CN110709417A - 具有突变人IgG4的多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含突变人IgG4的多肽，该突变人IgG4能够增加与包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的FcγRIIb/c(CD32b/c)而非FcγRIIa(CD32a)的结合及其激活。更具体地，本发明涉及用于预防和/或治疗自体免疫疾病或过敏症的多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以更高的结合亲和力结合人CD32b/c，如在权利要求中进一步定义的。

Description

具有突变人IgG4的多肽
本发明涉及包含突变人IgG4的多肽，该突变人IgG能够增加与包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif,ITIM)的FcγRIIb/c(CD32b)而非FcγRIIa(CD32a)的结合及其激活。更具体地，本发明涉及包含用于预防和/或治疗自体免疫疾病或过敏症的多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4多肽，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，如权利要求中进一步定义的。
背景技术
为了正确选择抗体同种型，在以后将抗体用作治疗药物时必须考虑几点(Salfeld,2007)。目前所有获批的治疗性抗体均为小鼠、人或混合来源的G-型免疫球蛋白或者衍生物。四种同种型均通过不同特征来进行表征(表1)。
表1：四种IgG同种型的关键特征
Figure BDA0002298886870000011
(aIgG2的同二聚体对于给定抗原是四价的，但异二聚体也是需要的)。
IgG3的特征在于更长和更灵活的铰链结构域以及存在11个重链间二硫键(vs.对IgG1和IgG4而言为2个；对IgG2而言为4个)。尽管具有高的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependentcellular cytotoxicity,ADCC)潜力，通常不选择IgG3用于治疗性抗体的研发，这可能是因为其半衰期短、扩展的铰链区对蛋白质水解敏感以及广泛的同种异型多样性。经常选择IgG1用于杀灭致病性细胞(具有过表达的靶抗原)或病毒。迄今为止，大多数现有的治疗性嵌合抗体、人源化抗体和人抗体都基于IgG1/κ骨架。
IgG2和IgG4显示了特定的结构和功能特征，例如动态结构重排，这些在IgG1中没有观察到。IgG4同种型相对于IgG1同种型的优点是IgG4不介导任何效应子功能，例如，补体介导的溶解(CML)以及抗体依赖性细胞毒性。
IgG4的缺点之一是形成半分子。在体内，IgG4抗体分泌为二硫键连接的四聚体和半分子，其通过强的非共价相互作用连接。在非还原条件下，非共价结合的IgG4分子在SDS-PAGE上解离成半分子。然而，与还原剂(例如，二硫苏糖醇)一起温育是需要的(Bloom etal.,1997)。在体外和体内，半分子能结合表位，但无需交联即可阻断它。因此，半分子的形成导致较少的功能性抗体和降低的治疗作用。通常，通过在体外进行SDS-PAGE-分析或基于芯片的凝胶电泳来检测半分子的形成(Forrer et al.,2004)。
然而，IgG4可经历Fab臂交换。在Fab臂交换期间，两个IgG4四聚体结合并交换一个由重链和轻链组成的半分子，得到双特异性抗体(van der Neut Kolfschoten et al.,2007；Rispenset al.,2009)。Fab臂交换在使用IgG4抗体的治疗中可能是一个问题，因为它们不仅能够与彼此进行Fab臂交换，还能够与内源IgG4进行Fab臂交换。体内发生IgG4 Fab臂交换的机制需要血液的还原环境(由0.8+0.2mM GSH(Michelet et al.,1995)引起)，或者需要细胞表面的还原环境以促进铰链区内重链间二硫键的断裂(van der NeutKolfschoten et al.,2007)。例如，那他珠单抗(以商品名
Figure BDA0002298886870000021
销售)，一种临床不稳定IgG4，在体内和体外经历Fab臂交换(Labrijn et al.,2009)。Fab臂交换能导致双特异性抗体和一价抗体。因此，不再可能进行交联。由于以上缺点，IgG4同种型通常不是开发治疗性抗体的首选。
已证实Ser228突变为Pro稳定了IgG4，因为不能容易地形成链内二硫键(Schuurman et al.,2001)。例如，Mylotarg是一种具有S228P突变的治疗性IgG4-抗体，其在体内和在小鼠模型中均阻断Fab臂交换(Labrijn et al.,2009)。
然而，现有文献数据显示，除了IgG4铰链区之外，与IgG1 Fc-部分相比，IgG4 Fc-部分的CH3结构域中的氨基酸差异对Fab臂交换而言是非常重要的(van der NeutKolfschoten et al.,2007)。IgG1和IgG4的CH3结构域的区别在于5个氨基酸残基，其中仅一个氨基酸在CH3结构域间界面上。这个氨基酸位于409位，并且其在IgG1和IgG4同种型中分别是赖氨酸(K409)和精氨酸(R409)。因此，K409似乎在防止IgG1分子构建半分子上具有显著作用。
经由增加与CD32b的结合或其交联的免疫抑制方法已获得专利保护并且已经被描述，例如吸引受体的单克隆抗体(WO 2009/083009)、双特异性单克隆抗体(例如，抗CD79B/抗CD32B，Veri et al.,2010)和“双功能性”单克隆抗体(例如，抗CD19和IgG1-S267E/L328F的经修饰的Fc区，Xencor,Horton et al(2012)，以及对CD32a和CD32b均具有增加的亲和力的PMID:22257644)。Mimoto et al.(2013)描述了IgG1的另一种经修饰的Fc区，其使用IgG1-P238D/L328E，仅增强了CD32b亲和力。
WO 2014/144542A2公开了抑制补体系统的生物活性肽氨基酸序列，并进一步公开了这些生物活性肽氨基酸序列可与人IgG4融合。如此修饰的抗体可用于治疗银屑病。
Vidarsson et al.:IgG Subclasses and Allotypes:From Structure toEffector Functions.Frontiers in Immunology,Vol.5(2014)证实了IgG4和IgG1均对抑制性Fc受体CD32b具有结合亲和力。
Chu et al.Molecular Immunology 45(15):3926-3933(2008)认为IgG1-Fc对CD32b具有高结合亲和力，并且可在多种自体免疫疾病中具有广泛适用性。
本公开的目的是提供具有改进特性(诸如增加的与抑制性Fc受体CD32b/c的结合以及增加的该抑制性Fc受体CD32b/c的激活)的治疗性IgG4分子。在预防和/或治疗自体免疫疾病或过敏症的背景下，如果定期施用，则预计本发明的治疗性IgG4分子导致改善的治疗作用。
发明概述
令人惊讶的是，发现IgG4的恒定区中的定点突变R409K增加了IgG4抗体对CD32a和CD32b/c(二者均为FcγRIIa/b受体)的亲和力。作为典型的IgG4分子，预期其不会显示与人Fcγ受体(如CD16a、CD32a、CD32b/c和CD64)的任何亲和力或功能性相互作用。此外，当进行功能性分析时，可能显示仅CD32b/c能被这种抗体激活。用作对照的不同的野生型人IgG1和IgG4抗体显示对CD32b/c的亲和力明显较低。
CD32b/c在其胞内结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，并且用作抑制性的受体(PMID:14613290)。CD32b/c主要存在于B细胞上，但是也存在于CD14+单核细胞和髓系树突状细胞(mDC)与浆细胞样树突状细胞(pDC)上，并且在保持耐受性方面起重要作用(PMID:17312177)。由于在激活的B细胞中触发CD32b/c依赖性抑制信号通路会导致对B细胞增殖和Ig分泌的抑制(PMID：20506263)，如上所述的稳定的人IgG4因此可用作炎性或自体抗体介导的自体免疫疾病(如，例如SLE、银屑病、多发性硬化和类风湿性关节炎)或者过敏症中的治疗剂。
当对CD32b/c受体具有高亲和性和激活潜力的突变人IgG4 mAb用于治疗性目的时，在其被固定于其他免疫和内皮细胞(取决于其特异性)之后或在与特异性(抗药物)抗体复合之后，其可在体内诱导CD32b/c依赖性信号传导，在基于抗体的治疗期间，在抗体施用之后有时会出现这种情况。另外，由对细胞表面受体具有特异性的突变人IgG4骨架组成的抗体可用于特异性地抑制其激活，所述细胞表面受体在表达CD32b/c的细胞上表达。这种抗体可结合至指定的细胞特异性受体(例如，PDC上的CD304、CD303、ILT7、CD123，或B细胞上的CD19、CD20、BCR，或单核细胞上的CD14、CD11c)，并同时结合和交联相同细胞的细胞表面上或者在另一细胞的细胞表面上的CD32b/c，其与抗体最初结合的细胞相互作用。
因此，认为上述目标通过如下多肽得到解决：使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一种在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c，如在权利要求中进一步定义的。类似地，还认为上述目标通过提供如下多肽得到解决：使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一种在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者过敏症的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c，如在权利要求中进一步定义的。
发明详述
在造血系统的细胞中广泛表达的Fcγ受体(FcγR)，与IgG抗体的Fc部分结合。在人类系统中，FcγR家族被分为三个主要类别，FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，它们各自显示不同的结构和功能特性。在人类中，每组受体由2-3种密切相关的基因编码，它们被指定为A、B和C。免疫复合物与激活的FcγR(即，CD16、CD32A和CD64)的结合诱导了磷酸化级联反应，这导致以钙通量和细胞因子释放为特征的细胞激活。相反，由B细胞表达的抑制性FcγR(CD32b/c)的触发诱导凋亡。与此不同，CD32b/c与激活的受体(诸如B细胞受体)的伴随刺激(concomitant stimulation)导致对钙通量和增殖的抑制，即，阻断细胞激活(Nimmerjahn和Ravetch,2008)。CD32b/c在B细胞上和在多种其它细胞类型(诸如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和DC)上表达。CD32b/c，作为唯一在受体的胞内部分包含ITIM结构域的抑制性受体，被认为在数个调节过程中是重要的。最近的数据表明CD32b/c信号传导障碍与诸如SLE的自体免疫病症相关(Blank et al.,2005)。
