CN110687303A - 一种检测he4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测HE4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用,该光电化学免疫传感器由由Nb2共价结合到MWCNTs‑PDA‑AuNPs修饰后的基底电极上,HE4抗原与Nb2特异性结合,Nb3@nPCN‑224与HE4抗原特异性结合制得。本发明利用光电化学免疫法提高了传感器的抗干扰性,同时使用的光活性物质nPCN‑224具有很好的生物相容性,可以负载大量的生物分子,还具有很强的光电活性,以此来提高传感器的灵敏度。本发明制备的光电免疫传感器,操作简单,反应迅速,灵敏度高,抗干扰性强,稳定性佳,能够实现对于痕量抗原HE4的检测,为开发出用于临床诊断的优异平台提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域,具体涉及一种检测HE4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用。
背景技术
卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。对卵巢癌的早期诊断有助于病人的及时治疗从而提高病人的存活率,但由于卵巢深居盆腔,体积小,缺乏典型症状,难以早期发现,所以早期诊断是一大难题。在肿瘤发展的过程中,肿瘤组织或细胞会释放出一些特异性的蛋白质进入循环体系,而这些特异性蛋白在血液中的含量水平标志着肿瘤发展的阶段,所以在生物医学上常将这些特异性蛋白称为肿瘤标记物。而尽早的检测出肿瘤标记物是影响癌症患者恢复的关键因素。HE4是一种新型的卵巢癌特异性肿瘤标志物,研究表明尤其在早期阶段,HE4的特异性和灵敏度要高于常见标志物CA125,所以实现对HE4的高特异性和高灵敏度的检测在卵巢癌的医学研究和检测方面及其重要。
目前,对HE4的常用检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA),酶免疫分析法(EIA)和放射免疫分析法(IRMA)等,但这些方法大多仪器昂贵,操作复杂、耗时。光电化学分析是一种基于光电化学活性物质的光电信号转换而进行检测的一种分析方法,其成本低、设备简单、易于微型化、背景信号低,可降低检测下限,已广泛应用于DNA分析,细胞检测和酶传感中,当然光电免疫分析用于标志物的检测不仅可以利用光电化学分析的优点,还可以可提高检测的灵敏度和特异性。另外,光电活性材料在光电免疫分析中扮演着很重要的角色,MOF作为一种有机-无机杂化材料,其多孔性强,比表面积大,具有结构与功能的多样性,可用于标记生物分子。同时,卟啉基MOF是一种很好的光电活性物质,光的吸收效率高。另外,可以通过改变MOF合成的条件来调控MOF的尺寸,nMOFs和microsized MOFs相比更适用于传感器的信号转导。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种基于具有稳定和高光电活性物质nPCN-224的光电化学免疫传感器用于卵巢癌标志物HE4的检测,该光电化学免疫传感器操作简便,灵敏度高,稳定性佳,选择性好,能够实现对于痕量HE4抗原的检测,为定量检测HE4提供了有效的工具。本发明制备的传感器为Nb3@nPCN-224/Ag/Nb2/M-P-A/ITO,后将此传感器放入电解液中进行光电检测。
本发明的另一个目的是提供所述检测HE4的光电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的另一个目的是提供所述检测HE4的光电化学免疫传感器的应用。
本发明中技术术语的缩写如下:
