CN110702762B - 一种定量检测溶液中生物电子媒介的方法 - Google Patents

一种定量检测溶液中生物电子媒介的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于化学分析技术领域，本发明提供三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介中的应用，所述溶液中包括电化学活性细菌，通过对比分析三氧化钨的颜色变化情况，得到生物电子媒介的检测结果。本发明主要利用三氧化钨纳米探针的电致变色反应，其在接受电子媒介传递的来自电化学活性菌的电子后发生颜色变化，从而实现生物电子媒介的定性检测和定量分析。本发明检测方法准确度高，稳定性好。此外，本发明制备检测试纸方便携带，一次制备后可长时间使用，从而利于该探针的推广。实验结果表明，本发明该探针可用于检测不同生物电子媒介的电子转移能力。

Description

一种定量检测溶液中生物电子媒介的方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，尤其涉及三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介的应用。
背景技术
涉及生物体的氧化还原反应中，由于部分反应物不能在溶液相自由扩散，而且生物膜的限制又广泛存在，往往需要具有氧化还原活性的分子作为电子媒介来突破这样的限制。所述的电子媒介在矿物形成、微生物产电、污染物生物降解、微生物合成纳米材料等诸多生物电化学系统中，具有重要的作用。例如，电化学活性细菌具有将电子传递给胞外电子受体的能力，这种能力可用于微生物燃料电池产电；其胞外电子传递通常通过细菌和胞外电子受体直接接触或由溶液中的电子媒介介导完成。
基于电子媒介在生物电化学系统中所具有的重要作用，实现溶液中电子媒介的检测有利于其基础性的研究和实际应用。目前，现有的定性检测方法主要是利用电化学手段或异化金属还原实验进行检测。其中，电化学方法只能检测出具有氧化还原活性的物种存在，但不能确保其是否应用为生物的电子媒介。而异化还原金属的方法测试时间很长，测试结果也不尽准确。
定量检测方面一般是测定电子转移容量，目前主要针对环境中能够充当电子媒介的水溶性有机物，通过其与化学试剂的氧化还原反应，或通过电化学测试，测定所述水溶性有机物的电子转移容量。其中，单组分的电子媒介如核黄素、蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)、吩嗪等，在电子转移过程中所能接受或供给的电子量是相同的，其电子转移能力主要受电子媒介与电化学活性细菌的亲和力及其循环能力决定。因此，上述传统方法在生物电子媒介电子转移容量的检测过程中存在较大局限，检测准确性有待提高。
因此，开发一种准确度高的生物电子媒介的检测技术具有重大的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本申请提供三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介的应用，该探针可快速准确地定性检测溶液中的生物电子媒介，也可定量测定生物电子媒介的电子转移能力，准确度高。
本发明提供三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介中的应用，所述溶液中包括电化学活性细菌，通过对比分析三氧化钨的颜色变化情况，得到生物电子媒介的检测结果。
本发明提供一种定性检测溶液中生物电子媒介的方法，包括以下步骤：
在隔绝细菌物质存在的条件下，将三氧化钨纳米材料与待测溶液相接触，所述待测溶液中包括电化学活性细菌，所述三氧化钨纳米材料从白色变为蓝色，得到所述待测溶液中含有生物电子媒介；
所述隔绝细菌物质具有生物相容性，用于隔绝三氧化钨纳米材料与电化学活性细菌之间的直接接触。
