CN110639009A - 重组adamts13在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供重组ADAMTS13在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用。以C57BL/6雌性小鼠为研究对象，采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽构建EAE模型，分别在EAE病程7‑21天或者15‑29天，每日侧脑室注射重组ADAMTS13。结果表明，与对照组相比，重组ADAMTS13治疗可以减轻EAE小鼠血脊髓屏障损伤、抑制脊髓内炎症反应而发挥髓鞘保护作用。因此，为制备治疗自身免疫性脑脊髓炎和多发性硬化的药物保护提供新的思路，拓宽了重组ADAMTS13药物的应用范围。

Description

重组ADAMTS13在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用
涉及领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及重组ADAMTS13在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用。
背景技术
多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)最常见的脱髓鞘疾病，是最常见的神经系统疾病之一。MS起病年龄多在20-40岁，在许多国家，它是年轻人非创伤性神经功能障碍的主要原因。MS基础研究中，最为常用的动物模型是MOG35-55多肽构建的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型。虽然MS和EAE的具体病因目前尚不确定，但是大量研究证实炎性反应是参与脱髓鞘损伤的重要环节。
特异性免疫系统中的T淋巴细胞在MS和EAE的病理生理过程发挥重要作用。巨噬细胞是非特异性免疫系统的组成部分，包括CNS固有的小胶质细胞和CNS浸润的外周来源的单核细胞，在多发性硬化疾病的起始及进展过程中起重要作用。急性感染和损伤时，中性粒细胞会被募集到病变组织而发挥至关重要作用，而在MS/EAE等慢性炎症反应研究中中性粒细胞的作用很容易被忽略。但越来越多的研究发现非特异性免疫系统的中性粒细胞在MS和EAE病理生理损伤中发挥作用。
多发性硬化病变的标志是脱髓鞘损伤、轴突或神经元丢失以及星形胶质细胞增生。髓鞘是由CNS少突胶质细胞、周围神经系统施万细胞同心性包裹而形成的富含脂质的结构。除了增加神经纤维传递速度，髓鞘还可以为神经细胞轴突提供营养支持，从而在维持正常神经功能中发挥重要作用。炎性反应、营养不良等多种因素均可损害CNS少突胶质细胞髓鞘，继而引起轴突或神经元丢失(称为神经变性)，导致运动功能、感觉功能和认知功能损伤。此外，在EAE疾病模型中，血脊髓屏障破坏、趋化因子及炎性因子共同参与CNS脱髓鞘损伤。
综上所述，MS和EAE发病过程中，特异性和非特异性免疫系统的多种细胞参与髓鞘脱失、轴突和神经元变性。因此，寻找可以有效减轻中枢神经系统炎性反应的药物，是干预和治疗多发性硬化的重要策略。基础研究发现，重组ADAMT13可以显著减轻动脉粥样硬化、脑梗死、心肌缺血/再灌注损伤等多种动物模型的免疫反应而发挥保护作用。但是关于自身免疫性脑脊髓炎和多发性硬化的药物研究中，未有关于重组ADAMT13炎性调节和神经保护作用的报道。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的是确定重组ADAMTS13药物在EAE小鼠中能够发挥保护作用，从而提供一种重组ADAMTS13在制备自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明以C57BL/6雌性小鼠为研究对象，采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)多肽构建EAE模型，结果表明，与vehicle相比，重组ADAMTS13治疗性给药可以改善EAE小鼠临床症状、减少脊髓组织炎性细胞的浸润和髓鞘脱失。