随着许多作为治疗剂的不同新型单克隆抗体(mAb)的开发，FcγR相互作用又成为了研究焦点。诸如吞噬作用、炎性细胞因子诱导或趋化因子释放以及抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的若干mAb效应子功能均由Fc部分与表达Fcγ的免疫细胞的相互作用所介导，因此形成了mAb的治疗潜力。例如，在最近的研究中，当用超激动剂抗CD28 mAb治疗时FcγR相互作用促进了T细胞激活(Bartholomaeus et al.,2014)，但是在使用激动剂抗CD4 mAb的另一项研究中，需要FcγR相互作用来诱导mAb修饰T细胞的CDD4下调(Vogel et al.,2015)。
本发明人惊奇地发现可通过向IgG4的恒定区中引入突变来增加人IgG4与人CD32b/c Fcγ受体的结合和人CD32b/c Fcγ受体的激活。更具体地，本公开提供了一种多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一种在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c，如在权利要求中进一步定义的。
自体免疫疾病的实例是爱迪生氏病(Addison's disease)、无丙种球蛋白血症斑秃(agammaglobulinemia alopecia areata)、淀粉样变性、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自体免疫性肝炎、自体免疫性内耳病(AIED)、轴突&神经元神经病变(AMAN)、白塞病(Behcet's disease)、大疱性类天疱疮、卡斯特莱曼病(CD)、乳糜泻、查加斯病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多病灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss)、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、科干综合征(Cogan'ssyndrome)、冷凝集素病、先天性心脏阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST综合征、克罗恩病、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经炎)、盘状红斑狼疮、德雷斯勒综合征、子宫内膜异位、嗜酸细胞性食管炎(EoE)、嗜酸细胞性筋膜炎、结节性红斑、原发性混合性冷球蛋白血症(essential mixed cryoglobulinemia)、埃文斯综合征(Evans syndrome)、纤维肌痛症、纤维性肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、巨细胞性心肌炎、肾小球肾炎、古德帕斯彻氏综合征、肉芽肿性多血管炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、亨-舍二氏紫癜(HSP)、妊娠疱疹或妊娠性类天疱疮(ΜG)、低丙球蛋白血症、IgA肾病、IgG4-相关性硬化病、包涵体肌炎(IBM)、间质性膀胱炎(IC)、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、青少年肌炎(JM)、川崎病、兰伯特-伊顿综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓(Lichen planus)、硬化性苔藓(Lichen sclerosus)、木样结膜炎(ligneousconjunctivitis)、线状IgA病(LAD)、红斑狼疮、慢性莱姆病、美尼尔氏病、显微镜下多发性血管炎(MPA)、混合性结缔组织病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren's ulcer)、穆-哈二氏病(Mucha-Habermanndisease)、多发性硬化(MS)、重症肌无力、肌炎、发作性嗜睡症、视神经脊髓炎、中性粒细胞减少症、眼部瘢痕性类天疱疮、视神经炎、复发性风湿症(PR)、PANDAS(与链球菌属相关的小儿自体免疫性神经精神疾病)、副肿瘤性小脑变性(PCD)、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、帕罗二氏综合征、睫状体扁平部炎(周围葡萄膜炎)、Parsonnage-Turner综合征、天疱疮、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(PA)、POEMS综合征、(多神经病、器官巨大症、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病、皮肤改变)、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗死后综合征、心包切开术后综合征、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、孕酮性皮炎、银屑病、银屑病性关节炎、纯红细胞再生障碍(PRCA)、坏疽性脓皮病、雷诺氏现象、反应性关节炎、反射交感性营养不良、莱特尔氏综合征、复发性多软骨炎、多动腿综合征(RLS)、腹膜后纤维变性、风湿热、类风湿性关节炎(RA)、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、干燥综合征、精子和睾丸自体免疫、僵人综合征(SPS)、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)、交感性眼炎(SO)、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血小板减少性紫癜(TTP)、托-亨综合征(THS)、横贯性脊髓炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎(UC)、未分化结缔组织病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病(现在名为肉芽肿性多血管炎(GPA)。然而，特别考虑的患者组是那些与健康受试者相比显示CD32b表达调节异常的那些人受试者。例如，人受试者可表现出CD32b 695T等位基因和/或CD32b基因的2B.4单体型。或者，人受试者可具有CD32b 695C等位基因和/或CD32b基因的2B.1单体型。
认为诸如B细胞、PDC或单核细胞的免疫细胞上的CD32b/c的激活会导致这些细胞的下调。因此，预期包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4的多肽可有利地用于预防或治疗炎性自体免疫疾病。自体免疫疾病的特征还可在于与健康受试者相比其自体抗体的血浆水平增加。在进一步的实施方式中，自体免疫疾病的特征可在于与健康受试者相比I型干扰素生产增加，诸如干扰素-α的生产增加。
在优选实施方式中，自体免疫疾病选自由银屑病、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎和多发性硬化组成的组；在更优选的实施方式中，自体免疫疾病是全身性红斑狼疮或银屑病。
自体抗体免疫复合物经由如下方式激活多种免疫细胞，诸如树突状细胞和B细胞：与激活的Fc受体CD32a结合，随后内化，并激活模式识别受体，例如Toll样受体。这又导致促炎性细胞因子(诸如1型干扰素，特别是干扰素-α)的生产增加，这再次触发了自体抗体的生产。如下面的实施例中所示，本文中公开的IgG4变体不仅与野生型IgG4相比而且还可能与其他免疫球蛋白相比以高(或较高)亲和力与抑制性Fc受体CD32b/c结合。如实施例中所示，仅免疫球蛋白与CD32b/c结合不能自动地导致(改善的)激活。相反，本文的实施例显示，本文公开的IgG4变体特别适合于激活抑制性Fc受体CD32b/c，从而经由CD32a抑制树突状细胞和B细胞的激活。如在下面的实施例中进一步证实的，具体地，其中多肽包含识别BDCA-2(CD303)的表位的IgG4的实施方式特别有利于治疗上述疾病。这是因为证实了靶向BDCA-2会抑制1型干扰素生产，特别是干扰素-α生产。因此，合理地证明了本公开的多肽可有利地应用于新的治疗应用中，所述新的治疗应用涉及在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的CD32b/c，特别是其中多肽包含识别BDCA-2(CD303)的表位的IgG4。如实施例中所讨论的，银屑病是一种自体免疫疾病，其中干扰素-α和自体抗体在发病机制中起重要作用。这同样适用于上面所述的其他自体免疫疾病。例如，通常认为干扰素-α是人全身性红斑狼疮的主要致病因素，如以下文献中所综述的：Niewold,Journal ofIntereron&Cytokine Research 31(12),887-892(2011)。如其中第880页上的图1所示，与Fc受体结合并被其内化的自体抗体免疫复合物在发病机制中起关键作用。
这种关键作用被以下文献证实：Means et al.,J Clin Invest.115(2),407-417(2005):Correlation between disease severity and IFN-αlevels in SLE patientsand mitigation of disease in a mouse model of SLE by disruption of IFN-αsignaling have implicated IFN-αin SLE pathogenesis。据推测，SLE患者血清中高水平的IFN-α在SLE对自体抗原的耐受性丧失中起作用。已证实SLE患者血清中的IFN-α驱使单核细胞成熟为树突状细胞。据推测这些mDC吞没凋亡细胞和激活自体反应性T细胞和B细胞的能力驱动了SLE中的自体免疫反应。最后证实了用来自SLE患者的含DNA的免疫复合物通过TLR9/CD32途径刺激PDC诱导了PDC对IFN-α的强表达。
值得注意的是，还能证实，抗BDCA-2抗体能够抑制SLE患者中的IFN-α生产(Blomberg et al.Arthritis&Rheumatism,48(9),2524-2532(2003)；Dzionek et al.JExp.Med.194(12),1823-1834(2001))，并且SLE患者中干扰素-α活性的减少具有治疗利益(参见西法木单抗(一种抗IFN-α单克隆抗体)的临床试验NCT00299819)。因此，不仅通过本文中下面所示的实验数据，而且参考了SLE中已知作用和已知发病机制证实了本公开多肽的治疗适用性。
根据本文中提供的关于银屑病和SLE的事实和证据，本发明人认为本文所证实的效果和治疗利益能够外推到任何上述疾病，特别是特征在于与健康受试者相比自体抗体血浆水平增加和/或特征在于与健康受试者相比I型干扰素生产增加(诸如干扰素-α生产增加)的自体免疫疾病，诸如，类风湿性关节炎和多发性硬化，或者上文公开的自体免疫疾病中的任何其他疾病。类似的考虑也适用于过敏症，其特征在于高IgE滴度，导致IgE-抗原免疫复合物，这又可激活携带CD32的B细胞或单核细胞。多肽可为任何多肽，只要其包含至少一个包含R409K取代的人IgG4恒定区。例如，多肽可为能够与CD2b/c结合并包含本公开的突变IgG4恒定区的融合蛋白。例如，本文公开的突变人IgG4与配体分子或可溶性受体分子融合。或者，多肽可包含两个Fc区，例如两个人IgG4 Fc区(例如，尾对尾融合)，或与人IgG1 Fc区融合的人IgG4 Fc区。
