CN110668946A - 化合物Stybenpropol A及其防治动脉粥样硬化的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了一种化合物Stybenpropol A及其在改善动脉粥样硬化(AS)方面的应用。本发明从安息香中提取得到一种新型化合物Stybenpropol A，研究结果显示，在肿瘤坏死因子(TNF‑α)诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，Stybenpropol A能通过抑制TNF‑α诱导的NF‑κB活化和核转位以及增强抗凋亡蛋白Bcl‑2的表达，从而抑制内皮细胞炎症损伤，增加一氧化氮分泌水平，降低血管粘附分子和促炎因子水平，能显著抑制TNF‑α诱导的HUVECs炎症损伤和凋亡，为开发抗动脉粥样硬化药物提供了新的选择和途径，具有很好的应用前景。

Description

化合物Stybenpropol A及其防治动脉粥样硬化的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种安息香化合物Stybenpropol A及其在预防和治疗动脉粥样硬化方面的应用。
背景技术
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病发病率、致残率和病死率不断上升的共同病理基础，全球基于AS的死亡人数占全部死亡人数的50％，远远超过第二位死亡原因——肿瘤，严重影响着人们的健康，引起了全世界的广泛关注，因此，如何有效降低动脉粥样硬化的发病率和死亡率，成为我国临床和科研工作者所面临的重要问题。
炎症伴随着AS从斑块形成到最终破裂的所有阶段，逐渐缩小冠状动脉，导致一系列严重的临床并发症。在这种炎症中最典型模型的功能失调的内皮细胞，内皮素-1(ET-1)和一氧化氮血管张力失衡导致血管壁黏附分子和促炎因子表达增加。这些因素反过来驱动胆固醇积聚和单核细胞动脉内膜向外渗，最后促进泡沫细胞的形成和驱动AS。这种炎症诱导的内皮功能障碍和相关的程序性细胞死亡是AS和其相关疾病病理学的关键驱动因素。因此，抑制内皮细胞凋亡和减少炎症反应是抑制As发生和发展的关键靶点。
目前他汀类药物(HMG-CoA还原酶抑制剂)是用于治疗动脉粥样硬化的主要治疗药物，他汀类药物可降低冠心病的发病率和死亡率，减慢动脉粥样硬化斑块的发展，甚至使斑块消退，但其临床应用存在许多不良反应，如肝损伤，肌肉毒性和胃肠道刺激，导致其临床应用越来越受限制。因此临床上迫切需要研制能够抑制或者逆转动脉粥样硬化的新型药物，在这种情况下，天然来源的化合物就显得尤为宝贵。
中草药是中华民族几千年累积下来的文化瑰宝，与西药相比，其具有药源丰富、价格便宜、副作用小、多环节整体性治疗等优势。安息香是一种安息香科植物白花树(Styraxtonkinensis)树皮的树脂，在东南亚许多地区分布广泛，近年来研究表明安息香具有抗炎，解热和抗肿瘤作用，作为传统中药在临床上被广泛用于增强心血管功能和减轻动脉粥样硬化的症状，但是关于其具体有效成分的研究极少，故急需以传统中医理论和现代药理药效学为指导，研究开发天然来源的预防和治疗动脉粥样硬化的药物。
发明内容
本发明旨在提供安息香中能够预防和治疗动脉粥样硬化的有效成分，即化合物Stybenpropol A。本发明发现在肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中，Stybenpropol A能通过抑制TNF-α诱导的NF-κB活化和核转位以及增强抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制内皮细胞炎症损伤，增加一氧化氮水平，降低血管粘附和促炎因子水平，抑制内皮细胞凋亡，从而保护血管内皮细胞免受损伤和死亡，为开发动脉粥样硬化药物提供了新的选择和途径，具有很好的应用前景。
因此，本发明的目的在于提供一种安息香化合物Stybenpropol A。
本发明的另一目的在于提供安息香在制备Stybenpropol A中的应用。