多壁碳纳米管:MWCNTs;盐酸多巴胺:DA;聚多巴胺:PDA;金纳米粒子:AuNPs;meso-四(对-羧基苯基)卟啉:H2TCPP;苯甲酸:BA;人附睾蛋白4:HE4;HE4纳米抗体:Nb2,Nb3;牛血清蛋白:BSA;氧化铟锡半导体电极:ITO。
本发明中的原料中的捕获抗体:Nb2和标记抗体:Nb3按照文献Highly Selectiveand Sensitive Electrochemical Immunoassay of Cry1C Using Nanobody andπ-πStacked Graphene Oxide/Thionine Assembly(Anal.Chem.2016,88,9830-9836)合成。此外,其他原料均由市售可得。其中多壁碳纳米管MWCNTs购置于先丰纳米材料科技有限公司(为羧基化的MWCNTs);盐酸多巴胺DA购置于百灵威科技有限公司;附睾蛋白HE4抗原购置于北京义翘神州科技有限公司;H2TCPP购置于Sigma-Aldrich西格玛奥德里奇有限公司。
技术方案:为了实现上述目的,如本发明所述一种检测HE4的光电化学免疫传感器,其特征在于,由Nb2共价结合到MWCNTs-PDA-AuNPs修饰后的基底电极上,HE4抗原与Nb2特异性结合,Nb3@nPCN-224与HE4抗原特异性结合制得。
作为优选,所述基底电极为氧化铟锡半导体电极。
其中,所述MWCNTs-PDA-AuNPs由DA加入到MWCNTs的分散液中(溶剂为水),搅拌反应生成MWCNTs-PDA分散液,后将HAuCl4和Na3C6H5O7·2H2O加入到MWCNTs-PDA的分散液中反应生成MWCNTs-PDA-AuNPs分散液。
优选地,所述的MWCNTs-PDA-AuNPs由以下方法制备而成:
称取5-20mg羧基化MWCNTs分散于8-10mL的1×Tris-HCl缓冲液中,后加入0.5-2mL10-40mg/mL的DA溶液(溶剂为1×Tris-HCl缓冲液),避光反应18-30h,离心洗涤得MWCNTs-PDA,后分散于20-30mL H2O中,调节其pH至4.0-6.0,接着加入300-400μL 0.05-0.2M的氯金酸水溶液,后缓慢加入4-6mL0.05-0.2M现配的柠檬酸钠水溶液,反应1-3h,离心洗涤得MWCNT-PDA-AuNPs。
其中,所述Nb3@nPCN-224由H2TCPP、ZrOCl2·8H2O和BA溶于DMF中,加热(水热法)反应得到nPCN-224,后用NHS和EDC的混合液进行活化,接着用Nb3标记nPCN-224,即得Nb3@nPCN-224。
优选地,所述的Nb3@nPCN-224由以下方法制备而成:
(1)nPCN-224的合成:将5-20mg H2TCPP、20-40mg ZrOCl2·8H2O和250-300mg BA溶于5-20mL DMF中,加热反应,得到紫色固体为nPCN-224,离心洗涤,溶于DMF中形成分散液备用;
(2)Nb3@nPCN-224的合成:将100-300μL的50-200μg/mL Nb3的PBS溶液加入到活化后的nPCN-224的分散液中,孵育培养,然后加入BSA溶液封闭,离心,PBS溶液洗涤,最后分散在PBS溶液中保存,即为Nb3@nPCN-224。
步骤(1)中,加热温度为80-100℃,优选为90℃。加热时间为2-4h,优选为3h。
步骤(2)中,所述的PBS溶液为0.01M pH=7.4的PBS溶液。孵育温度为3.8-4.2℃,优选为4℃。孵育时间为10-14h,优选为12h。BSA的质量分数为0.5-5%,优选为1%,溶剂为0.01M pH=7.4的PBS溶液。封闭温度为25-37℃,优选为37℃。封闭时间为20-40min,优选为30min。
本发明所述的检测HE4的光电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)基底材料固定:将MWCNTs-PDA-AuNPs分散液滴涂在ITO表面,干燥后用超纯水清洗,晾干;
