CN110656032A - 外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法 - Google Patents

外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法中，所述外周血血小板分离试剂盒包括白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。本发明设计的外周血血小板分离试剂盒将梯度离心法和滤膜过滤相结合，在分离获得高纯度血小板(纯度可达99.98％)的同时，避免蛋白酶、核酸等杂质对血小板的污染，实现直接从人体全血样品中分离出结构完整且高纯度血小板。经本发明的外周血血小板分离试剂盒分离提纯的外周血血小板除可用于凝集试验、功能检测等传统研究外，还可用于实时定量PCR、高通量测序等灵敏度高的分子实验，具有普适性。

Description

外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法
技术领域
本发明涉及医用辅助设备技术领域，特别涉及一种外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法。
背景技术
血小板(platelet，thrombocyte)是从骨髓成熟的巨核细胞胞浆脱落下来的小块胞质，巨核细胞虽在骨髓造血细胞中为数最少，仅占骨髓有核细胞总数的0.05％，但其产生的血小板却对机体的止血功能极为重要。血小板常成群分布在红细胞之间，循环血中正常状态的血小板呈两面微凹、椭圆形或圆盘形。人的血小板平均直径约2-4微米，厚0.5-1.5微米，平均体积约7立方微米。血小板无细胞核，但有细胞器，此外内部还有散在分布的颗粒成分。血小板在止血过程中发挥着重要作用，帮助形成血液凝块，同时也是多种生长因子，包括血小板源生长因子(platelet-derived growth factor)、转化生长因子β(transforminggrowth factorβ，TGF-β)、碱性纤维原细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等的自然来源。人体内血小板数量和功能异常会产生血小板病，血小板过低(thrombocytopenia)或功能降低(thrombasthenia)将导致出血，血小板过高(thrombocytosis)则容易产生血块。
目前，血小板因为分离提纯的具体流程不明确，限制了临床中对血小板的研究的开展。回顾既往分离提纯血小板的方法，存在污染率高、回收率低的缺陷。
实验室研究中多采用梯度离心法、流式细胞仪结合抗体法和凝胶层析柱法。梯度离心法可快速获取高浓度血小板，但常伴随大量白细胞污染。流式细胞仪结合抗体法和凝胶层析柱法，可有效去除血小板中白细胞污染，获取纯化血小板，但此类方法步骤繁琐，花费庞大，需要配备特定的实验室仪器，且分选时间较长且容易造成血小板RNA降解。
目前我国部分血液中心和医院输血科为了减少输血不良反应，已广泛应用一次性白细胞滤器过滤法。白细胞滤器主要依靠一层特定的滤膜来过滤白细胞，它的工作原理有以下两个方面，一是阻滞作用；二是白细胞的黏附特性。然而输血科所使用的白细胞滤器体积巨大，适用于每袋一百至数百毫升的血液，而不适合用于实验室微量血液的处理。
针对现有技术中血小板研究存在的问题，本领域技术人员一直在寻找解决的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法，以解决使用现有血小板研究中存在血小板分离纯度不高，仅适用于特定实验研究的问题。
为解决上述技术问题，本发明提供一种外周血血小板分离试剂盒，所述外周血血小板分离试剂盒包括：白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。
可选的，在所述的外周血血小板分离试剂盒中，所述稳定管的容积至少为15ml。
可选的，在所述的外周血血小板分离试剂盒中，所述注射器的容积至少为20ml。
本发明还提供一种外周血血小板分离方法，所述外周血血小板分离方法包括如下步骤：
提供一如上所述的外周血血小板分离试剂盒；
将采集的外周血血样以200g常温离心20min；
将离心后得到的富血小板血浆层转移至所述外周血血小板分离试剂盒的注射器中；
先让富血小板血浆在所述注射器的外套管中自然过滤至少3min，再在所述注射器的芯杆的推进下，将外套管中剩余富血小板血浆全部推进至稳定管中；
将稳定管放置于离心机中，以1200g常温离心5min；
弃去离心后所述稳定管中的上清，所述稳定管中底部的沉淀部分为外周血血小板。
可选的，在所述的外周血血小板分离方法中，还包括如下步骤：
将获得的外周血血小板移至-80℃保存。
可选的，在所述的外周血血小板分离方法中，每毫升外周血平均可分离获得2×108个外周血血小板。
可选的，在所述的外周血血小板分离方法中，通过移液器吸取离心后的富血小板血浆层。
可选的，在所述的外周血血小板分离方法中，离心采用的平台为水平转子离心机。
在本发明所提供的外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法中，所述外周血血小板分离试剂盒包括白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。本发明设计的外周血血小板分离试剂盒将梯度离心法和滤膜过滤相结合，在分离获得高纯度血小板(纯度可达99.98％)的同时，避免蛋白酶、核酸等杂质对血小板的污染，实现直接从人体全血样品中分离出结构完整且高纯度血小板。经本发明的外周血血小板分离试剂盒分离提纯的外周血血小板除可用于凝集试验、功能检测等传统研究外，还可用于实时定量PCR、高通量测序等灵敏度高的分子实验，具有普适性。
附图说明
图1是本发明一实施例中外周血血小板分离试剂盒的结构示意图；
图2是本发明一实施例中外周血血小板分离方法的流程图；
图3a是利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用CD45标记白细胞后的示意图；
图3b是利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图；
图3c是利用流式细胞仪检测基于方法2和方法3获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图；
图3d是利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用CD61标记血小板，CD45标记白细胞后的示意图；
图3e是利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2过程中血小板的活化情况，用CD61标记血小板，CD62P标记活化血小板后的示意图；
图3f是以全血作为对照，利用荧光定量PCR检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用ANPEP标记白细胞后的示意图；
图3g是以全血作为对照，利用荧光定量PCR检测基于方法1和方法2获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。
