CN110643610A

CN110643610A - 用于结合补体组分3蛋白的核酸化合物

Info

Publication number: CN110643610A
Application number: CN201910922493.7A
Authority: CN
Inventors: 丹尼尔·W·德罗莱; 张弛; 丹尼尔·J·奥康奈尔; 沙希·古普塔
Original assignee: Somalogic Inc
Current assignee: Somalogic Inc
Priority date: 2014-05-30
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2020-01-03
Also published as: US20230093170A1; WO2015184372A1; US11466275B2; NO2718257T3; CN106459979A; ES2664179T3; EP3149173B1; CN106459979B; EP3149173A1; US20170166895A1; JP2017517261A; CA2949246C; JP6824041B2; CA2949246A1

Abstract

本文描述能够结合人补体组分3(C3)蛋白的适体；包含C3结合适体与C3‑蛋白的组合物；及其制备和使用方法。

Description

用于结合补体组分3蛋白的核酸化合物

本申请是国际申请号PCT/US2015/033355，国际申请日2015年5月29日，中国申请号201580028344.6，发明名称为“用于结合补体组分3蛋白的核酸化合物”的专利申请的分案申请。

本申请要求2014年5月30日提交的美国临时申请第62/005,300号的权益，其通过引用整体并入本文用于任何目的。

领域

本公开总体上涉及核酸领域，并且更具体地，涉及能够结合人补体组分3(C3或C3-蛋白)的适体、包含C3结合适体和C3的组合物，及使用此类适体抑制C3的生物功能的方法和检测C3的方法。

背景

补体系统包含一组相互作用的蛋白，其包括在血液和其它体液中发现的可溶性蛋白以及细胞结合蛋白(Makrides，Pharmacological Reviews 1998，50(1)：59-88)。该系统在宿主对病原体的防御所需的先天性免疫中起主要作用并且介导病原体细胞溶解、免疫细胞趋化作用和吞噬作用(Janeway等，Immunobiology：The Immune System in Health andDisease.第5版New Yerk：Garland Science；2001.)。

补体组分3(C3)蛋白(在血液中发现的糖蛋白)是该系统的成员并且在该途径中起中心作用(Lambris，Immunology Today 1988，9(12)：387-393)。人补体组分3(C3)基因位于染色体19的短臂上(Lusis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83：3929-3933)并且经转录、加工和翻译成C3前体(pro-C3)。C3前体在分泌后经历位点特异性内源蛋白水解裂解以产生循环C3。C3作为含两个通过二硫键连接的亚基(α链115kDa和β链75kDa)的蛋白质循环。正常人血清中C3-蛋白的浓度为大约1.15mg/mL(Kasperska-Zajac等，J.Inflammation 2013，10：22；doi：10.1186/1476-9255-10-22)。

其活化之后，C3-蛋白与表面的共价结合引发补体系统的许多效应。活化可通过可溶性C3-蛋白位点特异性蛋白水解为称为C3a和C3b的两种蛋白质来实现。C3b与表面共价结合，在表面上C3b起到靶向颗粒以便吞噬的作用(调理作用)或引发导致病原体细胞溶解的终端补体途径。C3a是所谓的过敏毒素，即各种生理功能如平滑肌细胞收缩、血管通透性、肥大细胞脱粒和免疫细胞趋化性的介体。阻止位点特异性蛋白水解活化事件的C3抑制剂是所期望的，因为它们可阻止C3a和C3b两者的生物功能以及终端补体途径的活化。

补体系统通常受到紧密调控以便防止对宿主的组织损害(Thurman等，J.Immunol.2006，176：1305-1310)。然而，失调时，如可在一个或多个控制机制失败时发生或通过非典型的免疫系统调节，所引起的补体过度活化可导致病理生理。例如，在非典型溶血性尿毒症综合征和年龄相关的黄斑变性中，牵涉补体控制蛋白因子H的改变而导致C3-转化酶活性的增加并因此导致补体过度活化(Ferreira等，Mol.Immunol.2010，47(13)：2187-2197)。然后补体的过度活化可攻击宿主自身的细胞，导致在这些疾病中观察到的组织损害。补体系统也可促成由许多炎性病症和缺血/再灌注损伤引起的组织损害。因此可以抑制补体系统的治疗剂，包括抑制C3活性的那些，可以证明是有益的。本公开通过提供可以抑制人C3-蛋白的生物活性并阻止C3a释放的适体而满足这样的需要。

测定体液中C3的浓度作为对几种疾病和疾患的诊断试验，包括但不限于诊断急性炎性疾患、微生物感染、先天性C3缺乏症、急性肾小球肾炎、全身性红斑狼疮、膜性增生性肾小球肾炎和免疫复合物病(Nilsson等，Clin.Dev.Immunol..2012，2012：文章编号962702，第11页)。目前，抗体是用于检测C3最常用的工具。然而，抗体有几个缺点，包括稳定性(不同温度和pH条件的耐受性，和缺乏从非理想条件的可回收性)，这等同于保质期有限、储存要求特殊(例如，冷却)、聚集和生产相对昂贵。本公开通过提供对人C3-蛋白具有结合特异性的适体解决了抗体所遇到的问题。

概述

本公开描述能够结合人补体组分3(C3)蛋白的适体；经证实这些适体是补体介导的C3活化的抑制剂并且因此用作诊断和治疗剂。描述了包含C3-蛋白结合适体的药物组合物；及其制备和使用方法。

在一些实施方案中，提供了结合C3蛋白的适体。在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：152)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；每个D独立地且每次出现为A、C或3-碳间隔区；每个V独立地且每次出现为A、G、C或3-碳间隔区；L为A、U、T或C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；Y为C、U或T；并且n为0或1。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPAYRPPM-3′(SEQ ID NO：153)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，提供了结合C3蛋白的适体。在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：131)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；每个D独立地且每次出现为A、C或3-碳间隔区；每个V独立地且每次出现为A、G、C或3-碳间隔区；L为A、U、T或C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；并且n为0或1。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPACGPPM-3′(SEQ ID NO：135)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPP-3′(SEQID NO：154)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；V为A、G、C或3-碳间隔区；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；Y为C、U或T；并且X是选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇的接头。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPPM-3′(SEQ ID NO：155)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPACGPP-3′(SEQID NO：136)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；V为A、G、C或3-碳间隔区；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；并且X是选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇的接头。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPACGPPM-3′(SEQ ID NO：137)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在上述任何实施方案中，K可为C-5经修饰的嘧啶、C或G；每个M可独立地且每次出现为C或C-5经修饰的嘧啶；和/或L可为A或C-5经修饰的嘧啶。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-PAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：156)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；V为A、G或C；Y为C、U或T；并且R为G或A。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-PAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：134)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；并且V为A、G或C。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含与选自SEQ ID NO：4-130和138-151的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含与选自SEQ ID NO：4-28、32-34、37-75、78-118、121-130和139-151的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含第一区和第二区，其中第一区包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)并且第二区包含序列5′-GPAYRPP-3′(SEQ ID NO：157)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含第一区和第二区，其中第一区包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)并且第二区包含序列5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。

在一些实施方案中，其中第一区的3′-末端共价连接到第二区的5′-末端。在一些实施方案中，第一区和第二区通过至少一个、两个、三个、四个或五个接头共价连接，其中每个接头独立地选自核苷酸、经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇。在一些实施方案中，每个接头独立地选自核苷酸、3-碳间隔区和六乙二醇。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列5′-GPAYRPP-3′(SEQ ID NO：157)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A。

在一些实施方案中，结合C3蛋白的适体包含序列SEQ ID NO：125，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。

在本文所述的适体的一些实施方案中，每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-噻吩基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-酪氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-3，4-亚甲二氧基苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(MBndU)、5-(N-4-氟苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(FBndU)、5-(N-3-苯丙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PPdU)、5-(N-咪唑基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ImdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-R-苏氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThrdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。在一些实施方案中，每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。在一些实施方案中，每个C-5经修饰的嘧啶为5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。

在本文所述任何实施方案中，适体可包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸。

在本文所述任何实施方案中，所述适体长度可为约24至约100个核苷酸，或长度为约30至约60个核苷酸，或长度为约28至约60个核苷酸，或长度为约40至约50个核苷酸，或长度为约28个核苷酸。在本文所述任何实施方案中，适体长度可为24至100个核苷酸，或长度为30至60个核苷酸，或长度为28至60个核苷酸，或长度为28至50个核苷酸，或长度为28至40个核苷酸，或长度为40至50个核苷酸，或长度为28至32个核苷酸。

在一些实施方案中，本文所述的适体结合C3蛋白并抑制C3蛋白裂解。在一些实施方案中，C3蛋白为人C3蛋白。

在一些实施方案中，提供了一种组合物，其包含本文所述的适体和补体组分3(C3)蛋白。在一些此类实施方案中，补体组分3(C3)蛋白为人补体组分3(C3)蛋白。

在一些实施方案中，提供了抑制补体组分3(C3)蛋白裂解的方法，其包括使C3蛋白与本文所述的适体接触。在一些实施方案中，C3蛋白是在体外样品中。在一些实施方案中，C3蛋白是在受试者中。

在一些实施方案中，提供了抑制补体系统的至少一种活性的方法，其包括使所述补体系统的组分与本文所述的适体接触。在一些实施方案中，所述补体系统的组分是在体外样品中。在一些实施方案中，所述补体系统的组分是在受试者中。

在一些实施方案中，提供了抑制受试者中的补体组分3(C3)蛋白裂解的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的适体。

在一些实施方案中，提供了抑制受试者中的补体系统的至少一种活性的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本文所述的适体。

在一些实施方案中，提供了治疗年龄相关的黄斑变性、自身免疫性疾病、血液病、传染性疾病、脓毒病、炎性疾病或神经退行性疾病的方法，其包括向受试者施用有效量的本文所述的适体。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自红斑狼疮和类风湿性关节炎。在一些实施方案中，所述血液病为阵发性睡眠性血红蛋白尿。在一些实施方案中，所述炎性疾病选自缺血/再灌注损伤、关节炎和肾炎。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病选自亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和帕金森氏病(Parkinson′s disease)。

在一些实施方案中，提供了本文所述的适体用于抑制C3蛋白裂解的用途。在一些实施方案中，提供了本文所述的适体用于抑制补体系统的至少一种活性的用途。在一些实施方案中，提供了本文所述的适体用于治疗年龄相关的黄斑变性、自身免疫性疾病、血液病、传染性疾病、脓毒病、炎性疾病或神经退行性疾病的用途。在一些实施方案中，自身免疫性疾病选自红斑狼疮和类风湿性关节炎。在一些实施方案中，所述血液病为阵发性睡眠性血红蛋白尿。在一些实施方案中，所述炎性疾病选自缺血/再灌注损伤、关节炎和肾炎。在一些实施方案中，所述神经退行性疾病选自亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和帕金森氏病(Parkinson′s disease)。

在一些实施方案中，提供了选择对C3蛋白具有结合亲和力的适体的方法。在一些实施方案中，一种方法包括：(a)使候选混合物与C3蛋白接触，其中所述候选混合物包含经修饰核酸，其中所述候选混合物的至少一个或每个核酸中的一个、几个或所有嘧啶包含C-5经修饰的嘧啶；(b)使所述候选混合物暴露于缓慢解离速率富集过程，其中相对于所述候选混合物中的其它核酸，从靶分子解离的速率缓慢的核酸结合所述C3蛋白，形成核酸-靶分子复合物；(c)从所述候选混合物中分离解离速率缓慢的核酸；并且(d)扩增所述解离速率缓慢的核酸以得到富集能够以缓慢解离速率结合所述C3蛋白的核酸序列的核酸混合物，从而选择与所述C3蛋白分子解离速率缓慢的适体。在一些实施方案中，所述候选混合物包含含有序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)的核酸，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所述候选混合物包含含有序列5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)的核酸，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，所述候选混合物包含含有序列5′-GPAYRPP-3′(SEQ ID NO：157)的核酸，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A。在一些实施方案中，每个核酸独立地长度为约24至约100个核苷酸，或长度为约30至约60个核苷酸，或长度为约28至约60个核苷酸，或长度为约40至约50个核苷酸，或长度为约28个核苷酸。在一些实施方案中，每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-噻吩基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-酪氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-3，4-亚甲二氧基苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(MBndU)、5-(N-4-氟苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(FBndU)、5-(N-3-苯丙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PPdU)、5-(N-咪唑基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ImdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-R-苏氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThrdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。在一些实施方案中，每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。在一些实施方案中，每个C-5经修饰的嘧啶为5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。在一些实施方案中，所述混合物中的多个核酸包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方案中，所述混合物中的多个核酸包含C3-间隔区、HEG接头或PEG接头。在一些实施方案中，C3蛋白为人C3蛋白。

本发明的前述和其它目的、特征和优点将从参考附图所做的以下详细描述中更加显而易见。

附图简述

图1A和1B.(A)示出了25个独立来源的活性模型1适体序列。示出了超过40,000个序列的第9轮库中测序出相同或等效(≤5个核苷酸差异)适体的次数。每个序列中突出显示与测序最频繁的模型1适体8491-3_3相同的核苷酸。(B)前两行中示出了适体模型1的核苷酸位置和共有序列。A、C、G和P行(其中A为腺嘌呤，C为胞嘧啶并且G为鸟嘌呤，P为NapdU)指出在适体模型1中在限定共有序列的23个核苷酸位置的每一处观察到这些核苷酸的频率。在共有序列中，多核苷酸共有性用以下单字母代码表示。R＝A或G；M＝P或C，K＝C、G或P；L＝A或P；D＝C或A；V＝A、C或G。在位置8和9之间允许单碱基插入。这种插入发生的频率为0.16。“无插入”的频率为0.84。