(2)锚定识别分子:向步骤(1)得到的基底电极表面滴加EDC/NHS的混合液,室温放置后用PBS溶液清洗,清洗后将识别分子捕获抗体Nb2滴加到基底电极上,孵育后用PBS溶液清洗;
(3)非特异性位点封闭:向步骤(2)得到的电极表面滴加BSA溶液,25-37℃下封闭0.5-1h,后用PBS溶液清洗;
(4)孵育目标分子HE4:将HE4抗原溶液滴加到步骤(3)得到的电极上,在25-37℃下反应30-70min,后用PBS溶液清洗除去未特异性结合的抗原;
(5)光电化学免疫传感器的构建:将Nb3@nPCN-224分散液滴加到步骤(4)得到的电极表面进行特异性反应,25-37℃孵育30-70min,后用PBS溶液清洗,晾干,即得检测HE4的光电化学免疫传感器。
步骤(1)中,MWCNTs-PDA-AuNPs的浓度为0.1-1mg/mL,分散剂为H2O优选为0.75mg/mL。MWCNTs-PDA-AuNPs是过量的。所述过量为滴加的量比实际起作用的量要多,所以反应完要清洗。
步骤(2)中,NHS浓度为5-20mg/mL,优选为10mg/mL,溶剂为0.01M,pH=6PBS溶液。EDC浓度为10-30mg/mL,优选为20mg/mL,溶剂为0.01M,pH=6PBS溶液。Nb2的浓度为1-40μg/mL,优选为10μg/mL,溶剂为0.01M,pH=7.4PBS溶液。PBS溶液的浓度为0.01M,pH=7.4。EDC/NHS和Nb2是过量的。
步骤(3)中,BSA的质量分数为0.5-5%,优选为1%,溶剂为0.01M pH=7.4的PBS溶液。BSA溶液是过量的。
步骤(4)中,PBS溶液的浓度为0.01M,pH=7.4。
步骤(5)中,Nb3@nPCN-224分散液的浓度为0.5-2.0mg/mL,优选为1.0mg/mL。Nb3@nPCN-224分散液是过量的。PBS溶液的浓度为0.01M,pH=7.4。
作为优选,步骤(2)中所述孵育为3.8-4.2℃孵育12-15h。步骤(2)中所述封闭为25-37℃下封闭0.5-1h。
本发明所述的检测HE4的光电化学免疫传感器在定量检测HE4中的应用。
具体的,本发明检测HE4的光电化学免疫传感器在为定量检测HE4中的提供有效的工具,在制备定量检测HE4工具中的应用。
工作原理:卟啉类衍生物是一类常用的光电化学活性物质,具有很强的光吸收和发射的能力和很好的光电转换效率。同时,由于MOF的多孔3D结构,卟啉基MOF不仅可以提高其光电信号的稳定性,同时也可以提高光电转换效率。本发明利用H2TCPP作为MOF合成的前驱体,通过水热法合成出具有纳米级尺寸的nPCN-224,后利用nPCN-224的优异的光电性能以及能与生物分子进一步偶联的特点,构建了基于nPCN-224的signal-on型的光电化学免疫传感器来检测卵巢癌标志物HE4。所构建的免疫传感器成本低廉,操作简单,灵敏度高,稳定性好,选择性佳,易于微型化,有望在临床医学诊断方面进一步发挥作用。
本发明将具有很好导电性和稳定性的MWCNTs-PDA-AuNPs复合物作为基底材料负载到电极表面用以提高传感器的性能,并利用其表面的AuNPs来连接识别分子Nb2构成捕获层来特异性结合HE4,后HE4再与Nb3@nPCN-224复合物特异性结合构成夹心型光电免疫传感器。
本发明提供了一种利用光活性物质nPCN-224对卵巢癌标志物HE4进行检测的光电免疫生物传感器的方法。首先通过稀释单晶合成体系,生成更多的MOF单体(本发明合成的nPCN-224),来降低MOF尺寸合成出具有纳米级尺寸的nPCN-224,其光电活性比其前驱体H2TCPP的光电活性强3.5倍左右,并且可以利用H2TCPP末端的羧基来进一步偶联标记抗体Nb3形成复合物Nb3@nPCN-224,可用其作为signal-on型免疫传感的光电化学探针.