本发明的另一目的在于提供Stybenpropol A在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供Stybenpropol A在制备促进内皮细胞分泌一氧化氮药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供Stybenpropol A在制备预防内皮细胞炎症药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供Stybenpropol A在制备抑制内皮细胞凋亡药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供Stybenpropol A在制备降低ICAM-1、VCAM-1、IL-8、IL-Iβ、Bax和caspase-9中任一或任几种蛋白表达药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供Stybenpropol A在制备促进Bcl-2、IKK-β、IκB-α中任一或任几种蛋白表达药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种预防和治疗动脉粥样硬化的药物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明从安息香中提取得到一种对TNF-α诱导损伤的HUVECs具有抗炎和抗凋亡作用，从而预防和治疗动脉粥样硬化的新化合物Stybenpropol A，其结构式如下所示：
TNF-α作为一个有效的促炎症细胞因子，可以调解各种炎症反应和参与细胞凋亡，自噬和相关流程，慢性炎症过程中促炎细胞因子和黏附分子诱导刺激单核细胞黏附并浸润内皮细胞，导致动脉粥样硬化的发生。因此，粘附分子和促炎细胞因子是动脉粥样硬化病变发展和进一步发生心血管事件的重要预测因子。作为血管炎症的重要介质，当存在内皮细胞功能障碍时，这些分子被上调。因此本发明建立了TNF-α介导的HUVECs损伤模型，通过实验证明Stybenpropol A能显著降低HUVECs损伤模型中VCAM-1，ICAM-1，IL-1β和IL-8的表达，抑制炎性因子和粘附分子的释放，从而减轻TNF-α诱导HUVECs的炎性损伤和细胞凋亡，通过调节NF-κB和caspase-9信号通路而对TNF-α诱导损伤的HUVECs细胞起保护作用。
在AS中，内皮对血管的保护作用主要由一氧化氮介导，由于内皮一氧化氮合酶(eNOS)产生的内皮一氧化氮发挥多种抗动脉粥样硬化作用，血管内皮损伤和功能障碍的特征在于内皮细胞中一氧化氮水平降低。本发明发现Stybenpropol A增加TNF-α介导的HUVECs损伤模型的一氧化氮合成，从而增加血管舒张和保护血管内皮。
本发明进一步探索了Stybenpropol A在AS中的相关信号通路。NF-κB是AS的关键介质，调节炎症过程和相关的细胞因子表达。非活性NF-κB与IκB结合保留在的细胞质中，在TNF-α刺激后，IκB和IKK-β被磷酸化，然后迅速降解，释放出NF-κB，然后NF-κB经历核转位和随后的基因调控。因此，降低的IκB和IKK-β水平对应于NF-κB活性的增加。给予Stybenpropol A后，TNF-α处理的HUVECs中ICAM-1和VCAM-1蛋白表达显著降低，而IκB-α和IKK-β水平显著增加。这表明，Stybenpropol A可通过抑制NF-κB途径保护HUVECs免受损伤和抑制相关单核细胞迁移和粘附。
此外，由于炎症被认为是AS发展的关键因素，在本研究中，Stybenpropol A可通过抑制细胞凋亡来保护TNF-α诱导损伤的HUVECs，因此本发明探讨了其在AS中的凋亡机制。Caspase-9是细胞凋亡过程中的关键蛋白酶，参与内源性和外源性途径的细胞凋亡，所以抑制其活化可以阻断细胞凋亡级联和细胞凋亡。本发明研究发现，TNF-α诱导的HUVECs中Caspase-9显著增加，用Stybenpropol A预处理后Caspase-9水平显著降低。表明Stybenpropol A可通过改善激活的HUVECs炎症反应调节Caspase-9来抑制HUVECs的凋亡。
此外，Bax，Bcl-2是Bcl-2蛋白家族成员，在调节内皮细胞凋亡中发挥关键作用。Bcl-2通过阻断Caspase蛋白酶和Bax的活化来抑制细胞凋亡，Bax是线粒体膜离子的重要组成部分。通过促进细胞色素C穿过线粒体并激活caspase-9引发细胞凋亡。本发明中TNF-α通过上调Caspase-9水平和破坏Bcl-2和Bax之间的平衡来触发线粒体凋亡途径，Stybenpropol A预处理后增强了抗凋亡蛋白的表达，且降低了促凋亡蛋白的表达。因此表明Stybenpropol A可通过抑制线粒体细胞凋亡途径来保护HUVECs免受TNF-α诱导的细胞凋亡。