图2.示出了根据蛋白质浓度(x-轴)绘制的结合的DNA分子的分数(y-轴)的图示。人C3-蛋白浓度范围为1x10^-7M至1x10^-12M，并且平衡结合常数(K_d)使用y＝(最大值-最小值)(P_t)/(K_d+P_t)+最小值计算。适体8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-94_53(SEQ ID NO：58)和8491-94_97(SEQ ID NO：125)分别以3.13x10^-11M、3.34x10^-11M和5.49x10^-11M的K_d结合C3。

图3.示出了根据对照蛋白人C5浓度(x-轴)绘制的结合的DNA分子的分数(y-轴)的图示。C5蛋白浓度范围为1x10^-7M至1x10^-12M。未检测到8491-94_53(SEQ ID NO：58)或8491-94_97(SEQ ID NO：125)与人C5蛋白的明显结合。

图4.模式1序列抑制人血清中补体介导的抗体包被的绵羊红血细胞的溶血。如实施例3所述使用25nM人C3蛋白和1μM指定适体进行实验。每根柱展示了相对于“无抑制剂对照”两次独立实验的中位数百分比溶血。渗透溶解对照示出了当所有红血细胞溶解时在412nm下的相对百分比吸光度。误差条指出两个实验的范围。非结合适体8491-94_14(SEQ ID NO：35)、8491-94_15(SEQ ID NO：36)、8491-398_3(SEQ ID NO：30)和8491-401_3(SEQ ID NO：29)抑制溶解低于25％。C3蛋白结合适体8491-3_3(SEQ ID NO：4)、8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-189_3(SEQ ID NO：8)、8491-282_3(SEQ ID NO：9)、8491-387_3(SEQ ID NO：16)、8491-388_3(SEQ ID NO：18)、8491-389_3(SEQ ID NO：6)、8491-390_3(SEQ ID NO：7)、8491-393_3(SEQ ID NO：14)、8491-394_3(SEQ ID NO：11)、8491-395_3(SEQ ID NO：10)、8491-396_3(SEQ ID NO：13)、8491-397_3(SEQ ID NO：12)、8491-399_3(SEQ ID NO：27)、8491-400_3(SEQ ID NO：24)、8491-405_3(SEQ ID NO：17)、8491-406_3(SEQ ID NO：15)和8491-409_3(SEQ ID NO：28)抑制溶解高于50％。

图5A和5B.8491-94_3(SEQ ID NO：5)及其衍生物对人血清中补体介导的抗体包被的绵羊红血细胞的溶血的抑制。如实施例3中所述使用不同浓度的如图所示的适体与固定浓度(20nM)的人C3-蛋白进行实验。将数据拟合为4-参数逻辑方程以确定IC₅₀。图(A)显示8491-94_3以14.8nM的IC₅₀抑制，而8491-94_26(SEQ ID NO：54)、8491-94_27(SEQ ID NO：55)、8491-94_30(SEQ ID NO：60)、8491-94_36(SEQ ID NO：66)、8491_94_37(SEQ ID NO：67)和8491-94_43(SEQ ID NO：73)分别以15.1nM、24.6nM、20.9nM、25.0nM、24.7nM和19.2nM的IC₅₀值抑制。图(B)显示适体8491-94_53(SEQ ID NO：58)以17.1nM的IC₅₀抑制，而适体8491-94_90(SEQ ID NO：118)、8491-94_97(SEQ ID NO：125)和8491-94_100(SEQ ID NO：128)分别以18.9nM、15.6nM和19.7nM的IC₅₀值抑制。

图6.在酵母聚糖-A诱导的补体活化之后8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-94_53(SEQID NO：58)和8491-94_97(SEQ ID NO：125)对C3a释放的抑制(在34％正常人血清中)。如实施例4所述进行实验。将数据拟合为4-参数逻辑方程以确定8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-94_53(SEQ ID NO：58)和8491-94_97(SEQ ID NO：125)的IC₅₀值分别为2μM、1.5μM和3μM的。

图7A和7B.如实施例5所述，在37℃下用0.002个单位/μL DNA酶I(A)消化适体8491-94_53(SEQ ID NO：58)、8491-94_90(SEQ ID NO：118)、8491-94_97(SEQ ID NO：125)、8491-94_100(SEQ ID NO：128)和8491-94_102(SEQ ID NO：130)(250nM)指定小时数并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离消化产物。用SYBR金使条带可视化。示出了全长(FL)适体及选定分子长度标记的尺寸，其中N为核苷酸的数量。(B)通过光密度测定法测定的每个全长适体条带(SOMAmer)随时间的剩余百分比。前缀“OH”指示未修饰的5′-端。

图8A和8B.在37℃下如实施例5所述用0.014个单位/μL DNA酶II消化适体8491-94_53(SEQ ID NO：58)、8491-94_90(SEQ ID NO：118)、8491-94_97(SEQ ID NO：125)、8491-94_100(SEQ ID NO：128)和8491-94_102(SEQ ID NO：130)指定小时数并且通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离消化产物。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离消化产物。用SYBR金使条带可视化。示出了全长(FL)适体及选定分子长度标记的尺寸，其中N为核苷酸的数量。(B)通过光密度测定法测定的每个全长适体条带(SOMAmer)随时间的剩余百分比。前缀“OH”指示未修饰的5′-端。

图9示出了如实施例15所讨论的某些示例性C-5经修饰的嘧啶(或5-dU修饰)。每个修饰结构连接到dU，例如图10所示。

图10示出了如实施例部分所讨论的某些C-5嘧啶和骨架修饰。

图11示出了可并入适体，如解离速率缓慢的适体中的某些示例性经修饰嘧啶(或C-5经修饰的嘧啶)。图11提供了对R′、R″和R″′的定义。

图12A和12B.(A)在酵母聚糖-A诱导的补体活化之后模式1SOMAmer 8491-3_3(SEQ IDNO：4)、8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-189_3(SEQ ID NO：8)、8491-387_3(SEQ ID NO：16)和8491-389_3(SEQ ID NO：6)对10％正常人血清中C3a释放的抑制。适体浓度为2μM并且如实施例4所述进行实验。数据表示为从无抑制剂对照得到的信号的百分比。(B)对照实验证明8491-3_3(SEQ ID NO：4)、(8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-189_3(SEQ ID NO：8)、8491-387_3(SEQ ID NO：16)和8491-389_3(SEQ ID NO：6)不实质性干扰对C3a释放的测定。数据表示为从无抑制剂对照得到的信号的百分比。

详述

I.术语和方法

除非另有说明，否则技术术语按照常规用法使用。分子生物学常用术语的定义可在Benjamin Lewin，Genes V，由Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell ScienceLtd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编)，Molecular Biology andBiotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)中找到。

为了便于本公开各个实施方案的审查，提供了具体术语的下列解释：

适体：术语适体，如本文中所用，是指对靶分子具有期望的作用的非天然存在的核酸。期望的作用包括但不限于，靶标结合、抑制靶标活性、增强靶标活性、改变靶标结合性质(例如，增加或降低靶标对配体、受体、辅因子等的亲和力)、抑制靶标加工(如抑制蛋白靶标的蛋白酶裂解)、增强靶标加工(如增加蛋白靶标的蛋白酶裂解速率或程度)及抑制或促进靶标和另一个分子之间的反应。适体也可以称作“核酸配体”。在一些实施方案中，适体为SOMAmer。如本文中所用，除非另有特别说明，否则术语“适体”包括适体及其药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，适体特异性结合靶分子，其中所述靶分子是不同于多核苷酸的三维化学结构，其通过不依赖于沃森/克里克碱基配对(Watson/Crick base pairing)或三螺旋形成的机制与适体结合，并且其中所述适体不是具有被靶分子结合的已知生理功能的核酸。在一些实施方案中，给定靶标的适体包括通过下述方法从核酸候选混合物中鉴定的核酸，所述方法包括：(a)使候选混合物与靶标接触，其中相对于候选混合物中的其它核酸，对靶标具有增加的亲和力的核酸可与候选混合物的其余部分分离；(b)将亲和力增加的核酸与候选混合物的其余部分分离；并且(c)扩增亲和力增加的核酸以得到配体富集的核酸混合物，从而鉴定靶分子的适体。人们认识到亲和相互作用是一个程度的问题；然而，关于这一点，适体“特异性结合”其靶标意味着适体以比结合混合物或样品中的其它、非靶标、组分高得多的亲和力程度结合其靶标。“适体”或“核酸配体”是具有特定核苷酸序列的一类或一种核酸分子的一组拷贝。适体可包括任何合适数量的核苷酸。“适体”是指一组以上此类分子。不同适体可以具有相同或不同数量的核苷酸。适体可包含DNA、RNA、DNA和RNA两种及任一种或两种的修饰形式，并且可为单链、双链，或含有双链或三链区，或任何其它三维结构。

生物活性：术语生物活性，如本文中所用，是指可以影响生理或病理生理过程的一种或多种细胞间、细胞内或细胞外过程(例如，细胞-细胞结合、配体-受体结合、细胞信号传导等)。

C-5经修饰的嘧啶：C-5经修饰的嘧啶，如本文中所用，是指在C-5位置具有修饰的嘧啶。C-5经修饰的嘧啶的实例包括美国专利第5,719,273和5,945,527号中描述的那些。本文提供了C-5经修饰的嘧啶的某些非限制性实例。

C3适体：“C3适体”，如本文中所用，是指能够结合C3-蛋白的适体。

C3-间隔区：“C3-间隔区”或“3碳间隔区”或“C3取代”，如本文中所用，是指包含至少三个设计为跨越与核苷酸相同距离的碳，但缺乏核糖和嘌呤或嘧啶碱基部分的接头。在一些实施方案中，C3间隔区具有结构(CH₂)₃，其中它通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接到相邻核苷酸或其它部分。

补体系统的组分：补体系统的组分，如本文中所用，是指在补体途径中起作用并且能够引发、活化、促进和/或调节补体途径的一种或多种蛋白。因此，在由于接触包含补体系统组分的样品而能够抑制或基本上抑制补体系统的试剂(例如，适体)的情况下，举例而言，该试剂可与补体途径中的一种或多种蛋白相互作用、结合和/或干扰补体途径中的一种或多种蛋白的活性、结合和/或功能。

抑制：术语抑制，如本文中所用，意为将靶标的生物活性降低到靶标丧失可测量的量的活性的程度；或将靶标的稳定性和/或将靶标的活性降低到靶标不再具有可测量的活性的程度。在一些实施方案中，此类抑制可通过影响靶标与另一种分子的相互作用和/或影响靶标加工而发生。如本文所述，可受抑制的靶标为C3。

经修饰的：如本文中所用，术语“修饰”、“经修饰的”及其任何变型，在关于寡核苷酸使用时，意指寡核苷酸包含至少一个非天然部分，如至少一个非天然糖部分、至少一个非天然核苷酸间连键、至少一个非天然核苷酸碱基部分和/或至少一个在寡核苷酸中非天然存在的部分(例如，3碳间隔区或六乙二醇(HEG))。在一些实施方案中，寡核苷酸的四种组成核苷酸碱基(即，A、G、T/U和C)中的至少一种是经修饰的核苷酸。在一些此类实施方案中，经修饰的核苷酸包含比天然存在的碱基疏水性更强的碱基部分。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸赋予寡核苷酸核酸酶抗性。在一些实施方案中，当适体包含一个或多个包含疏水性碱基部分的经修饰核苷酸时，适体主要通过疏水相互作用结合其靶标，如蛋白。在一些实施方案中，此类疏水相互作用产生高结合效率和稳定的共晶复合物。在C-5位置具有取代的嘧啶是经修饰的核苷酸的实例。修饰也可包括3′和5′修饰，如加帽。其它修饰可包括一个或多个天然存在的核苷酸被类似物取代，核苷酸间修饰如具有不带电连键的那些(例加，甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电连键的那些(例加，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，具有嵌入剂的那些(例加，吖啶、补骨脂素(psoralen)等)，含螯合剂的那些(例加，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)，含烷化剂的那些，及具有经修饰的连键的那些(例加，α-异头核酸等)。进一步地，核苷酸的糖上普通存在的任何羟基均可由膦酸基团或磷酸基团置换；由标准保护基团保护；或活化以制备与附加核苷酸或与固体载体的附加连键。5′和3′端OH基团可以磷酸化或经胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、聚乙二醇(PEG)聚合物(在一些实施方案中范围为约10至约80kDa的PEG聚合物，在一些实施方案中范围为约20至约60kDa的PEG聚合物)或其它亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。在一个实施方案中，修饰是嘧啶的C-5位置。这些修饰可以通过直接在C-5位置的酰胺连键或由其它类型的连键来产生。

多核苷酸也可含有本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物及脱碱基核苷类似物(如甲基核糖核苷)。如上所述，一个或多个磷酸二酯连键可以被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NR₂(“酰胺酯”)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH₂(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中每个R或R′独立地为H或经取代或未取代的烷基(1-20个C)，任选含醚(-O-)连键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连键都需要是相同的。类似形式的糖、嘌呤和嘧啶的取代在设计最终产物中可以是有利的，例如，替代性骨架结构如聚酰胺骨架也可以。

调节：如本文中所用，“调节”意为通过增加或降低，改变靶标的水平、稳定性、加工和/或活性。

核酸：如本文中所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换用于指核苷酸的聚合物并且包括DNA、RNA、DNA/RNA杂交体和此类实体的经修饰形式。术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。术语核酸包括适体，但不限于此(即，该术语包括核苷酸的其它聚合物)。