同样，重组ADAMTS13预防性给药也可以显著性地改善EAE小鼠的临床症状、减轻脊髓组织炎性细胞的浸润和髓鞘脱失。免疫荧光及流式细胞术结果均发现重组ADAMTS13降低脊髓组织中T淋巴细胞、中性粒细胞的数量。EAE小鼠血脊髓屏障通透性降低，脊髓中CXCL1和CCL2趋化因子的表达水平降低，以及IL-1β和IL-17细胞因子水平降低，共同参与了重组ADAMTS13在EAE小鼠模型中的炎性抑制及髓鞘保护作用。因此，重组ADAMTS13治疗可以减轻EAE小鼠血脊髓屏障损伤、抑制脊髓内炎症反应而发挥髓鞘保护作用。
针对重组ADAMTS13的上述功能，本发明的第一方面提供重组ADAMTS13在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎中的应用。
本发明的第二个方面提供重组ADAMTS13在制备保护神经的药物中的应用。
本发明的第三个方面提供重组ADAMTS13在制备减轻血脊髓屏障损伤的药物中的应用。
本发明的第四个方面提供重组ADAMTS13在制备抑制脊髓内炎症反应的药物中的应用。
本发明的第五个方面提供一种治疗自身免疫性脑脊髓炎的药物，该药物包含重组ADAMTS13。
本发明的第六个方面提供一种保护神经的药物，该药物包含重组ADAMTS13。
本发明的第七个方面提供一种减轻血脊髓屏障损伤的药物，该药物包含重组ADAMTS13。
本发明的第八个方面提供一种抑制脊髓内炎症反应的药物，该药物包含重组ADAMTS13。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明开创性地发现重组ADAMTS13可以减轻EAE小鼠血脊髓屏障损伤、抑制脊髓内炎症反应而发挥髓鞘保护作用，为制备治疗自身免疫性脑脊髓炎的药物提供策略，进而为制备治疗多发性硬化的药物提供依据。
附图说明
图1为本发明一实施例中重组ADAMTS13治疗显著减轻EAE小鼠的疾病严重程度的表示图；
图2为本发明一实施例中重组ADAMTS13预防性给药显著减轻EAE小鼠的疾病严重程度的表示图；
图3为本发明一实施例中重组ADAMTS13对EAE小鼠脱髓鞘损伤的影响的结果图；
图4为本发明一实施例中重组ADAMTS13对EAE小鼠脊髓内炎性细胞浸润的影响的结果图；
图5为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13治疗对EAE小鼠脊髓内T淋巴细胞浸润的影响的结果图；
图6为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13治疗对EAE小鼠脊髓内白细胞浸润的影响的结果图；
图7为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13治疗对EAE小鼠脊髓内中性粒细胞浸润的影响的结果图；
图8为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13治疗对EAE小鼠脊髓内小胶质细胞的影响的结果图；
图9为本发明一实施例中重组ADAMTS13预防性干预对EAE小鼠血脊髓屏障的影响的结果图；
图10为本发明一实施例中预防性和治疗性重组ADAMTS13干预对EAE小鼠脊髓内炎性因子和趋化因子的影响的结果图；
图11为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13干预对EAE小鼠脊髓内炎性因子的影响的结果图；
图12为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13干预对EAE小鼠脾脏内炎性细胞的影响的结果图；