因此，安息香在制备Stybenpropol A中的应用，也应在本发明的保护范围之内。另外，本发明的化合物Cysestermerol A亦可通过化学手段合成。
本发明还请求保护Stybenpropol A在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
本发明还请求保护Stybenpropol A在制备促进内皮细胞分泌一氧化氮药物中的应用。
本发明还请求保护Stybenpropol A在制备预防内皮细胞炎症药物中的应用。
本发明还请求保护Stybenpropol A在制备抑制内皮细胞凋亡药物中的应用。
本发明还请求保护Stybenpropol A在制备降低ICAM-1、VCAM-1、IL-8、IL-1β、Bax和caspase-9中任一或任几种蛋白表达药物中的应用。
本发明还请求保护Stybenpropol A在制备促进Bcl-2、IKK-β、IκB-α中任一或任几种蛋白表达药物中的应用。
本发明还请求保护一种包含所述Stybenpropol A的预防和治疗动脉粥样硬化的药物。
作为一种可选择的方案，从安息香中提取制备Stybenpropol A的方法包括以下步骤：
S1.取安息香干燥树脂(5Kg)加入40L 95％乙醇冷浸提取3次，每次24h，合并浓缩提取液，得到总提取物(4.2Kg)。总提取物用适量温水混悬，经石油醚(1:1)萃取三次后，继续以乙酸乙酯(1:1)萃取3次，获得乙酸乙酯萃取物(3.8Kg)。
S2.取2Kg乙酸乙酯萃取物，适量的甲醇溶解，采用硅胶色谱法进行梯度洗脱(石油醚/乙酸乙酯，梯度为50:1，30:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)，获得7个组分：B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7。将B2(598g)经硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯)，在梯度为40:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1下分离，通过TLC随行显色合并分别得到7个组分，即B2.1、B2.2、B2.3、B2.4、B2.5、B2.6、B2.7。
S3.取B2.2(21.2g)载样于MCI gel柱色谱，以甲醇/水(10％，30％，50％，70％，90％)进行梯度洗脱，进一步获得6个组分：B2.2.1、B2.2.2、B2.2.3、B2.2.4、B2.2.5、B2.2.6。将B2.2.4(4.0g)经中低压ODS柱洗脱，(流速为8mL/min，流动相是甲醇/水，梯度为50％～60％～70％～80％～90％～100％)划分为6个组分：B2.2.4.1、B2.2.4.2、B2.2.4.3、B2.2.4.4、B2.2.4.5、B2.2.4.6。取B2.2.4.4(50mg)经pre-HPLC(甲醇/水，80％)制备获得Stybenpropol A(6mg)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明从安息香中提取得到一种天然化合物Stybenpropol A，其能通过抑制TNF-α诱导的NF-κB活化和核转位以及增强抗凋亡蛋白的表达，从而抑制内皮细胞炎症损伤，增加一氧化氮水平，降低血管粘附分子和促炎因子水平，抑制内皮细胞凋亡，从而保护血管内皮细胞免受损伤和死亡，可用于预防和治疗动脉粥样硬化。
2.本发明提供的Stybenpropol A结构明确，亦可通过化学手段合成，在制备防治动脉粥样硬化药物方面具有很好的应用前景。
3.本发明提供的Stybenpropol A为安息香防治动脉粥样硬化方面的物质基础研究奠定了基础，为开发天然新型的动脉粥样硬化药物提供了新的选择和途径。
附图说明
图1是Stybenpropol A的HMBC相关性示意图；
图2是TNF-α处理对HUVECs细胞活力的影响；
图3是Stybenpropol A对TNF-α诱导损伤的HUVECs的一氧化氮的分泌影响；