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
本发明利用光电活性物质nPCN-224构建了signal-on型双抗夹心型光电化学免疫生物传感器,其中Nb3@nPCN-224和HE4结合后,光电流明显增强,用于卵巢癌标志物HE4的检测。此发明的优势在于利用光电化学免疫法提高了传感器的抗干扰性,同时使用的光活性物质nPCN-224具有很好的生物相容性,可以负载大量的生物分子,还具有很强的光电活性,以此来提高传感器的灵敏度。利用该方式所制备的光电免疫传感器,操作简单,反应迅速,灵敏度高,抗干扰性强,稳定性佳,能够实现对于痕量抗原HE4的检测,为开发出用于临床诊断的优异平台提供了新思路。
本发明利用MWCNTs-PDA-AuNPs作为电极基底共价连接HE4第一抗体Nb2,以H2TCPPP作为前驱体通过水热法合成纳米级尺寸的nPCN-224作为光电活性物质,并与HE4第二抗体Nb3复合为Nb3@nPCN-224作为光电化学探针,构建了signal-on型的光电化学双抗体夹心免疫传感器来检测卵巢癌标志物HE4。本发明中的nPCN-224光电流强度为其前驱体H2TCPP光电流强度的3.5倍,所构建的光电免疫传感器与传统的酶联免疫吸附法等方法相比,操作简便,价廉,易于微型化且灵敏度高,特异性和稳定性好。
附图说明
图1为nPCN-224的光电活性检测图。
图2为免疫传感器的组装过程中光电检测电流-时间图。
图3为免疫传感器的组装过程中电极表面阻抗变化曲线。
图4为HE4浓度与光电流强度变化率之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。
实施例1
Nb3@nPCN-224复合物的制备
(1)nPCN-224的合成:用分析天平精确称取10mg H2TCPP,30mg ZrOCl2·8H2O和290mg BA于10mL DMF中,后于90℃烘箱中水热反应3h,冷却至室温,离心洗涤,沉淀复溶于DMF中待用得到nPCN-224。
(2)Nb3@nPCN-224复合物的合成:取200μL 5mg/mL nPCN-224溶液于1mL的10mg/mLNHS和20mg/mL EDC的混合液中,室温活化2h,后离心洗涤,沉淀复溶于2mL 0.01M pH=7.4PBS溶液中;接着加入200μL 100μg/mL Nb3(溶于0.01M pH=7.4PBS溶液),4℃培养12h,后离心洗涤;最后,加入2mL质量分数为1%的BSA溶液(溶于0.01M pH=7.4PBS溶液),37℃搅拌30min,后离心洗涤,沉淀分散于1mL 0.01M PBS(pH=7.4)溶液中待用。
实施例2
MWCNTs-PDA-AuNPs(M-P-A)复合物的制备
称取10mg羧基化MWCNTs分散于9mL的1×Tris-HCl缓冲液中,后加入1mL 20mg/mL的DA溶液(溶剂为1×Tris-HCl缓冲液),避光反应24h,离心洗涤固体物质得MWCNTs-PDA,后分散于25mL H2O中,调节其pH至5.0,接着加入350μL 0.1M的氯金酸水溶液,后缓慢加入5mL0.1M现配的柠檬酸钠水溶液,反应2h,离心洗涤固体物质得MWCNT-PDA-AuNPs。
实施例3
光电化学免疫传感器的制备方法
(1)基底材料固定
向0.16cm2固定面积的ITO上滴加10μL 0.75mg/mL MWCNTs-PDA-AuNPs(M-P-A)分散液(分散剂为H2O),37℃培养箱中干燥5h,后用超纯水涮洗,晾干,得M-P-A/ITO基底电极。
(2)锚定识别分子
以EDC/NHS为活化剂活化M-P-A上的羧基,连接Nb2与基底电极。即向步骤(1)得到的基底电极表面滴加10μL EDC(20mg·mL-1)与NHS(10mg·mL-1)的混合溶液,室温放置2h,然后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗,后将10μL 10μg/mL的识别分子Nb2溶液(溶剂为0.01M pH=7.4PBS溶液)滴加在基底电极表面,4℃孵育12h,使其负载在电极材料表面,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗掉未结合的Nb2。
(3)非特异性位点封闭:为了覆盖电极表面除抗体外还可能与抗原结合的非特异性识别位点。即向步骤(2)得到的基底电极表面滴加质量分数为1%BSA溶液(溶剂为0.01MpH=7.4PBS溶液),37℃封闭30min,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液洗涤除去多余的BSA溶液。
(4)目标分子HE4的孵育