图13为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13干预对EAE小鼠脾脏内T细胞分化的影响的结果图；
图14为本发明一实施例中预防性重组ADAMTS13干预对EAE小鼠外周血中炎性细胞的影响的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例一EAE动物模型构建及评估
1.1实验动物
本实验采用8周雌性C57BL/6小鼠，体重18-20g左右，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。实验小鼠饲养于上海交通大学附属第六人民医院动物实验中心SPF级屏障环境中，维持12h/12h的昼夜节律，提供充足的普通饲料和高压消毒饮水，定期更换垫料。
1.2EAE动物模型构建
(1)称取适量MOG35-55多肽冻干粉溶解在无菌PBS溶液中，配制初始浓度为4mg/ml的MOG35-55溶液；
(2)称取适量结核杆菌素H37ra(TB)溶解在弗氏佐剂(CFA)溶液中，配制TB含量为8mg/ml的完全弗氏佐剂溶液。
(3)上述两步骤制备的MOG35-55溶液与完全弗氏佐剂溶液等体积(1:1)混合，置于冰上，超声波乳化仪间断乳化，制成完全油包水乳液。完全抗原滴入水中，应保证完整球状不分散。
(4)将百日咳毒素(PTX)，按照1:100比例使用无菌PBS溶液稀释备用。
(5)异氟烷气体麻醉C57BL/6雌性成年小鼠后，每只小鼠背部脊柱两侧注射100μl油包水乳液。在经MOG35-55免疫后0d和2d腹腔注射100μl PTX稀释液。
1.3EAE动物模型评估
小鼠免疫造模后10天左右进入发病期。当小鼠具有EAE的临床症状，饮食和饮水困难时，可以将食物放在笼子地板上，并给瘫痪的小鼠补充液体。根据动物临床症状进行采用0-5评分系统评分(详见下表1)。称重及盲法评估行为学评分，每次由2人独立评分。
表1典型EAE小鼠临床得分评估
实施例二 侧脑室置管及药物治疗
2.1侧脑室置管
(1)取8周龄雌性C57BL/6小鼠，以2％的异氟烷浓度和0.2L/min的气体流速诱导麻醉小鼠，使小鼠进入麻醉状态(钳夹脚趾无反应且呼吸平稳)。
(2)并将小鼠置于立体定位仪上，碘伏消毒颅骨区域，于小鼠颅骨沿正中线作一长约2.5cm的切口，暴露颅骨。定位右侧侧脑室(前囟后0.3mm，中线右侧旁开0.9mm)，在颅骨表面做标记，用微型颅钻在标记处钻孔，以防损伤硬脑膜。期间以1.5％的异氟烷浓度和0.2L/min的气体流速维持麻醉。麻醉过程中，注意观察小鼠生命体征，根据其生命体征的变化适当调节异氟烷浓度。通过调节保温垫的温度，维持小鼠肛温在36.5-37.5℃范围内。
(3)用26s置管沿着钻孔中心垂直缓慢进针，深度3.0mm。采用牙科水泥将置管固定于颅骨。使用4-0灭菌丝质手术缝线缝合皮肤，并用碘伏棉签消毒。手术完毕后，待小鼠复苏后将其由保温垫转移回鼠笼内。
2.2侧脑室药物注射步骤：
左手拇指和食指轻柔按住小鼠背部以限制小鼠的活动，使小鼠保持安静状态，右手拇指和食指旋转导管帽，缓慢拔出导管内芯。消毒的注射内管插入聚乙烯导管PE20，连接10μl微量注射器。缓慢地将药物推入2μl，注射内管停留3min后再拔出。导管内芯归位，拧上导管帽，将小放回笼内。
2.3实验动物分组
本实施例的目的是比较重组ADAMTS13与vehicle相比，治疗或者预防EAE的作用。治疗作用实验中：在MOG35-55免疫后第10天(10dpi)时进行侧脑室置管手术，15dpi开始每天侧脑室注射药物至29dpi；预防作用实验中：在MOG35-55免疫后第3天(3dpi)时进行侧脑室置管手术，7dpi开始每天侧脑室注射药物至21dpi。
重组ADAMTS13蛋白购买于美国R&D公司，取适量重组ADAMTS13溶液用无菌1*PBS溶液分别配置成12.5ng/μl和25ng/μl的浓度，分装并保存于负20度冰箱，避免反复冻融。
实验分为组、Vehicle组、ADAMTS13组。给药情况如下：
Figure BDA0002246575400000062