图4是Stybenpropol A对TNF-α诱导的HUVECs炎症的影响；
图5是Stybenpropol A对TNF-α诱导的HUVECs凋亡的影响；
图6是Stybenpropol A对细胞凋亡相关的蛋白表达以及NF-κB核转录的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
1、实验材料
(1)实验细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)P0细胞，购自于美国澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司。
(2)试剂与仪器：安息香干燥树脂(5Kg)购于安徽毫州，Stybenpropol A由实验室前期从安息香提取分离得到，并通过核磁共振和质谱等技术鉴定其结构，通过HPLC法测得各化合物纯度在98％以上；人重组TNF-α购于美国Peprotech公司；ECM(含HUVECs基础培养液、ECGS生长因子、青霉素和链霉素)购于美国ScienCell生物科技有限公司；0.25％胰蛋白酶、FBS南美胎牛血清、PBS均购于美国Gibco公司；CCK-8试剂购自日本同仁公司；一氧化氮试剂盒购于南京建成生物工程研究所；VCAM-1、ICAM-1、IL-1β、IL-8酶联免疫试剂盒购于武汉Cloud-Clone科技股份有限公司。鼠抗VCAM-1抗体、兔抗ICAM-1抗体、兔抗IKK-β抗体、兔抗IκB-a抗体、鼠抗Bax抗体、鼠抗Bcl-2抗体、兔抗Caspase-9抗体均购于美国Proteintech公司；Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；RIPA细胞裂解液购自北京贝博生物技术有限公司；SephadexTMLH-20，Pharmacia公司；柱色谱用硅胶H，薄层层析硅胶GF254，青岛海洋化工集团公司；Rp-C18反相硅胶(40～60μm)，德国Merck；CHP-20P gelMCI，日本三菱化学公司；半制备高效液相色谱仪(CBM-20A)日本岛津；MP200型快速中低压制备色谱仪，天津博纳艾杰尔科技有限公司；红外光谱仪(VERTE 70)，德国BRUKER公司；核磁共振谱仪(Advance III-600型)，德国BRUKER公司；质谱仪(UPLC/Q-Tof6230)美国安捷伦(Agilent)公司。
2、实验方法
(1)安息香树脂95％乙醇浸提液经乙酸乙酯萃取后，通过传统柱色谱反复分离，最后利用PHPLC分离得到单体化合物；利用各种光谱方法，包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、MS、IR和UV，确定化合物的平面结构。
(2)人脐静脉内皮细胞培养：将冻存的HUVECs进行复苏，转移到T25培养瓶，加入含质量分数分别为1％青链霉素、10％FBS、1％ECGS的ECM基础培养基，于体积分数为5％CO2、37℃的培养箱中培养，待细胞生长至90％融合时用质量分数为0.25％胰酶-EDTA消化，按1∶3传代，接种于96孔板或培养瓶中实验。
(3)实验分组：分为空白对照组，模型组(TNF-α质量浓度为12.5ng/mL孵育12h)和实验组，其中实验组分3个亚组，即摩尔浓度分别为12.5、50、200μM安息香化合物Stybenpropol A孵育24h后加入质量浓度为12.5ng/mL TNF-α共同孵育12h。
(4)CCK-8检测细胞活力：为了确保待测样品是在安全浓度范围内的，用CCK-8测HUVECs细胞在不同药物浓度培养24小时后的吸光度值。将安息香单体化合物(0～200uM)加入无血清无生长因子的HUVECs专用培养液配置在不同浓度，预孵24h后，在450nm波长下使用酶标仪检测各组细胞的存活率。为了测定安息香化合物Stybenpropol A对TNF-a诱导损伤的内皮细胞存活率的影响，HUVECs细胞在96孔板上适应性生长24h后，将摩尔浓度分别为12.5、50、200μM安息香化合物Stybenpropol A预孵24h，然后12.5ng/ml的TNF-a诱导损伤培养12h，最后在450nm波长下使用CCK-8测每个组的吸光度。
(5)硝酸还原酶法测一氧化氮含量：将收集的上清液按照试剂盒操作测定一氧化氮水平，采用分光光度计在450nm波长处检测最大吸收值。