将10μL待测HE4抗原溶液(浓度为10ng/mL,溶剂为0.01M pH=7.4PBS溶液)滴加在步骤(3)得到的基底电极表面,37℃下孵育1h,用0.01M PBS(pH=7.4)溶液洗涤除去未结合的HE4抗原。
(5)光电化学免疫传感器的构建
在步骤(4)得到的基底电极表面上滴加10μL制备好的1mg/mL Nb3@nPCN-224溶液(实施例1),37℃孵育1h,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗除去未与HE4结合的Nb3@nPCN-224,晾干,即得HE4光电化学免疫传感器。
将制备好的传感器放入0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液(pH=5)中检测电极在孵育HE4抗原后与结合Nb3@nPCN-224后两步的光电流变化,分析结果。
实施例4
nPCN-224的光电活性检测
(1)仪器:上海辰华电化学工作站(chi660e软件),氙灯光源,万用电表
(2)材料及试剂
ITO:氧化铟锡半导体电极,规格为0.4cm×0.4cm
电解液:0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液,pH=5
试剂:nPCN-224,H2TCPP
(3)方法:电极处理:ITO电极置于丙酮,乙醇,超纯水中各超声15min,氮气吹干,用万用电表测试正反并做标记待用。
滴样:于ITO电极表面分别滴加5μL 1mg/mL nPCN-224溶液和5μL 0.5mg/mLH2TCPP溶液,检测电极光电流强度。
测试:氙灯光源系统提供光照,利用电化学工作站三电极体系,观察电极表面光电流强度在有光照和无光照时的差异,比较nPCN-224和H2TCPP的光电活性。
(4)结果
nPCN-224的光电活性性质如图1所示,从图中可以看出nPCN-224的光电流强度大约为4.851μA·cm-2,且在保证nPCN-224中H2TCPP量相等的情况下,nPCN-224的光电流强度大约为其前驱体H2TCPP光电流的3.5倍,说明nPCN-224的3D多孔结构更有利于活性物质的富集和物质交换,从而促进光生电子和空穴的分离来提高光电流。
该实验的主要目的是为了证明所选取的光活性材料nPCN-224具有很强的光电流强度。
实施例5
传感器组装过程中电极表面光电流监测
(1)仪器:同实施例4
(2)材料及试剂:
ITO:同实施例4
电解液:同实施例4
试剂:同实施例4
(3)方法:
电极处理:同实施例4
传感器组装:按照实施例3进行光电免疫传感器的组装。
测试:氙灯光源系统提供光照,利用电化学工作站三电极体系,依次于0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液中检测观察电极表面电流在光照下的强度与其无光照时的差异,探究所构建的免疫传感器的可行性。
(4)结果:
图2为免疫传感器的组装过程中光电检测电流-时间图:a为ITO,b为M-P-A/ITO(实施例3步骤1),c为Nb2/M-P-A/ITO(实施例3步骤2),d为Ag/Nb2/M-P-A/ITO(实施例3步骤4),e为Nb3@nPCN-224/Ag/Nb2/M-P-A/ITO(实施例3步骤5)。从图2可以看出,当M-P-A固定在ITO上,光电流明显增强,可能是由于MWCNTs的光电活性所引起。后随着Nb2和HE4抗原的依次连接,由于生物分子的阻抗作用和导电性差,光电流逐渐降低。但在和Nb3@nPCN-224结合后,光电流明显提高,说明Nb3已成功地和nPCN-224进行复合,并且nPCN-224有很强的光电活性。该实验的目的是为了说明基于nPCN-224所构建的HE4光电免疫传感器的可行性。
实施例6
光电免疫传感器组装过程中电极表面阻抗监测
(1)仪器:上海辰华电化学工作站(chi660e软件)
(2)材料及试剂:
ITO:氧化铟锡半导体电极,规格为0.4cm×0.4cm
电解液:5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-,溶剂0.01M PBS溶液,pH=7.4
试剂:0.75mg/mL M-P-A、20mg/mL EDC、10mg/mL NHS、10μg/ml Nb2、1%BSA、10ng/mL HE4、1mg/mL Nb3@nPCN-224
(3)方法:
电极处理:ITO电极处理同实施例4
传感器组装:按照实施例3进行光电免疫传感器的组装。
测试:依次于5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-的磷酸盐缓冲液中检测其电化学阻抗图谱(electrochemical impedance spectroscopy,EIS),比较各步骤电极表面阻抗的变化,监测传感器的成功组装。