核酸酶：如本文中所用，术语“核酸酶”是指能够裂解寡核苷酸的核苷酸亚单位之间的磷酸二酯键的酶。如本文中所用，术语“核酸内切酶”是指裂解在寡核苷酸内部位点的磷酸二酯键的酶。如本文中所用，术语“核酸外切酶”是指裂解连接寡核苷酸的末端核苷酸的磷酸二酯键的酶。生物流体通常含有核酸内切酶和核酸外切酶两种的混合物。

抗核酸酶：如本文中所用，术语“抗核酸酶”和“核酸酶抗性”是指寡核苷酸用作核酸内切酶或核酸外切酶的底物的能力降低，使得在与此类酶接触时，寡核苷酸不降解或降解更加缓慢或降解到比相似长度和序列但缺乏正测量其核酸酶抗性的寡核苷酸的一个或多个修饰的对照寡核苷酸更低的程度。

核苷酸：如本文中所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或其经修饰的形式。核苷酸包括的种类包括嘌呤(例加，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤等)以及嘧啶(例加，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶等)。当碱基表示为“A”、“C”、“G”、“U”或“T”时，其旨在涵盖核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者，及其经修饰的形式。

药学上可接受的：药学上可接受的，如本文中所用，意指经联邦或国家政府管理机构批准或列入美国药典或其它公认的药典中用于动物并且更特别地是用于人。

药学上可接受的盐：化合物(例如，适体)药学上可接受的盐，如本文中所用，是指含有该化合物和通过离子键与该化合物结合的一种或多种另外的药学上可接受的原子或基团的产物。在一些实施方案中，药学上可接受的盐通过使化合物与酸或碱接触生成。药学上可接受的盐可包括但不限于酸加成盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氢硫酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、芳基烷基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐；碱金属阳离子如Li、Na、K，碱土金属盐如Mg或Ca，或有机胺盐。如本文中所用，除非另有特别说明，否则术语“适体”包括适体及其药学上可接受的盐。

药物组合物：药物组合物，如本文中所用，是指包含化合物(如适体)呈适于向个体施用的形式的配制剂。药物组合物通常配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于玻璃体内、肠内和肠胃外，包括，例如，皮下注射或输注、静脉内注射或输注、关节内注射、腹腔内动脉注射和输注、房水内注射和植入及玻璃体内注射和植入。

蛋白：如本文中所用，“蛋白”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义使用。“纯化的”多肽、蛋白、肽或肽片段基本上不含来自于从中获得纯化蛋白的细胞、组织或无细胞来源的细胞材料或其它污染蛋白，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。

SELEX：术语SELEX，如本文中所用，通常是指对以期望的方式与靶分子相互作用，例如以高亲和力与蛋白质结合的核酸的选择；及对那些选定核酸的扩增。SELEX可用于鉴定对特定靶分子具有高亲和力的适体。术语SELEX和“SELEX方法”可以互换使用。在一些实施方案中，提供了选择与靶分子结合的适体的方法，其包括(a)制备核酸的候选混合物，其中所述候选混合物包含经修饰的核酸，其中所述候选混合物的至少一个或每个核酸中的至少一个嘧啶在C5位置经化学修饰；(b)使候选混合物与靶分子接触，其中相对于所述候选混合物中的其它核酸，对靶分子具有增加的亲和力的核酸结合靶分子，形成核酸-靶分子复合物；(c)将亲和力增加的核酸与候选混合物的其余部分分离；并且(d)扩增亲和力增加的核酸以得到富集能够以增加的亲和力结合靶分子的核酸序列的核酸混合物，从而鉴定靶分子的适体。在某些实施方案中，所述方法还包括进行缓慢解离速率富集过程。

序列同一性：序列同一性，如本文中所用，在两个或更多个核酸序列的情况下是序列共有相同核苷酸位置数量的函数(即，同一性％＝相同位置数/比较的两个序列中较短序列中的位置总数×100)，考虑到了需要引入以优化两个或更多个序列的比对的空位数量及每个空位的长度。序列的比较和两个或更多个序列之间百分比同一性的测定可以使用数学算法，如BLAST和Gapped BLAST程序在其默认参数下完成(例如，Altschul等，J.Mol.Biol.215：403，1990；还参见在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的BLASTN)。对于序列比较，通常一个序列充当与试验序列相比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要，则指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定程序参数计算试验序列相对于参考序列的百分比序列同一性。用于比较的序列的最佳比对可以，例如通过局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482，1981)，通过同源性比对算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443，1970)，通过相似性搜索法(Pearson和Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)，通过计算机执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)或通过目测(通常参见，Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.andWiley-Interscience出版(1987))进行。如本文中所用，在描述核酸如适体的百分比同一性时，其序列与参考核苷酸序列至少，例如约95％相同，意图是参考核酸序列的每100个核苷酸中除核酸序列可包括多达5个点突变外，该核酸序列与参考序列相同。换言之，为获得序列与参考核酸序列至少约95％相同的所需核酸序列，可以使参考序列中多达5％的核苷酸缺失或用另一种核苷酸取代，或可以将多达参考序列中核苷酸总数的5％的某一数量的核苷酸插入到参考序列中(本文中称为插入)。参考序列产生所需序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5′或3′末端位置或那些末端位置之间的任何地方，单独散布在参考序列的核苷酸间或在参考序列内的一个或多个连续基团中。

SOMAmer：如本文中所用，“SOMAmer”或解离速率缓慢的经修饰适体是指解离速率(t_1/2)≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的适体(包括包含至少一个具有疏水性修饰的核苷酸的适体)。在一些实施方案中，使用标题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利7,947,447中描述的改进SELEX方法生成SOMAmer。

间隔区：间隔区，如本文中所用，是指形成经修饰寡核苷酸的一部分，并且通常代替经修饰寡核苷酸中的核苷的非核苷小分子。示例性间隔区序列包括但不限于，聚乙二醇、烃链(如3碳间隔区)和其它聚合物或共聚物。在一些实施方案中，间隔区提供连接适体的两个区域(如两个共有或保守区)，同时保持适体活性的共价分子支架。在某些方面，间隔区序列可以通过核苷酸糖部分(包括经修饰的糖部分)上的3′或5′位置共价连接到相邻核苷酸。

基本上抑制：基本上抑制，如本文中所用，是指相对于对照，活性或作用的完全或部分阻断，例如任何可测量的降低或至少10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％抑制或降低。在一些实施方案中，在适体的存在下测量对靶标活性的抑制或对靶标的影响(例如靶标的裂解)，并且对照是在无适体的基本上相似的条件下。在一些实施方案中，测量的活性是补体系统的活性。本领域的普通技术人员可以意识到可用于测量活性水平，并且因此可用于测量对补体系统的抑制的不同测定和方法。可用于测定补体系统的抑制程度的示例性方法包括对补体介导的溶血的任何测定，这在实施例3中有更详细的描述。另一种示例性方法包括如实施例4中更详细地描述，测定C3-蛋白经蛋白水解裂解成C3a和C3b的程度。

靶分子：靶分子(或靶标)，如本文中所用，是指具有不同于多核苷酸的三维化学结构，适体可以以期望方式对其作用的任何化合物或分子。靶分子的非限制性实例包括蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、有毒物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织、前述任一种的任何部分或片段等。几乎任何化学或生物效应子均可为合适的靶标。任何大小的分子均可作为靶标。也可以某种方式修饰靶标以增强靶标和核酸之间相互作用的可能性或强度。靶标还可包括特定化合物或分子的任何微小变化，如在蛋白质的情况下，例如，在其氨基酸序列、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，包括与标记组分的偶联上的微小变化，这基本上不改变该分子的同一性。“靶分子”或“靶标”是一类或一种能够结合适体的分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子”或“靶标”是指一组以上此类分子。

治疗有效量：如本文中所用，术语“治疗有效量”通常意指如本文所述，改善待预防、减轻或治疗的病症或疾患的至少一种症状所需的量。短语“治疗有效量”在涉及本公开的适体时，意指因为在需要此类治疗的大量个体中施用适体而提供特定药理反应的适体剂量。需要强调的是在特定情况下向特定个体施用的治疗有效量的适体在治疗本文所述的疾患/疾病中不会总是有效，即使本领域技术人员认为此类剂量是治疗有效量。

除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。“包含A或B”意为包括A或B，或A和B。还应该理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小及所有分子量或分子质量值都是近似值，并且是为了描述而提供。

进一步地，本文提供的范围理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围理解为包括来自于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的任何数字、数字组合或子范围(除非上下文另外明确指出，否则还包含其分数)。除非另有说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举的范围内的任何整数，并且在适当的时候，包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。同样，除非另有说明，否则本文列举的关于任何物理特征，如聚合物亚单位、大小或厚度的任意数字范围都应当被理解为包括所列举范围内的任何整数。如本文中所用，除非另有说明，否则“约”或“基本上由......组成意指所指示的范围、值或结构的±20％。如本文中所用，术语“包括(include)”和“包含(comprise)”是开放式的并且同义使用。应理解术语“一个(a)”和“一种(an)”如本文中所用是指“一个或多个”所列举的组分。替代性方法的使用(例如“或”)应理解为意指任何一个、两个替代性方案或其任何组合。

虽然在本公开的实践或试验中可以使用与本文所述相似或等效的方法和材料，但下面描述合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书，包括术语的解释为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的并非不旨在限制。

II.概述

本发明提供特异性结合C3蛋白的适体(有时被称为“C3适体”)。在一些实施方案中，适体抑制C3蛋白的裂解。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：152)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；每个D独立地且每次出现为A、C或3-碳间隔区；每个V独立地且每次出现为A、G、C或3-碳间隔区；L为A、U、T或C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；Y为C、U或T；并且n为0或1。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPAYRPPM-3′(SEQ ID NO：153)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：131)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；每个D独立地且每次出现为A、C或3-碳间隔区；每个V独立地且每次出现为A、G、C或3-碳间隔区；L为A、U、T或C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；并且n为0或1。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPACGPPM-3′(SEQ ID NO：135)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：154)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；V为A、G、C或3-碳间隔区；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；Y为C、U或T；并且X是选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇的接头。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPPM-3′(SEQ ID NO：155)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：136)，其中K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；R为A或G；M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；V为A、G、C或3-碳间隔区；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；并且X是选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇的接头。在一些实施方案中，所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPACGPPM-3′(SEQ ID NO：137)，其中每个M独立地且每次出现为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-PAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：156)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C或3-碳间隔区；V为A、G或C；Y为C、U或T；并且R为G或A。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-PAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：134)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；并且S为C或3-碳间隔区；V为A、G或C。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含与选自SEQ IDNO：4-130和138-151的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个P均为NapdU。在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含与选自SEQ ID NO：4-28、32-34、37-75、78-118、121-130和139-151的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个P均为NapdU。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含第一区和第二区，其中所述第一区包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)并且所述第二区包含序列5′-GPAYRPP-3′(SEQ ID NO：157)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A。在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含第一区和第二区，其中第一区包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)并且第二区包含序列5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-GPAYRpp-3′(SEQ ID NO：157)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A。

在一些实施方案中，提供了一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列SEQ IDNO：125，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。在一些实施方案中，每个P均为NapdU。

在一些实施方案中，C3适体可包括多达约100个核苷酸、多达约95个核苷酸、多达约90个核苷酸、多达约85个核苷酸、多达约80个核苷酸、多达约75个核苷酸、多达约70个核苷酸、多达约65个核苷酸、多达约60个核苷酸、多达约55个核苷酸、多达约50个核苷酸、多达约45个核苷酸、多达约40个核苷酸、多达约35个核苷酸、多达约30个核苷酸、多达约25个核苷酸或多达约20个核苷酸。在一些实施方案中，C3适体可由多达100个核苷酸、多达95个核苷酸、多达90个核苷酸、多达85个核苷酸、多达80个核苷酸、多达75个核苷酸、多达70个核苷酸、多达65个核苷酸、多达60个核苷酸、多达55个核苷酸、多达50个核苷酸、多达45个核苷酸、多达40个核苷酸、多达35个核苷酸、多达30个核苷酸、多达25个核苷酸或多达20个核苷酸组成。

在本公开的另一个方面，C3适体可与SEQ ID NO：4-151中的任一个至少99％相同、至少95％相同、至少90％相同、至少85％相同、至少80％相同或至少75％相同。在本公开的另一个方面，C3适体可与SEQ ID NO：SEQ ID NO：4-28、32-34、37-75、78-118、121-130和139-151中的任一个至少95％相同、至少90％相同、至少85％相同、至少80％相同或至少75％相同。在一些实施方案中，结合C3的适体与选自SEQ ID NO：SEQ ID NO：4-28、32-34、37-75、78-118、121-130和139-151的序列95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。在一个相关的方面，其片段的长度为25至49个核苷酸(或长度从25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸到长度为26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸)。在一些实施方案中，结合C3的适体长度为25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸。

在本公开的另一个方面，C3适体对C3的解离常数(K_d)可为约10nM或更低。在另一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约15nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约20nM或更低在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约25nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约30nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约35nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约40nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约45nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)为约50nM或更低。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)在约2pM至约10nM的范围内(或2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM、15pM、20pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、150pM、200pM、250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、600pM、650pM、700pM、750pM、800pM、850pM、900pM、950pM、1000pM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)。在又一个示例性实施方案中，C3适体对C3蛋白的解离常数(K_d)在至少2pM的范围内(或至少2pM、3pM、4pM、5pM、6pM、7pM、8pM、9pM、10pM、15pM、20pM、25pM、30pM、35pM、40pM、45pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、150pM、200pM、250pM、300pM、350pM、400pM、450pM、500pM、550pM、600pM、650pM、700pM、750pM、800pM、850pM、900pM、950pM、1000pM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM或10nM)。可如实施例2所述，用结合测定法，使用多点滴定并且拟合方程y＝(最大值-最小值)(蛋白)/(K_d+蛋白)+最小值测定合适的解离常数。应理解，解离常数的测定很大程度上取决于其测量条件并且因此这些数字可相对于诸如平衡时间等因素显著变化。在本文所述任何实施方案中，适体，核酸分子包含DNA、RNA或其组合的核苷酸。