(6)ELISA法检测上清液VCAM-1、ICAM-1、IL-8、IL-1β含量：将收集的上清液按照试剂盒操作测定VCAM-1、ICAM-1、IL-8、IL-1β水平，采用分光光度计在450nm波长处检测最大吸收值。
(7)流式细胞仪测细胞凋亡率：将细胞培养液吸出至合适离心管内，PBS洗涤贴壁细胞，一次加入适量的胰酶消化细胞，把细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，与前面的细胞培养液一起1000g离心5分钟，弃上清，加入195ulAnnexin-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5ulAnnexin-FITC，轻轻混匀。加入10ul碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20～25度)避光孵育10～20分钟，随后置于冰浴中。上机检测，采用flowjo软件对细胞图进行分析。
(8)Western-blot法检测VCAM-1、ICAM-1、Bax、Caspase-9、Bcl-2、IKK-β、IκB-a蛋白表达：内皮细胞给药处理，预冷的PBS冲洗2遍，用细胞刮按照试剂盒提取细胞总蛋白。同时采用BCA法蛋白定量，调整各样本蛋白浓度为同一浓度。配胶、灌胶，上样，电泳1.5h，转膜20min，质量分数为5％脱脂奶粉中室温封闭1h，洗膜，然后分别以稀释后(1∶1000)的一抗4℃孵育过夜，再置入稀释好的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗，室温孵育2h，将ECL发光液A液和B液按1∶1的比例避光混合，均匀覆盖在PVDF膜上，在凝胶成像仪中进行自动曝光显像，采集图像。条带扫描后，采用image J软件对目的蛋白进行定量分析，以β-actin作为内参对照。
(9)统计学方法：所有的实验均重复3次，实验数据计量资料以(平均数±标准差)表示，应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 7.00进行统计绘图；多组间比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)，两两比较时采用LSD法；当P＜0.05时，表示有统计学差异。
实施例1 Stybenpropol A的提取和鉴定
1、提取方法
安息香树脂95％乙醇浸提液经乙酸乙酯萃取后，通过传统柱色谱反复分离，最后利用Pre-HPLC分离得到单体化合物，记为Stybenpropol A。
具体从安息香中提取化合物Stybenpropol A的方法包括以下步骤：
S1.取安息香干燥树脂(5Kg)加入40L 95％乙醇冷浸提取3次，每次24h，合并浓缩提取液，得到总提取物(4.2Kg)。总提取物用适量温水混悬，经石油醚(1:1)萃取三次后，继续以乙酸乙酯(1:1)萃取3次，获得乙酸乙酯萃取物(3.8Kg)。
S2.取2Kg乙酸乙酯萃取物，适量的甲醇溶解，采用硅胶色谱法进行梯度洗脱(石油醚/乙酸乙酯，梯度为50:1，30:1，15:1，10:1，5:1，3:1，1:1)，获得7个组分：B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7。将B2(598g)经硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯)，在梯度为40:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1下分离，通过TLC随行显色合并分别得到7个组分，即B2.1、B2.2、B2.3、B2.4、B2.5、B2.6、B2.7。
S3.取B2.2(21.2g)载样于MCI gel柱色谱，以甲醇/水(10％，30％，50％，70％，90％)进行梯度洗脱，进一步获得6个组分：B2.2.1、B2.2.2、B2.2.3、B2.2.4、B2.2.5、B2.2.6。将B2.2.4(4.0g)经中低压ODS柱洗脱，(流速为8mL/min，流动相是甲醇/水，梯度为50％～60％～70％～80％～90％～100％)划分为6个组分：B2.2.4.1、B2.2.4.2、B2.2.4.3、B2.2.4.4、B2.2.4.5、B2.2.4.6。取B2.2.4.4(50mg)经pre-HPLC(甲醇/水，80％)制备获得Stybenpropol A(6mg)。