然而，如本文所证实，(治疗)效果同样是通过本文公开的多肽本身获得的，并且不依赖于与生物活性肽氨基酸序列的融合，如在WO 2014/144542A2中所述的。在后者中，公开了在特定肽序列背景下的药物效果，所述特定肽序列例如与IgG4融合。因此，在优选实施方式中，多肽不与用作药物活性剂的生物活性肽氨基酸序列融合。
在本公开的多肽中还考虑了带有本公开的突变IgG4恒定区的单体抗体，例如其中人IgG4恒定区与另一个同种型或种类的抗体的可变区融合的嵌合体。
在特别优选的实施方式中，人IgG4包括进一步的取代，例如被认为会进一步稳定人IgG4分子的取代。这样的取代在本领域中是已知的。特别考虑的是其中使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4进一步包含在241位处的脯氨酸(241P)的实施方式。在另一个实施方式中，使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4还包含在228处的脯氨酸(228P)。在另一个实施方式中，使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4进一步包含在228位处的脯氨酸(228P)和在241位处的脯氨酸(241P)。
在某些实施方式中，本公开的突变IgG4恒定区相对于SEQ ID NO：1的全长具有至少95％的序列同一性，更优选相对于SEQ ID NO：1的全长具有至少96％的序列同一性，更优选相对于SEQ ID NO：1的全长具有至少97％的序列同一性，更优选相对于SEQ ID NO：1的全长具有至少98％的序列同一性，和最优选相对于SEQ ID NO：1的全长具有至少99％的序列同一性。
在一个特殊的实施方式中，使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4包括在对应于409位的位置处具有赖氨酸(409K)和在对应于241位的位置处具有脯氨酸(241P)的SEQ IDNO：1的氨基酸序列(hIgG4)。
通常，当比对序列之间的序列同一性为相对于SEQ ID NO:1的全长为至少为x％时，氨基酸序列与SEQ ID NO：1具有“至少x％的同一性”。可使用公开可获得的计算机同源性程序(例如NCBI主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi上提供的“BLAST”程序)，使用其中提供的默认设置来进行这样的比对。
与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，带有R409K取代的人IgG4 Fc能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c。如本文所用，表达方式“与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c”表示，当将多肽和野生型抗体进行以下测定时，与不相关的野生型人IgG4和野生型人IgG1(或者包含所述野生型人IgG4和野生型人IgG1而不包含带有R409K突变的人IgG4的多肽)相比，包含至少一个带有R409K取代的人IgG4 Fc的多肽显示了统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力：
将ELISA板用5μg/mL重组Fcγ受体IIb(例如R&D Systems，1875-CD-050)的包被缓冲液在4℃下包被过夜。用1x PBS 0.05％Tween 20洗涤包被的板3次，并用在1x PBS中的5％BSA封闭。将多肽和抗体以连续2倍稀释的抗体溶液以50μL/孔(或相当于每孔50μg人IgG4的相同摩尔浓度)应用于ELISA板，并在室温下温育1小时。作为空白对照，也将各个抗体浓度应用于缺乏包被的Fcγ受体的孔，以从产生的信号中减去非特异性结合。洗涤后(参见上文)，将1x PBS中的检测抗体(例如，抗人κ-HRP，FE 110316.07，以1:4000的比例；或另一种可商购的抗IgG4-HRP缀合抗体或抗IgG1-HRP缀合抗体，按照制造商说明的稀释度使用)以50μL/孔应用，并在室温下再次温育1小时。如上所述再次洗涤后，为测定显影，50μL/孔加入TMB(CH111027.37)，并在约5分钟后以50μL/孔使用10％H2SO4来终止。然后通过ELISA读取器在450nm波长下分析显影的板。为进一步提高可比性，还可以使用不同已知量的IgG4和/或IgG1来制备标准曲线，然后将其与450nm波长的吸光度相关联。
或者，本文所述的在409位处具有赖氨酸(使用根据Kabat等人的EU索引，为409K)的人IgG4能够以比野生型人IgG1和/或野生型人IgG4的结合亲和力高至少2倍，优选至少5倍，和最优选至少10倍的更高结合亲和力与人CD32b/c结合，如通过使用上述测定所确定的。
如实施例中所示，与野生型人IgG4和/或野生型人IgG1相比，人IgG4 409K显示出对人CD32b/c的激活增强。如本文所用，表达方式“与野生型人IgG4和/或野生型人IgG1相比，人CD32b/c的激活增强”旨在表示本发明的多肽对CD32b/c的激活比野生型人IgG4和/或野生型人IgG1(或包含野生型人IgG4和/或野生型人IgG1而不包含人IgG4 409K的相应多肽)更强。可以通过使用以下激活测定来测试此特征。从该定义可以明显看出，与CD32b/c的结合不会自动导致人类CD32b/c的激活增强。实际上，本发明的令人惊讶的方面是，本公开的多肽在与受体结合后触发CD32b/c的激活增强。
为检测不同的mAb结合和交联各种FcγR的能力，将mAb包被到塑料上，并添加用融合蛋白转染的鼠胸腺瘤细胞系BW5147，所述融合蛋白由CD32b的胞外结构域和鼠T细胞受体的跨膜和胞内ζ-链组成。如果mAb与所检测的FcγR相互作用，则会诱导鼠IL-2生产。将Fcγ-CD32b/c-相互作用的读数视为绝对IL-2水平。用野生型IgG4和/或IgG1(或包含野生型人IgG4和/或野生型人IgG1而不包含人IgG4 409K的相应多肽)的对照mAb进行的测试允许相互作用强度的比较评价。当mAb结合到细胞-表面靶并与不同免疫细胞上的Fc-受体相互作用时，该实验设定适合于研究在体内也相关的Fc-FcR-相互作用的条件。在下面的实施例2中进一步描述了受体细胞系的生产。
将本公开的多肽、野生型人IgG4、野生型人IgG1或包含野生型人IgG4和/或野生型人IgG1而不包含人IgG4 409K的相应对照多肽在结合缓冲液(10mM Bis-Tris,pH 6)中从10μg/ml的浓度开始以1:10连续稀释3倍(总计log3稀释)。将100μl的每种稀释液转移到单个孔中，并在4℃进行包被过夜。除去包被试剂后，以200μl/孔添加封闭缓冲液(PBS+FCS 10％)，于室温下温育1小时。封闭后，用300μl PBS洗涤孔3次。将表达CD32b的BW5147报告细胞转移到孔中，以2x 105细胞/200μl细胞培养基的浓度。将细胞在37℃，5％CO2下温育24小时。然后收集无细胞的上清液，并按照制造商的说明使用小鼠IL-2ELISA试剂盒(BenderMedSystems，#BMS601)分析鼠IL-2。IL-2水平与激活程度直接相关。
在优选实施方式中，本公开的多肽是单克隆抗体。如本文所用，“单克隆抗体”是指抗体包含相同CDR，从而识别相同的表位。通常，使用杂交瘤技术重组产生单克隆抗体，如本领域通常已知的。尽管本公开的人IgG4单克隆抗体经由其重链Fc部分结合至人CD32b/c，并且能够在表达CD32b/c的细胞上将其激活，但在优选实施方式中，所述抗体不经由其抗原结合区识别人CD32b/c受体，即，其不识别人CD32b/c的表位。相反，单克隆抗体显现出对于不同抗原的特异性。在某些实施方式中，单克隆抗体可为双特异性的。这表示两个抗原结合区中的每一个可结合至同一抗原的不同表位，或结合至不同抗原的不同表位。根据前述公开，本文所公开的抗体可为双特异性的三功能抗体；或者所述抗体可以是双特异性双功能抗体。在某些实施方式中，单克隆抗体是未修饰的，并且特别是不与用作药物活性剂的生物活性肽氨基酸序列融合，如在WO 2014/144542A2中所述的。
然而，在优选实施方式中，单克隆抗体是单特异性抗体。作为单特异性单克隆抗体，本公开的人IgG4抗体将用两个抗原结合区结合相同表位，即，抗体仅具有单一的特异性。
在优选实施方式中，本公开的抗体结合至通常也存在于表达CD32b/c的细胞上的细胞表面受体。具有这样的特异性的抗体能够与所述细胞表面受体共同交联CD32b/c，或至少将抑制性CD32b/c受体与所述细胞表面受体一起共定位，从而有可能下调细胞表面受体的任何激活。
例如，带有本公开的突变IgG4恒定区的抗体可以如下方式化学地、共价地或非共价地进行多聚：使得能够交联表达CD32b/c的细胞上的CD32b/c而无需形成免疫复合物。
抗体可结合至表达CD32b/c的细胞(例如，PDC、单核细胞、B细胞、髓样DC等)的细胞表面上的表位，从而被固定并且同时通过本文所述的其突变IgG4恒定区来结合和交联CD32b/c受体，从而抑制指定细胞的激活和/或诱导调节表型。带有本公开的人IgG4恒定区的任何抗体的交联和抗药抗体的免疫复合物的形成可通过本文所述的突变IgG4恒定区的方式交联CD32b/c而向自体免疫环境中引入有益作用，从而抑制B细胞或其他表达CD32b/c的细胞(例如，单核细胞、髓样或浆细胞样DC)的激活。
或者，本发明的多肽或单克隆抗体可被设计为使其与通常与表达CD32b/c的细胞相互作用的另一种细胞相互作用。在带有本公开的人IgG4恒定区的抗体结合至任何种类的细胞(例如，造血细胞亚群、内皮细胞、上皮细胞等)表面上的靶表位时，所述抗体可被固定。随后，当表达IgG4抗体表位的细胞与表达CD32b/c的细胞之间的细胞-细胞接触之后，抗体可交联表达CD32b/c的细胞表面上的CD32b/c，从而抑制表达CD32b/c的细胞的激活。
在优选实施方式中，抗体识别选自CD303(也称为BDCA-2)、CD304、ILT7和CD123的细胞表面受体的表位，因为它们可在PDC的细胞表面上发现。在其他优选实施方式中，将抗体针对B细胞上的细胞表面分子或受体。例如，抗体可识别选自CD19、CD20、B细胞受体(BCR)、CD79A和CD79B的细胞表面受体的表位。在其他优选实施方式中，抗体识别单核细胞上的细胞表面受体或分子的表位。特别是，本公开的抗体可识别选自CD14和CD11c的表位。在仍然另一个优选实施方式中，抗体识别选自CD141和CD11c的细胞表面受体的表位。
在最优选的实施方式中，抗体识别BDCA-2(CD303)的表位。这种抗体的实例是单克隆抗体MB101。所述抗体例如可从以登录号DSM ACC3237于2014年4月24日由MiltenyiBiotec GmbH,Bergisch Gladbach保藏在德国不伦瑞克的DSMZ(German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures)的杂交瘤获得，并且代表本公开的另一个优选实施方式。根据单克隆抗体MB101，本公开的抗体可包含如SEQ ID NO：2-4所示的重链CDR 1-3和如SEQ ID NO：5-7中所示的轻链CDR 1-3。甚至更优选地，本公开的抗体可包含SEQ ID NO：8的可变重链和SEQ ID NO：9的可变轻链。如实施例5中所示，I期临床试验的数据似乎支持MB101对自体免疫疾病如银屑病的治疗作用。