SELEX

SELEX通常包括制备核酸的候选混合物，使候选混合物与所需靶分子结合以形成亲和复合物，将亲和复合物与未结合的候选核酸分开，从亲和复合物分开并分离核酸，纯化核酸，并且鉴定特定适体序列。该方法可包括多轮以进一步改善选定适体的亲和性。该方法可包括在该方法中的一个或多个点的扩增步骤。参见，例如，标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利第5,475,096号。SELEX方法可用于产生共价结合其靶标的适体以及非共价结合其靶的适体。参见，例如，标题为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands byExponential Enrichment：Chemi-SELEX”的美国专利第5,705,337号。

SELEX方法可用于鉴定含有经修饰的核苷酸的高亲和力适体，经修饰的核苷酸赋予适体改善的特征，例如，提高的体内稳定性或改善的递送特征。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。SELEX方法鉴定的含有经修饰的核苷酸的适体在标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”的美国专利第5,660,985号中有描述，该专利描述含有在嘧啶的5′和2′位置经化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利第5,580,737号，见上文，描述了含有经2′-氨基(2′-NH2)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的一个或多个核苷酸的高特异性适体。还参见，标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布20090098549，其描述了具有扩展的物理化学性质的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

SELEX也可用于鉴定具有期望解离速率特征的适体。参见标题为“Method forGenerating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利申请公布20090004667，其描述了生成可结合靶分子的适体的改进SELEX方法。如上所述，这些解离速率缓慢的适体被称为“SOMAmer”。描述了产生与其各自的靶分子的解离速率缓慢的适体或SOMAmer和光适体(photoaptamer)或SOMAmer的方法。所述方法包括使候选混合物与靶分子接触，允许核酸-靶标复合物的形成发生，并且进行缓慢解离速率富集过程，其中解离速率快速的核酸-靶标复合物将解离并且不会重新形成，而解离速率缓慢的复合物将保持完好。另外，所述方法涉包括在候选核酸混合物的产生中使用经修饰的核苷酸以生成解离速率性能改善的适体或SOMAmer。

这种测定法的变型采用包括使适体能够共价结合或“光交联”其靶分子的光反应性官能团的适体。参见，例如，标题为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”的美国专利第6,544,776号。这些光反应性适体也被称为光适体。参见，例如，美国专利第5,763,177号、美国专利第6,001,577号和美国专利第6,291,184号，其中每个专利的标题均为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”；还参见，例如，标题为“Photoselection of Nucleic Acid Ligands”的美国专利第6,458,539号。微阵列与样品接触并且光适体已经有机会结合其靶分子之后，使光适体经光活化，并且洗涤固体载体以去除所有非特异性结合的分子。可使用严格的洗涤条件，因为与光适体结合的靶分子由于光适体上的光活化官能团所产生的共价键通常未被去除。

在这两种测定形式中，适体或SOMAmer在与样品接触之前被固定在固体载体上。然而，在某些情况下，适体或SOMAmer在与样品接触之前固定可能不会提供最佳测定。例如，适体或SOMAmer的预先固定可引起适体或SOMAmer与固体载体表面上的靶分子的低效混合，或许导致过长的反应时间并且，因此，导致延长的孵育期而容许适体或SOMAmer与其靶分子的有效结合。进一步地，当在测定中采用光适体或photoSOMAmer时并且根据用作固体载体的材料，固体载体可倾向于散射或吸收用于实现光适体或photoSOMAmer与其靶分子之间的共价键形成的光。而且，根据所采用的方法，与其适体或photoSOMAmer结合的靶分子的检测可遭受不精确性，因为固体载体表面也可暴露于所使用的任何标记剂并受其影响。最后，适体或SOMAmer在固体载体上的固定通常涉及在适体或SOMAmer暴露于样品之前的适体或SOMAmer制备步骤(即，固定)，并且这个制备步骤可影响适体或SOMAmer的活性或功能性。

容许SOMAmer捕获其在溶液中的靶标，然后采用设计为在检测之前去除SOMAmer-靶标混合物的特定组分的分离步骤的SOMAmer测定法也已有描述(参见标题为“MultiplexedAnalyses of Test Samples”的美国专利申请公布20090042206)。描述的SOMAmer测定法使得能够通过检测和量化核酸(即，SOMAmer)进行试样中非核酸靶标(例如，蛋白靶标)的检测和量化。描述的方法产生用于检测和量化非核酸靶标的核酸替代物(即，SOMAmer)，从而允许各种核酸技术，包括扩增，应用于更广泛的所需靶标，包括蛋白靶标。

在标题为“Modified SELEX Processes Without Purified Protein”的美国专利第6,376,190号中描述了靶标为肽的SELEX方法的实施方案。在本案中，靶标为C3-蛋白。

补体组分3(C3)蛋白

SELEX方法中使用的天然人循环C3蛋白是从血液纯化的并且得自加Corporation，San Diego，California(产品目录号A401)。对于结合和活性研究而言，使用来自Quidel的天然循环C3-蛋白，得自COMPLEMENT TECHNOLOGY，Inc.，Tyler，Texas(产品目录号A113)的循环人C3-蛋白也一样。

适体中的化学修饰

适体可含有改善其性质和特征的经修饰的核苷酸。此类改善的非限制性实例包括体力稳定性、抗降解的稳定性、对其靶标的结合亲和力和/或改善的递送特征。

此类修饰的实例包括在核苷酸的核糖和/或磷酸和/或碱基位置的化学取代。SELEX方法鉴定的含有经修饰的核苷酸的适体在标题为“High Affinity Nucleic Acid LigandsContaining Modified Nucleotides”的美国专利第5,660,985号中有描述，该专利描述含有在嘧啶的5′和2′位置经化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利第5,580,737号，见上文，描述了含有经2′-氨基(2′-NH₂)、2′-氟(2′-F)和/或2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的一个或多个核苷酸的高特异性适体。还参见，标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布20090098549，其描述了具有扩展的物理化学性质的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

C-5修饰的具体实例包括脱氧尿苷在C-5位置被独立选自以下的取代基取代：如就在下面描述的苄基羧酰胺(或者苄氨基羰基)(Bn)、萘基甲基羧酰胺(或者萘基甲基氨羰基)(Nap)、色氨基羧酰胺(或者色氨基羰基)(Trp)和异丁基羧酰胺(或者异丁基氨羰基)(iBu)。

C-5经修饰的嘧啶的化学修饰也可以单独地或呈任何组合与2′-位置糖修饰、环外胺上的修饰和4-硫代尿苷的取代等组合。

代表性C-5经修饰的嘧啶包括：5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2’-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2’-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2’-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2’-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷或5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)。

在一些实施方案中，每个X、Y和/或Z独立地选自5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PedU)、5-(N-噻吩基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷和5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)。在一些实施方案中，每个Z为5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)。

若存在，可以在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分间断。可在聚合之后，例如通过与标记组分偶联进一步修饰多核苷酸。

进一步地，C-5经修饰的嘧啶核苷酸包括以下：

在一些实施方案中，经修饰的核苷酸赋予寡核苷酸核酸酶抗性。在C-5位置具有取代的嘧啶是经修饰的核苷酸的实例。修饰可包括骨架修饰、甲基化、稀有碱基配对组合，如异碱基异胞苷和异胍等。修饰也可包括3′和5′修饰，如加帽。其它修饰可包括一个或多个天然存在的核苷酸被类似物取代，核苷酸间修饰如具有不带电连键的那些(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)和具有带电连键的那些(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，具有嵌入剂的那些(例如，吖啶、补骨脂素等)，含螯合剂的那些(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)，含烷化剂的那些，及具有经修饰的连键的那些(例如，α-异头核酸等)。进一步地，核苷酸的糖上普通存在的任何羟基均可由膦酸基团或磷酸基团置换；由标准保护基团保护；或活化以制备与附加核苷酸或与固体载体的附加连键。5′和3′端OH基团可以磷酸化或经胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、聚乙二醇(PEG)聚合物(在一个实施方案中范围为约10至约80kDa，在另一个实施方案中范围为约20至约60kDa的PEG聚合物)或其它亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。在一个实施方案中，修饰是嘧啶的C-5位置。这些修饰可以通过直接在C-5位置的酰胺连键或由其它类型的连键来产生。

多核苷酸也可含有本领域中通常已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、a-异头糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、无环类似物及脱碱基核苷类似物(如甲基核糖核苷)。如上所述，一个或多个磷酸二酯连键可以被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括其中磷酸酯被P(0)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(0)NR2(“酰胺酯”)、P(0)R、P(0)OR′、CO或CH₂(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中每个R或R′独立地为H或经取代或未取代的烷基(1-20C)，任选含醚(-0-)连键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连键都需要是相同的。类似形式的糖、嘌呤和嘧啶的取代在设计最终产物中可以是有利的，例如，替代性骨架结构如聚酰胺骨架也可以。

本公开还提供了一种包含两个或更多个选自SEQ ID NO：4-130和138-151的核酸序列的配制剂，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶。

另一方面，C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-噻吩基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-酪氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-3，4-亚甲二氧基苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(MBndU)、5-(N-4-氟苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(FBndU)、5-(N-3-苯丙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PPdU)、5-(N-咪唑基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ImdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-R-苏氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThrdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。

另一方面，C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。

另一方面，C-5经修饰的嘧啶为5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。

另一方面，所述配制剂的所述两种或更多种核酸分子还包含选自2′-O-甲基修饰的核苷酸、C3-间隔区及其组合的至少一个附加修饰。

另一方面，所述配制剂的所述两种或更多种核酸分子还包含经HEG接头或PEG接头取代的至少一个核苷酸位置和/或还包含HEG接头或PEG接头。

另一方面，所述配制剂的所述两种或更多种核酸分子各自独立地长度为约24至约100个核苷酸，或长度为约30至约60个核苷酸，或长度为约40至约50个核苷酸；或还包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个附加核苷酸。

另一方面，补体组分3(C3)蛋白为人补体组分3(C3)蛋白。

包含适体的药物组合物

在一些实施方案中，提供了包含本文所述的至少一种适体和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。合适的载体在Lippincott Williams&Wilkins出版的“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第21版”中有描述，其通过引用并入本文。包括本文所述的至少一种适体和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物还可包括一种或多种不是C3抑制剂的活性剂。

本文所述的适体可以在任何药学上可接受的剂型中使用，包括但不限于注射剂型、液体分散体、凝胶、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、冻干配制剂、干粉剂、片剂、胶囊、控释配制剂、快速融化配制剂、延迟释放配制剂、延长释放配制剂、脉冲释放配制剂、混合的即时释放和控制释放配制剂等。具体地说，本文所述的适体可以配制：(a)用于选自玻璃体内、口服、肺部、静脉、动脉、鞘内、关节内、经直肠、眼、结肠、肠胃外、脑池内、阴道内、腹膜内，局限性、经颊、经鼻和局部施用中的任一种的施用；(b)配制成选自液体分散体、凝胶、气雾剂、软膏剂、乳膏剂、片剂、小袋和胶囊中的任一种的剂型；(c)配制成选自冻干配制剂、干粉剂、快速融化配制剂、控释配制剂、延迟释放配制剂、延长释放配制剂、脉冲释放配制剂、混合的立即释放和控释配制剂中的任一种的剂型；或(d)其任何组合。

用于肠胃外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可包含以下的一种或多种组分：(1)无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；(2)抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯(methyl paraben)；(3)抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；(4)螯合剂如乙二胺四乙酸；(5)缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和(5)用于调节张力的试剂如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节pH。肠胃外制剂可封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

适于注射使用的药物组合物可包括无菌水溶液(在水溶性的情况)或分散体和用于无菌注射液或分散体的临时制备的无菌粉剂。对于静脉施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor EL)(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应当是无菌的并且应当流动性达到易注射的程度。该药物组合物应在制造和储存条件下是稳定的，并应防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

术语“稳定”，如本文中所用，意指保持呈适于向受试者施用的状态或条件。

载体可以是溶剂或分散介质，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以保持适当的流动性，例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂。微生物作用的预防可通过各种抗菌剂和抗真菌剂来实现，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇，以及无机盐如氯化钠。注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来实现。

根据需要，可通过在具有以上列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中按适当的量掺入活性剂(例如，适体)，接着过滤灭菌来制备无菌注射液。通常，通过将至少一种适体掺入到含有基本分散介质和任何其它所需成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，示例性制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这两者将产生适体加上来自于其先前无菌过滤的溶液的任何另外的所需成分的粉剂。

在一些实施方案中，适体配制成用于玻璃体内注射。适于玻璃体内施用的配制剂，例如在Lippincott Williams&Wilkins出版的“Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第21版”中有描述。例如，在Rawas-Qalaji等(2012)Curr.Eye Res.37：345；Bochot等(2012)J.Control Release 161：628；Yasukawa等(2011)Recent Pat.DrugDeliv.Formul.5：1；和Doshi等(2011)Semin.Ophthalmol.26：104中讨论了眼部药物递送。在一些实施方案中，包含适体的药物组合物通过玻璃体内注射施用，每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每10周、每11周一次、每12周一次或比每12周一次频率更低。

口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可以封装(例如)在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，适体可与赋形剂混合并且呈片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口水的流体载体制备，其中流体载体中的化合物口服施加并且涮洗并吐出或咽下。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分被包括在内。

对于通过吸入施用，化合物呈气溶胶喷雾的形式从含有合适推进剂，例如气体如二氧化碳的加压容器或分配器中递送，呈雾化液体或干粉从合适的装置中递送。对于经粘膜或经皮施用，在配制剂中施用适于待渗透屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括，例如，对于经粘膜施用而言，洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮施用，将活性剂配制成如本领域中通常已知的软膏、药膏、凝胶或乳膏。该试剂还可以制备成栓剂形式(例如，用常规的栓剂基质如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠剂形式。