2、结构鉴定方法
利用各种光谱方法，包括1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、MS、IR和UV，确定化合物Stybenpropol A的平面结构。
3、鉴定结果
Stybenpropol A为棕色油状物，HRESIMS(m/z 411.12003[M+Na]+)给出其分子式为C23H20O5，计算其不饱和度为14。1H NMR谱中给出两组苯甲酰氧基的H信号，分别为δ8.23(m，2H)，8.12(m，2H)，7.63(m，1H)和7.57(m，1H)，7.51(t，J＝7.8Hz，2H)，7.47(t，J＝7.8Hz，2H)，同时给出一组4-羟基-3-甲氧基苯基的吸收峰，位于δ7.14(d，J＝8.1Hz，1H)，7.08(d，J＝1.9Hz，1H)，7.05(dd，J＝8.1，1.9Hz，1H)，3.84(s，3H)；δ6.75(dt，J＝15.8，1.4Hz，1H)，6.41(dt，J＝15.8，6.4Hz，1H)5.01(d d，J＝6.3，1.4Hz，2H)推断为一组反式烯丙基信号。
13C NMR谱(表1)共给出23个碳原子的吸收信号，结合HSQC谱，这些信号分别为2个酯羰基，18个芳香环碳，2个双键上的次甲基和1个连氧亚甲基。由此推断，该化合物可能为苯丙烯衍生物。在HMBC谱中，H-7/C-1，C-6存在相关，H-9/C-7，C-8存在相关，以上两组信号可以证实苯丙烯骨架的存在；H-9/C-1′存在相关，可以确定酯键的位置，OMe/C-3存在相关，说明甲氧基的取代位置在苯环的C-3上。另外一个苯甲酰氧基唯一的连接位置只能是4位上的氧原子，即形成另外一个酯键，如图1所示。
表1 Stybenpropol A的1H(500MHz)和13C NMR(125MHz)数据(δ，ppm)
Figure BDA0002250558500000091
Figure BDA0002250558500000101
综上鉴定结果，化合物Stybenpropol A属于一种新型苯丙烯衍生物，其结构式如下式所示：
Figure BDA0002250558500000102
实施例2 Stybenpropol A保护HUVECs细胞免受TNF-a诱导损伤
在不同浓度的TNF-α(0，6.25，12.5，25，50，100，200ng/mL)下建立TNF-α诱导的HUVECs损伤模型。使用CCK-8测定在处理后12，24和48小时检测细胞活力。如图2中A图所示，与对照组相比，TNF-α处理导致细胞活力呈时间和剂量依赖性降低。具体而言，与空白对照组相比，12.5ng/mL TNF-α处理12小时后细胞活力降低至50％。
为了确定Stybenpropol A可以保护TNF-α诱导损伤的HUVECs的最佳条件，首先确定了Stybenpropol A对HUVECs是否具有细胞毒性或增殖作用。从图2中B图可以看到HUVECs用Stybenpropol A(0～200μM)处理24小时后细胞存活率没有变化。因此可以得出Stybenpropol A不会改变细胞活力。接着用指定浓度(0～200μM)的Stybenpropol A预处理HUVECs 24小时，再用TNF～α孵育细胞12小时，使用阿托伐他汀钙作为阳性对照，结果如图2中C图所示，结果表明，0～200μM的Stybenpropol A具有显著的细胞保护作用，200μM是最有效的Stybenpropol A的给药浓度。
实施例3 Stybenpropol A对TNF-a诱导损伤的内皮细胞分泌血管保护因子一氧化氮的影响
Stybenpropol A对TNF-a诱导损伤的内皮细胞分泌血管保护因子一氧化氮的影响结果如图3所示，从图3中可以看出与正常对照组比较，模型组一氧化氮含量明显降低(P<0.01)；与模型组比较，Stybenpropol A在低剂量(12.5μM)的时候没有改善作用，而在中、高剂量(＞50μM)的时候，对TNF-a诱导损伤的HUVECs分泌的一氧化氮含量有一定的增高(P<0.01or P<0.05)，且呈剂量依赖性。
实施例4 Stybenpropol A减弱TNF-a诱导损伤的内皮细胞的炎症