优选地，所述隔绝细菌物质为海藻酸钙；所述三氧化钨纳米材料为三氧化钨纳米棒。
优选地，所述定性检测的方法包括如下步骤：
S1、制备由海藻酸钙和三氧化钨纳米棒构成的检测试纸；
S2、将所述检测试纸浸入包括电化学活性细菌的待测溶液中，作用一定时间后进行目视比色，得到所述待测溶液中生物电子媒介的含量。
优选地，所述步骤S1具体为：
将海藻酸钠溶液与三氧化钨纳米棒悬浊液混合，得到混合液；
将所述混合液涂布在基底上，干燥后浸入氯化钙溶液进行固化，得到含三氧化钨纳米棒的海藻酸钙试纸。
此外，本发明还提供一种定性检测溶液中生物电子媒介的方法，包括以下步骤：
将三氧化钨纳米材料分别与待测溶液及电化学活性细菌菌液相接触，所述待测溶液中包括等量的所述电化学活性细菌菌液；
目视比较接触后三氧化钨纳米材料的颜色深浅，颜色较深，所述待测溶液中含有生物电子媒介。
本发明提供一种定量检测溶液中生物电子媒介的方法，包括以下步骤：
将浓度呈梯度变化的生物电子媒介溶液分别与电化学活性细菌菌液混合，再加入三氧化钨纳米材料悬浊液，培养一段时间后得到不同的色度变化；
根据米式方程拟合变色速率与生物电子媒介浓度的关系，得到生物电子媒介转移电子的能力。
优选地，所述定量检测的方法具体包括：
将浓度呈梯度变化的生物电子媒介溶液分别与模式电化学活性细菌希瓦氏菌菌液稀释后混合，再加入三氧化钨纳米棒悬浊液，培养一段时间；
将培养后的混合物表面扫描成像并读取色度，利用米式方程拟合变色速率与生物电子媒介浓度的关系，得到生物电子媒介转移电子的能力。
优选地，所述希瓦氏菌菌液使用含有20mM乳酸钠的矿物盐培养基重悬，用量为50μL，浓度为OD580＝5～10。
优选地，所述三氧化钨纳米棒悬浊液的用量为50μL，浓度为10～30g/L。
优选地，所述利用米式方程拟合，得到Km和Vmax值计算出V0，用以表示生物电子媒介转移电子的速率；计算公式为V0＝Vmax/Km；
或，直接拟合反应速率和生物电子媒介浓度的双倒数图，其斜率为V0的倒数拟合。
与现有技术相比，本发明提供了三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介的应用。本发明主要利用三氧化钨纳米探针的电致变色反应，其在接受电子媒介传递的来自电化学活性菌的电子后发生颜色变化，从而实现生物电子媒介的定性检测和定量分析。本发明检测方法准确度高，稳定性好。此外，本发明制备检测试纸方便携带，一次制备后可长时间使用，从而利于该探针的推广。实验结果表明，本发明该探针可用于检测不同生物电子媒介的电子转移能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例1制备的三氧化钨纳米棒的扫描电镜和透射电镜分析结果；
图2是本发明实施例1制备的三氧化钨纳米棒的X射线衍射谱图；
图3是本发明实施例2提供的试纸图片；
图4是本发明实施例2提供的测试后的试纸图片；
图5是本发明实施例3提供的电子媒介核黄素电子转移速率类酶动力学拟合图；
图6是本发明实施例3提供的电子媒介AQDS电子转移速率类酶动力学拟合图；
图7是本发明实施例5提供的腐殖酸电子转移速率测定的动力学拟合图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介中的应用，所述溶液中包括电化学活性细菌，通过对比分析三氧化钨的颜色变化情况，得到生物电子媒介的检测结果。
本发明所述探针可检测溶液中是否含有生物电子媒介，该定性检测快速、准确；并且，所述探针可定量测定生物电子媒介的电子转移能力，具有操作简便、准确度高的特点。
本发明所采取的一种定性检测溶液中生物电子媒介的技术方案是：
在隔绝细菌物质存在的条件下，将三氧化钨纳米材料与待测溶液相接触，所述待测溶液中包括电化学活性细菌，所述三氧化钨纳米材料从白色变为蓝色，得到所述待测溶液中含有生物电子媒介；所述隔绝细菌物质具有生物相容性，用于隔绝三氧化钨纳米材料与电化学活性细菌之间的直接接触。