在一些实施方案中，用会防护从身体快速清除的载体制备适体。例如，可以使用控释配制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类配制剂的制备方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。材料也可以从Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc.购得。

脂质体悬浮液(包括靶向具有针对病毒抗原的单克隆抗体的受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利第4,522,811号中所述。

另外，适体的悬浮液可以作为适当的油性注射悬浮液来制备。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。非脂质聚阳离子氨基聚合物也可以用于递送。任选地，悬浮液还可以包括合适的稳定剂或增加化合物溶解度并允许制备高浓缩溶液的试剂。

在一些情况下，为了易于施用和剂量均匀，可能特别有利的是配制呈单位剂型的口服或肠胃外组合物。本文使用的剂量单位形式是指对于待治疗受试者而言适合作为单一剂量的物理离散单位；每个单位含有经计算联合需要的药物载体会产生所需治疗效果的预定量适体。本文所述适体的剂量单位形式的规格决定于并且直接取决于特定适体的特征和要达到的特定治疗效果，及化合此类活性剂用于个体治疗的领域中固有的局限性。

包含至少一种适体的药物组合物可以包括一种或多种药物赋形剂。此类赋形剂的实例包括但不限于，粘合剂、填充剂、润滑剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、防腐剂、缓冲剂、润湿剂、崩解剂、泡腾剂和其它赋形剂。此类赋形剂是本领域已知的。示例性赋形剂包括：(1)粘合剂，其包括各种纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素(如Avicel PH101和Avicel PHI02)、硅化微晶纤维素(ProSolv SMCC^TM)、黄蓍胶和明胶；(2)填充剂，如各种淀粉、乳糖、乳糖一水合物和无水乳糖；(3)崩解剂，如藻酸、Primogel、玉米淀粉、轻度交联聚乙烯吡咯烷酮、马铃薯淀粉、玉米淀粉和改性淀粉、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、淀粉羟乙酸钠及其混合物；(4)润滑剂，包括对待压缩粉末的流动性作用的试剂，并且包括硬脂酸镁、胶体二氧化硅(如Aerosil 200)、滑石、硬脂酸、硬脂酸钙和硅胶；(5)助流剂如胶体二氧化硅；(6)防腐剂，如山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、对羟基苯甲酸的其它酯(如对羟基苯甲酸丁酯)、醇类(如乙醇或苯甲醇)、酚类化合物(如苯酚)或季化合物(如苯扎氯铵)；(7)稀释剂如药学上可接受的惰性填充剂，如微晶纤维素、乳糖、磷酸氢钙、糖类和/或任何上述物质的混合物；稀释剂的实例包括微晶纤维素(如Avicel PH101和Avicel PHI 02)；乳糖如乳糖一水合物、无水乳糖和Pharmatose DCL21；磷酸氢钙如Emcompress；甘露糖醇；淀粉；山梨糖醇；蔗糖；和葡萄糖；(8)甜味剂，包括任何天然或人造甜味剂，如蔗糖、糖精蔗糖、木糖醇、糖精钠、甜蜜素(cyclamate)、阿斯巴甜(aspartame)和安赛蜜(acesulfame)；(9)调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、橙味剂、麦力甜(Magnasweet)(MAFCO的商标)、泡泡糖香料、水果香料等；和(10)泡腾剂，包括泡腾对偶物如有机酸和碳酸盐或碳酸氢盐。合适的有机酸包括，例如柠檬酸、酒石酸、苹果酸、富马酸、己二酸、琥珀酸和海藻酸及酸酐和酸式盐。合适的碳酸盐和碳酸氢盐包括，例如，碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸镁、甘氨酸碳酸钠、L-赖氨酸碳酸盐和精氨酸碳酸盐。或者，可只有泡腾对偶物的碳酸氢钠组分存在。

在各个实施方案中，本文所述的配制剂是基本上纯的。如本文中所用，“基本上纯”意指活性成分(例如，适体)是存在的主要种类(即按摩尔计它比组合物中的任何其它个别种类更丰富)。在一些实施方案中，基本上纯化的部分是其中活性成分占存在的所有大分子种类的至少约50％(按摩尔计)的组合物。通常，基本上纯的组合物将包括存在于该组合物中的所有大分子种类的约80％以上。在各个实施方案中，基本上纯的组合物将包括存在于该组合物中的所有大分子种类的至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在各个实施方案中，将活性成分纯化至均匀(通过常规方法在组合物中不能检测出污染物种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。

包含适体的试剂盒

本公开提供了包含本文所述的任何适体的试剂盒。此类试剂盒可以包括，例如(1)至少一种适体；和(2)至少一种药学上可接受的载体，例如溶剂或溶液。另外的试剂盒组分可任选地包括，例如：(1)本文鉴定的任何药学上可接受的赋形剂，如稳定剂、缓冲剂等，(2)用于容纳和/或混合试剂盒组分的至少一个容器、小瓶或类似装置；和(3)递送装置。

治疗方法

本公开提供了通过使用本文所述的适体预防或治疗医学疾患{例如，缓解其一种或多种症状)的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的此类适体。所述适体液可用于预防性治疗。在一些实施方案中，在玻璃体内施用适体。在一些实施方案中，口服或静脉施用适体。

治疗方法中使用的适体可以是本文所述的适体、其药学上可接受的盐、其前药或其前药的药学上可接受的盐。

个体或受试者可以是任何动物(家畜、牲畜或野生动物)，包括但不限于，猫、狗、马、猪和牛，并且优选为人。如本文中所用，术语患者、个体和受试者可互换使用。

如本文中所用，“治疗”描述出于治疗疾病、疾患或病症的目的对患者的管理和护理并且包括在患者中施用适体以预防疾病、疾患或病症的症状或并发症发作；减轻所述疾病、疾患或病症的症状或并发症；或消除所述疾病、疾患或病症的存在。更具体地，“治疗”包括逆转、减弱、减轻、最小化、抑制或中止疾病(病症)状态的至少一种有害症状或影响、疾病进展、疾病病原体或其它异常情况。只要症状和/或病理改善，通常继续治疗。

如本文中所用，“预防”意指全部或部分地预防；改善或控制；减少、减轻或降低；或延迟或中止。

在各个实施方案中，公开的组合物和方法用于治疗年龄相关的黄斑变性、自身免疫性疾病、血液病、传染性疾病、脓毒病、炎性疾病或神经退行性疾病。

在一些实施方案中，公开的化合物或其药学上可接受的盐或其前药可与改善或根除上述疾病状况的其它治疗方法组合施用。包括公开的适体的组合物可含有，例如一种以上适体。在一些实例中，含有一种或多种适体的组合物与用于治疗所述疾病的另一种有用试剂(例如，用于治疗年龄相关的黄斑变性、自身免疫性疾病、血液病、传染性疾病、脓毒病、炎性疾病或神经退行性疾病的试剂)组合施用。在一些实施方案中，用于此类组合中的已知治疗剂的目前可用剂型将是合适的。

“组合疗法”(或“共同疗法”)包括施用适体组合物和至少一种第二试剂作为旨在由这些治疗剂的共同作用提供有益效果的特定治疗方案的一部分。该组合的有益效果包括但不限于由治疗剂的组合产生的药代动力学或药效学共同作用。呈组合施用这些治疗剂通常是在规定时间段内进行(根据所选组合，通常为几分钟、几小时、几天或几周)。

“组合疗法”可以但通常并非旨在涵盖施用这些治疗剂中的两种或更多种，作为偶然且任意产生本公开的组合的独立单一治疗方案的一部分。“组合疗法”旨在包括以顺序方式施用这些治疗剂，即，其中各治疗剂在不同时间施用，以及以基本上同时的方式施用这些治疗剂，或至少两种治疗剂。基本上同时施用可以，例如，通过向受试者施用具有固定比率的每种治疗剂的单剂量或每种治疗剂的多个单剂量实现。

利用该适配体的剂量方案根据多种因素选择，包括，例如，受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学疾患；待治疗疾患的严重程度；施用途径；受试者的肾和肝功能；及采用的特定适体或其盐。普通技术的医师或兽医可以容易地确定并规定预防、对抗或阻止疾患进展所需的组合物的有效量。

一般而言，该剂量，即治疗有效量，范围为每天约1μg至约100mg/kg受治受试者体重。

提供以下实施例以说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限制于所述具体特征或实施方案。

实施例

实施例1：对C3-蛋白具有结合特异性的适体的选择和鉴定

本实施例提供了选择和生产人C3蛋白的DNA适体的代表性方法。

候选混合物的制备

通过退火为生物素化ssDNA模板的DNA引物(如下面表1所示)的聚合酶延伸来制备部分随机化ssDNA的候选混合物。候选混合物含有40个核苷酸的随机盒，其含有dATP、dGTP、dCTP和5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷三磷酸(NapdUTP)。

表1.模板和引物的序列

B′＝生物素

5毫升的链霉亲和素加上UltraLink树脂(PIERCE)的50％浆料用2.5mL经NaOH、102mMNaCl、5mM KCl、5mM MgCl2和0.05％吐温20(TWEEN 20)调节至pH 7.5的SB18T0.05(40mMHEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)缓冲液洗涤一次并用2.5mL的16mM NaCl洗涤三次。20纳摩尔具有两个生物素残基(在序列中命名为B′)和40个随机位置(在序列中命名为N₄₀)的模板1(SEQ ID NO：1)添加到经洗涤的UltraLink SA珠粒中并且在37℃下旋转30分钟。然后用16mM NaCl洗涤珠粒。每次洗涤间期，通过离心回收珠粒。现含有捕获模板的珠粒悬浮于1.25mL延伸反应缓冲液[含有24nmol引物(SEQ ID NO：2)、1X SQ20缓冲液(120mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM KCl、7mM MgSO₄、6mM(NH₄)₂SO₄、0.001％BSA和0.1％Triton X-100)、187.5个单位的KOD XL DNA聚合酶(EMD MILLIPORE)和各0.5mM的dATP、dCTP、dGTP和NapdUTP。允许珠粒在68℃下孵育2小时。然后用16mM NaCl洗涤珠粒三次。用1mL的20mM NaOH从珠粒洗脱适体文库。洗脱的文库立即用15μL的1N HCl和10μLHEPES pH 7.5及1μL 10％吐温-20中和。用AMICON Ultracel YM-10过滤器将文库浓缩到大约0.2mL并通过紫外吸收光谱法测定文库的浓度。

用于固定的靶蛋白的标记

靶蛋白的Alexa488标记

通过Alexa

488(Molecular Probes^TM)与伯胺的共价偶合来标记从正常血清(QUIDEL，产品目录号A401)纯化的无标签人C3-蛋白。将C3-蛋白(263pmol，于68μL中)与137倍摩尔过量的A1exa488活性染料混合并且允许反应在室温下孵育2小时。使用Zeba^TM离心式脱盐柱(PIERCE)去除未反应的标记并且将缓冲液更换为SB18T0.05。

人C3-蛋白的生物素标记

通过NHS-PEO4-生物素(PIERCE，EZ-Link NHS-PEG4-生物素)与含有伯胺的残基的共价偶合来生物素化从正常血清(QUIDEL，产品目录号A401)纯化的无标签人C3-蛋白。将蛋白(200pmol，于75μL中)与7倍摩尔过量的NHS-PEG4-生物素混合并且允许反应在4℃下孵育16小时。反应完成后，更换缓冲液并通过使用YM3过滤器(MILLIPORE)超滤去除未反应的NHS-PEG4-生物素。更换的缓冲液为SB18T0.05。

靶蛋白的固定

SELEX方法的第1轮至第4轮，

488标记靶蛋白被固定在蛋白G磁珠(

LIFE TECHNOLOGIES，或下文称为蛋白G珠粒)上。通过将10mg珠粒与70μg兔IgG抗Alexa

488(INVITROGEN，MOLECULAR PROBES，A11094)于1mL的SB18T0.05缓冲液中混合制备抗体包被珠粒。允许混合物在37℃下孵育30分钟。为去除未结合的抗体，用14mL的SB18T0.05洗涤珠粒三次。最后，将珠粒悬浮在1mL(10mg/mL)的SB18T0.05中并且储存在4℃下，直至使用。

SELEX方法的第5轮至第9轮，生物素标记的靶蛋白被固定在MYONE-SA顺磁性珠粒(MYONE SA，INVITROGEN，或下文称为SA珠粒)上。通过用14mL的SB18T0.05洗涤三次制备珠粒(50mg)。最后，将珠粒按10mg/mL悬浮在SB18T0.05中并且储存在4℃下，直至使用。

缓慢解离速率富集过程进行适体选择

完成SELEX方法总共9轮，选择亲和力和缓慢解离速率。每一轮之前，进行反选以降低背景并降低获得与蛋白非特异性结合的适体的可能性。如下进行反选。

对于第1轮，在95℃加热100μL于SB18T0.05中含大约1nmolDNA的DNA候选混合物5分钟，然后冷却5分钟至70℃，再冷却5分钟至48℃，然后转移至37℃封闭5分钟。然后将样品与10μL蛋白竞争剂混合物(于SB18T0.05中的0.1％HAS、10μM酪蛋白和10μM凝血酶原)和1mg(100μL)蛋白G珠粒混合并且在37℃下边搅拌边孵育10分钟。通过磁力分离去除珠粒。