在另一方面，本公开进一步涉及多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者过敏症的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c，如在权利要求中进一步定义的。就其产生的技术意义而言，关于本公开的多肽的上述第一方面的优选实施方式同样适用于该第二方面。特别是，本文所述的在409位具有赖氨酸(使用根据Kabat等人的EU索引，为409K)的人IgG4能够以比野生型IgG1和/或野生型IgG4的结合亲和力高至少2倍、优选至少5倍、最优选至少10倍的结合亲和力来结合人CD32b/c，如使用上述测定所确定的。在优选实施方式中，使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4进一步包含在241位处的脯氨酸(241P)。认为这种额外的取代进一步稳定了IgG4分子。因此，在特别优选的实施方式中，使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4包含在对应于409位的位置处具有赖氨酸(409K)和在对应于241位的位置处具有脯氨酸(241P)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列(hIgG4)。如上所述，多肽可为融合蛋白，特别是包含本公开的两个人IgG4 Fc部分的融合蛋白，或者与人IgG1或人IgE融合的人IgG4 Fc。仍然，在进一步优选中，多肽是单克隆抗体。尽管这种单克隆抗体被设计为经由其抗原结合区结合至CD32b/c是有可能的，但在优选实施方式中，本文所述的单克隆抗体不经由其抗原结合区识别人CD32b/c的表位。相反，在治疗过敏原的背景下，抗体可识别IgE的表位。例如，抗体可展示抗IgE单克隆抗体的CDR或可变结合区。或者，抗体可识别选自CD14和CD11c的细胞表面受体的表位；或者选自CD141和CD11c的细胞表面受体。因此，在某些实施方式中，抗体识别选自下述的细胞表面受体的表位：CD303、CD304、ILT7、CD123、CD19、CD20、诸如IgE的B细胞受体(BCR)、CD79A、CD79B、CD14、CD11c和CD141。
通过以下实施方式进一步描述本公开。
1.一种多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c。
2.实施方式1所述用途的多肽，其中自体免疫疾病是炎性自体免疫疾病。
3.实施方式1或2所述用途的多肽，其中自体免疫疾病的特征还在于与健康受试者相比自体抗体的血浆水平增加。
4.实施方式1-3中任一项所述用途的多肽，其中自体免疫疾病选自由全身性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化和类风湿性关节炎组成的组。
5.实施方式1-4中任一项所述用途的多肽，其中自体免疫疾病是全身性红斑狼疮或银屑病。
6.实施方式1-5中任一项所述用途的多肽，其中使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4进一步包含在241位处的脯氨酸(241P)。
7.实施方式1-6中任一项所述用途的多肽，其中根据Kabat等人的EU索引，人IgG4包括在对应于409位的位置处具有赖氨酸(409K)和在对应于241位的位置处具有脯氨酸(241P)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列(hIgG4)。
8.实施方式1-7中任一项所述用途的多肽，其中与野生型IgG4和/或野生型IgG1相比，人IgG4 409K 241P显示出人CD32b/c的激活增加。
9.实施方式1-8中任一项所述用途的多肽，其中多肽是单克隆抗体。
10.实施方式9所述用途的多肽，其中单克隆抗体不经由其抗原结合区识别人CD32b/c的表位。
11.实施方式9或10所述用途的多肽，其中单克隆抗体是单特异性抗体。
12.实施方式1-11中任一项所述用途的多肽，其中抗体识别选自下述的细胞表面受体的表位：CD303、CD304、ILT7和CD123。
13.实施方式1-11中任一项所述用途的多肽，其中抗体识别选自下述的细胞表面受体的表位：CD19、CD20、B细胞受体(BCR)、CD79A和CD79B。
14.实施方式1-11中任一项所述用途的多肽，其中抗体识别选自CD14和CD11c的细胞表面受体的表位。
15.实施方式1-11中任一项所述用途的多肽，其中抗体识别选自CD141和CD11c的细胞表面受体的表位。
16.实施方式12所述用途的多肽，其中抗体识别BDCA-2(CD303)的表位。
17.实施方式16所述用途的多肽，其中抗体包含SEQ ID NO：2-4中所示的重链CDR1-3和SEQ ID NO：5-7中所示的轻链CDR 1-3。
18.实施方式17所述用途的多肽，其中抗体包括SEQ ID NO：8的可变重链和SEQIDNO：9的可变轻链。
19.实施方式1-10或12-18中任一项所述用途的多肽，其中抗体是双特异性三功能抗体；或其中抗体是双特异性双功能抗体。
20.实施方式1-19中任一项所述用途的多肽，其中与健康受试者相比人受试者显示CD32b表达的调节异常。
21.实施方式1-20中任一项所述用途的多肽，其中人受试者具有CD32b 695T等位基因和/或CD32b基因的2B.4单体型。
22.实施方式1-20中任一项所述用途的多肽，其中人受试者具有CD32b 695C等位基因和/或CD32b基因的2B.1单体型。
23.一种多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，与野生型人IgG1相比和与野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者过敏症的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c。
24.实施方式23所述用途的多肽，其中使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4进一步包含在241位处的脯氨酸(241P)。
25.实施方式23或24所述用途的多肽，其中使用根据Kabat等人的EU索引，人IgG4包括在对应于409位的位置处具有赖氨酸(409K)和在对应于241位的位置处具有脯氨酸(241P)的SEQ ID NO：1的氨基酸序列(hIgG4)。
26.实施方式23-25中任一项所述用途的多肽，其中多肽是单克隆抗体。
27.实施方式26所述用途的多肽，其中单克隆抗体不经由其抗原结合区识别人CD32b/c的表位。
28.实施方式26或27所述用途的多肽，其中抗体识别IgE的表位。
29.实施方式26或27所述用途的多肽，其中抗体识别选自CD14和CD11C的细胞表面受体的表位。
30.实施方式26或27所述用途的多肽，其中抗体识别选自CD141和CD11C的细胞表面受体的表位。
31.实施方式26或27所述用途的多肽，其中抗体识别选自下述的细胞表面受体的表位：CD303、CD304、ILT7、CD123、CD19、CD20、诸如IgE的B细胞受体(BCR)、CD79A、CD79B、CD14、CD11c和CD141。
32.一种在409位具有赖氨酸(使用根据Kabat等人的EU索引，为409K)的人IgG4，该IgG4能够比野生型人IgG1和/或野生型人IgG4的结合亲和力高至少2倍、优选至少5倍、和最优选至少10倍的结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c。
33.实施方式32所述用途的人IgG4，其如上述实施方式2-22中所进一步定义的。
34.一种在409位具有赖氨酸(使用根据Kabat等人的EU索引，为409K)的人IgG4，该IgG4能够比野生型人IgG1和/或野生型人IgG4的结合亲和力高至少2倍、优选至少5倍、和最优选至少10倍的结合亲和力结合人CD32b/c，所述多肽用于在人受试者过敏症的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c。
35.实施方式34所述用途的人IgG4，其如上述实施方式24-31中所进一步定义的。
在以下实施例和附图中进一步说明本发明，这些实施例和附图并非旨在被理解为限制如权利要求所定义的本发明。
附图说明
图1显示了不同IgG1 mAb和MB101对重组人FcγRI(CD64)受体的结合亲和力(板结合)。可观察到两种IgG1变体均对CD64具有高亲和力，如针对IgG1单克隆抗体所预期的。MB101对CD64具有显著较低的亲和力，这并不令人惊奇，因为MB101是人源化的IgG4分子，据报道其与IgG1分子相比对CD64具有较低的亲和力。
图2显示了嵌合IgG1 mAb和MB101.10对重组人FcγRIIa(CD32a)受体的结合亲和力(板结合)。可观察到，与嵌合IgG1分子相比，MB101对CD32a具有适度较高的亲和力。
图3显示了嵌合IgG1 mAb和MB101对重组人FcγRIIb(CD32b)受体的结合亲和力(板结合)。可观察到，与嵌合IgG1分子相比，MB101对CD32b受体具有显著较高的亲和力。
图4显示了嵌合IgG1 mAb和MB101.10对重组人FcγRIIIa(CD16a)受体的结合亲和力(板结合)。可观察到，与嵌合IgG1分子相比，MB101对CD16a具有显著较低的亲和力。仍然可发现对CD16a的最小残留结合亲和力。
图5显示了嵌合IgG1 mAb和MB101.10对重组人FcγRIllb/c(CD16b/c)受体的结合亲和力(板结合)。可观察到，MB101对于CD16b/c没有亲和力。相比而言，嵌合IgG1分子对CD16b/c具有中等结合亲和力。
图6：不同mAb与表达人FcγR CD16v158的转染体(transfectants)的相互作用。将表达FcγR CD16的BW5147转染体与包被的TGN1412(点)、Tysabri(正方形)、Mabthera(三角形)、Remicade(黑色菱形)或MB101(蓝色菱形)在指定浓度下一起温育，并且通过ELISA测量鼠IL-2分泌(Bender MedSystems)。数值以一式两份(MB101)或一式三份(TGN1412、Tysabri、Mabthera和Remicade)测量结果的平均值±SD表示。
图7：不同mAb与表达人FcγR CD32A的转染体的相互作用。将表达人FcγR CD32A的转染体与包被的TGN1412(点)、Tysabri(正方形)、Mabthera(三角形)、Remicade(黑色菱形)或MB101(蓝色菱形)在指定浓度下一起温育并通过ELISA测量鼠IL-2分泌(BenderMedSystems)。数值以一式两份(MB101)或一式三份(TGN1412、Tysabri、Mabthera和Remicade)测量结果的平均值±SD表示。