在本发明的实施例中，所述隔绝细菌物质为海藻酸钙；电化学活性细菌的体积很大，不能通过海藻酸钙的层状结构与三氧化钨发生接触，而小分子的电子媒介如核黄素、蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)、吩嗪等可以通过，这样三氧化钨纳米材料的变色明显，便于定性检测。本发明实施例所述的三氧化钨纳米材料可以为颗粒、棒状等形貌，优选采用三氧化钨纳米棒。
本发明优选实施例利用海藻酸钙隔绝三氧化钨纳米棒与电化学活性细菌之间的直接接触，三氧化钨纳米棒在接受电子媒介传递的来自电化学活性细菌的电子后，从白色变为蓝色，得到待测溶液中含有生物电子媒介，如不变色，得到待测溶液中不含有生物电子媒介，此为定性方法。
为了更加方便、快速定性检测溶液中是否含有生物电子媒介，本发明实施例提供了由海藻酸钙和三氧化钨纳米棒构成的检测试纸。在本发明的实施例中，所述检测试纸具体以海藻酸钠溶液和三氧化钨纳米棒悬浊液为原料制得；制备步骤如下：
将海藻酸钠溶液与三氧化钨纳米棒悬浊液混合，得到混合液；将所述混合液涂布在基底上，干燥后浸入氯化钙溶液进行固化，得到含三氧化钨纳米棒的海藻酸钙试纸，即由海藻酸钙和三氧化钨纳米棒构成的检测试纸。
具体地，本发明实施例首先制备三氧化钨纳米棒，可按照以下步骤进行制备：将钨酸钠和氯化钠溶解在水中，随搅拌加入盐酸溶液调节溶液pH至 2.0，调节后的溶液在反应釜中加热进行水热反应，得到三氧化钨纳米棒。其中，所述调节后的溶液即水热反应溶液，其用量优选低于反应釜体积的70％。所述钨酸钠的用量优选为0.12～0.13M，更优选为0.125M。所述氯化钠的用量优选为0.2～0.3M，更优选为0.25M；所述盐酸的浓度优选为3M。所述水热反应的温度优选为160～200℃，更优选为180℃；水热反应时间优选为18～24 h，更优选为24h。所述三氧化钨纳米棒的直径50nm左右，长1-2μm。
本发明实施例将制得的三氧化钨纳米棒分散形成悬浊液，将海藻酸钠溶液与其混匀，得到混合液。其中，所述海藻酸钠溶液的浓度优选为2～3g/L，更优选为2.5g/L。在本发明中，优选将海藻酸钠与水混合得到的海藻酸钠溶液静止12h，使其完全溶解分散；溶解方法优选为在80℃恒温水浴中保持1h。所述海藻酸钠溶液和三氧化钨纳米棒悬浊液的体积比优选为4:1；所述三氧化钨纳米棒悬浊液的浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L。
本发明实施例将海藻酸钠和三氧化钨纳米棒的混合液均匀涂布在基底，例如ITO导电玻璃等亲水基底上，优选在60℃烘干；然后将烘干的导电玻璃浸入氯化钙溶液中，优选固化2小时，形成湿的海藻酸钙试纸，将其揭下，贴在垂直于地面的玻璃平面上晾干，得到含三氧化钨纳米棒的检测试纸，可简称三氧化钨试纸。其中，采用亲水基底利于得到均匀的膜；所述氯化钙溶液的浓度优选为2wt％。所述检测试纸的颜色为白色，形态均一。
获得检测试纸后，裁切规格优选为1×3cm2，本发明实施例用其对待测溶液进行检测，具体过程包括：先将样品溶液与希瓦氏菌菌液等体积混合，形成待测溶液，再将所述检测试纸浸入其中，作用一定时间后进行目视比色，得到所述待测溶液中生物电子媒介的定性含量。
在本发明的实施例中，所述浸入后作用的时间优选为10～60min，更优选为30min。之后，本发明实施例将所述检测试纸取出并对比颜色变化，试纸变蓝说明样品溶液中含有生物电子媒介。本发明实施例提供的该定性检测方法效果明显，简便易行，可操作性强。
此外，本发明还提供了一种定性检测溶液中生物电子媒介的方法，包括以下步骤：
将三氧化钨纳米材料分别与待测溶液及电化学活性细菌菌液相接触，所述待测溶液中包括等量的所述电化学活性细菌菌液；
目视比较接触后三氧化钨纳米材料的颜色深浅，颜色较深，所述待测溶液中含有生物电子媒介。
进一步地，本发明实施例提供了一种定量检测溶液中生物电子媒介的方法，包括以下步骤：
