CN110853030B - 生物反应器病毒感染细胞质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,涉及生物反应器技术领域,方法包括计算显著图、显著图分割、连通区域标记和感染细胞标记,本发明首次将显著性方法应用在感染质量评价中,实现了病毒感染细胞状态客观评价,解决了主观评价和经验评价误差较大,不能定量分析的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物反应器技术领域,特别是涉及生物反应器病毒感染细胞质量评价方法。
背景技术
生物反应器是通过模拟酶或生物体(如细胞、微生物等)在体生长环境,来实现离体培养的一种通过生物反应或者自身代谢得到预期产物的装置。生物反应器在疫苗生产、单克隆抗体制备、医药生产、肿瘤防治、酿酒、生物发酵、有机污染物降解等方面都发挥着重要的应用。
在生物制药领域很大一部分应用生物反应器培养细胞是为了作为病毒增殖的载体,而在正常细胞背景下对被病毒感染细胞的状态自动评价难度较大。目前都是采用人主观视觉评价或依据经验在特定条件下以感染时间作为病毒感染程度评价指标。主观评价和经验评价误差较大,而且不能定量分析。
发明内容
本发明实施例提供了生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,可以解决现有技术中存在的问题。
本发明提供了生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,包括以下步骤:
利用GBVS模型计算图像的显著图;
采用二维最大熵算法计算所述显著图的最显著区域分割阈值,根据该分割阈值将显著图分割为多个分级显著区域,该分级显著区域包括各级的显著目标和非显著背景;
对各级的显著区域进行二值化并按照显著图分割区域进行合并,得到最终的分割结果;
对分割后的图像中的连通区域进行标记,构建标准细胞面积的标准细胞模板,利用该标准细胞模板对标记的连通区域采用模板匹配方法进行感染细胞标记。
本发明中的生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,方法包括计算显著图、显著图分割、连通区域标记和感染细胞标记,本发明首次将显著性方法应用在感染质量评价中,实现了病毒感染细胞状态客观评价,解决了主观评价和经验评价误差较大,不能定量分析的问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为二维灰度直方图;
图2为分级显著性区域分割算法的流程图;
图3为Oka株水痘病毒感染2BS株二倍体细胞不同感染密度下监测图像;
图4为本发明的评价方法流程图;
图5为不同感染密度下细胞图像模板匹配结果;
图6为本发明的方法与其他常规方法的对比示意图;
图7为水痘病毒感染二倍体细胞的专家标记结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供了生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,该方法的大致流程为:首先利用视觉显著性GBVS模型根据感染细胞图像颜色、亮度、方向这三个特性辨别图像局部区域的特征,计算图像的显著图,然后提出了二维最大熵算法将显著图分割为多个分级显著区域,将显著图的不均匀区域进行细分。在每个分级显著区域内进行全局阈值二值化,开闭运算等,将感染细胞区域与未感染细胞区域进行标记,通过本发明提出的标准细胞面积判定方法计算,得到黑色圆形标准细胞模板,采用模板匹配方法,将标记的感染细胞利用标准细胞模板进行还原。
GBVS模型
GBVS模型优化了计算特征图的方法,其基本思想主要包括两步:首先,在某些特征通道上形成特征图,然后以强调显著性的方式对其进行归一化,并与其他特征图组合。GBVS模型的显著图生成是从图像颜色、图像亮度、方向这三个特征进行提取,相对于Itti模型,GBVS模型的特征图是利用图谱的方式来生成,只需采用Itti模型的前四层高斯金字塔分解图即可。GBVS模型特征图生成算法主要有两个关键点,分别是构造马尔可夫矩阵以及计算其最大谱所对应的特征向量。