(4)结果:
图3为传感器组装过程中电极表面的阻抗监测图:a为ITO,b为M-P-A/ITO(实施例3步骤1),c为Nb2/M-P-A/ITO(实施例3步骤2),d为Ag/Nb2/M-P-A/ITO(实施例3步骤4),e为Nb3@nPCN-224/Ag/Nb2/M-P-A/ITO(实施例3步骤5)。当M-P-A固定在ITO后,相较于裸ITO,M-P-A/ITO的阻抗有些许增加,是由于M-P-A表面负电荷和[Fe(CN)6]3-/4-之间的电荷排斥所引起。后随着Nb2,HE4和Nb3@nPCN-224的组装,由于导电性差的生物分子阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在电解液中的电子传递,阻抗逐渐增大。本实施例为了说明该光电免疫传感器已成功组装。
实施例7
HE4浓度与光电流升高比率之间的线性关系
(1)仪器:上海辰华电化学工作站(chi660e软件),氙灯光源,万用电表
(2)材料及试剂:
ITO:氧化铟锡半导体电极,规格为0.4cm×0.4cm
电解液:0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液,pH=5
试剂:0.75mg/mL M-P-A、20mg/mL EDC、10mg/mL NHS、10μg/ml Nb2、1%BSA、10ng/mL-1pg/mL HE4、1mg/mL Nb3@nPCN-224
(3)方法:
电极处理:ITO电极处理同实施例4。
传感器组装:按照实施例3进行光电免疫传感器的组装,不同的是步骤(4)配制不同浓度的HE4溶液(浓度为1pg/mL-10ng/mL,如1pg/mL,0.01ng/mL,0.1ng/mL,1ng/mL和10ng/mL)进行测定。
测试:氙灯光源系统提供光照,利用电化学工作站三电极体系,观察电极表面在光照下的光电流强度,比较结合HE4后与结合Nb3@nPCN-224后两步的光电流变化,分析光电流强度变化率与HE4浓度之间的关系。
图4为HE4浓度与光电流变化率之间的线性关系图。从图4可以看出,光电流的升高比率与HE4浓度呈线性相关关系,y=0.1714x+2.5149,相关系数R2=0.996,检测范围为1pg/mL-10ng/mL。
实施例8
Nb3@nPCN-224复合物的制备
(1)nPCN-224的合成:用分析天平精确称取5mg H2TCPP,20mg ZrOCl2·8H2O和250mg BA于5mL DMF中,后于90℃烘箱中水热反应3h,冷却至室温,离心洗涤,沉淀复溶于DMF中待用。
(2)Nb3@nPCN-224复合物的合成:取200μL 5mg/mL nPCN-224溶液于1mL的10mg/mLNHS和20mg/mL EDC的混合液中,室温活化2h,后离心洗涤,沉淀复溶于2mL 0.01M pH=7.4PBS溶液中;接着加入100μL 200μg/mL Nb3(溶于0.01M pH=7.4PBS溶液),4℃培养12h,后离心洗涤;最后,加入2mL质量分数为0.5%的BSA溶液(溶于0.01M pH=7.4PBS溶液),25℃搅拌40min,后离心洗涤,沉淀分散于1mL 0.01M PBS(pH=7.4)溶液中待用。
实施例9
Nb3@nPCN-224复合物的制备
(1)nPCN-224的合成:用分析天平精确称取20mg H2TCPP,40mg ZrOCl2·8H2O和300mg BA于20mL DMF中,后于90℃烘箱中水热反应3h,冷却至室温,离心洗涤,沉淀复溶于DMF中待用。
(2)Nb3@nPCN-224复合物的合成:取200μL 5mg/mL nPCN-224溶液于1mL的10mg/mLNHS和20mg/mL EDC的混合液中,室温活化2h,后离心洗涤,沉淀复溶于2mL 0.01M pH=7.4PBS溶液中;接着加入300μL 50μg/mL Nb3(溶于0.01M pH=7.4PBS溶液),4℃培养12h,后离心洗涤;最后,加入2mL质量分数为5%的BSA溶液(溶于0.01M pH=7.4PBS溶液),37℃搅拌20min,后离心洗涤,沉淀分散于1mL 0.01M PBS(pH=7.4)溶液中待用。
实施例10
MWCNTs-PDA-AuNPs(M-P-A)复合物的制备
称取5mg羧基化MWCNTs分散于8mL的1×Tris-HCl缓冲液中,后加入0.5mL 40mg/mL的DA溶液(溶剂为1×Tris-HCl缓冲液),避光反应18h,离心洗涤固体物质得MWCNTs-PDA,后分散于20mL H2O中,调节其pH至4.0,接着加入300μL 0.1M的氯金酸水溶液,后缓慢加入4mL0.2M现配的柠檬酸钠水溶液,反应1h,离心洗涤固体物质得MWCNT-PDA-AuNPs。
