CN110791435A

CN110791435A - 一种低温冻存保存液

Info

Publication number: CN110791435A
Application number: CN201911160787.7A
Authority: CN
Inventors: 陈章然; 肖传兴; 许鸿志; 任建林; 张帮周; 杨晓宁
Original assignee: Xiamen Chengge Biotechnology Co Ltd; Xiamen University
Current assignee: Xiamen Chengge Biotechnology Co Ltd; Xiamen University
Priority date: 2019-11-23
Filing date: 2019-11-23
Publication date: 2020-02-14

Abstract

本发明提供了一种低温冻存保存液，包括重量百分比的组份如下：3‑15%的可食用保存物质、85‑97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。在菌群移植过程中，使用甘油来保存菌群，一方面可能会患者头晕、恶心及腹泻等症状；另一方面，去除菌液中的甘油时需要反复离心洗涤，这既使操作步骤变得繁琐又使得菌体因为曝氧及机械损伤等引起活菌比例下降。本发明采用可食用保存物质，降低了患者在菌群移植过程的不良反应，同时避免了去除菌液中甘油的繁琐过程，确保活菌比例。

Description

一种低温冻存保存液

技术领域

本发明涉及一种低温冻存保存液，具体涉及一种菌群移植过程中使用的低温冻存保存液。

背景技术

近年来关于肠道菌群的研究不断涌现，肠道菌群在人类健康中的作用也越来越得到人们关注。人体肠道菌群种类多达1000余种，细菌总数多达100万亿，是宿主细胞数量的10倍。肠道菌群主要分布于结肠。结肠菌数量为10¹²个/g肠内容物，而回肠菌、空肠菌和十二指肠菌依次为10⁷个/g肠内容物、10⁴个/g肠内容物、10³个/g肠内容物。居于远端肠道内的菌群紧贴肠黏膜表面，并与上皮细胞粘连，形成细菌生物膜菌群，从而影响肠道的通透性。同时，还与营养物质的吸收、分布、代谢、排泄以及肠道免疫系统密切相关。随着人们对肠道菌群研究的加深，人体微生态系统与人类健康和疾病的关系得以更加清晰，一方面精神系统、呼吸系统、代谢系统及消化道系统等疾病的发生与发展与肠道菌群紊乱密切相关，另一方面通过干预人体肠道微生态调节紊乱的肠道菌群至平衡状态也能延缓疾病的进程，如菌群移植。

菌群移植（FMT）就是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建具有正常功能的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。在国际合作组对此词进行统一之前，少数情况下被译为“粪菌移植”、“肠菌治疗”和“肠菌移植”或“肠微生态移植”。2013年菌群移植技术已经被美国食品药品监督管理局批准用于治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染(Clostridium difficile infection，CDI)的治疗，同年也被美国《时代》杂志评选为“十大医学突破”之一。越来越多的基础科学和临床研究表明，菌群移植技术对治疗炎症性肠病、肠易激综合征、便秘、肥胖及糖尿病等慢性代谢疾病都有其独到的优势。2017年，肝病领域顶级期刊《Hepatology》以封面文章刊登了来自厦门大学附属中山医院团队关于肠菌移植治疗慢性乙型肝炎的重要研究结果。该研究中证实肠菌移植（IMT）对于乙肝e抗原（HBeAg）阳性慢性乙型肝炎的患者有一定的疗效，可以诱导那些进行了长期的抗病毒治疗后仍为HBeAg阳性患者的抗原清除。因此，菌群移植的技术和理念正在被越来越多的人认可。

迄今为止, FMT被认为是安全有效的治疗方法,FMT的治疗效果主要依赖于供体选择、移植途径及剂量等，尤其依赖于FMT操作过程中活菌的比例。而在FMT的操作中，菌群分离提取后的保存是一个非常重要的方面，如果菌体保存得当，活菌比例高，那么临床的移植效果会较好，反之不然。无论是单菌还是从健康供体分离出的菌群，当前人们主要是使用保护剂如甘油及二甲基亚砜保存在-80℃的低温条件下以避免细胞内的结合水等物质形成冰晶破坏细胞，而由于菌群移植菌液需进入人体的特殊性及安全性，甘油则作为目前主要的菌群移植用冻存溶剂。