对于第2-9轮，将65μL得自前一轮的DNA候选混合物等分试样(65％得自前一轮的eDNA)与16μL的5x SB18T0.05混合。加热样品3分钟至95℃并且按0.1℃/秒的速率冷却至37℃。然后将样品与9μL蛋白竞争剂混合物(于SB18T0.05中的0.1％HAS、10μM酪蛋白和10μM凝血酶原)和0.1mg(10μL)蛋白G珠粒(第2-4轮)或SA珠粒(第5-9轮)混合并且在37℃下边搅拌边孵育10分钟。通过磁力分离去除珠粒。

在第一次反选之后，靶蛋白被预先固定在蛋白G珠粒上进行第1轮选择过程。为实现这一点，将2mg具有固定的抗Alexa

488抗体的蛋白G珠粒与50pmol的

488标记靶蛋白混合并且在37℃下孵育30分钟。通过用SB18T0.05洗涤珠粒去除未结合的靶标。将反选DNA候选混合物(100μL)添加到珠粒中并且在37℃下边混合边孵育60分钟。第一轮未采用缓慢解离速率富集过程并且仅用100μL SB18T0.05洗涤珠粒5次。洗涤之后，通过添加170μL的20mM NaOH，并且在37℃下边混合边孵育5分钟，将结合的适体从珠粒上洗脱。磁力分离珠粒之后将含适体的洗脱液(165μL)转移到新管并且通过添加41μL含80mM HCl的25mM Tris-HCl pH7.5中和溶液。

对于第2-9轮，如下所述用DNA候选混合物和靶蛋白进行选择，同时并行地，用DNA候选混合物，但不用靶蛋白，进行相同选择。得自有靶蛋白的样品(信号S)和无靶蛋白的样品(背景B)的PCR的Ct值的比较用作降低下一轮中靶标浓度的指导。如果ΔCt值大于4，但小于8，则在下一轮靶蛋白减少三倍。如果ΔCt值大于8，则在下一轮靶标减少10倍。

对于第2轮，标记的靶蛋白(5pmol，于10μL中)与40μL反选DNA候选混合物混合并在37℃下孵育15分钟。通过添加50μL的10mM硫酸葡聚糖开始缓慢解离速率富集过程，接着立即添加0.2mg具有固定的抗Alexa

488抗体的蛋白G珠粒。允许这在37℃下边混合边孵育15分钟。然后珠粒用30％于SB18T0.05中的甘油洗涤一次并用100μL的SB18T0.05洗涤5次。通过添加85μL的20mM NaOH并且在37℃下边混合边孵育5分钟，将适体链从珠粒上洗脱。通过磁力分离去除珠粒并将80μL适体洗脱液转移到新管中并用20μL由25mM Tris-HCl pH7.5和80mM HCl组成的溶液中和。除在添加具有固定的抗Alexa

488抗体的蛋白G珠粒15分钟前添加硫酸葡聚糖外，如对第2轮所述，进行第3和4轮。同样，不进行甘油洗涤。

第5至9轮使用生物素标记的靶蛋白进行。对于第5轮，靶蛋白(1.6pmol，于10μL中)与40μL反选DNA候选混合物混合并在37℃下孵育15分钟。然后通过添加50μL的10mM硫酸葡聚糖开始缓慢解离速率富集过程并且允许混合物再边混合边孵育15分钟。添加SA珠粒(0.2mg)以便捕获靶蛋白-适体复合物(在37℃下边混合边孵育15分钟)。然后珠粒用100μL的SB18T0.05洗涤5次。通过添加85μL的20mM NaOH，并且在37℃下边混合边孵育5分钟，将结合的适体从珠粒上洗脱。通过磁力分离去除珠粒并将80μL适体洗脱液转移到新管中并用20μL由25mM Tris-HCl pH 7.5和80mM HCl组成的溶液中和。

除利用30分钟葡聚糖激发并用0.05mg的SA珠粒捕获标记的靶蛋白外，如同第5轮那样进行第6轮。除仅利用0.16pmol靶蛋白外，像第6轮那样进行第7和8轮。除仅利用0.05pmol靶蛋白外，像第8轮那样进行SELEX方法第9轮。

适体扩增和纯化

通过QPCR扩增并量化从每一轮选定的适体DNA。将48μL DNA添加到12μL QPCR混合物中(10X KOD DNA聚合酶缓冲液；稀释至5X的Novagen#71157、25mM MgCl₂、5μM正向PCR引物(引物1，SEQ ID NO：2)、5μM生物素化反向PCR引物(引物2，SEQ ID NO：3)、5X SYBR Green I、0.075U/μL KOD XL DNA聚合酶及各1mM dATP、dCTP、dGTP和dTTP)并且以下列方案在ABIO-RAD MyIQ QPCR仪器中热循环：96℃15秒、55℃10秒和69℃30分钟循环1次；接着96℃15秒、69℃1分钟循环30次。用仪器软件进行量化并且比较有和无靶蛋白时选择的DNA拷贝数以确定信背比。

扩增后，PCR产物经由生物素化反义链被捕获在SA珠粒上。用14mL 20mM NaOH洗涤1.25mL SA珠粒(10mg/mL)一次，用14mL SB18T0.05洗涤两次，重新悬浮在1.25mL 3M NaCl+0.05％吐温中，并储存在4℃下。将25μL SA珠粒(10mg/mL于3M NaCl中)添加到50μL双链QPCR产物中并且在25℃下边混合边孵育15分钟。用16mM NaCl洗涤珠粒一次，然后通过添加100μL 20mM NaOH，并且在37℃下边混合边孵育1分钟将“有义”链从珠粒上洗脱。丢弃洗脱的链并用SB18T0.05洗涤珠粒3次且用16mM NaCl洗涤一次。

通过引物延伸由固定的反义链制备含NapdU的适体有义链。使珠粒悬浮在40μL引物延伸反应混合物中(1X引物延伸缓冲液(120mM Tris-HCl pH 7.8、10mM KCl、7mM MgSO₄、6mM(NH₄)₂SO₄、0.1％TRITON X-100和0.001％牛血清白蛋白)、3μM正向引物(引物1，SEQ ID NO：2)、各0.5mM dATP、dCTP、dGTP和NapdUTP及0.015U/μL KOD XL DNA聚合酶)并且在68℃下边混合边孵育60分钟。用SB18T0.05洗涤珠粒3次，并且通过添加85μL的20mM NaOH，并在37℃下边混合边孵育1分钟将适体链从珠粒上洗脱。磁力分离之后将80μL适体洗脱液转移到新管，用20μL的80mM HCl中和，用5μL的0.1M HEPES(pH 7.5)缓冲。

选择严格性和反馈

每一轮响应于QPCR信号(ΔCt)按照以下规则降低选择步骤的相对靶蛋白浓度：

如果ΔCt＜4，则[P]_(i+1)＝[P]_(i)

如果4≤ΔCt＜8，则[P]_(i+1)＝[P]_(i)/3.2

如果ΔCt≥8，则[P]_(i+1)＝[P]_(i)/10

其中[P]＝蛋白浓度并且i＝当前轮数。

每一轮选择之后，测定DNA富集混合物的收敛状态。用4mM含1X SYBR Green I的MgCl₂将10μL双链QPCR产物稀释到200μL。使用C₀t分析法分析样品的收敛性，所述分析法测量双链寡核苷酸的复杂混合物的杂交时间。样品以下列方案进行热循环：98℃1分钟、85℃1分钟循环3次；98℃1分钟，然后85℃30分钟循环2次。在85℃下的30分钟期间，按5秒间隔测量荧光图像。根据时间对数绘制荧光强度，并且观察到随着SELEX每一轮增加的杂交速率，表面序列收敛。

富集库测序和适体鉴定

SELEX方法9轮之后，为收敛库测序。如下进行序列制备。使用含独特条码/指数序列(每个库的独特序列标识符)的SELEX文库特异性引物通过PCR扩增该库。使用Quant-iT^TM

dsDNA试剂(LIFE TECHNOLOGIES)测定法量化单独的PCR产物，按等摩尔浓度合并，并且使用AMICON U1tra-0.5离心过滤装置(MILLIPORE)浓缩/进行缓冲液更换。然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化混合物，并且使用Amicon Ultra-0.5离心过滤装置浓缩洗脱物并通过PAGE可视化以确认最终混合物的尺寸、纯度和产率。将样品提交至SeqWright Genomic Services(GE HEALTHCARE，Houston，TX)以便离子激流PGM测序。从含有超过40,000个序列的序列库中，随机选择384个并使用定制软件分析收敛性，该软件使用局部比对算法测定序列计数/拷贝数并鉴定共同收敛模式。选择库中具最大代表性/拷贝数的序列和来自每种收敛模式的至少一个序列做进一步表征。收敛模式1最初由序列8491-3_3(SEQ ID NO：4)、8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-189_3(SEQ ID NO：8)和8491-282_3(SEQID NO：9)鉴定。源自这四个序列的共有结构域用于鉴定超过40,000个序列的整个第9轮序列库中收敛模式1的其它成员。

适体合成

为测定结合和抑制潜力，通过固相合成制备单独的适体。经修饰的脱氧尿苷-5-羧酰胺，即用于固相合成的酰胺试剂通过以下制备：′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基)-5-三氟乙氧基羰基-2′-脱氧尿苷(Nomura等.(1997)Nucl.Acids Res.25：2784)与适当[1-萘基甲胺]伯胺缩合(RNH₂，1.2个当量；Et₃N，3个当量；乙腈；60℃；4小时)；3′-O-经2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺亚磷酸(1.2个当量；iPr₂EtN，3个当量；CH₂Cl₂；-10至0℃；4小时)；并在中性硅胶上通过快速色谱法纯化(Still等.(1978)J.Org.Chem.43：2923)。使用亚磷酰胺法通过固相合成制备适体(Beaucage和Caruthers(1981)Tetrahedron Lett.22：1859)，对所述方案进行了一些调整以说明本文所述的独特碱基修饰。以10％二氯乙酸于甲苯中45秒实现脱三苯甲基化；用0.1M亚磷酰胺于通过5-苄巯基四氮唑活化并使其反应3次每次5分钟的1：1乙腈：二氯甲烷中完成偶合；并且根据仪器供应商建议进行加帽和氧化。于帕尔不锈钢反应器中在最佳压力、时间和温度下用气态氨或甲胺实现去保护。用去离子水将产物洗脱到合适的96孔板中，统计抽样(√N+1)用于LCMS表征，通过UV分光光度法量化，并于缓冲水溶液中测试蛋白结合亲和力。

实施例2：适体与C3-蛋白的平衡结合常数(K_d)

本实施例提供了本文用于测量适体-C3蛋白的结合亲和力并测定K_d的方法。简言之，放射性标记的DNA-适体(³²P)在95℃下于SB18T0.01缓冲液(40mM HEPES(pH 7.5)、125mMNaCl、5mM KCl、5mM MgCl₂、0.01％吐温-20)中加热3分钟并缓慢冷却到37℃。通过将约1x10^-11M的放射性标记DNA与在1x10^-7M至1x10^-12M浓度范围的重组C3-蛋白于SB18T0.01缓冲液中按60μL的反应体积混合，并且在37℃下孵育60分钟形成复合物。将各一份的反应物(5μL)转移到尼龙(nylon)膜并干燥以测定每种反应物中的总计数。复合物被捕获在ZORBAX树脂(30ng/μL，AGILENT)上，在真空下通过多屏HV板(MILLIPORE)，并用180μL SB18T0.01缓冲液洗涤以将蛋白结合的复合物与未结合的DNA分开。用FUJI FLA-3000磷屏成像仪为尼龙膜和多屏HV板成像并且使用ImageQuant^TM分析软件量化每个样品中的放射性量。根据C3-蛋白浓度(P_t)绘制捕获的DNA的分数，并且使用下列配方测定平衡结合常数(K_d)：y＝(最大值-最小值)(P_t)/(K_d+P_t)+最小值。

作为说明的实例，图2示出了描绘与人C3-蛋白的结合曲线的图表。DNA适体8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-94_53(SEQ ID NO：58)和8491-94_97(SEQ ID NO：125)分别以3.13x10^-11M、3.34x10^-11M和5.49x10^-11M的K_d结合C3-蛋白。图3示出了描绘适体8491-94_53(SEQ ID NO：58)和8491-94_97(SEQ ID NO：125)与人C5蛋白的结合的图表。未检测到与人C5蛋白的明显结合，说明这些适体对C3-蛋白有特异性。

表2示出了适体序列和对收敛模式1的成员C3的亲和力。

表2：收敛模式1的代表性序列。在随机区内显示为收敛的序列。所有序列还含有5′和3′引物(未示出)的5个碱基以及3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

P-NapdU

NB-未结合

实施例3：对补体介导的溶血的抑制

本实施例提供了本文用于测量适体对补体介导的抗体包被的绵羊红血细胞溶血的抑制的方法。将1∶20稀释的C3-蛋白缺乏的人血清(COMPLEMENT TECHNOLOGIES产品目录号A314)与20或25nM人C3-蛋白(如所示)和有或无适体的抗体包被的绵羊红血球(7x10⁷个细胞/mL)COMPLEMENT TECHNOLOGIES产品目录号B200)按指示的最终浓度混合。未添加适体或未添加C3-蛋白和适体的对照样品也连同其中所有红血球被裂解的阳性对照一起被包括在内。稀释样品并且以0.075mL的总体积在明胶佛罗那缓冲液(gelatin veronal buffer)(GVB++；0.1％明胶、0.15mM氯化钙、0.5mM氯化镁、5mM佛罗那、145mM NaCl、0.025％NaN₃，pH7.3，COMPLEMENT TECHNOLOGIES产品目录号B102)中进行测定，并且在37℃下孵育30分钟。离心样品(200xg，10分钟)并且在GVB++缓冲液中1∶4稀释之后，测量上清液在412nm下的吸光度。图4和图5中示出了收敛模式1的适体抑制补体介导的溶血的能力。