实施例11
MWCNTs-PDA-AuNPs(M-P-A)复合物的制备
称取20mg羧基化MWCNTs分散于10mL的1×Tris-HCl缓冲液中,后加入2mL 10mg/mL的DA溶液(溶剂为1×Tris-HCl缓冲液),避光反应30h,离心洗涤固体物质得MWCNTs-PDA,后分散于30mL H2O中,调节其pH至6.0,接着加入400μL 0.05M的氯金酸水溶液,后缓慢加入6mL 0.05M现配的柠檬酸钠水溶液,反应3h,离心洗涤固体物质得MWCNT-PDA-AuNPs。
实施例12
(1)基底材料固定
向0.16cm2固定面积的ITO上滴加10μL 0.1mg/mL MWCNTs-PDA-AuNPs(M-P-A)分散液(分散剂为H2O),37℃培养箱中干燥5h,后用超纯水涮洗,晾干,得M-P-A/ITO基底电极。
(2)锚定识别分子
以EDC/NHS为活化剂活化M-P-A上的羧基,连接Nb2与基底电极。即向步骤(1)得到的基底电极表面滴加10μL EDC(10mg·mL-1)与NHS(5mg·mL-1)的混合溶液,室温放置2h,然后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗,后将10μL1μg/mL的识别分子Nb2溶液(溶剂为0.01M pH=7.4PBS溶液)滴加在基底电极表面,3.8℃孵育15h,使其负载在电极材料表面,后用0.01MPBS(pH=7.4)溶液清洗掉未结合的Nb2。
(3)非特异性位点封闭:为了覆盖电极表面除抗体外还可能与抗原结合的非特异性识别位点。即向步骤(2)得到的基底电极表面滴加质量分数为0.5%BSA溶液(溶剂为0.01M pH=7.4PBS溶液),25℃封闭60min,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液洗涤除去多余的BSA溶液。
(4)目标分子HE4的孵育
将10μL待测HE4抗原溶液(浓度为10ng/mL,溶剂为0.01M pH=7.4PBS溶液)滴加在步骤(3)得到的基底电极表面,25℃下孵育30min,用0.01M PBS(pH=7.4)溶液洗涤除去未结合的HE4抗原。
(5)光电化学免疫传感器的构建
在步骤(4)得到的基底电极表面上滴加10μL制备好的1mg/mL Nb3@nPCN-224溶液(实施例1),25℃孵育30min,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗除去未与HE4结合的Nb3@nPCN-224,晾干,即得HE4光电化学免疫传感器。
实施例13
(1)基底材料固定
向0.16cm2固定面积的ITO上滴加10μL1 mg/mL MWCNTs-PDA-AuNPs(M-P-A)分散液(分散剂为H2O),37℃培养箱中干燥5h,后用超纯水涮洗,晾干,得M-P-A/ITO基底电极。
(2)锚定识别分子
以EDC/NHS为活化剂活化M-P-A上的羧基,连接Nb2与基底电极。即向步骤(1)得到的基底电极表面滴加10μL EDC(30mg·mL-1)与NHS(20mg·mL-1)的混合溶液,室温放置2h,然后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗,后将10μL40μg/mL的识别分子Nb2溶液(溶剂为0.01MpH=7.4PBS溶液)滴加在基底电极表面,4.2℃孵育12h,使其负载在电极材料表面,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗掉未结合的Nb2。
(3)非特异性位点封闭:为了覆盖电极表面除抗体外还可能与抗原结合的非特异性识别位点。即向步骤(2)得到的基底电极表面滴加质量分数为5%BSA溶液(溶剂为0.01MpH=7.4PBS溶液),37℃封闭30min,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液洗涤除去多余的BSA溶液。
(4)目标分子HE4的孵育
将10μL待测HE4抗原溶液(浓度为10ng/mL,溶剂为0.01M pH=7.4PBS溶液)滴加在步骤(3)得到的基底电极表面,37℃下孵育70min,用0.01M PBS(pH=7.4)溶液洗涤除去未结合的HE4抗原。
(5)光电化学免疫传感器的构建
在步骤(4)得到的基底电极表面上滴加10μL制备好的1mg/mL Nb3@nPCN-224溶液(实施例1),37℃孵育70min,后用0.01M PBS(pH=7.4)溶液清洗除去未与HE4结合的Nb3@nPCN-224,晾干,即得HE4光电化学免疫传感器。