图8：不同mAb与表达人FcγR CD32b/c的转染体的相互作用。表达FcγR CD32b/c的BW5147转染体与包被的TGN1412(点)、Tysabri(正方形)、Mabthera(三角形)、Remicade(黑色菱形)或MB101(蓝色菱形)在指定浓度下一起温育并通过ELISA测量鼠IL-2分泌(Bender MedSystems)。数值以一式两份(MB101)或一式三份(TGN1412、Tysabri、Mabthera和Remicade)测量结果的平均值±SD表示。
图9：向MB101的恒定区引入单个氨基酸交换(Pool 6；R409K)导致与CD32b和CD64结合的显著增加。MB101(抗CD303)表达为野生型IgG4，并且两个单突变变体Pool 3(抗CD303 IgG4 S241P)和Pool 6(抗CD303 IgG4 R409K)从1μg开始以log3连续稀释的方式在Na2HPO4结合缓冲液中于37℃被包被到96孔板中，持续2小时。作为对照，使用来自IgG4(TGN1412)和IgG1(BT-061)亚类的抗体。随后将表达人FcγR之一的转染体在包被板上温育18小时。随后，收获无细胞的上清液，并通过ELISA方法分析小鼠IL-2含量。N＝5，并且对于每个值进行两个生物重复(biological duplicate)。使用双向方差分析(two-way Anova)用Bonferroni的多重比较检验(Bonferroni's multiple comparison test)进行统计分析。
图10：MB101(抗CD303 IgG4 S241P/R409K)和Pool 6(抗CD303 IgG4 R409K)诱导表达CD32b的转染体产生比Pool 3(抗CD303 IgG4 S241P)和野生型IgG4显著多的IL-2。为了更精确地检验MB101、野生型IgG4和两个单突变变体的CD32b结合，将mAb的线性稀释液从1μg开始包被到板上，并且与表达CD32b的转染体一起温育。在18小时之后，收获上清液并使用ELISA方法分析。N＝3，对于每个值进行两个生物重复。使用双向方差分析用Bonferroni的多重比较检验进行统计分析。
图11：与Pool 3(抗CD303 IgG4 S241P)和野生型IgG4相比，MB101(抗CD303IgG4S241P/R409K)和Pool 6(抗CD303 IgG4 R409K)显示与CD32b/c的结合更强。为更精确地检验MB101、野生型IgG4和两个单突变变体的CD32b/c结合，将mAb的线性稀释液与预先用重组CD32b/c包被的ELISA板一起温育。用抗人κ-HRP和TMB的基板来对FcR-结合的抗BDCA2 Ab进行探测。
图12：与Pool 3(抗CD303 IgG4 S241P)或野生型IgG4相比，MB101(抗CD303IgG4S241P/R409K)和Pool 6(抗CD303 IgG4 R409K)在BDCA-2转染体中诱导显著更多的GFP表达。为了检验MB101、野生型IgG4和两个单突变变体在与BDCA-2结合方面是否有区别，在组成型表达BDCA-2的转染体中分析GFP表达的诱导。(A)以指定浓度将mAb添加到单独培养基中，随后添加1x 105BDCA-2转染体。在培养24小时之后使用LSRII和FlowJo软件分析GFP+细胞百分数。(B)以指定浓度将抗体添加到1x 105CD99(上行)或CD32b(下行)转染体中，随后添加1x 10 5BDCA-2转染体。在培养24小时之后分析GFP+细胞的百分数。显示了一个典型试验。
图13：与Pool 3(抗CD303 IgG4 S241P)和野生型IgG4相比，将BDCA-2转染体与MB101(抗CD303 IgG4 S241P/R409K)和Pool 6(抗CD303 IgG4 R409K)一起温育诱导显著更多的GFP表达。为检验MB101、野生型IgG4和两个单突变变体在与BDCA-2结合方面是否有区别，分析BDCA-2转染体的GFP诱导。(A)以指定浓度将抗体添加到1x 105CD32b转染体中，随后添加1x 105BDCA-2转染体。在培养24小时之后使用LSRII和FlowJo软件分析GFP+细胞的百分数。(B)像(A)一样，但是分析的是平均荧光强度(MFI)。显示了五个独立试验的数据。使用双向方差分析用Bonferroni的多重比较检验进行统计分析。
序列表说明
SEQ ID NO:1-人IgG4重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3；登录号UNIPROT P01861-1；突出S241和R409)
Figure BDA0002298886870000121
SEQ ID NO:2-MB101重链CDR1
SGFSLSTSGMGVG
SEQ ID NO:3-MB101重链CDR2
HIWWEDDKYYNPSLKS
SEQ ID NO:4-MB101重链CDR3
TRNWDYYTMDY
SEQ ID NO:5-MB101轻链CDR1
RASQEISGYLS
SEQ ID NO:6-MB101轻链CDR2
YAASTLDS
SEQ ID NO:7-MB101轻链CDR3
LQYASYPPT
SEQ ID NO:8-MB101可变区重链(突出显示CDR)
Figure BDA0002298886870000131
SEQ ID NO:9-MB101可变区轻链(突出显示CDR)
Figure BDA0002298886870000132
SEQ ID NO:10-人IgG1重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3；GenBank登录号AAC82527.1)
Figure BDA0002298886870000133
实施例
实施例1-MB101的Fc受体结合特性
在该实施例中，分析了不同mAb与五种人Fcγ受体CD16a、CD16b/c、CD32a、CD32b和CD64相互作用的能力。为稳定性的目的，将两个突变(S241P和R409K)引入到人IgG4抗体MB101中。MB101是针对CD303的重组人源化治疗性单克隆IgG4抗体。MB101最初被设计为IgG4治疗性抗体，以不显示或显示显著降低的效应子功能。为了经由CD16和CD64来评估ADCC(抗体依赖性细胞毒性)和CDC(补体来源的细胞毒性)-潜力，针对MB101与这些受体的结合来对其进行表征。
尽管与ADCC和CDC无关，还测试了MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)与人Fcγ受体CD32a和CD32b/c的结合。由于MB101旨在和设计为稳定化的人源化IgG4分子，预计MB101表现为典型的IgG4分子并且显示与人Fcγ受体(如CD16A、CD32a、CD32b/c和CD64)没有亲和力或功能性相互作用。
通过评价与重组板结合的人重组受体(FcγR)CD16a、CD32a、CD32b/c和CD64的结合特性，体外分析了与MB101的嵌合IgG1抗体变体相比较的Fc受体结合特征。
缩写
ADCC：抗体依赖性细胞的细胞毒性(antibody dependent cell cytotoxicity)
ELISA：酶联免疫吸附测定法
Fc：(Ab的)可结晶片段
HRP：辣根过氧化物酶
ITAM：基于免疫受体酪氨酸的激活基序
ITIM：基于免疫受体酪氨酸的抑制基序
mAb：单克隆抗体
PBS：磷酸盐缓冲盐水
RT：室温
SD：标准方差
TMB：3,3',5,5'-四甲基联苯胺
材料/设备
MB101.10 IgG4抗体(SAP 320-002-807,L/N A303P022)
重组嵌合抗CD303(BDCA-2)IgG1野生型(Cor 6.10.11)
嵌合抗BDCA2 IgG1(FE 060620.02)
MB101.10(L/N A303P022)是针对BDCA-2(CD303)的人源化IgG4抗体，并且旨在用于临床应用。除了该版本的MB101之外，使用在嵌合小鼠(杂交瘤)中产生的嵌合抗BDCA-2IgG1抗体以及重组嵌合抗CD303(BDCA-2)IgG1抗体(具有人Fc区的AC144结合区)。MB101.10在CHO DG44细胞中制造，重组嵌合抗CD303(BDCA-2)IgG1在HEK293.EBNA细胞中制造，且嵌合抗BDCA-2IgG1抗体来源于杂交瘤细胞。
Fcγ受体：
重组人FcγRI/CD64，R&D Systems，1257-FC-050
重组人FcγRIla/CD32a，R&D Systems，1330-CD-050
重组人FcγRIIb/CD32b)R&D Systems,1875-CD-050
重组人FcγRIlla/CD16a，R&D Systems，4325-FC-050
重组人FcγRIllb/CD16b，R&D Systems，1597-FC-050
方法
将ELISA板用各自为5μg/mL的Fcγ受体I、IIa、IIb、IIIa和IIIb在包被缓冲液中于4℃包被过夜。将包被的板用1x PBS 0.05％Tween 20洗涤三次，并用在1x PBS中的5％BSA封闭。将抗体以50μL/孔在抗体溶液的连续两倍稀释下施加到ELISA板，并于室温下温育1小时。作为空白对照，也将相应的抗体浓度施加到缺乏包被的Fcγ受体的孔中，以从所得信号中减去非特异性结合。洗涤后(见上文)，以50μL/孔施加在1x PBS中的1:4000的检测抗体抗人κ-HRP(FE 110316.07)，并于室温下再温育1小时。在另外洗涤后(见上文)，为测定显影，以50μL/孔施加TMB(CH111027.37)并在约5分钟之后以50μL/孔用10％H2SO4来终止。随后经由ELISA读数器在450nm波长下分析显影的板。
结果
对于与FcγRI(CD64，高亲和力Fcγ受体)的结合，图1显示了两个IgG1变体均对CD64具有高亲和力，正如对于IgG1单克隆抗体所预期的那样。MB101对CD64具有显著较低的亲和力，这也不令人惊讶，因为MB101是人源化IgG4分子，据报道与IgG1分子相比其对CD64的亲和力较低。必须注意的是MB101仍对CD64具有最小亲和力。
对于与FcγRIIa(CD3a，低亲和力Fcγ受体)的结合，图2显示了与嵌合IgG1分子相比，MB101对CD32a具有适当较高的亲和力。
对于与FcγRIIb(CD31b，低亲和力Fcγ受体)的结合，图3显示了与嵌合IgG1分子相比，MB101对CD32b受体具有显著较高的亲和力。
对于与FcγRIIIa(CD16a，低亲和力Fcγ受体)的结合，图4显示了与嵌合IgG1分子相比，MB101对CD16a具有显著较低的亲和力。仍可发现对CD16a的残余结合亲和力最小。
对于与FcγRIIIb/c(CD16b/c)的结合，图5显示了MB101对CD16b/c没有亲和力。相比而言，嵌合IgG1分子对CD16b/c具有中等结合亲和力。
结论
对于不同的测试受体能观察到FcγR相互作用的明显差别。MB101与CD16a、CD16b/c和CD64的相互作用显著低于相比较的嵌合抗BDCA-2IgG1。MB101对CD16a、CD16b/c和CD64的显著较低的亲和力是通过选择使用没有效应子功能的人IgG4骨架的MB101的预期设计特征。该设计特征应当减少抗体与效应子细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞和自然杀伤细胞)的相互作用。由于这种低亲和力和激活潜力，假定MB101的ADCC活性潜力低或不存在，并且实现了预期的设计目的。