甘油又名丙三醇,是一种无色、无臭、味甘的粘稠液体，其具有保水作用，广泛用于菌体的低温保存。

在菌群移植过程中，使用甘油来保存菌群，一方面可能会患者头晕、恶心及腹泻等症状；另一方面，去除菌液中的甘油时需要反复离心洗涤，这既使操作步骤变得繁琐又使得菌体因为曝氧及机械损伤等引起活菌比例下降。为了避免以上问题，需要找到可以替代甘油、直接食用的其它冻存保护剂，并确保其能维持较好的菌体保存效果。但目前国内外尚无相应的文章或专利进行介绍，因此本专利以活菌比例及细菌菌群结构的角度比较分析不同冻存保护剂与甘油的情况，从而找到可以替代甘油的低温冻存保护剂方案。

发明内容

本发明提供了一种低温冻存保存液，以至少解决现有技术中患者在菌群移植过程的不良反应，同时去除菌液中甘油的繁琐操作过程会导致活菌比例下降的问题。

本发明提供了一种低温冻存保存液，包括重量百分比的组份如下：3-15%的可食用保存物质、85-97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。

进一步地，所述可食用保存物质由甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶等体积混合而成。

进一步地，所述可食用保存物质为山梨糖醇。

更进一步地，所述低温冻存保存液包括7%-12%的山梨糖醇。

进一步地，所述生理盐水为0.9%浓度的NaCl水溶液。

本发明还公开了一种使用上述低温冻存保存液制备的菌群移植物，由下列重量份的原料组成：菌种3.5-5重量份、低温冻存保存液0.7-1.1重量份。

进一步地，所述菌种为粪菌。

更进一步地，所述粪菌的提取方法如下：取100~200g的供体粪便溶解于750mL~1L的0.9%NaCl溶液中，使用粪便分析前处理仪对其进行处理，去除残渣，获得粪菌30-40g。

本发明与现有技术相比，采用可食用保存物质与生理盐水替换甘油，避免了患者在菌群移植过程的不良反应。同时，本发明的菌群移植物可直接使用于移植过程，避免了去除菌液中甘油的过程，提高活菌的比例。

附图说明

图1为本发明实施例的实验流程图；

图2为菌体在冻存不同时间梯度下的活菌比例；

图3为菌群在不同冻存保护剂下冻存1周的活菌比例；

图4为菌群在不同冻存保护剂下冻存1月的活菌比例；

图5为菌群在不同冻存保护剂下冻存3月的活菌比例；

图6为菌群在不同冻存保护剂下不同冻存时间下的菌群多样性比较；

图7为菌群在不同冻存保护剂下冻存3个月后门水平的菌群组成；

图8为菌群在不同冻存保护剂下冻存3个月后科水平的菌群组成。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。

本发明实施例中共涉及8种冻存保护液处理，包括甘油组、山梨糖醇组、葡萄糖组、蔗糖组、蜂蜜组、脱脂牛奶组、混合液组（山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、蜂蜜及脱脂牛奶等体积混合）及空白对照组。共涉及7个时间点，即将分体的菌体分别按照8种冻存保护液处理后置于-80℃条件下冻存0天，1周，2周，3周，1月，2月及3月后进行流式细胞活菌计数及16S rDNA测序分析，评估各保护液对细菌的冻存保护效果。