Claims (10)
1.一种检测HE4的光电化学免疫传感器,其特征在于,由Nb2共价结合到MWCNTs-PDA-AuNPs修饰后的基底电极上,HE4抗原与Nb2特异性结合,Nb3@nPCN-224与HE4抗原特异性结合制得。
2.根据权利要求1所述的光电化学免疫传感器,其特征在于,所述基底电极为氧化铟锡半导体电极。
3.根据权利要求1所述的光电化学免疫传感器,其特征在于,所述MWCNTs-PDA-AuNPs由DA加入到MWCNTs的分散液中,搅拌反应生成MWCNTs-PDA分散液,后将HAuCl4和Na3C6H5O7·2H2O加入到MWCNTs-PDA的分散液中反应生成MWCNTs-PDA-AuNPs。
4.根据权利要求1所述的光电化学免疫传感器,其特征在于,所述Nb3@nPCN-224由H2TCPP、ZrOCl2·8H2O和BA溶于DMF中,加热反应得到nPCN-224,用Nb3标记nPCN-224,即得Nb3@nPCN-224。
5.一种权利要求1所述的检测HE4的光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)基底材料固定:将MWCNTs-PDA-AuNPs分散液滴涂在ITO表面,干燥后用超纯水清洗,晾干;
(2)锚定识别分子:向步骤(1)得到的基底电极表面滴加EDC/NHS的混合液,室温放置后用PBS溶液清洗,清洗后将识别分子捕获抗体Nb2滴加到基底电极上,孵育后用PBS溶液清洗;
(3)非特异性位点封闭:向步骤(2)得到的电极表面滴加BSA溶液,25-37℃下封闭0.5-1h,后用PBS溶液清洗;
(4)孵育目标分子HE4:将HE4抗原溶液滴加到步骤(3)得到的电极上,在25-37℃下反应30-70min,后用PBS溶液清洗除去未特异性结合的抗原;
(5)光电化学免疫传感器的构建:将Nb3@nPCN-224溶液滴加到步骤(4)得到的电极表面进行特异性反应,25-37℃孵育30-70min,后用PBS溶液清洗,晾干,即得检测HE4的光电化学免疫传感器。
6.根据权利要求5所述的光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述MWCNTs-PDA-AuNPs的浓度优选为0.1-1mg/mL。
7.根据权利要求5所述的光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述NHS浓度为5-20mg/mL,EDC浓度为10-30mg/mL,Nb2的浓度为1-40μg/mL。
8.根据权利要求5所述的光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述孵育为3.8-4.2℃孵育12-15h。
9.根据权利要求5所述的光电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述封闭为25-37℃下封闭0.5-1h。
10.一种权利要求1所述的检测HE4的光电化学免疫传感器在定量检测HE4中的应用。
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CN201911087430.0A CN110687303A (zh) | 2019-11-08 | 2019-11-08 | 一种检测he4的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用 |
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Cited By (1)
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CN115032246A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-09-09 | 大连理工大学 | 一种基于激光诱导石墨烯的场效应管生物传感器 |
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CN107422018A (zh) * | 2017-06-29 | 2017-12-01 | 东南大学 | 一种检测TNF‑α的光电免疫传感器及其制备方法和应用 |
CN108469524A (zh) * | 2018-03-29 | 2018-08-31 | 东南大学 | 一种检测ca125的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用 |
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