(1)构造马尔可夫矩阵
给定一个原始图像I,它的灰度图用M表示,M(i,j)和M(p,q)为像素点(i,j)和像素点(p,q)的灰度值,则M(i,j)与M(p,q)的差异对比性可以用两点灰度值比值的对数来表示,为:
灰度图M的像素点可以看作是有向图GA的节点,从节点(i,j)到节点(p,q)的有向边分配一个权重:
权重矩阵表示有向图GA的邻接矩阵,它反映了有向图GA中任意节点与其它节点之间的联系。
其中,
其中,σ为自由参数,取值范围一般在图像宽度的1/10到1/5之间。
如式(2)所示,节点(i,j)与节点(p,q)连接成边的权重与节点之间的差异对比性和间隔距离成正比。节点(i,j)到节点(p,q)与节点(p,q)到节点(i,j)的权重相同,即:
w1((i,j),(p,q))=w1((p,q),(i,j)) (4)
因此,GA是一个无向图,将权重矩阵按列进行归一化后就得到能够充分反映各个像素点与其周边像素点间差异对比性的马尔可夫矩阵。Harel J将其称为“organic”(有机的)方法,因为其与生物学中的视网膜神经元结构功能非常相似,以其中引起的自发行为的方式互相沟通,可以快速决定哪些场景的区域需要进行额外处理。
(2)计算最大谱对应特征向量
GBVS模型采用幂计算最大谱对应的特征向量。
设M具有n个线性无关的特征向量X1,X2,…,Xn,特征向量对应的特征值分别为λ1,λ2,…,λn,且:
|λ1|≥|λ2|≥…≥|λn| (5)
任取一非0向量U0与M作迭代:
Uk=MUk-1,k=1,2,3,… (6)
得到向量序列{Uk},k=1,2,3,…。
由于特征向量X1,X2,…,Xn线性无关,因此,n维非0向量U0可以由特征向量线性表示:
U0=a1X1+a2X2+...+anXn (7)
则有:
且有:
|λ2/λ1|≤1,|λ3/λ1|≤1,...,|λ1/λ1|≤1 (9)
设a1≠0,为非0向量,因此,当k足够大时,除第一项/>外,其他各项均趋近于0,Uk可以近似作为λ1对应的特征向量。
①具体特征向量求解算法如下:
对Mn×n任取非0向量U0,对k=1,2,3,…,依次执行循环:
其中,ai是Uk-1=(a1,a2,...,an)T的各分量。
Uk=MYk-1;
其中,ak-1是Yk-1绝对值的最大分量;ak是Uk绝对值的最大分量。
当|tk-tk-1|<ε时,令X=Yk-1,结束循环,否则继续循环。
②GBVS模型的特征图生成,具体算法如下:
将前4层高斯金字塔分解图像,即σ=[0,1,2,3]插值到σ=3尺度上;
构造出各层高斯金字塔分解图像的马尔可夫矩阵;
采用幂计算最大谱对应的特征向量;
重新插值到原图像σ=0尺度上,得到特征图。
③GBVS模型具体实现步骤如下:
依据Itti模型提取出图像颜色、图像亮度和方向特征在σ=[0,1,2,3]尺度上的高斯金字塔分解图;
采用上述算法计算出图像颜色、图像亮度和方向的特征图;
对各个特征图进行归一化N(·)处理;
对归一化后的同类特征图进行求和平均;
对所有求和平均后的特征图进行求和;
对求和后的特征图进行边缘模糊化处理,获得最终显著图。
二维最大熵算法
信息熵H是从信息源的统计特性来表征信息源的总体特征,熵值越大,表明信息源中的信息量越多,对于图像的信息熵来说,它表征了整幅图像灰度分布的聚集特性,根据信息论,信息熵可以定义为:
其中,p(x)为随机变量x的概率密度函数。
对于一幅图像来说,变量x可以是图像的灰度、梯度或者是区域灰度等特征。Kapur等在信息熵理论的基础上提出一种一维最大熵图像分割算法,该算法的基本原理是根据图像灰度的一维直方图来求取分割阈值,利用该阈值分割图像保证一阶灰度统计信息量最大化,即一维熵最大。该算法只采用了图像的像素点灰度信息,并没有利用图像的空间信息,当图像背景复杂,信噪比降低,一维直方图不呈现理想双峰分布时,该算法分割效果不理想。在此基础上Abutaleb等提出一种基于二维最大熵的图像分割算法,其原理是通过图像中各像素点的灰度信息和各点对应区域灰度均值生成二维直方图来求取最佳分割阈值,利用该阈值分割图像可以使目标相对背景信息量最大,提高分割的抗干噪能力。