其中，甘油组中低温冻存保存液含8%-15%的甘油（本实施例中甘油含量为8%）、山梨糖醇组中低温冻存保存液含7%-12%的山梨糖醇（本实施例中山梨糖醇含量为7%）、葡萄糖组中低温冻存保存液含6%-10%的葡萄糖（本实施例中葡萄糖含量为6%）、蔗糖组中低温冻存保存液含3%-6%的蔗糖（本实施例中蔗糖含量为3%）、蜂蜜组中低温冻存保存液含8-12%的蜂蜜（本实施例中蜂蜜含量为8%）、脱脂牛奶组中低温冻存保存液含8-12%的脱脂牛奶（本实施例中脱脂牛奶含量为8%）、混合液组中低温冻存保存液含8-12%的可食用保存物质（可食用保存物质由山梨糖醇、葡萄糖、蔗糖、蜂蜜及脱脂牛奶等体积混合）（本实施例中可食用保存物质含量为8%）。

本实验例具体实施方案：

1.粪便采集：选取健康供体，将收集的供体粪便100~200g溶解于750mL~1L的0.9%NaCl溶液中，经承葛生物科技有限公司生产的粪便分析前处理仪TG-01及配套耗材处理去除残渣，得到粪菌30-40g；

2.将得到的粪菌等份分为8组（甘油组、山梨糖醇组、葡萄糖组、蔗糖组、蜂蜜组、脱脂牛奶组、混合液组、空白组），分别各组中加入1mL的低温冻存保存液进行溶解，而粪菌空白组以生理盐水溶解的作为对照；

3.将步骤2中得到的溶液置于-80℃条件下，设置时间梯度为0天，1周，2周，3周，1月，2月及3月，其中0天为新鲜分离的粪菌，每种条件设置3个样品重复；

4. 取出相应时间节点的菌体溶液，对菌体进行流式细胞计数，使用的试剂盒为Live/Dead ® BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit (L34856)。具体的操作步骤为：1)将菌液进行适度稀释（稀释100倍，10μl加到990μl）的浓度调整到OD₆₀₀=0.5左右；2)取987μl的0.85% NaCl溶液于2ml离心管中；3)分别加入1.5μl的3.34 mM SYTO9及30mM PI染料；4)加入10μl经稀释的肠菌液；5)室温黑暗条件下孵育15min；6)流式参数设置后再观察，统计活菌/死菌比值情况；

5.取出相应时间节点的菌液（0天，1周，2周，3周，1月，2月及3月），使用Power fecalDNA isolation kit（Qiagen）直接提取DNA；

6.提取的DNA经过Multiskan™ GO 全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific, US）测定其浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，对于少部分低浓度或降解严重的DNA样品，重新提取直到DNA满足后续实验需要。采用两端都加有不同Barcode的引物对，对样品细菌的16S rRNA基因的V3-V4区进行PCR扩增从而进行HiSeq的Paired-End测序。PCR的反应体系（20 μl）为：10 μl 的KAPA HiFi HotStart ReadyMix（KAPA Biosystems,USA）、2μl 的DNA（约 30 ng/μl）和 1μl 的正反向引物（10 μM）。16S正向引物序列为5’-CCTACGGGNBGCASCAG-3’，反向引物序列为5’-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3’。PCR反应条件为：95℃预变性3 min，然后是 30个循环的95℃变性20 sec、60 ℃退火30 sec、72℃延伸30sec，最后再72 ℃延伸10 min。采用AxyPrep™ PCR Cleanup Kit (Axygen, USA) 试剂盒对PCR产物进行纯化、洗脱，用Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, US）进行浓度测定，之后吸取60ng的每个样品混合在一起，组成一个测序样品。这个混合样品进行HiSeq2000的250 bp Paired-End测序；

7. 测序下机的数据，利用flash对Hiseq测序获得的原始双端Paired-end序列进行序列拼接。接着利用cutadapt对拼接好的序列去除引物，并去除质量较差以及出现多个N的序列。拼接质控好的序列利用usearch去除嵌合体,接着进行OTU聚类。利用uclust对聚好的OTU序列进行种属分类鉴定。

8. 在上一步得到的OTU表格基础上，接着采用R中的vegan包将样品重抽样到相同的测序深度，然后再利用vegan程序包计算每个样品的alpha多样性，包括香农指数H、多度估计值Chao1与Pielou's均匀度指数J。采用Wilcox.test方法对各组进行统计比较。使用ggplot2工具包进行细菌群落结构及组成的分析。