为了进一步探讨Stybenpropol A介导的抗AS功效的机制，本发明通过ELISA评估了Stybenpropol A对TNF-α诱导损伤HUVECs的VCAM-1，ICAM-1，IL-1β和IL-8分泌的影响，结果如图4所示。从图4中可以看出TNF-α处理显著增加了HUVECs对VCAM-1，ICAM-1，IL-1β和IL-8的分泌，而Stybenpropol A预处理组显著显著这些上调。因此表明Stybenpropol A可以预防HUVECs损伤模型中发生的TNF-α介导的炎症。
实施例5 Stybenpropol A对TNF-a诱导损伤的内皮细胞凋亡率的影响
探讨Stybenpropol A(0～200μM)对TNF-α诱导的HUVECs细胞凋亡的影响，其结果如图5所示，从图5中可以看到，相比于对照组(6.70％±0.83％)而言，TNF-α模型组凋亡细胞的比率显著增加至15.27％±1.16％(P<0.01)，表明TNF-α可诱导HUVECs凋亡，而Stybenpropol A实验组以剂量依赖的方式显著降低TNF-α诱导的细胞凋亡，实验组与TNF-α模型组之间存在显著差异(P<0.01or P<0.05)。因此表明Stybenpropol A对TNF-a诱导损伤的内皮细胞表现出明显的细胞保护作用。
实施例6 Stybenpropol A对TNF-α诱导损伤的内皮细胞VCAM-1、ICAM-1、IKK-β、IκB-α、Bax、Caspase-9、Bcl-2蛋白的影响
NF-κB是对各种刺激的炎症反应的关键介质，它可能被激活而导致凋亡细胞的死亡，因此，评估了IκBα水平以便在本研究中评估NF-κB活化状态。为了探索Stybenpropol A介导其抗细胞凋亡功效的机制，通过蛋白质印迹法评估了IKK-β，IκB-α，VCAM-1和ICAM-1蛋白水平，结果如图6所示，从图6可以看到TNF-α处理导致HUVECs中IKK-β和IκB-α降解以及VCAM-1和ICAM-1水平升高，而Stybenpropol A可以逆转这些作用，表明Stybenpropol A抑制TNF-α诱导的NF-κB活化和核转位。因此，Stybenpropol A的抗炎特性可能与其对NF-κB的调节有关。
为了进一步探讨Stybenpropol A如何影响TNF-α诱导的细胞凋亡，我们评估了HUVECs中凋亡相关的Bax，Bcl-2和caspase-9蛋白的表达。我们发现TNF-α处理导致Bcl-2下调和Bax表达增加，而Stybenpropol A逆转了这种作用，从而增加了Bcl-2/Bax比率。此外，TNF-α处理增强了Caspase-9的水平，并且这也被Stybenpropol A抑制。因此从前述分析得到Stybenpropol A可以增强抗凋亡蛋白的表达，从而减少内皮细胞的凋亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种安息香化合物Stybenpropol A，其特征在于，其结构式如下所示：
Figure FDA0002250558490000011
2.安息香在制备权利要求1所述化合物Stybenpropol A中的应用。
3.权利要求1所述Stybenpropol A在制备预防和治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
4.权利要求1所述Stybenpropol A在制备促进内皮细胞分泌一氧化氮药物中的应用。
5.权利要求1所述Stybenpropol A在制备预防内皮细胞炎症药物中的应用。
6.权利要求1所述Stybenpropol A在制备抑制内皮细胞凋亡药物中的应用。
7.根据权利要求4～6任一所述应用，其特征在于，所述内皮细胞为肿瘤坏死因子诱导损伤的人脐静脉内皮细胞。
8.权利要求1所述Stybenpropol A在制备降低ICAM-1、VCAM-1、IL-8、IL-1β、Bax和caspase-9中任一或任几种蛋白表达药物中的应用。
9.权利要求1所述Stybenpropol A在制备促进Bcl-2、IKK-β、IκB-α中任一或任几种蛋白表达药物中的应用。
10.一种预防和治疗动脉粥样硬化的药物，其特征在于，包含权利要求1所述Stybenpropol A。
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