将浓度呈梯度变化的生物电子媒介溶液分别与电化学活性细菌菌液混合，再加入三氧化钨纳米材料悬浊液，培养一段时间后读取变色情况并记录色度变化；根据米式方程拟合变色速率与生物电子媒介浓度的关系，定量生物电子媒介转移电子的能力。
在本发明的实施例中，所述的电化学活性细菌的代表属为Geobacter和Shewanella；其中Geobacter是严格厌氧菌，为了实验操作的简便，本发明优选采用兼性厌氧的Shewanella。进一步的，Shewanella oneidensis MR-1是湖底厌氧沉积物中分离出的模式电化学活性细菌，引用文献可为Mevers,E.；Su, L.；Pishchany,G.；Baruch,M.；Cornejo,J.；Hobert,E.；Dimise, E.；Ajo-Franklin,C.M.；Clardy,J.,An elusiveelectron shuttle from a facultative anaerobe.Elife 2019,8。
具体地，本发明实施例将浓度呈梯度变化的生物电子媒介溶液分别与模式电化学活性细菌希瓦氏菌菌液稀释后混合，可采用96孔板进行混合操作，再分别加入等量的三氧化钨纳米棒悬浊液，培养一段时间；将培养后的混合物表面使用扫描仪进行扫描成像，用Image Pro Plus软件进行色度读取，利用米式方程拟合变色速率与生物电子媒介浓度之间的关系，得到生物电子媒介转移电子的能力。
在本发明提供的上述定量电子媒介电子转移能力的方法中，所述希瓦氏菌菌液优选使用含有20mM乳酸钠的矿物盐培养基重悬，用量优选为50μL，浓度优选为OD580＝5～10，更优选OD580＝10。所述三氧化钨纳米棒悬浊液的用量优选为50μL，浓度优选为10～30g/L，更优选为20g/L。所述生物电子媒介溶液如核黄素、蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)、吩嗪、腐殖酸等，优选使用含有 20mM乳酸钠的矿物盐培养基梯度稀释，用量优选为100μL。在本发明中，进行生物电致变色实验之前，优选先进行预试验，具体过程包括：配制电子媒介的饱和溶液，梯度稀释为20组不同浓度的电子媒介溶液，通过一次生物电致变色实验确定正式实验的稀释倍数。
在本发明的具体实施例中，所述的矿物盐培养基的成分为：每升水中，包含NaCl5.85g，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)11.91g，NaOH 0.3g，NH4Cl 1.498g，KCl 0.097g，NaH2PO4·2H2O 0.67g，微量元素液4mL；用5mol/L KOH 溶液调节溶液pH至7.0；通高纯度氮气15分钟除氧。其中微量元素液的成分为：每升水中，包含氨三乙酸(NTA)1.5g，MgSO4·7H2O5g，MnSO4·H2O 5g， NaCl 10g，FeSO4·7H2O 1g，CaCl2·2H2O 1g，CoCl2·6H2O 1g，ZnCl21.3g， CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.1g，H3BO3 0.1g，Na2MoO4·2H2O 0.25 g，NiCl2·6H2O 0.25g，Na2WO4·2H2O 0.25g。
本发明实施例将希瓦氏菌菌液、三氧化钨纳米棒悬浊液和生物电子媒介溶液分别加入96孔板中，可向孔中加入80μL石蜡油进行封口，优选于30℃培养30分钟，然后扫描成像、读色，使用米式方程进行拟合。
在本发明中，用电子媒介促进的三氧化钨色度变化与空白组的差值表示电子传递的反应速率。可用以下两种方式拟合：
1)直接利用所得数据拟合米氏方程得到Km和Vmax值，计算出V0用以表示电子媒介转移电子的速率；计算公式为V0＝Vmax/Km；
2)直接拟合反应速率和电子媒介浓度的双倒数图，其斜率为V0的倒数。
