙烯纳米颗粒的溶液之中，两根光纤探针的轴向在一条直线上(图2a1)。此时向两根光纤探针中分别通入波长为980nm的激光，出射激光在光纤探针前端的作用下将发生汇聚，此时溶液中的大肠杆菌将在光梯度力的作用下被捕获至光轴(也即光纤的轴向方向)，进而调整大肠杆菌长轴取向与光纤轴向方向保持一致。随着细菌捕获数量的增加，被捕获的大肠杆菌将首尾相连组装成一条沿光轴分布的细胞串列。由于大肠杆菌细胞折射率大于周围水溶液，光纤探针的出射激光将沿细胞串列进行传输。由于大肠杆菌直径(500nm)小于激光波长(980nm)，传输的激光将部分出现在细胞串列表面形成倏逝波。倏逝波在垂直串列方向的强衰减引发较大的光学梯度，捕获聚苯乙烯纳米颗粒至细胞串列表面。此时操控两根光纤探针的入射激光功率，当左侧光纤探针大于右侧光纤时(如图2a2)，聚苯乙烯颗粒在光轴方向上所受合力向右，此时其将在光力作用下向右侧进行传输(如图2a3)；反之，若右侧光纤探针中的激光功率大于左侧光纤，聚苯乙烯纳米颗粒将沿细胞串列向左侧进行传输(如图2a4)。因此，组装形成的细胞串列如同一条机械传送带可实现纳米颗粒的可控双向输运。除了纳米颗粒以外，该生物传送带还可进一步实现生物细胞的双向传输。由于该传送带使用生物细胞组装而成，避免了对金属及介电材料的依赖，具有良好的生物兼容性，因此称之为“生物传送带”。本发明具体基于大肠杆菌细胞串列表面的倏逝波构建生物传送带，最终实现纳米颗粒及细胞的稳定捕获和双向可控传输。

下面结合具体实施例对本发明所述的双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针、系统、生物传送带及传输方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

本发明光纤探针为精心设计的具有特殊探针尖端的抛物线型结构，光学显微图片如图2b所示，其前端为抛物线形，直径在长度为11.25μm的长度内由6.3μm下降到1.8μm。光纤探针前端有一个柱形针尖结构，直径和长度分别为600nm和1.8μm，也即与单个大肠杆菌的尺寸一致，以将光纤探针的出射激光更加高效的耦合进入组装的大肠杆菌串列之中。光纤探针由一根单模光纤(芯径：9μm，包层：125μm，连接头：FC/PC)经熔融拉伸法制备而成。首先采用光纤剥线钳取出光纤表面的涂覆层得到一段长度为4厘米的裸光纤，进而套上一根玻璃毛细管(内部直径：0.9毫米，管壁厚：0.1毫米，长度：12厘米)，以防止后续试验操作中光纤探针的断裂和弯曲。裸光纤露出在毛细血管外，并置于酒精灯火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，使用镊子夹住光纤探针一端，并沿轴向方向以2.5mm/s的速度进行拉伸，相应光纤直径将在3毫米的长度内从125μm减小至6.3μm。将光纤探针移开火焰上方，并将拉伸速度提至10mm/s，快速将其拉断，并在尾端形成一个圆柱形的纳米探针。重复以上步骤，制备另一根具有同样前端结构的光纤探针。图2c展示了实验中所用到的大肠杆菌的扫描电镜图片，它呈两端半球形的棒状结构，长度为2μm，直径为500nm。图2d展示了聚苯乙烯纳米颗粒的扫描电镜图片，其为直径950nm的球形。

实施例2

实验装置如图3所示，两根制备完毕的光纤探针末端分别连接两台波长为980nm的光纤激光器，并分别置于两个三维调节架上(SAM,Kohzu Precision Co.,Ltd.)，以实现步进精度为50nm的调节。探针前端相对置于大肠杆菌和纳米颗粒的混合溶液中，并操控三维调节架实现两根光纤探针的轴向对准。混合溶液通过一支注射器滴在置于显微镜二维位移台上的载玻片上，悬浮液厚度控制在15～25μm以内，以提供良好的操控环境和高清成像性能。操作过程于显微镜(Union,HISOMET II-DH II)的物镜下进行，最大放大倍数为1000倍。显微镜通过一台电荷耦合元件(CCD,Sony iCY-SHOT,DXC-S500)与电脑相连，实现图像的实时获取和视频记录。

利用本发明光纤探针，通过光纤光镊技术可在大肠杆菌溶液中组装形成一条生物传送带，实验过程如图4所示。调节两根光纤探针相对置于溶液中且光轴在一条直线上(图4a1)，水流垂直光轴向上流动(如粗箭头所示)。同时向两根光纤探针中通入波长为980nm的激光，激光功率为53毫瓦。两根光纤中间的大肠杆菌将被捕获并沿光轴方向排列。在时间为6，10秒时分别有14(图4a2)，18个(图4a3)大肠杆菌细胞被捕获，并最终在两根光纤探针中间形成一条长度为35μm的细胞串列。细胞串列的长度依赖于光纤探针的间距和激光功率，如图4b所示，在输入激光功率分别为30，40和50毫瓦时，对应生物传送带的最大长度分别为18(图4b1)，25(图4b2)和33μm(图4b3)。进一步增大激光功率，可形成长度更长的细胞串列，但激光功率应控制在120毫瓦以内，否则会对生物细胞造成损失，此时可形成的最大长度为90μm。