假设一幅图像f(x,y)由M×N个像素组成,即x≤M,y≤N,根据图像各个像素灰度值及其8邻域平均像素灰度值生成一幅邻域窗口宽度d=3的光滑图像g(x,y):
对于图像边缘处像素的灰度值对整个图像分割影响较小,可以直接用其像素灰度值表示该像素点的邻域平均灰度值。经过光滑处理后的图像,各个像素点的灰度值均被量化成G个灰度级,分别为0,1,…,G-1。
图像中各像素点分别由一个灰度二元组(i,j)来表示,i是原图像该像素的灰度值,j是经过光滑处理后的图像该像素点的灰度值,联合概率密度为:
其中,r(i,j)为二元组(i,j)在图像中出现的概率。
因此,二维灰度直方图为Hist(i,j)=r(i,j),如图1所示。图中的二维矢量(s,t)将二维灰度直方图分为四个区域,其中A区域为图像背景区域,B区域为图像目标区域,C区域为图像噪声区域,D区域为图像边界区域。二维矢量(s,t)即为图像的分割阈值。
C区域中包含的噪声信息和D区域中包含的边缘信息,信息量少,概率较小,可以忽略。因此可以看作是采用一个二维矢量阈值将图像分成目标区域和背景区域,可以通过二维最大熵理论来计算细胞显微图像显著图的最佳分割阈值。
二维熵H为:
背景区域的概率分布可以表示为:
目标区域的概率分布可以表示为:
背景区域二维熵为:
其中,HA为背景区域的熵,具体为:
同理,目标区域二维熵为:
图像的二维熵可以表示为:
其中,HL为整幅图像的熵,具体为:
基于二维熵理论选取的最佳阈值应满足:
基于分级显著性区域分割的感染细胞评价
利用GBVS模型生成层次化的显著图,利用二维最大熵算法计算显著图的最显著区域分割阈值,分割出最显著区域,剩余的非显著区域依然受图像亮度、色彩、方向等影响较大,分割效果不理想。因此,提出一种分级显著区域分割算法,实现自适应闭合细胞感染图像区域分割,算法的实现框架如图2所示。
首先计算原图像的GBVS显著图s(x),s(x)中颜色越深表示原图像中f(x)的特征显著性越强,利用二维最大熵算法将显著图像s(x)分为1级显著区域s(M)和1级非显著区域s(m)两部分,对应原图像的灰度图像得到1级显著目标和1级非显著背景。对1级非显著区域s(m)继续利用二维最大熵算法分割,得到2级显著目标和2级非显著背景,不断重复分割,直到第n级非显著背景中无法区分显著信息,即时,完成分级显著区域分割,共将原图像按照显著性信息分成n+1个区域。
各级显著区域中背景差异很小,对各级显著区域分别进行图像区域分割,首先设置两个阈值T1=15,T2=128,以像素点(i,j)为中心,选取窗口大小为(2w+1)×(2w+1),w∈N,窗口内像素最大灰度值为gmax,最小灰度值为gmin,gmax和gmin的平均值为T,如果gmax-gmin>T1,则像素点(i,j)的阈值设为T,如果gmax-gmin≤T1,则该窗口内灰度信息比较均衡,该窗口区域可能正处于目标区域或背景区域内。之后再判断T和T2的关系,如果T<T2,将像素点(i,j)灰度值定为0,否则设为255。利用该方法遍历各级显著图像中各像素点,将原显著区域图像二值化。按照分级显著图分割区域将各级二值化图合并,并利用开、闭运算对图像噪声进行去除,得到最终分割结果。
利用改进的连通区域标记方法对分割后图像中的连通区域进行标记,利用基于数学统计学的标准细胞判定方式计算标准细胞面积,利用连通区域面积Sc与标准细胞面积Ss对比确定感染细胞是否粘连。为了更直观在图像中显示感染细胞分布情况,提出一种基于模板匹配的感染细胞标记方法,具体步骤如下:
(1)首先构建标准细胞面积的黑色圆形标准细胞模板。
(2)如果Sc≤Ss则对应原图像在连通区域质心坐标处匹配一个圆形标准细胞模板。
(3)如果Sc>Ss,计算nc=[Sc/Ss],[Sc/Ss]表示大于等于Sc/Ss的最小整数,寻找连通区域上-下、右上-左下、左-右、右下-左上4个方向最长边界。