综上所述，本发明中的三氧化钨纳米材料可作为快速检测生物电子媒介的电致变色纳米探针。本发明提供的方法包括以下部分：一方面，提供检测试纸，利用海藻酸钙隔绝三氧化钨纳米棒与电化学活性细菌之间的直接接触，在接受电子媒介传递的来自微生物的电子后从白色变为蓝色，此为定性方法；另一方面，将电子媒介溶液梯度以及模式电化学活性细菌希瓦氏菌稀释后加入96孔板，再加入三氧化钨纳米棒悬浊液，培养一段时间后读取变色情况并记录色度变化，根据米氏方程拟合变色速率与电子媒介浓度的关系，定量电子媒介转移电子的能力。
本发明提供的三氧化钨纳米棒可通过其生物电致变色反应实现生物电子媒介的定性检测和定量分析，准确度高、稳定性好，且试纸方便携带，一次制备后可长时间使用，从而利于本探针的推广。实验结果表明，本电致变色纳米探针可用于检测不同电子媒介的电子转移能力。
为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的三氧化钨作为纳米探针检测溶液中生物电子媒介的应用进行具体地描述。但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。
以下实施例中的原料均为市售产品。
实施例1：三氧化钨纳米棒的合成
准确称量0.825g Na2WO4·2H2O和0.290g NaCl溶解在20mL去离子水中，搅拌至溶解完全。随后，一边搅拌一边将3M HCl溶液缓慢滴入上述溶液中，直至溶液的pH达到2.0。将调节后的溶液转移到容积45mL的聚四氟乙烯内胆，置入不锈钢高压反应釜中，拧紧反应釜使其在180℃烘箱中保温 24小时。反应结束后，将所述高压反应釜自然冷却至室温，然后用0.22μm 的微孔滤膜抽滤，得到白色产物。最后，用200mL超纯水将所得白色产物重悬并超声分散，而后用0.22μm的微孔滤膜抽滤，洗涤，该分散-洗涤过程重复三次后，将得到的滤饼置于40℃烘箱内烘干，备用。
所合成的三氧化钨纳米棒的电镜照片及物相分析依次参见图1、图2，图 1中(a)和(b)分别是SEM照片、TEM照片，图2是基于XRD的物相分析结果。所述三氧化钨纳米棒的直径50nm左右，长1-2μm。
实施例2：生物电子媒介的定性检测
(1)检测试纸的制备；
将海藻酸钠(购自国药集团)置于表面皿中，在70℃烘箱内干燥24h。准确称取0.5g干燥的海藻酸钠，少量多次地加入200mL去离子水中，不断用玻璃棒搅拌并超声分散，放置过夜，形成均匀的悬浊液。将此悬浊液置于80℃水浴锅内恒温加热1小时，直到其变为半透明的凝胶状，即为海藻酸钠溶液(也称海藻酸钠凝胶)，冷却至室温，待用。
取实施例1制备的三氧化钨纳米棒1.25g，加入50mL水，超声20分钟使其形成均匀的悬浊液，再将其加入上述冷却的海藻酸钠凝胶，搅拌使之混匀，形成三氧化钨-海藻酸钠凝胶。将该三氧化钨-海藻酸钠凝胶(或称混合液) 均匀涂布在ITO导电玻璃上，在60℃烘干，然后浸入2％氯化钙溶液中室温固化2小时，清水洗净，揭下所形成的湿的海藻酸钙试纸，贴在与地面垂直的玻璃板上自然晾干。将所得检测试纸裁切为1×3cm2，厚度约0.1mm，颜色为白色，具体如图3所示。
(2)样品溶液的准备；
在LB培养基中，分别培养希瓦氏菌黄素分泌途径敲除株Shewanella oneidensisΔbfe和希瓦氏菌黄素过表达株Shewanella oneidensis Oef，在30℃、 200rpm条件下培养16小时，然后离心收集上清液，使用0.22μm滤膜过滤，分别得到Δbfe和Oef的培养上清液，作为样品溶液备用。所述的两个突变株通过现有基因编辑方式获得，引用文献可为Kotloski,N.J.；Gralnick,J.A., Flavin electron shuttles dominate extracellularelectron transfer by Shewanella oneidensis.MBio 2013,4(1),e00553-12.