在形成细胞串列的基础上，作为生物可兼容的传送带能够实现纳米颗粒双向传输的功能。图5a展示了一个被捕获至传送带表面的聚苯乙烯纳米颗粒沿传输带向右传输的情形。实验过程如图5b所示，两根光纤探针中间组装形成一条长度为30μm的生物传送带，并捕获一个聚苯乙烯纳米颗粒至传送带表面(图5b1)。此时调整两根光纤探针的激光功率，左侧为60毫，右侧为30毫瓦，也即两端通过激光功率差值为ΔP＝+30mW。此时在光轴方向上，颗粒所受光散射力的合力朝右(也即沿x正方向)，并在1秒的时间内向右传输12μm(图5b2)。此时颗粒所受合力为0，故在该位置处振荡。7秒的时候(图5b3)，改变两根光纤探针的输入功率分别为45毫瓦和60毫瓦(也即ΔP＝-15mW)，此时颗粒所受合力方向将朝向x负方向，进而驱动其沿传送带向左侧进行传输，实现了单个纳米颗粒的双向输运(图5b4)。

除了单颗粒以外，本发明还能够实现多个纳米颗粒的同时双向传输。如图5c所示，两个聚苯乙烯颗粒同时捕获至长为17μm的生物传送带表面，两者边缘间距为1.1μm(图5c1)。此时调整两根光纤探针内的输入激光分别为30和40毫瓦(也即ΔP＝-10mW)，双颗粒将同时沿生物传送带向-x方向进行传输，并在1秒时间内分别传输了1.6和2.2μm(图5c2)。之所以颗粒2传输距离更大，是由于更接近光纤探针2末端，所受散射力更强，进而获得了一个更大的传送速度。进一步，改变两端光纤探针的激光功率差值为ΔP＝+10mW，两个纳米颗粒将沿+x方向分别传输5.1和4.6μm，此时两颗粒直接接触(图5c3)。进一步调整功率差为-15mW，双颗粒将同时沿-x方向传输7.8μm(图5c4)。以上实验表明，通过调控两根光纤探针的输入激光功率，可实现单个及多个聚苯乙烯纳米颗粒的同时双向传输，证明了本发明在实现纳米颗粒传输及药物靶向输运方面的潜在应用。

除传输纳米颗粒以外，本发明所述生物传送带还能够实现生物细胞的可控双向传输。图6a展示了一个大肠杆菌被捕获至生物传送带表面，当左侧光纤探针激光功率大于右侧时，被捕获的大肠杆菌细胞将朝向右侧进行传输。实验过程如图6b和图6c所示：通入两根光纤探针的激光功率分别为30和60毫瓦(也即ΔP＝-30mW)，此时被捕获的细胞将在光散射力作用下沿-x方向进行传输(图6b1)，并于5秒的时间内传送了6μm的距离(图6b2)。此时细胞到达平衡位置，并在周围环境布朗运动的影响下轻微振荡。调整激光功率差值为ΔP＝-45mW，此时细胞将再次向左侧传送，在时间为20秒和25秒时，分别传输了2.4μm(图6b3)和1.1μm(图6b4)。进一步，本发明调整激光功率差值为ΔP＝+60mW，此时细胞将沿着传送带向+x方向进行传输(图6c1)，分别在2，3和4秒时传输了0.8(图6c2)，2.6(图6c3)和1.3μm(图6c4)。因此，本发明生物传送带亦可实现生物细胞的可控双向传送。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.基于双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针的生物传送带的制备方法，所述双向传输纳米颗粒和细胞的光纤探针前端的外周面为抛物线型，且所述光纤探针的前端一体拉伸有圆柱形尖端，所述光纤探针数量为2个；所述制备方法包括以下步骤：

在含生物细胞的溶液中，调节两根光纤探针轴向对准，在两根光纤探针的末端分别输入相同波长的激光，控制含生物细胞的溶液垂直光轴流动，增大两根光纤探针的间距和激光的功率，得到串联的生物细胞传送带；

所述光纤探针的抛物线型的轴线与所述圆柱形的轴线在一条直线上，且圆柱形尖端根部的任一点与所述光纤探针前端的抛物面之间的切线与所述光纤探针轴线的夹角为40°~45°；

所述光纤探针的抛物线型前端的直径在11.25μm的长度内由6.3μm下降到1.8μm；所述圆柱形尖端的直径为0.6μm，长度为1.8μm。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述光纤探针的制备方法，包括以下步骤：

去掉单模光纤的表面涂覆层，得到裸光纤；将裸光纤外套一根玻璃毛细管，置于火焰上方进行加热，当到达光纤熔点后，沿轴向进行第一拉伸，拉伸速度为2.5mm/s，将第一拉伸后的光纤移开火焰上方，沿轴向进行第二拉伸并拉断，拉伸速度为10mm/s，得到含圆柱形尖端的光纤探针。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述单模光纤的包层直径为125μm，所述第一拉伸后，光纤直径在3mm的长度内减至6.3μm。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物细胞包括大肠杆菌细胞、乳酸杆菌细胞或红细胞。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述激光的波长为980nm，且所述激光的功率在120毫瓦以内。

6.基于权利要求1~5任一项所述制备方法得到的生物传送带双向传送细胞或纳米颗粒的方法，包括以下步骤：

通过调节两根光纤探针末端输入激光的功率，实现一个或多个细胞或者纳米颗粒的双向传送；细胞或纳米颗粒的移动方向朝向功率小的一端。

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