发现收敛模式1的适体具有所需高亲和力结合(表2)和抑制性质(图4)。从超过40,000个序列的原始序列库中鉴定出这种模式的27个独立序列。测试所有27个序列与人C3-蛋白的结合。发现25个以高亲和力结合人C3-蛋白(表2)。还测试了这些序列中20个抑制补体介导的抗体包被的绵羊红血细胞的溶血的能力(图4)。在溶血测定中为强抑制剂的18种适体是以高亲和力结合C3-蛋白的适体。不结合C3-蛋白的适体不是抑制剂(＜25％抑制)。作为另外的对照，测试了两个序列与C3-蛋白的结合和对C3-蛋白的抑制，其中8491-94_3序列(SEQ ID NO：5)内的单个NapdU修饰的核苷酸经脱氧胸苷核苷酸置换。这两个序列，8491-94_14(SEQ ID NO：35)和8491-94_15(SEQ ID NO：36)，并未以高亲和力结合C3-蛋白(参见下面的表3)或抑制溶血(图4)。这些数据表明，与C3-蛋白的高亲和力结合对于观察到的抑制性质是需要的并且经修饰的NapdU核苷酸大大有助于总体结合亲和力。

排除经证实不结合C3-蛋白的两个序列之后，比对剩余25个序列以揭示长度为23个核苷酸的共有结构域(图1)。该图中示出了鉴定出每个序列的次数。与任何其它序列具有5个以上核苷酸差异的序列被视为独立选择的序列。与图1所示任何特定序列具有1至5个核苷酸差异的序列包括在该序列的总序列计数中。该结构域特征在于在位置2、6、10、13、17、21和22具有保守性NapdU碱基(P)。位置1在25个序列中的20个中为P，在3个序列[8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-395_3(SEQ ID NO：10)和8491-388_3(SEQ ID NO：18)]中为鸟嘌呤(G)并且在两个序列[8491-397(SEQ ID NO：12)和8491-399(SEQ ID NO：27)]中为胞嘧啶(C)。位置3为G而位置4为嘌呤碱基，其中A出现19次而G出现6次。位置5除在一个序列[8491-399_3(SEQ ID NO：27)]中为P外，在所有序列中为C。位置7在23个序列中为C并且在两个序列[8491-397_3(SEQ ID NO：12)和8499-408_3(SEQ ID NO：23)]中为A。位置8在所考虑的25个序列中的17个序列中为A，在5个序列中为C且在3个序列中为G。在4个序列[8491-387(SEQID NO：16)、8491-396(SEQ ID NO：13)、8491-397(SEQ ID NO：12)和8491-404(SEQ ID NO：25)]中观察到共有基序内介于位置8和9之间的单个碱基插入(C或A)。除在两个序列[8491-404(SEQ ID NO：25)和8491-397(SEQ ID NO：12)]中其为P外，位置9为A。证实这些序列之一以3.1nM的K_d结合C3-蛋白[8491-397_3(SEQ ID NO：12)]。位置10-14就序列5’-P-A-G-P-C-3’(SEQ ID NO：132)而言绝对保守。除在三个序列中为A[8491-390_3(SEQ ID NO：7)、8491-282_3(SEQ ID NO：9)和8491-399_3(SEQ ID NO：27)]并且在一个序列中为G[8491-409_3(SEQ ID NO：28)]外，位置15为C。位置16-22在结合C3-蛋白的那些序列中完全保守。这些位置含有序列5’-G-P-A-C-G-P-P-3’(SEQ ID NO：133)。在所考虑的25个序列中，位置23在20种情况下为P，但在5种情况下为C。

在人C3-蛋白的这些高亲和力抑制剂中，选择8491-94_3(SEQ ID NO：5)进行SELEX后修饰以鉴定改善的性质和特征。如图5A所示，这个序列可以14.8nM的IC₅₀抑制该系统中抗体包被的绵羊红血细胞的溶血。

实施例4：C3a释放的抑制。

本实施例提供了本文用于测量适体防止C3-蛋白经蛋白水解裂解为C3a和C3b并因此防止人C3-蛋白活化的能力的方法。该测定法的原理是用预先活化的酵母聚糖(COMPLEMENTTECHNOLOGIES产品目录号B400)在适体存在或缺乏时引发人血清中补体系统的替代途径。该途径被引发时，C3a释放，然后被血清中已经存在的肽链内切酶迅速代谢为C3a desArg。然后使用DB OptEIATM人C3a酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(BD BIOSCIENCES，SanDiego，CA产品目录号550499)根据生产商的指导测量C3a desArg的相对量。正常人血清(COMPLEMENT TECHNOLOGIES产品目录号NHS)在含有10nM EGTA镁(COMPLEMENTTECHNOLOGIS产品目录号B106)，添加或未添加预定浓度的适体的明胶佛罗那缓冲液(0.1％明胶、5mM佛罗那、145mM NaCl、0.025％NaN₃，pH 7.3，COMPLEMENT TECHNOLOGIES产品目录号B101)稀释至10％或34％。通过添加酵母聚糖-A(0.5mg/mL)引发补体级联并且允许补体级联在37℃下进行30分钟。然后通过在室温下离心(7，000xg，4分钟)将酵母聚糖-A从溶液中去除并且适当地稀释样品以用人C3a ELISA试剂盒测量。作为适体对C3a desArg ELISA性能干扰的可能性的对照，在反应30分钟之后添加适体。图12A中示出了在酵母聚糖-A诱导补体活化之后，代表性收敛模式1序列，8491-3_3(SEQ ID NO：4)、(8491-94_3(SEQ ID NO：5)、8491-189_3(SEQ ID NO：8)、8491-387_3(SEQ ID NO：16)和8491-389_3(SEQ ID NO：6)抑制C3a释放的能力。如图12B中所示，观察到的抑制不是由于适体对C3a检测系统(C3adesArg ELISA)的干扰。在这个对照中，在补体级联已经运行之后添加适体，使得适体以与图12A中所示相应抑制实验中相同的浓度存在。图6中显示模式1成员，8491-94_3(SEQ IDNO：5)，会抑制34％正常人血清中的C3a释放，IC₅₀为2μM。

脱氧胸苷取代8491-94_3(50-mer)的中NapdU。

对8491-94_3(SEQ ID NO：5)进行脱氧胸苷(dT)步移(walk)。单个dT取代8个位置中含经修饰核苷酸(NapdU)的一个。dT步移意指测定每个经修饰核苷酸对于高亲和力结合的贡献。高亲和力结合不需要的经修饰核苷酸可以潜在地经非修饰碱基取代或缺失。在该表中，“P”表示NapdU，而A、T、C和G表示天然存在的脱氧核糖核苷酸并且“NB”表示与多达100nM人C3-蛋白未结合。表4中示出了这种步移的结果。取代前七个经修饰的(最靠近5′末端的七个)核苷酸，相对于无任何取代的50-mer，降低了对C3-蛋白的亲和力。取代最靠近3′末端的NapdU未显著影响结合。

表3.脱氧胸苷(T)取代50-mer 8491-94_3(SEQ ID NO：5)中的NapdU修饰碱基(P)。所有序列均含在3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

50-mer 8491-94_3(SEQ ID NO：5)的截短。

选择序列8491-94_3(SEQ ID NO：5)进行SELEX后修饰和分析，并且在一系列的缺失实验中已经截短为28-mer 8491-94_53(SEQ ID NO：58)(表4)。截短序列保持对人C3-蛋白的高亲和力并且仍然含有如上所述的23个核苷酸的共有基序。在此28-mer中去除了如上所示并非大大有助于高亲和力结合的经修饰核苷酸。在用C3缺乏，添加了20nM(最终浓度)C3-蛋白的人血清进行的溶血测定中还测试了代表性截短抑制C3-蛋白的能力(图5)。8491-94_26(SEQ ID NO：54)、8491-94_27(SEQ ID NO：55)和8491-94_53(SEQ ID NO：58)能够分别以15.1nM、24.6nM和17.1nM的IC₅₀抑制溶血。还证实28-mer截短序列，8491-94_53(SEQ ID NO：58)，会以1.5μM的IC₅₀抑制34％正常人血清中的C3a释放(图6)。

表4：50-mer序列8491-94_3(SEQ ID NO：5)的截短。所有序列均含在3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

8491-94_26(SEQ ID NO：54)中的C3-间隔区单取代。

C3适体的第一轮SELEX后修饰是在30-mer 8491-94_26(SEQ ID NO：54))中除含有NapdU的那些位置以外的所有位置的C3-间隔区步移。C3-间隔区步移意指鉴定并非高亲和力结合所需，可潜在地一起被去除，经3-碳间隔区(C3-间隔区)或其它接头如六乙二醇(Heg)或聚乙二醇(PEG)接头置换的碱基。表5中示出了C3-间隔区取代的结果。在该表中，“P”表示NapdU，“C3”表示C3-间隔区；A、C和G表示天然存在的脱氧核糖核苷酸并且“NB”表示与多达100nM C3-蛋白未结合。几个位点耐受C3-间隔区取代。三个内部位置的C3-间隔区的取代与8491-94_26(SEQ ID NO：54)相比显示与C3-蛋白的结合增强。相对于8491-94_26(SEQ ID NO：54)的5′-末端存在位置8、18和26。位置8的取代产生适体8491-94_36(SEQ IDNO：66)，其以31.5pM的亲和解离常数(K_d)结合C3-蛋白，而位置18或26的取代分别产生适体8491-94_43(SEQ ID NO：73)和[8491-94_48(SEQ ID NO：78)]，其分别以14.2pM和30.2pM的K_d值结合C3-蛋白。

在28-mer适体8491-94_53中的等效位置产生单个Heg或C3-间隔区(“C3”)取代或多个C3-间隔区取代(表6)。值得注意的是，取代位置7、17和25(相对于8491-94_53的5′-末端编号)的C3-间隔区基团产生相比于8491-94_53(SEQ ID NO：58)的33.4pM，K_d为22.1pM的适体。

含有C3-间隔区基团的个别序列在溶血测定中保持抑制C3-蛋白的能力(图5)。序列8491-94_30(SEQ ID NO：60)、8491-94_36(SEQ ID NO：66)、8491-94_37(SEQ ID NO：67)和8491-94_43(SEQ ID NO：73)在这项测定中分别能够以20.9nM、25.0nM、24.7和19.2nM的IC₅₀值抑制溶血。

表5.30-mer 8491-94_26(SEQ ID NO：54)中的C3-间隔区取代。所有序列均含在3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

表6.28-mer 8491-94_53中的C3-间隔区和六乙二醇(Heg)间隔区取代。所有序列均含在3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

8491-94_53(SEQ ID NO：58)中的2′-O-甲基单取代。

为增强截短的含NapdU、解离速率缓慢的经修饰适体(SOMAmer)8491-94_53(SEQ IDNO：58)的核酸酶抗性，在与C3-蛋白的结合未受显著影响的核苷酸位置并入2′-O-甲基(2’-OMe)基团。任何单独的2′-OMe添加对蛋白结合的影响可先验预测。因此，进行“2′-OMe步移”，其中产生了适体8491-94_53(SEQ ID NO：58)的几种变体，其中每种变体仅含单个经修饰核苷酸。测定每种变体的结合亲和力(Sequence ID编号88至115)。

进行2′-O-甲基取代以便鉴定可以耐受这种核酸酶抗性取代的位置。表7中示出了每种构建体的序列和结合亲和力。此表中，上标1(¹)表示具有2′-O-甲基取代的核苷酸，“P”表示NapdU，“A”、“C”和“G”表示天然存在的脱氧核碱基并且“NB”表示与多达100nM人C3-蛋白未结合。可在保持低于100pM的K_d的同时在18个位置进行取代。

表7.28-mer 8491-94_53(SEQ ID NO：58)中的2′-O-甲基和脱氧胸苷取代。所有序列均含在3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

8491-94_53(SEQ ID NO：58)中的多个2′-O-甲基取代或多个2′-O-甲基取代和C3-间隔区取代。

为了将对核酸酶的抗性增加到最大限度，需要具有多个2′-O-甲基取代的适体。与多个2′-O-甲基取代组合添加C3-间隔区或Heg部分可潜在地进一步增加核酸酶稳定性。基于以上2’-OMe步移的结合信息，产生许多适体，其中在每个适体中并入了几个2’-OMe添加，有或无先前鉴定为允许此类取代的胞嘧啶核苷酸的C3-间隔区或Heg部分的同时取代(序列ID编号116至130)。另外，与几个2’-OMe取代组合，有或无C3-间隔区的同时取代，探索某些位置的碱基取代(序列ID编号138至151)。构建序列并且于表8中示出了相关结合亲和力。此表中，上标1(¹)表示具有2′-O-甲基取代的核苷酸，“P”表示NapdU，“C3”表示3-碳间隔区，“Heg”表示六乙二醇，“A”、“C”、“T”、“U”和“G”表示天然存在的脱氧核碱基，并且“NB”表示与多达100nM人C3-蛋白未结合。并非所有组合均保持高亲和力结合。例如8491-94_91(SEQ IDNO：119)、8491-94_92(SEQ ID NO：120)和8491-94_126(SEQ ID NO：138)未显示出可辨结合活性。然而，包括含有17个2’-O-甲基核苷酸的8491-94_97(SEQ ID NO：125)的其它组合仍然保持对人C3-蛋白的高亲和力结合。在溶血测定中测试了代表性序列抑制C3-蛋白的能力(图5b)。适体8491-94_90(SEQ ID NO：118)、8491-94_97(SEQ ID NO：125)和8491-94_100(SEQ ID NO：128)分别以18.9nM、15.6nM和19.7nM的IC₅₀值抑制。另外，证实适体8491-94_97(SEQ ID NO：125)以3μM的IC₅₀值抑制34％正常人血清中的C3a释放(图6)。