另，分别配制50μM的核黄素溶液和10mMAQDS溶液，并加入前文所述的Shewanellaoneidensis MR-1菌液，备用。Shewanella oneidensis MR-1是本测试方法的电子源，所以所有的测试均需添加其菌液。
(3)测定；
将上述样品溶液分别与含有乳酸钠的矿物盐培养基(培养基成分如前所述)等体积混合，分别浸入试纸，作用30分钟，进行比色，结果如图4所示。
图4从左到右依次为：空白检测试纸，Δbfe菌株培养上清液浸润作用后的试纸，Oef菌株培养上清液浸润作用后的试纸，核黄素溶液浸润作用后的试纸，AQDS溶液浸润作用后的试纸。其中，Δbfe菌株培养上清液浸润作用后的试纸与空白试纸颜色一致，Oef菌株培养上清液浸润作用后的试纸基本一致；相比于空白试纸，核黄素溶液浸润作用后的试纸和AQDS溶液浸润作用后的试纸均呈现比较明显的蓝色，前者颜色略深于后者。
结果表明，细菌和三氧化钨纳米棒之间的直接接触被海藻酸钙完全隔绝；只有当溶液中含有电子媒介时，试纸才会在电化学活性细菌的作用下变蓝。而从不同实验组颜色的差异也可以看出，电子媒介浓度或种类不同，试纸的显色程度也会有明显差异。
实施例3：核黄素和AQDS的电子传递能力对比
步骤一：培养希瓦氏菌，将Shewanella oneidensis MR-1菌株(与实施例2 定性检测的菌株相同)在LB培养基中培养至对数期。离心收集细菌，用不含电子供体的无机矿物盐培养基重悬三次；最后一次使用含有乳酸钠的矿物盐培养基稀释至OD580＝10。
步骤二：生物电致变色反应，将步骤一稀释后的希瓦氏菌菌液、三氧化钨纳米棒悬浊液(按照实施例2中制备)和电子媒介溶液分别加入96孔板中；核黄素的浓度梯度取：将50μL希瓦氏菌菌液、100μL核黄素纯溶液和50μL 三氧化钨纳米棒悬浊液先后加入96孔板中，每个浓度设置三组平行实验；核黄素浓度梯度为：0.1μM,0.2μM,0.3μM,0.4μM,0.5μM,0.6μM,0.8μM,1.0 μM,1.2μM,1.4μM,1.6μM,1.8μM,2.0μM,2.5μM,3.0μM,3.5μM,4.0μM,4.5 μM,5.0μM,5.5μM,6.0μM,7.0μM,8.0μM,9.0μM,10.0μM。向每个孔中加入 80μL石蜡油进行封口；在30℃培养箱中培养30分钟，使用扫描仪进行扫描成像；
并且，将AQDS纯溶液替换核黄素纯溶液，进行同样操作。
步骤三：拟合，用Image Pro Plus软件进行读色，每组色度与未添加电子媒介空白组的色度作差，得到电子媒介转移电子的速度；直接拟合反应速率和电子媒介浓度的双倒数图，由其斜率的倒数求得V0。得到的拟合结果分别如图5和图6所示，图5为核黄素溶液的拟合结果，图6为AQDS溶液的拟合结果。
结果说明，不同电子媒介介导的电子传递能很好地以米氏方程进行拟合，核黄素(Riboflavin)的电子转移速率常数V0约为130000M-1，而AQDS的电子转移速率常数约为1700M-1，因而该方法能够实现快速的电子转移能力定量检测。
实施例4：电子媒介定量检测准确性
在含有核黄素和AQDS的混合溶液中同时进行各自含量的定量，具体过程如下：分别配制50nM,200nM,400nM,500nM,600nM,700nM,800nM的核黄素溶液和500nM,1000nM,2000nM,3000nM,5000nM的AQDS溶液。使用前述方法检测不同浓度的两种电子媒介促进WO3变色的能力，通过促进作用的提高倍数确定待测溶液中电子媒介浓度与基准溶液浓度的倍数关系。
检测结果参见表1，从表1可见，该方法能够准确地测定混合溶液中不同种类电子媒介的含量而不会发生相互干扰。
表1.含有核黄素和AQDS的混合溶液的检测结果
Figure BDA0002247849500000111
Figure BDA0002247849500000121
实施例5、腐殖酸(HA)的电子传递能力定量
步骤一：培养希瓦氏菌，将Shewanella oneidensis MR-1菌株在LB培养基中培养至对数期。离心收集细菌，用不含电子供体的无机矿物盐培养基重悬三次；最后一次使用含有乳酸钠的矿物盐培养基稀释至OD580＝10。