有趣地，MB101显示了对CD32a和CD32b的显著亲和力，其适度至显著高于嵌合抗BDCA-2IgG1的结合亲和力，并且从人IgG4分子的选择或从引入的将IgG4分子改变为略带IgG1样的人单克隆抗体骨架的稳定突变中无法预期这一点。惊奇地，发现MB101对CD32a和CD32b受体的亲和力甚至高于对IgG1对照的亲和力。
Fcγ受体FcγIIa(CD32a)具有激活的ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)，并且在单核细胞、中性粒细胞、血小板和树突状细胞上发现。与这种受体的结合可经由ITAM导致激活的细胞。因此，MB101与这种受体的亲和力可诱导B细胞和树突状细胞的激活。Fcγ受体FcγIIb(CD32b)具有抑制的ITIM(基于免疫受体酪氨酸的抑制基序)，并且在B细胞和髓系树突状细胞上发现。与这种受体的结合可经由ITIM导致抑制的细胞。因此，MB101与这种受体的亲和力可抑制B细胞的抗体生产和抑制某些树突状细胞的成熟和细胞激活。
实施例2-针对CD32a和CD32b的功能性的基于细胞的体外测定
这组实验的目的是在体外测定中评价抗体MB101对在重组稳定转染的报告细胞系上的低亲和力人Fcγ受体(FcγR)CD16A、CD32a和CD32b/c的激活特性。这项研究的目的是评估在Fc部分介导的结合后MB101激活不同表达FcγR的细胞的能力。特别感兴趣的是分析MB101与Fc受体在结合后的结合亲和力和受体活性方面的潜在相互作用。在这些测定中，野生型IgG1和IgG4抗体均用作对照。
在人群中，尽管频率较低，但仍表达了几种不同等位基因形式的低亲和力FcγR。我们测试了与以下等位基因形式的Fcγ受体的IgG相互作用：CD16aV158(FcγRIIIAV158)、CD32aR131(FcγRIIAR131)和CD32b/c(FcγRIIB/C)。对于CD16，发现两种重要的等位基因形式，CD16aF158和CD16aV158(根据Nimmerjahn,F.和Ravetch,J.V.2008.Fc gammareceptors as regulators of immune responses.Nature Reviews Immunology 8:34进行氨基酸序列编号)。我们研究了更大量存在的CD16、CD16aV158的等位基因形式。对于CD32，发现三种不同的受体由三个单独的基因座CD32a、b和c编码。尽管CD32b和CD32c展现不同的生物学功能，但它们在氨基酸43-217位中表达相同的胞外氨基酸序列。因此，为了确定CD32b和CD32c的Fcγ相互作用，我们使用了一种表达CD32b胞外域的转染体。在下文中，该克隆称为CD32b/c。对于CD32a，我们表达了在人群中广泛发现的等位基因形式CD32aR131。
为产生转染体，使用鼠胸腺瘤细胞系BW5147。为表面表达不同的Fcγ受体，将融合蛋白工程化，所述融合蛋白由与鼠T细胞受体的跨膜和胞内ζ-链相连的相应的人FcγR部分的胞外域组成。由于BW5147细胞携带胞内应答元件，一旦经由T细胞受体的ζ-链传递信号，所述胞内应答元件就会导致鼠白介素(IL)-2的产生，预计转染体在所表达的FcγR与IgG相互作用之后会分泌鼠IL-2。推断鼠IL-2的产生量与IgG和相应的FcγR的相互作用强度直接相关。
为检测不同的mAb结合和交联各种FcγR的能力，将mAb包被到塑料上并添加转染体。如果mAb与所测试的FcγR相互作用，则诱导鼠IL-2产生。将Fcγ-FcγR-相互作用的读数视为IL-2的绝对水平。使用对照mAb的测试允许相互作用强度的比较性评价。该实验设定适用于研究Fc-FcR-相互作用的条件，当mAb结合至细胞-表面靶并且与不同免疫细胞上的Fc受体相互作用时，其在体内也是相关的。
缩写：
ADCC：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody dependent cell-mediatedcytotoxicity)
CD：分化簇
ELISA：酶联免疫吸附测定法
Fc：(Ab的)可结晶片段
FCS：胎牛血清
IL：白介素
mAb：单克隆抗体
PBS：磷酸盐缓冲盐水
RT：室温
SD：标准偏差
FcγR转染体
使用BW5147-转染体表达融合蛋白，所述融合蛋白由小鼠ζ-跨膜和胞浆结构域以及CD16a、CD32a或CD32b/c的胞外结构域组成。
细胞系 称为 质粒
BW5147CD16A<sub>V158</sub>-ζ CD16a pcDNAZ-CD16zeta
BW5147CD32A<sub>V131</sub>-ζ CD32a pcDNAZ-CD32Azeta
BW5147CD32B-ζ CD32b/c pcDNAZ-CD32Bzeta
表达FcγR的转染体的细胞培养材料
RPMI Biochrom AG#F 1215 500ml
FCS(100％) Sigma#F 7524 10％
Glutamax(100x) Invitrogen#35050-038 1％
丙酮酸钠(100mM) Biochrom#AG L0473 1％
Zeocin(用于选择) Invitrogen#ant-zn-5b 0.5mg/ml终点浓度
细胞每2-3天在富含0.5mg/ml Zeocin的培养基中传代。
用抗体包被塑料和测定程序
将mAb在结合缓冲液中(10mM Bis-Tris,pH 6)从10μg/ml的浓度开始以1:10连续稀释3次(总共log3稀释)。将100μL的每种稀释液转移到单个孔中并于4℃包被过夜。在去除包被试剂之后，以200μL/孔添加封闭缓冲液(PBS+FCS 10％)并于室温下温育1小时。在封闭后，用300μL PBS洗涤孔三次。将表达FcγR的转染体转移到孔中，浓度为2x 105细胞/200μL细胞培养基。将细胞于37℃,5％CO2下温育24小时。随后收集无细胞的上清液并使用小鼠IL-2ELISA试剂盒(Bender MedSystems,#BMS601)遵循生产商说明来分析小鼠IL-2。
结果
为了量化不同mAb与人FcγRs的相互作用，将抗体TGN1412、Tysabri、Mabthera、Remicade和MB101以10至0.1μg/ml范围内的log3稀释液以一式两份(MB101)或一式三份(TGN1412、Tysabri、Mabthera和Remicade)进行包被。TGN1412、Tysabri和MB101是IgG4mAb，而Mabthera和Remicade是IgG1 mAb。
如图6中所示，MB101显示与低亲和力FcγR CD16的相互作用很小。MB101的相互作用与其他IgG4 mAb Tysabri和IgG1 mAb Mabthera的相互作用相当。此外，MB101与表达CD16的转染体的相互作用低于用IgG4 mAb TGN1412观察到的那些。
mAb MB101显示与表达FcγR CD32a的转染体的相互作用非常小(图7)，并且与用Tysabri(IgG4)、Remicade(IgG1)、TGN1412(IgG4)或Mabthera(IgG1)发现的那些类似。MB101对重组CD32a报告细胞的激活特性数据显示了MB101对CD32a没有激活潜力(但有结合潜力，见上文)，并且仅被判断为CD32a的结合分子而非激活分子。
然而，当与其它IgG4 mAb(TGN1412或Tysabri)和IgG1 mAb(Mabthera或Remicade)比较时，MB101显示了与表达CD32b/c的转染体的相互作用增强。细胞被高度激活以分泌IL-2，IL-2是受体介导效应的指示物。MB101对重组CD32b报告细胞的激活特性数据显示了MB101不仅对CD32b具有显著的结合活性(远高于对IgG4和IgG1分子的结合活性)，而且还对CD32b具有显著的激活潜力，这是在该水平下对其他测试的IgG4和IgG1分子所没有发现的。预期对抑制性ITIM受体CD32b的这种激活能力导致B细胞和树突状细胞抑制。
结论
在本研究中，分析了不同mAb与低-亲和力人FcγR CD16(FcγRIIIAV158)、CD32a(FcγRIIAR131)和CD32b/c(FcγRIIB)相互作用的能力。未分析典型的高亲和力CD64(FcγRI)，因为其将会因不同特质(低亲和力受体相对于高亲和力受体)而带来非可比性的结果。对于不同的测试mAb可观察到FcγR相互作用的明显差别。MB101与表达CD16-和CD32a-的转染体的相互作用似乎低于TGN1412和Remicade与CD16的相互作用以及TGN1412和Mabthera与CD32a的相互作用。相比于IgG1和IgG4 mAb，MB101显示了对表达CD32b/c的转染体的高度增强的相互作用和激活。预期对抑制性ITIM受体CD32b的这种激活能力导致B细胞和树突状细胞抑制。
实施例3-MB101及其单突变变体的Fcγ相互作用
使用表达人FcγR的胞外结构域的鼠转染体来评估mAb变体与不同FcγR的多价相互作用。在所用的系统中，通过鼠IL-2的释放来测量相互作用，所述鼠IL-2在转染体的FcγR参与(engagement)之后分泌到上清液中。将mAb以1μg、0.3μg、0.1μg和0.03μg的浓度包被到maxisorb 96孔板上。除了MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)之外，还测试了两种单突变变体Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)、野生型IgG4抗体(aCD303-hIgG4)以及其它IgG4和IgG1对照mAb。将抗体在结合缓冲液中于37℃包被2小时，随后用1％BSA于室温下封闭1小时。添加2x 105转染体并于37℃温育18小时，随后收获上清液并通过ELISA方法测试鼠IL-2含量。
结果显示于图9中。在与表达CD16的转染体一起温育之后检测的IL-2表达水平揭示了经典IgG1对照抗体诱导显著的IL-2表达，而IgG4对照、野生型IgG4抗体和Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)仅诱导少量IL-2，其随着mAb稀释度增加而进一步降低。对于Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)和MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)获得的数据显示，存在IL-2表达增加的趋势，然而数据不显著。
用表达32a的转染体获得的数据整体上很相似于MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)、两种变体和野生型抗体。所检测的IL-2水平通常稍微高于IgG4对照，但明显低于IgG1对照。分析添加CD32b转染体之后的诱导揭示了相比于Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)和野生型IgG4，MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)之间的显著差异。在包被浓度为0.3μg时，这种差异特别明显。这说明了在铰链区包含单突变(Pool6；aCD303-hIgG4-R409K)导致与CD32b的相互作用增强，因此增加了IL-2产生，使IgG4FcγR结合特性偏向IgG1变化。Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)和MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)的CD32B相互作用增强也在使用CD64转染体的试验中被类似地观察到。