图1中：1-稳定管；2-白细胞滤器；3-注射器。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明提出的外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法作进一步详细说明。根据下面说明和权利要求书，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。
请参考图1，其为本发明的外周血血小板分离试剂盒的结构示意图。如图1所示，所述外周血血小板分离试剂盒包括：白细胞滤器2、与所述白细胞滤器2的出血口连通的稳定管1、以及与所述白细胞滤器2入血口连通的注射器3。其中，所述稳定管1的容积至少为15ml；所述注射器3的容积至少为20ml。本实施例中稳定管1的容积优选为15ml，所述注射器3的容积优选为20ml。
相应的，本实施例还提供了一种外周血血小板分离方法。下面参考图1及图2详细说明本实施例所述外周血血小板分离方法。
首先，执行步骤S1，提供一如上所述的外周血血小板分离试剂盒。
接着，执行步骤S2，将采集的外周血血样以200g常温离心20min。
接着，执行步骤S3，将离心后得到的富血小板血浆层转移至所述外周血血小板分离试剂盒的注射器3中(实际是注射器3的外套管中)。
具体的，通过移液器吸取离心后的富血小板血浆层，注意吸取最上层的富血小板血浆层时不要触及中间层和下层，以免将中间层和下层的成分掺入富血小板血浆中。
接着，执行步骤S4，先让富血小板血浆在所述注射器3的外套管中自然过滤至少3min，再在所述注射器3的芯杆的推进下，将外套管中剩余富血小板血浆全部推进至稳定管1中。利用白细胞滤器2的滤膜来过滤白细胞，与此同时还避免蛋白酶、核酸等杂质对血小板的污染。
接着，执行步骤S5，将稳定管1放置于离心机中，以1200g常温离心5min。所述离心机优选为水平转子离心机。
接着，执行步骤S6，弃去离心后所述稳定管1中的上清，所述稳定管1中底部的沉淀部分为外周血血小板。
接着，执行步骤S7，将获得的外周血血小板移至-80℃保存。
基于多次试验数据统计获知，基于本发明的外周血血小板分离方法可实现每毫升外周血平均可分离获得2×108个外周血血小板，分离获得的外周血血小板纯度可达99.98％。
为了验证本发明的外周血血小板分离方法的可靠性，下面比较分析三种不同的血小板分离方法的优劣。
三种血小板分离方法具体如下：
方法1：传统差速离心分离方法(两步离心法)。
方法2：采用外周血血小板分离试剂盒进行外周血血小板分离方法。
方法3：白细胞滤器+磁珠分选方法(第一次离心+白细胞滤器过滤+磁珠分选+第二次离心)。
最后利用流式细胞仪、荧光定量PCR检测污染白细胞、血小板回收率。
1.1利用流式细胞仪检测分离纯化所得的血小板中混杂的白细胞数量，CD45标记白细胞。
请参考图3a，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用CD45标记白细胞后的示意图。如图3a所示，框线R1框选范围内的每个黑点代表一个白细胞，黑点的数目就是Counts数量，该数目越小，说明分离纯化的效果越好；黑色集中的区域显示的是密集的血小板。基于方法1和方法2分离纯化所得的血小板中混杂的白细胞数量的比值结果为50：1。由此可知，基于方法2所得的血小板中白细胞的污染较少。
1.2利用流式细胞仪检测血小板回收率，用CD61标记血小板。
请参考图3b，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。如图3b所示，基于方法1和方法2分离纯化所得的血小板回收率的比值结果为1：4。由此可知，基于方法2所得的血小板量较较方法1高。每一个上样量(5/10万毫升外周血中)，分离可得约40000个血小板，即每毫升外周血均可获得2×108个血小板。
1.3利用流式细胞仪检测血小板回收率，用CD61标记血小板。
请参考图3c，其为利用流式细胞仪检测基于方法2和方法3获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。如图3c所示，基于方法3和方法2分离纯化所得的血小板回收率的比值结果为1：15。由此可知，基于方法2所得的血小板量较方法3高。
1.4利用流式细胞仪检测分离纯化所得血小板中混杂的白细胞数量，用CD61标记血小板，CD45标记白细胞。
请参考图3d，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用CD61标记血小板，CD45标记白细胞后的示意图。如图3d所示，比较方法1和方法2的分离结果可知，基于方法2所得的血小板中白细胞的污染较少。
1.5利用流式细胞仪检测不同处理方法过程中血小板的活化情况。用CD61标记血小板，CD62P标记活化血小板。
请参考图3e，其为利用流式细胞仪检测基于方法1和方法2过程中血小板的活化情况，用CD61标记血小板，CD62P标记活化血小板后的示意图。如图3e所示，比较方法1和方法2的分离结果可知，基于方法2过程中的活化血小板较少，基于方法1过程中的活化的血小板较多。
1.6利用荧光定量PCR检测分离纯化所得血小板中混杂的白细胞数量，用ANPEP标记白细胞。请参考图3f，其为以全血作为对照，利用荧光定量PCR检测基于方法1和方法2获得的血小板中混杂的白细胞数量，用ANPEP标记白细胞后的示意图。如图3f所示，比较方法1和方法2的结果，可知基于方法2所得的血小板中白细胞的污染较少，离纯度高(99.98％)。
1.7利用荧光定量PCR检测血小板回收率，用CD61标记血小板。请参考图3g，其为以全血作为对照，利用荧光定量PCR检测基于方法1和方法2获得的血小板回收率，用CD61标记血小板后的示意图。如图3g所示，基于方法1和方法2分离纯化所得的血小板回收率结果可知，基于方法2所得的血小板量较方法3高。
综上三种血小板分离方法对比分析可知，基于本发明的外周血血小板分离试剂盒进行血小板分离所得的血小板含量较高，白细胞的残留污染较少，每毫升外周血平均可获得2×108个血小板，分离纯度高(99.98％)。优于其他分离方法。
对于实施例公开的方法而言，由于与实施例公开的结构相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见结构部分说明即可。
综上，在本发明所提供的外周血血小板分离试剂盒及外周血血小板分离方法中，所述外周血血小板分离试剂盒包括白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。本发明设计的外周血血小板分离试剂盒将梯度离心法和滤膜过滤相结合，在分离获得高纯度血小板(纯度可达99.98％)的同时，避免蛋白酶、核酸等杂质对血小板的污染，实现直接从人体全血样品中分离出结构完整且高纯度血小板。经本发明的外周血血小板分离试剂盒分离提纯的外周血血小板除可用于凝集试验、功能检测等传统研究外，还可用于实时定量PCR、高通量测序等灵敏度高的分子实验，具有普适性。
上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。