步骤二：生物电致变色反应，将稀释后的希瓦氏菌菌液、三氧化钨纳米悬浊液和电子媒介溶液分别加入96孔板中；将50μL希瓦氏菌菌液、100μL腐殖酸溶液和50μL三氧化钨悬纳米棒浊液先后加入96孔板中，每个浓度设置三组平行实验；腐殖酸的浓度梯度为：2 mg/L,4mg/L,6mg/L,8mg/L,10mg/L, 12mg/L,16mg/L,20mg/L,40mg/L,60mg/L,100mg/L,200mg/L。向每个孔中加入80μL石蜡油进行封口；在30℃培养箱中培养30分钟，使用扫描仪进行扫描成像；
步骤三：拟合，用Image Pro Plus软件进行读色，每组色度与未添加电子媒介空白组色度作差，得到电子媒介转移电子的速度；直接拟合反应速率和电子媒介浓度的双倒数图，由其斜率的倒数求得V0。得到的拟合图如图5所示，V0约为6.06g-1·L。结果说明，腐殖酸介导的电子传递能很好地以米氏方程进行拟合。
由以上实施例可知，本发明主要利用三氧化钨纳米探针的电致变色反应，其在接受电子媒介传递的来自电化学活性菌的电子后发生颜色变化，从而实现生物电子媒介的定性检测和定量分析；本发明该探针可用于检测不同生物电子媒介的电子转移能力。本发明检测方法准确度高，稳定性好。此外，本发明制备检测试纸方便携带，一次制备后可长时间使用，从而利于该探针的推广。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于使本技术领域的专业技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，是能够实现对这些实施例的多种修改的，而这些修改也应视为本发明应该保护的范围。

Claims (3)

1.一种定量检测溶液中生物电子媒介的方法，包括以下步骤：
将浓度呈梯度变化的生物电子媒介溶液分别与模式电化学活性细菌希瓦氏菌菌液稀释后混合，再加入三氧化钨纳米棒悬浊液，培养一段时间后得到不同的色度变化；
将培养后的混合物表面扫描成像并读取色度，利用米氏方程拟合变色速率与生物电子媒介浓度的关系，得到生物电子媒介转移电子的能力；
所述利用米氏方程拟合，得到米氏常数Km和最大变色速率Vmax值计算出电子转移速率常数V0，用以表示生物电子媒介转移电子的速率；计算公式为V0=Vmax/Km；
或，直接拟合反应速率和生物电子媒介浓度的双倒数图，其斜率为V0的倒数拟合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述希瓦氏菌菌液使用含有20 mM乳酸钠的矿物盐培养基重悬，用量为50 μL，浓度为OD580=5~10。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述三氧化钨纳米棒悬浊液的用量为50 μL，浓度为10~30 g/L。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104697990A (zh) * 2015-01-06 2015-06-10 山东理工大学 脲酶米氏常数测定方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101407763A (zh) * 2008-11-28 2009-04-15 哈尔滨工业大学 一种电化学活性菌株的分离及电化学活性的检验方法
JP6410188B2 (ja) * 2013-07-31 2018-10-31 国立大学法人名古屋大学 電子伝達システム及びその用途
CN104263672B (zh) * 2014-07-23 2016-08-24 常州市第一人民医院 一株高产电的希瓦氏菌及其应用
CN108330136A (zh) * 2017-05-05 2018-07-27 北京航空航天大学 一种构建产黄素单核苷酸的工程菌株的方法及其应用
CN109987719B (zh) * 2019-03-20 2023-10-27 山东师范大学 一种分离产电菌的装置及方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104697990A (zh) * 2015-01-06 2015-06-10 山东理工大学 脲酶米氏常数测定方法

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