表8.28-mer适体8491-94_53(SEQ ID NO：58)中的多个2′-O-甲基取代或有或无C3-间隔区和/或核苷酸取代的2′-O-甲基取代。所有序列均含在3′-末端的3′-3′连接脱氧胸苷(未示出)。

¹含2’-OMe糖的核苷酸。

实施例5：适体对受DNA酶I或DNA酶II消化的敏感性测定。

本实施例提供了本文用于测定适体对受脱氧核糖核酸酶I(DNA酶I)或脱氧核糖核酸酶II(DNA酶II)消化的敏感性的一般方法和材料的概述。对于DNA酶I适体稳定性测定而言，将最终浓度为250nM的聚丙烯酰胺凝胶纯化适体在37℃下用2单位/mL的重组人DNA酶I(CELLSCIENCES，产品目录号CSI10719)于核酸酶缓冲液(10mM Tris HCl pH 7.6、2.5mM MgCl₂、0.5mM CaCl₂)中以100μL的总反应体积孵育。在不同的时间，收集15μL等分试样并通过添加等体积的2x凝胶上样缓冲液(93.85％甲酰胺、0.2％SDS、20mM Na₂EDTA、0.05％二甲苯青和0.1％橙黄G)并在95℃下加热2分钟来终止反应。使用15％聚丙烯酰胺变性凝胶(8M脲)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将消化产物与全长适体分开。在200V下于Tris硼酸盐缓冲体系中进行电泳20分钟。凝胶用大约2μM

金(MOLECULAR PROBES，产品目录号S11494)染色10分钟以使条带可视化。使用Q分析软件(ALPHA INNOTECH)量化每个时间点剩余的全长适体的量。如有必要，在背景减除后测定每个条带的强度并且将数据表示为在零时间点全长输入DNA的剩余百分比。对于这些实验而言利用具有3′-3′连接的dT“帽”的适体的含5′-羟基形式。

对于DNA酶II适体稳定性测定而言，将最终浓度为250nM的聚丙烯酰胺凝胶纯化适体在37℃下用140单位/mL的猪DNA酶II(WORTHINGTON BIOCHEMICAL CORPORATION)于核酸酶缓冲液(0.1M NaOAc pH 4.6、2.0mM MgCl₂、15mM NaCl₂)中以100μL的总反应体积孵育。在不同的时间，收集15μL等分试样并通过添加等体积的2x凝胶上样缓冲液(93.85％甲酰胺、0.2％SDS、20mM Na₂EDTA、0.05％二甲苯青和0.1％橙黄G)并在95℃下加热2分钟来终止反应。使用15％聚丙烯酰胺变性凝胶(8M脲)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将消化产物与全长适体分开并且在200V下于Tris硼酸盐EDTA缓冲体系中进行电泳20分钟。凝胶用大约2μM

金(MOLECULAR PROBES，产品目录号S11494)染色10分钟以使条带可视化。使用

Q分析软件(ALPHA INNOTECH)量化每个时间点剩余的全长适体的量。如有必要，在背景减除后测定每个条带的强度并且将数据表示为在零时间点全长输入DNA的剩余百分比。对于这些实验而言利用具有3′-3′连接的dT“帽”的适体的含5′-羟基形式。

这些测定法用于确定具有多个2’-O-甲基取代的适体与不含2’-O-甲基取代的适体28-mer 8491-94_53(SEQ ID NO：58)相比是否具有增强的核酸酶抗性。在8491-94_53中的3′末端一起使用NapdU核苷酸、2’-OMe取代和添加倒置脱氧胸苷与未修饰的DNA相比可赋予很大程度的核酸酶保护。尽管如此，8491-94_53在核酸酶的存在下仍不完全稳定。例如，8491-94_53(SEQ ID NO：58)可被人重组DNA酶I(图7)和猪胰腺DNA酶II(图8)消化。如图7所示，全长8491-94_53适体(上方条带)的强度经2小时降低大约20％及图8中经12小时强度降低大约75％，分别表明对受DNA酶I和DNA酶II消化的敏感性。还测试了四种具有多个2’-OMe取代的适体的核酸酶抗性。为8491-94_90(10个2’-OMe取代)、8491-94_97(17个2’-OMe取代)、8491-94_100(15个2’-OMe取代和3个C3-间隔区取代)和8491-94_102(9个2’-OMe取代和3个C3-间隔区取代)。适体8491-94_97(SEQ ID NO：125)和8491-94_102(SEQ ID NO：130)对DNA酶I显示出增强的稳定性，而适体8491-94_90(SEQ ID NO：118)和8491-94_100(SEQ ID NO：128)并没有(图7)。适体8491-94_97(SEQ ID NO：125)和8491-94_100(SEQ ID NO：128)对DNA酶II显示出增强的稳定性，而适体8491-94_90(SEQ ID NO：118)和8491-94_102(SEQ IDNO：130)并没有(图8)。因此，适体8491-94_97(SEQ ID NO：125)是测试的具有多个核酸酶稳定取代的四种适体之一，其对DNA酶I和DNA酶II两者均显示出增强的稳定性。

Claims

1.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：152)

其中，

K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；

每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；

每个R独立地且每次出现为A或G；

M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；

每个D独立地且每次出现为A、C或3-碳间隔区；

每个V独立地且每次出现为A、G、C或3-碳间隔区；

L为A、U、T或C-5经修饰的嘧啶；

W为G或3-碳间隔区；

S为C或3-碳间隔区；

Y为C、U或T；并且

n为0或1，

其中所述适体长度为24至100个核苷酸，或长度为30至60个核苷酸，或长度为28至60个核苷酸，或长度为28至50个核苷酸，或长度为28至40个核苷酸，或长度为40至50个核苷酸，或长度为28至32个核苷酸。

2.根据权利要求1所述的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：131)。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPACGPPM-3′(SEQ ID NO：135)或5′-KPGRMPDVD_nLPAWPSVGPAYRPPM-3′(SEQ ID NO：153)。

4.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPP-3′(SEQID NO：154)，

其中，

K为C-5经修饰的嘧啶、C、U、T、G或3-碳间隔区；

每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；

R为A或G；

M为C、U、T、C-5经修饰的嘧啶或3-碳间隔区；

V为A、G、C或3-碳间隔区；

W为G或3-碳间隔区；

S为C或3-碳间隔区；

Y为C、U或T；并且

X为选自经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇的接头，

5.根据权利要求4所述的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：136)。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的适体，其中所述适体包含序列5′-KPGRMPXPAWPSVGPACGPPM-3′(SEQ ID NO：137)或5′-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPPM-3′(SEQ IDNO：155)。

7.权利要求1至6中任一项所述的适体，其中

K为C-5经修饰的嘧啶、C或G；

每个M独立地且每次出现为C或C-5经修饰的嘧啶；和/或

L为A或C-5经修饰的嘧啶。

8.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-PAWPSVGPAYRPP-3′(SEQ ID NO：156)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；S为C为3-碳间隔区；V为A、G或C；Y为C、U或T；并且R为G或A，

9.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列5′-PAWPSVGPACGPP-3′(SEQ ID NO：134)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；W为G或3-碳间隔区；并且S为C或3-碳间隔区；V为A、G或C，

10.根据前述权利要求任一项所述的适体，其中所述适体包含与选自SEQ ID NO：4-28、32-34、37-75、78-118、121-130和139-151的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％相同的序列。

11.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含第一区和第二区，其中所述第一区包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)并且所述第二区包含序列5′-GPAYRPP-3′(SEQ ID NO：156)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A，其中所述适体长度为24至100个核苷酸，或长度为30至60个核苷酸，或长度为28至60个核苷酸，或长度为28至50个核苷酸，或长度为28至40个核苷酸，或长度为40至50个核苷酸，或长度为28至32个核苷酸。

12.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含第一区和第二区，其中所述第一区包含序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)并且所述第二区包含序列5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶，其中所述适体长度为24至100个核苷酸，或长度为30至60个核苷酸，或长度为28至60个核苷酸，或长度为28至50个核苷酸，或长度为28至40个核苷酸，或长度为40至50个核苷酸，或长度为28至32个核苷酸。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的适体，其中所述第一区的3′-末端共价连接到所述第二区的5′-末端。

14.根据权利要求13所述的适体，其中所述第一区和所述第二区通过至少一个、两个、三个、四个或五个接头共价连接，其中每个接头独立地选自核苷酸、经取代或未取代的C₂-C₂₀接头、亚烷基二醇和聚亚烷基二醇。

15.根据权利要求14所述的适体，其中每个接头独立地选自核苷酸、3-碳间隔区和六乙二醇。

16.一种结合C3蛋白的适体，其中所述适体包含序列SEQ ID NO：125，其中所述适体长度为24至100个核苷酸，或长度为30至60个核苷酸，或长度为28至60个核苷酸，或长度为28至50个核苷酸，或长度为28至40个核苷酸，或长度为40至50个核苷酸，或长度为28至32个核苷酸。

17.根据权利要求1-9或11-15中任一项所述的适体，其中每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：

5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-噻吩基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-酪氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-3，4-亚甲二氧基苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(MBndU)、5-(N-4-氟苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(FBndU)、5-(N-3-苯丙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PPdU)、5-(N-咪唑基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ImdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TapdU)、5-(N-R-苏氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThrdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。

18.根据权利要求1-9或11-15中任一项所述的适体，其中每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：

5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。

19.根据权利要求1-9或11-15中任一项所述的适体，其中每个C-5经修饰的嘧啶为5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。

20.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸。

21.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述适体抑制C3蛋白裂解。

22.根据前述权利要求中任一项所述的适体，其中所述C3蛋白为人C3蛋白。

23.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的适体和补体组分3(C3)蛋白。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述补体组分3(C3)蛋白为人补体组分3(C3)蛋白。

25.一种抑制补体组分3(C3)蛋白裂解的方法，其包括使C3蛋白与权利要求1-22中任一项所述的适体接触，其中所述C3蛋白是在体外样品中。

26.一种抑制补体系统的至少一种活性的方法，其包括使所述补体系统的组分与权利要求1-22中任一项所述的适体接触，其中所述补体系统的组分是在体外样品中。

27.有效量的权利要求1-22中任一项所述的适体在制备用于抑制受试者中的补体组分3(C3)蛋白裂解的药物中的用途。

28.有效量的权利要求1-22中任一项所述的适体在制备用于抑制受试者中的补体系统的至少一种活性的药物中的用途。

29.有效量的权利要求1-22中任一项所述的适体在制备用于治疗年龄相关的黄斑变性、自身免疫性疾病、血液病、传染性疾病、脓毒病、炎性疾病或神经退行性疾病的药物中的用途。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自红斑狼疮和类风湿性关节炎。

31.根据权利要求29所述的用途，其中所述血液病为阵发性睡眠性血红蛋白尿。

32.根据权利要求29所述的用途，其中所述炎性疾病选自缺血/再灌注损伤、关节炎和肾炎。

33.根据权利要求29所述的用途，其中所述神经退行性疾病选自亨廷顿氏病和帕金森氏病。

34.一种选择对C3蛋白具有结合亲和力的适体的方法，其包括：

(a)使候选混合物与C3蛋白接触，其中所述候选混合物包含经修饰核酸，其中所述候选混合物的至少一个或每个核酸中的一个、几个或所有嘧啶包含C-5经修饰的嘧啶，其中所述候选混合物包含含有序列5′-PAGPC-3′(SEQ ID NO：132)，5′-GPAYRPP-3′(SEQ ID NO：156)或5′-GPACGPP-3′(SEQ ID NO：133)的核酸，其中每个P独立地且每次出现为C-5经修饰的嘧啶；Y为C、U或T；并且R为G或A，其中每个核酸独立地长度为约30至约60个核苷酸，或长度为约28至约60个核苷酸，或长度为约28至约50个核苷酸，或长度为约28至约40个核苷酸，或长度为约40至约50个核苷酸，或长度为约28至约32个核苷酸；

(b)使所述候选混合物暴露于缓慢解离速率富集过程，其中相对于所述候选混合物中的其它核酸，从所述靶分子解离的速率缓慢的核酸结合所述C3蛋白，形成核酸-靶分子复合物；

(c)从所述候选混合物中分离解离速率缓慢的核酸；

(d)扩增所述解离速率缓慢的核酸以得到富集能够以缓慢解离速率结合所述C3蛋白的核酸序列的核酸混合物，从而选择与所述C3蛋白分子解离速率缓慢的适体。

35.根据权利要求34所述的方法，其中每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-噻吩基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-酪氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-3，4-亚甲二氧基苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(MBndU)、5-(N-4-氟苄基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(FBndU)、5-(N-3-苯丙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(PPdU)、5-(N-咪唑基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ImdU)、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-R-苏氨酰基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(ThrdU)、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]羧酰胺)-2′-氯化脱氧尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-[1-(2，3-二羟丙基)]羧酰胺)-2′-脱氧尿苷)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。

36.根据权利要求34所述的方法，其中每个C-5经修饰的嘧啶独立地选自：5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NapdU)、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基甲基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NEdU)、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-1-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-2-萘基乙基羧酰胺)-2′-氟尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BFdU)、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷、5-(N-3-苯并呋喃基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2′-O-甲基尿苷和5-(N-3-苯并噻吩基乙基羧酰胺)-2’-氟尿苷。

37.根据权利要求34所述的方法，其中每个C-5经修饰的嘧啶为5-(N-萘基甲基羧酰胺)-2′-脱氧尿苷(NapdU)。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述混合物中的多个核酸包含至少一个2′-O-甲基修饰的核苷酸。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述混合物中的多个核酸包含C3-间隔区、HEG接头或PEG接头。

40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述C3蛋白为人C3蛋白。