(4)如果nc为奇数,则对应原图像在连通区域质心坐标处匹配一个圆形标准细胞模板,过质心垂直于最长边界将连通区域分为两个子连通区域,如果nc为偶数,则直接过质心垂直于最长边界将连通区域分为两个子连通区域。
(5)对两个子连通区域继续进行(2)-(4)步判断,直到全部子连通区域均匹配标准细胞模板。
(6)遍历所有连通区域,完成整幅图像模板匹配。
改进的连通区域标记方法实现步骤如下:
(1)首先从上到下从左到右对目标图像进行扫描,细胞边界就是找到的第一个未标号的二值化为1的像素点。
(2)记录该像素点为起始点,对其八邻域扫描,扫描顺序为,上、右上、右、右下、下、左下、左、左上,找到下一个未标号的二值化为1的像素点,记录该像素点为起始点继续扫描。直到在八邻域内找不到未标号的二值化为1的像素点,停止扫描。
(3)步骤(2)扫描过程中,标记所有扫描顺序为上的点,当被标记点位于连通区域最下方时,分别再以其为起始点重复步骤(2),直到找不到未标号的二值化为1的像素点为止,此时找到连通区域全部像素点。
(4)完成该连通区域标记后,跳过该连通区域继续执行步骤(1)寻找新的未标号的二值化为1的像素点为下一连通区域的起点。重复步骤(2)和步骤(3)直至标记整幅图像所有连通区域结束。
实验结果与分析
应用于水痘疫苗研发生产,对水痘-带状疱疹病毒Oka株感染人胚肺二倍体细胞2BS株感染细胞过程进行监测。应用MATLAB R2012a软件进行数据处理,分别选取不同监测时段低、中、高三种感染密度细胞图像对本发明方法进行验证,原图像及对应的GBVS显著图如图3所示。
对低、中、高三种感染密度细胞图像应用本发明方法进行处理,处理过程流程图如图4所示。
图中a为对细胞原图像计算GBVS显著图,b为本发明提出的自适应闭合感染细胞图像分级显著性区域分割算法,此处自动分为4级,c为基于分级区域的背景渲染,以最低像素值作为背景区域像素,d为闭合运算,e为本发明提出的模板匹配算法,f为整合分级模板匹配后的最终结果。
低、中、高三种感染密度细胞图像应用本发明方法进行处理,处理结果如图5所示。
分别利用Otus阈值分割、基于区域生长和分水岭分割、模糊c均值聚类分割、k均值聚类分割,以及Bernsen局部阈值分割、全局阈值分级区域检测、显著性检测后,利用本发明提出的基于模板匹配的感染细胞标定方法标定结果与本发明方法对比如图6所示。
从主观评价标定效果上看,本发明提出的算法效果明显优于传统算法,为验证本发明方法准确性,分别选取同一个细胞工厂生物反应器感染6h、24h、48h细胞图像各20幅,进行专家标记,感染区域为正样本,非感染区域为负样本,最后在图像以二值化方式呈现出来,正样本像素值为255,负样本像素值为0。对图6(a)原图像的专家正样本标记如图7所示。
利用客观评价方法测试本发明方法,分别使用计数比CR、面积比AR和误分率ME三个评价指标对算法进行客观评价。
计数比CR为算法计算感染细胞数量与专家标记感染细胞数量之比,该值越接近1,算法越准确。面积比AR为算法计算感染细胞面积与专家标记感染细胞面积之比,该值越接近1,算法越准确。与其他常规算法对比结果如表1所示。
表1本发明方法与其他常规算法对比结果
通过计数比CR、面积比AR和误分率ME三个客观评价指标分析,在感染面积评价上与专家标记平均符合率93.5%,感染细胞数量评价上平均符合率85.8%,误分率平均17.5%,优于传统其他算法。实验结果表明利用本发明方法进行病毒感染细胞评价效果较好,本发明方法实现了病毒感染细胞状态客观评价,解决了主观评价和经验评价误差较大,不能定量分析的问题。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (3)
1.生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,其特征在于,包括以下步骤:
利用GBVS模型计算图像的显著图;
利用GBVS模型计算图像的显著图具体包括:
依据Itti模型提取出图像颜色、图像亮度和方向特征在σ=[0,1,2,3]尺度上的高斯金字塔分解图;