在考察各保存方式效果（活菌比例、菌群多样性及结构）时，都是将各冻存保护液成分与甘油结果进行比较，差异越小表明保存效果越好；同时将各保存液实验组结果与第0天时的情况进行比较，评估冻存保护剂在不同时间范围内的保存效果。

从活菌比例角度来看，随着冻存时间的延长，活菌的比例整体呈下降趋势。其中第0天的肠菌活菌比例平均80%，最高可达90%以上，冻存1周后平均活菌为60%，而冻存3个月时活菌比例仍维持在60-70%(图2)；菌群冻存1周时，山梨糖醇维持活菌比例最高（图3），而菌群冻存1个月（图4）及3个月（图5）时，山梨糖醇对活菌比例维持的效果基本与甘油持平。由于山梨糖醇是一种常见的食品添加剂，低浓度时对人体无害，因此其在可食用性及维持菌群高活性方面具有较好的优势。

从细菌多样性来看（图6），葡萄糖、蔗糖、蜂蜜、脱脂牛奶、甘油及混合液冻存保护液使用过程中的多样性指数（香浓指数）变化不明显，比较稳定。而山梨糖醇在冻存菌液1周时，菌体多样性指数最高，在使用2个月时，H指数可达到3.4，但到第三个月时菌群多样性指数出现波动。

从菌群的组成来看（图7和图8），所有冻存保护剂冻存过程中，主要的细菌门类为Bacteroidetes,Firmicutes, Proteobacteria及Synergistetes。其中未使用任何冻存保护剂组中，拟杆菌门含量最高而厚壁菌门细菌最低；甘油冻存菌体3个月后含有较高比例的拟杆菌而较少的厚壁菌门；山梨糖醇冻存后则含有最高比例的拟杆菌门细菌和最少的厚壁菌门细菌（图7）。主要的细菌科为Prevotellaceae, Bacteroidaceae,Enterobacteriaceae, Lachnospiraceae,Sutterellaceae, Veillonellaceae及Acidaminococcaceae。其中山梨糖醇使用下的Prevotellaceae菌含量最高，Sutterellaceae菌含量最低(图8)。而诸多研究已经报道Prevotellaceae科下的Prevotella属细菌为有益细菌，因此可确定山梨糖醇能够长期性维持有益细菌在粪菌中较高的比例及活性。

本发明实施例采用山梨糖醇替换甘油，实现长时间有效保护细菌活性的效果，同时避免了患者在菌群移植过程的应激反应。此外，本发明实施例的菌群移植物可直接使用于移植过程，避免了去除菌液中甘油的过程，提高活菌的比例。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。

Claims

1.一种低温冻存保存液，其特征在于，所述低温冻存保存液包括重量百分比的组份如下：3-15%的可食用保存物质、85-97%的生理盐水，所述可食用保存物质选自甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述可食用保存物质由甘油、葡萄糖、蜂蜜、山梨糖醇、蔗糖、脱脂牛奶等体积混合而成。

3.根据权利要求1所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述可食用保存物质为山梨糖醇。

4.根据权利要求3所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述低温冻存保存液包括7%-12%的山梨糖醇。

5.根据权利要求1所述生物样品冻存保存方法，其特征在于，所述生理盐水为0.9%浓度的NaCl水溶液。

6.一种使用权利要求1-5所述低温冻存保存液制备的菌群移植物，其特征在于，所述菌群移植物由下列重量份的原料组成：菌种3.5-5重量份、低温冻存保存液0.7-1.1重量份。

7.根据权利要求6所述菌群移植物，其特征在于，所述菌种为从健康供体分离的粪菌。

8.根据权利要求7所述菌群移植物，其特征在于，所述粪菌的提取方法如下：取100~200g的供体粪便溶解于750mL~1L的0.9%NaCl溶液中，使用粪便分析前处理仪对其进行处理，去除残渣，获得粪菌30-40g。