Claims (8)

1.一种外周血血小板分离试剂盒，其特征在于，包括：白细胞滤器、与所述白细胞滤器的出血口连通的稳定管、以及与所述白细胞滤器入血口连通的注射器。
2.如权利要求1所述的外周血血小板分离试剂盒，其特征在于，所述稳定管的容积至少为15ml。
3.如权利要求1所述的外周血血小板分离试剂盒，其特征在于，所述注射器的容积至少为20ml。
4.一种外周血血小板分离方法，其特征在于，包括：
提供一如权利要求1～3中任一项所述的外周血血小板分离试剂盒；
将采集的外周血血样以200g常温离心20min；
将离心后得到的富血小板血浆层转移至所述外周血血小板分离试剂盒的注射器中；
先让富血小板血浆在所述注射器的外套管中自然过滤至少3min，再在所述注射器的芯杆的推进下，将外套管中剩余富血小板血浆全部推进至稳定管中；
将稳定管放置于离心机中，以1200g常温离心5min；
弃去离心后所述稳定管中的上清，所述稳定管中底部的沉淀部分为外周血血小板。
5.如权利要求4所述的外周血血小板分离方法，其特征在于，还包括如下步骤：
将获得的外周血血小板移至-80℃保存。
6.如权利要求4所述的外周血血小板分离方法，其特征在于，每毫升外周血平均可分离获得2×108个外周血血小板。
7.如权利要求4所述的外周血血小板分离方法，其特征在于，通过移液器吸取离心后的富血小板血浆层。
8.如权利要求4～7中任一项所述的外周血血小板分离方法，其特征在于，离心采用的平台为水平转子离心机。
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