为更仔细地分析MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)与CD32B的相互作用，将两种MB101变体和野生型抗体以1μg、0.8μg、0.6μg、0.4μg和0.2μg的浓度包被。结果显示于图10中。同样在该条件下，MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)在0.8和0.6μg的浓度下比Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)和野生型IgG4诱导了显著多的IL-2生产。这进一步证实了原始IgG4抗体的铰链区中的单突变实际上不会改变FcγR结合特性。
使用CD32a/b结合的ELISA进一步证实了这些数据。对此，将ELISA板用重组人FcγRIIb(CD32b)蛋白(R&D Reagents,Cat:1875-CD；Lot:GJZ0814031)包被，并检测MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)、野生型MB101和两种突变变体Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)的结合。类似于从先前的实验中获得的数据，MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)和Pool 6变体(aCD303-hIgG4-R409K)显示与野生型IgG4 mAb和Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)相比与重组人FCγRIIB/C的结合更强，正如由更高的OD450值所证实的那样(图11)。
为进一步验证Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)的FcγR结合特性的变化是否也影响MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)的特异性靶向结合，我们使用在BDCA-2(由Miltenyi友善地提供)的参与之后显示诱导的GFP表达的转染体。这允许检测MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)与CD32B的结合增加是否也导致与Pool 3(aCD303-hIgG-S241P)和野生型抗体的诱导相比更大量的BDCA-2触发，正如通过转染体中更强的GFP表达所测量的。
因此，将1x 105CD32b或对照CD99转染体接种在96孔板的100μL培养基中。添加MB101(aCD303-hIgG4-S241P/R409K)、Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)、Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)和野生型抗体，浓度为0.5、0.1、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01μg。随后添加1x105BDCA-2转染体，将细胞共培养24小时。
如图12A中所示，当使用高浓度的MB101时，将可溶性抗体添加到BDCA-2转染体中导致GFP诱导，同时不同的抗体变体的行为大体上相似。当额外添加CD99对照转染体时，BDCA-2转染体仅显示背景GFP表达，而与CD32b转染体共培养导致大量GFP诱导(图12B下行)。这种表达在抗体变体之间有所不同，尤其是当使用0.05-0.01μg浓度的mAb时。由此可见，与Pool 3(aCD303-hIgG4-S241P)或野生型抗体相比，MB101(aCD303-hIgG-S241P/R409K)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)诱导更高的GFP水平。
为验证此数据和进行统计学分析，如图13所示重复试验。添加最高浓度的可溶形式抗体(0.5μg)，并且随后无需与BDCA-2转染体交联，这已经足以触发转染体的GFP表达(数据未示出)。然而，GFP表达程度随着较低抗体浓度而明显减弱。在用最高抗体浓度温育CD32b转染体和BDCA-2转染体的共培养试验中，没有检测到GFP诱导的显著差异。然而，似乎存在如下趋势：与其他抗体相比，MB101(aCD303-hIgG-S241P/R409K)和Pool 6(aCD303-hIgG4-R409K)诱导的GFP表达略多。这一趋势从使用的抗体浓度为0.05μg开始变得显著。这一现象可通过分析GFP+细胞百分数(图13A)以及GFP信号的平均荧光强度(MFI)(图13B)来检测。这些结果清楚表明将稳定的突变R409K引入IgG4抗体的铰链区不仅改变了抗体的FcγR结合特性，还通过经由细胞表面FcγR固定Ab而增强了特异性抗原结合能力，从而提供了相对于野生型IgG4变体的功能性优势。
实施例4-S241P和R409K稳定IgG 4
考虑到IgG4，半分子形成和Fab臂交换是固有现象。在本实施例中分析了铰链区中的突变(即，S241P)和/或CH3-结构域中的突变(即，R409K)消除aCD303-IgG4抗体解离成半分子和Fab臂交换中间体发生的能力。
抗体
Figure BDA0002298886870000191
缓冲液和稀释液
缩写
Figure BDA0002298886870000193
SDS-PAGE分析
首先，将样品非煮沸和煮沸地应用到非还原凝胶上。
施加3.5μg aCD303-IgG-野生型、2.5μg Tysabri、2.5μg Remicade和2.5μgAC144。对于所有其它抗体，将5μg置于每个凝胶上。将抗体以原样加载或于94℃煮沸5分钟后加载。作为对照，将aCD303-IgG-野生型与β-巯基乙醇一起温育以显示完全解离的重链和轻链。将样品置于4-12％Tris/Glycin-SDS-凝胶上。每个凝胶于30mA,5W,200V运行1小时15分钟并Coomassie染色。
对于未煮沸样品，所有的抗体条带均可见于170kDa标记条带附近，对应于约150kDa的全抗体。aCD303-hIgG4-R409K也显示了大分子量的污染条带。这可归因于产抗体细胞在含血清培养基中的培养。
样品煮沸后，所有抗体条带均在170kDA标记条带上运行。仅在Tysabri和aCD303-IgG4-野生型(包含IgG4-野生型铰链区)中看到半分子形成，所述半分子形成的特征在于72kDa和95kDa标记条带之间的条带。所有三种IgG4变体(微弱条带)的半分子形成显著降低。AC144和Remicade显示无半分子条带，代表稳定的IgG1-表型。可再次检测到aCD303-hIgG-R409K的高分子量污染条带。另外，可检测到略微高于55kDa标记条带的条带。怀疑这是来自含血清细胞培养物中的共纯化蛋白污染。
在第二组实验中，在1mM DTT存在下温育抗体。将抗体用1mM或1M DTT于37℃预温育1小时。将样品装载在4-12％Tris/Glycin-SDS-凝胶上。每个凝胶在30mA,5W,200V下运行1小时15分钟，并Coomassie染色。施加3.5μg aCD303-IgG4-野生型、2.5μg Tysabri、2.5μgRemicade和2.5μg AC144。对于所有其它抗体，将5μg置于每种凝胶上。作为对照，将aCD303-IgG4-野生型与β-巯基乙醇一起温育以显示完全解离的重链和轻链。
在将样品与1mM DTT一起温育之后，AC144和Remicade解离成H2和轻链。与此不同，aCD303-IgG4-野生型和aCD303-hIgG4-S241P完全解离成轻链和重链。Tysabri也显示残余的半分子条带(上面的条带)。IgG4变体R409K和S241P/R409K显示与IgG1同型抗体AC144和Remicade相同的H2和轻链条带谱(pattern)，证明了理想的稳定表型。这些结果证明了对于IgG4变体R409K和S241P/R409K而言，IgG1稳定性能够被恢复，所述IgG4变体R409K和S241P/R409K具有影响最深远的突变R409K。
对于所有抗体，DTT浓度设置为1M DTT。除了Tysabri以外，所有抗体的条带谱均与用1mM DTT处理的相当。Tysabri没有显示任何半分子，但完全解离成重链和轻链。总共在4个实验中验证了用1mM DTT进行还原的结果。在2个实验中验证了使用1M DTT进行还原的结果。
在最后的实验设置中，根据生理学GSH浓度，将抗体与1mM GSH一起温育(Micheletetal.,1995)。因此，Tysabri和aCD303-hIgG4-野生型解离为半分子，而所有其他抗体都是稳定的。应用3.5μg aCD303-IgG4-野生型、2.5μg Tysabri、2.5μg Remicade和2.5μg AC144。对于所有其他抗体，将5μg置于每种凝胶上。将抗体与1mM GSH在37℃预温育1小时。将样品放在4-12％Tris/Glycin-SDS-凝胶上，凝胶以30mA，5W，200V运行1小时15分钟。之后，将凝胶Coomassie染色。作为对照，将aCD303-IgG4-野生型与B-巯基乙醇一起温育以显示完全解离的重链和轻链。
这也表明，在体外生理条件下，aCD303-hIgG4-R409K和aCD303-hgG4-S241P/R409K的稳定性与IgG1抗体AC144和Remicade的相当。
用包被抗体的Fc-Fc-相互作用-测定
为了检测抗体是否参与Fab臂交换，通常使用ELISA形式的测定。Van derNeutKolfschoten et al.(2007)建立了一种测定法，其中用一种抗原包被板，并且使用另一种抗原检测结合两种抗原的双特异性抗体。Rispens et al.(2009)将IgG1和IgG4偶联至固相，并确定了IgG1或IgG4的结合。因此，他们发现，当结合至固相的IgG4或IgG1的CH3-结构域以及液相中的IgG4在结合前稍微解离时，就会发生Fc-Fc相互作用。IgG4结合到被固定的IgG4被解释为fab臂交换的中间状态，该状态无法成功，因为一个IgG4伴侣与固相结合。
对于本实施例，对于每个ELISA板，通过在1x PBS中将抗体(通常为AC144抗体)稀释至5μg/mL的浓度来制备12mL包被溶液。以100μL/孔用包被溶液包被微孔板，并在微孔板顶部用密封胶带密封以防止蒸发。在4℃下温育过夜。以350μL/孔用洗涤缓冲液洗涤板3次，两次洗涤之间浸泡10秒。为了封闭潜在的非特异性结合，以200μL/孔添加测定缓冲液，并将密封的板在室温下温育2小时。当用密封胶带将板密封时，可将板用封闭溶液在4℃下最多保存1周。
使用测定缓冲液将抗体稀释至100ng/mL。如果用DTT或GSH还原样品，则将等分试样移液到微量离心管中，并加入适量的还原原液。在培养箱(incubator)或恒温混匀仪(thermomixer)中于37℃还原1小时。对于该测定，以100μL/孔添加样品，将密封的板在室温下温育2小时。通常，以一式两份准备样品，并将测定缓冲液用作空白。温育结束后，以350μL/孔将板再次用洗涤缓冲液洗涤3次。应用在测定缓冲液中以1:1000至12000稀释的小鼠抗人κ-HRP，并将板在室温下以100μL/孔温育1小时。之后，以350μL/孔将板用洗涤缓冲液洗涤3次。为了检测，以100μL/孔使用TMB，并在大约5分钟后以100μL/孔用10％硫酸终止显色反应，导致颜色从蓝色变为黄色。在微量滴定板读数器中测量450nm处的吸光度。