采用GBVS模型计算出图像颜色、图像亮度和方向的特征图;
对各个特征图进行归一化N(·)处理;
对归一化后的同类特征图进行求和平均;
对所有求和平均后的特征图进行求和;
对求和后的特征图进行边缘模糊化处理,获得最终显著图;
采用GBVS模型计算特征图具体包括:
将提取出的高斯金字塔分解图的前4层,即σ=[0,1,2,3]插值到σ=3尺度上;
构造出各层高斯金字塔分解图像的马尔可夫矩阵;
采用幂计算最大谱对应的特征向量;
重新插值到原图像σ=0尺度上,得到特征图;
采用二维最大熵算法计算所述显著图的最显著区域分割阈值,根据该分割阈值将显著图分割为多个分级显著区域,该分级显著区域包括各级的显著目标和非显著背景;
根据分割阈值将显著图分割为多个分级显著区域具体包括:
根据分割阈值将显著图分为1级显著区域和1级非显著区域两部分,对应原图像的灰度图像得到1级显著目标和1级非显著背景;
对1级非显著区域继续利用分割阈值进行分割,得到2级显著目标和2级非显著背景,不断重复分割,直到第n级非显著背景中无法区分显著信息,完成分级显著区域分割;
对各级的显著区域进行二值化并按照显著图分割区域进行合并,得到最终的分割结果;
对各级的显著区域进行二值化具体包括:
设置两个阈值T1、T 2,其中T 2>T 1,以像素点(i,j)为中心,选取窗口,窗口内像素最大灰度值为g max,最小灰度值为g min,g max和g min的平均值为T,如果g max-g min>T1,则像素点(i,j)的阈值设为T,如果g max-g min≤T1,再判断T和T 2的关系,如果T<T 2,将像素点(i,j)灰度值定为0,否则设为255,利用该方法遍历各级显著目标中的各像素点,将显著目标进行二值化;
在对二值化后的显著区域合并后,还利用开、闭运算去除图像噪声;
对分割后的图像中的连通区域进行标记,构建标准细胞面积的标准细胞模板,利用该标准细胞模板对标记的连通区域采用模板匹配方法进行感染细胞标记。
2.如权利要求1所述的生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,其特征在于,对分割后的图像中的连通区域进行标记具体包括:
第1步,从上到下从左到右对目标图像进行扫描,以扫描到的第一个未标号的二值化为1的像素点作为细胞边界;
第2步,记录细胞边界像素点为起始点,对其八邻域扫描,扫描顺序为,上、右上、右、右下、下、左下、左、左上,找到下一个未标号的二值化为1的像素点,记录该像素点为起始点继续扫描,直到在八邻域内找不到未标号的二值化为1的像素点,停止扫描;
第3步,在第2步扫描过程中,标记所有扫描顺序为上的点,当被标记点位于连通区域最下方时,分别再以其为起始点重复第2步,直到找不到未标号的二值化为1的像素点为止;
第4步,完成该连通区域标记后,跳过该连通区域继续执行第1步寻找新的未标号的二值化为1的像素点为下一连通区域的起点,重复第2-3步直至标记整幅图像所有连通区域。
3.如权利要求1所述的生物反应器病毒感染细胞质量评价方法,其特征在于,利用标准细胞模板对标记的连通区域采用模板匹配方法进行感染细胞标记具体包括:
第1步,如果连通区域面积Sc小于或等于标准细胞面积S s,则对应切割后的图像在连通区域质心坐标处匹配一个标准细胞模板;
第2步,如果Sc>S s,计算n c=[Sc/S s],[Sc/S s]表示大于等于Sc/S s的最小整数,寻找连通区域上-下、右上-左下、左-右、右下-左上4个方向最长边界;
第3步,如果n c为奇数,则对应切割后的图像在连通区域质心坐标处匹配一个标准细胞模板,过质心垂直于最长边界将连通区域分为两个子连通区域;
第4步,如果n c为偶数,则过质心垂直于最长边界将连通区域分为两个子连通区域;
第5步,对两个子连通区域继续进行第2-4步的判断,直到全部子连通区域均匹配标准细胞模板;
第6步,遍历所有连通区域,完成整幅图像匹配。
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