为发现aCD303-IgG4变体是否可参与Fc-Fc相互作用，用AC144包被ELISA板，并将抗体与1mM步进(1mM-steps)的1-20mM DTT一起温育。还将Remicade与DTT一起温育，以包含稳定的hIgG1抗体作为对照。非稳定的Tysabri的染色最亮，具有最高的OD(450nm)值，其次是人源化CD303-IgG4-wt和IgG4变体S241P，这是由于应用的抗体与包被抗体的Fc部分结合所致。IgG4变体R409K和S241P/R409K显示出与Remicade相当的最低染色，证明了所需的稳定表型。在三个实验中验证了结果。
在下一个实验设置中，将人IgG4-λ包被在ELISA板上。再次，将抗体与1-10mM DTT一起温育按一式三份进行。同样，未稳定化的Tysabri显示最亮的染色，其次是人源化CD303-IgG4-野生型和IgG4变体S241P。IgG4变体R409K和S241P/R409K表现出与Remicade和AC144相当的最低染色。这四种抗体的OD(450nm)均不大大高于空白测量值。由PBS和BSA组成的测定缓冲液用作空白。这些结果再次证明，对于IgG4变体R409K和S241P/R409K而言，IgG1的稳定性能够被恢复，所述IgG4变体R409K和S241P/R409K具有影响最深远的突变R409K。
在两个正交测定(非还原SDS-PAGE分析和Fc-Fc相互作用测定)中，aCD303-IgG4变体R409K和S241P/R409K表现出与IgG1同型抗体AC144和Remicade相当的最稳定表型。
实施例5-MB101的I期临床试验
MB101是源自鼠抗体AC144的人源化抗BDCA-2(抗CD303)单克隆抗体，使用的是基于种系的轻链和重链可变区的人源化策略。MB101是具有409K和241P取代的人源化IgG4。MB101与BDCA-2受体的结合抑制浆细胞样树突状细胞(PDC)中干扰素(IFN)-α的诱导。PDC产生的IFN-α被认为是自身免疫性疾病的主要病理生理因素，而BDCA-2的触发被认为是阻断患者产生IFN的潜在治疗策略。
PDC产生IFN-α似乎是诱导银屑病炎症的关键事件，并且有实验证据表明：通过使用鼠前体单克隆抗体AC144将血液树突状细胞抗原(BDCA)-2受体连接到皮肤驻留PDC上来对该过程的抑制该，可以消除银屑病症状的发展[Nestle et al.Plasmacytoidpredendritic cells initiate psoriasis throμgh interferon-αproduction.J ExpMed.2005Jul 4；202(1):135-43]。当前用于银屑病患者的单克隆抗体疗法基于TNF-α、IL-12/IL-23和IL-17的中和，旨在通过中和中枢炎性细胞因子来中断激活周期。认为MB101方法会影响炎症周期的早期，因此可能是通过预防LFN-α诱导下游的促炎细胞因子诱导而治疗斑块状银屑病的替代方法。
使用体外人PDC上的鼠前体分子单克隆抗体(mAb)AC144来研究MB101的作用方式。MB101与BDCA-2抗原的结合有效地抑制了人PDC中FN-d/B产生的诱导，其机制可能是依赖于src-家族蛋白-酪氨酸激酶的钙动员和蛋白-酪氨酸磷酸化[Dzionek et al.BDCA-2,BDCA-3,and BDCA-4:three markers for distinct subsets of dendritic cells in humanperipheral blood.J lmmunol.2000Dec 1；165(11):6037-46.；Dzionek et al.BDCA-2,anovel plasmacytoid dendritic cellspecific type II C-type lectin,mediatesantigen capture and is a potent inhibitor of interferon alpha/betainduction.J Exp Med.2001Dec 17；194(12):1823-34.；Dzionek et al.Plasmacytoiddendritic cells:from specific surface markers to specificcellularfunctions.Hum Immunol.2002Dec；63(12):1133-48.]。
使用mAb AC144，即使IFN-α诱导刺激在长达6天后添加并且与所使用的刺激无关，BDCA-2的连接也显着抑制了IFN-α/β产生的诱导。这表明mAb AC144与BDCA-2的连接可诱导PDC中IFN-α/β产生的持久抑制，即mAb AC144的体内药代动力学和药效学半衰期之间存在差异，因此体内MB101的体内药代动力学和药效学半衰期之间也存在差异。
在最近的I期临床研究(M-2011-255)中，评估了银屑病患者中递增的单静脉注射剂量的MB101的安全性和耐受性。总体而言，单剂量的MB101在0.025至32.4μg/kg体重的剂量范围内是安全且耐受性良好的。从4.05μg/kg到32.4μg/kg的剂量水平(第6至9组)，可以定量血清中MB101的浓度。用MB101治疗的两名受试者(剂量组6中一名，剂量组8中一名)在给药后24小时显示出IFN-α分泌水平的明显增加。除这些受试者外，对于剂量组7-9，可以观察到来自经治疗受试者的样品中的IFN-α产生减少。与基线相比，用MB101治疗的受试者在24小时时的IFN-α水平低于用安慰剂治疗的受试者。在最后一个剂量组(第9组)中，CpG-A刺激后的IFN-α产生的减少显著，并且显示当与来自同一受试者的给药前对照样品相比减少了高达约80％。
PBCA上BDCA-2染色的MFI值的降低表现出明显的剂量反应，在较高剂量水平下效果最为明显。在16.2μg/kg和32.4μg/kg的剂量后，BDCA-2染色的平均荧光强度(MFI)值降低到基线值的10％到20％左右。BDCA-2染色的MFI值与剂量的关系呈S型曲线。PBMC上BDCA-2染色的MFI值随剂量增加而降低。因此，随着剂量的增加，PBMC上的BDCA-2染色明显减少。上述数据使得MB101可以适用于治疗自体免疫疾病(例如，银屑病)是合理的。
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序列表
<110> 美天施生物科技有限责任公司
<120> 具有突变人IgG4的多肽
<130> 30A-142 673
<150> EP17165439.5
<151> 2017-04-07
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Claims (15)

1.一种多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，该IgG4识别BDCA-2(CD303)的表位，并且当在室温下在1x PBS中在预包被有重组CD32b的ELISA板上，将所述多肽和野生型抗体温育1小时进行ELISA测定时，与具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的野生型人IgG1相比和与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的野生型人IgG4相比，该IgG4能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，
所述多肽用于在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c。
2.如权利要求1所述用途的多肽，其中所述自体免疫疾病是炎性自体免疫疾病。
3.如权利要求1或2所述用途的多肽，其中所述自体免疫疾病的特征还在于与健康受试者相比自体抗体的血浆水平增加。
4.如权利要求1-3中任一项所述用途的多肽，其中所述自体免疫疾病选自由全身性红斑狼疮、银屑病、多发性硬化和类风湿性关节炎组成的组；优选其中所述自体免疫疾病是全身性红斑狼疮或银屑病。
5.如权利要求1-4中任一项所述用途的多肽，其中使用根据Kabat等人的EU索引，所述人IgG4还包含在241位的脯氨酸241(241P)；优选其中所述人IgG4具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列(hIgG4)，使用根据Kabat等人的EU索引，所述氨基酸序列在对应于409位的位置处具有赖氨酸(409K)和在对应于241位的位置处具有脯氨酸(241P)。
6.如权利要求1-5所述用途的多肽，其中与野生型IgG4和/或野生型IgG1相比，所述人IgG4 409K显示对人CD32b/c的激活增加。
7.如权利要求1-6中任一项所述用途的多肽，其中所述多肽是单克隆抗体，特别是其中所述单克隆抗体不经由其抗原结合区识别人CD32b/c的表位。
8.如权利要求7所述用途的多肽，其中所述单克隆抗体是单特异性抗体。
9.如权利要求1-8中任一项所述用途的多肽，其中所述多肽不与生物活性肽氨基酸序列融合。
10.如权利要求1-9中任一项所述用途的多肽，其中所述抗体包含SEQ ID NO：2-4中所示的重链CDR 1-3和SEQ ID NO：5-7中所示的轻链CDR 1-3；特别是其中所述抗体包含SEQID NO：8的可变重链和SEQ ID NO：9的可变轻链。
11.如权利要求1-10中任一项所述用途的多肽，其中与健康受试者相比，所述人受试者显示CD32b表达的调节异常；特别是其中所述人受试者具有CD32b 695T等位基因和/或CD32b基因的2B.4单体型；或其中所述人受试者具有CD32b 695C等位基因和/或CD32b基因的2B.1单体型。
12.一种多肽，使用根据Kabat等人的EU索引，所述多肽包含至少一个在409位具有赖氨酸(409K)的人IgG4，该IgG4识别BDCA-2(CD303)的表位，并且当在室温下在1x PBS中在预包被有重组CD32b的ELISA板上，将所述多肽和野生型抗体温育1小时进行ELISA测定时，与具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的野生型人IgG1相比和与具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列野生型人IgG4相比，能够以统计学显著(p＝0.05)的更高结合亲和力结合人CD32b/c，
所述多肽用于在人受试者自体免疫疾病的预防和/或治疗中激活表达CD32b/c的细胞上的人CD32b/c。
13.如权利要求12中所述用途的多肽，其中使用根据Kabat等人的EU索引，所述人IgG4还包含在241位的脯氨酸(241P)；特别是其中所述人IgG4包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列(hIgG4)，使用根据Kabat等人的EU索引，所述氨基酸序列具有在对应于409位的位置处的赖氨酸(409K)和在对应于241位的位置处的脯氨酸(241P)。
14.如权利要求12或13所述用途的多肽，其中所述多肽是单克隆抗体。
15.如权利要求14所述用途的多肽，其中所述单克隆抗体不经由其抗原结合区识别人CD32b/c的表位。
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