组：无EAE造模及任何给药处理；Vehicle组：EAE造模后，侧脑室每天给予无菌1*PBS溶液2μl；ADAMTS13组:EAE造模后，侧脑室每天给予稀释后的重组ADAMTS13溶液2μl。
由图1可知，为了探究发病后侧脑室注射重组ADAMTS13是否可以有效治疗EAE小鼠，在MOG35-55免疫后15天开始给药，此时小鼠临床评分均达到1。与vehicle相比，重组ADAMTS13治疗性给药可以减轻EAE小鼠的神经功能缺损和临床评分。
由图2可知，为了探究发病前侧脑室注射重组ADAMTS13是否可以有效预防EAE小鼠的发病，在MOG35-55免疫后7天开始给药，此时小鼠临床评分均为0。与vehicle相比，重组ADAMTS13治疗可以减轻EAE的临床症状。
实施例三
(1)在治疗实验终止时(MOG35-55免疫后第30天)，小鼠心脏灌流及蛋白、细胞样本和免疫组化标本(小鼠腰髓组织)留取。
(2)HE染色：从负80度冰箱内取出冰冻脊髓切片后进行HE染色，然后每只小鼠脊髓4个连续切片，Olympus IX53荧光显微镜观察脊髓白质区域炎性细胞浸润，拍照。采用半定量、双盲的方法，评分标准[121]如下：
0分没有炎性细胞浸润；
1分少量的炎性细胞浸润；
2分血管周围组织大量的炎性细胞浸润；
3分血管周围组织大量的炎性细胞浸润合并临近脊髓组织炎性细胞浸润。
(3)快蓝髓鞘染色：从负80度冰箱内取出冰冻脊髓切片后进行快蓝髓鞘染色，然后每只小鼠脊髓4个连续切片，Olympus IX53荧光显微镜观察脊髓白质脱髓鞘、拍照。使用Image-Pro Plus软件标记对LFB染色具有抗性的区域(未染上蓝色的脱髓鞘区域)，并将该区域除以脊髓切片白质区域来进行脱髓鞘的定量分析。
(4)免疫荧光染色：从负80度取出脊髓冰冻组织切片进行血清封闭、染一抗、二抗和染核并清洗封片，然后用Olympus IX53荧光显微镜观察并拍照。其中，所使用的抗体如下表：
表2免疫荧光抗体稀释比例汇总
(5)流式细胞分析：制备脊髓组织单细胞悬液，然后进行封闭、染色，最后通过CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter)采集数据、分析样品。其中所使用的抗体如下：
表3流式细胞术抗体稀释比例汇总
Figure BDA0002246575400000082
实验结果
由图3快蓝髓鞘染色结果可知，vehicle对照组EAE小鼠出现髓鞘的大片脱失，集中在前正中沟两侧；重组ADAMTS13组EAE小鼠脊髓白质见小片状的髓鞘脱失、空泡样改变，出现在双侧脊髓表面。ADAMTS13组的脱髓鞘百分比为3.0％±0.2％(n＝3)，vehicle组的脱髓鞘百分比为：9.7％±0.8％(n＝3)。统计学分析显示：相对于vehicle，重组ADAMTS13治疗明显减轻EAE小鼠腰段脊髓髓鞘脱失(P<0.01)。
由图4HE染色结果可知，vehicle组EAE小鼠的脊髓可见浸润的大量的炎性细胞不仅围绕血管周围集中分布，还扩散到临近脊髓白质区域。重组ADAMTS13组EAE小鼠的脊髓炎性细胞浸润明显减轻，主要在脊膜和血管区域可见少量的炎性细胞浸润。统计结果显示，NS治疗组的炎性评分为：2.7±0.1(n＝3)，重组ADAMTS13治疗组的炎性评分为：1.8±0.2(n＝3)；统计学检验显示两组间差异有统计学意义(P<0.05)。相对于vehicle对照组，重组ADAMTS13治疗明显减轻EAE小鼠脊髓组织内炎性细胞浸润。
由图5免疫荧光染色结果可知，相对于vehicle，重组ADAMTS13预防性给药明显减轻EAE小鼠脊髓组织内T淋巴细胞浸润。
由图6采用流式细胞术分析浸润的细胞亚型及其比例的结果可知，重组ADAMTS13预防给药组脊髓内T淋巴细胞的比例较vehicle对照组相比明显降低，经统计学分析，差异具有统计学意义(P＜0.01)；较vehicle对照组相比，重组ADAMTS13预防给药组脊髓内中性粒细胞的比例明显降低，经统计学分析，差异具有统计学意义(P＜0.05)；重组ADAMTS13预防给药组脊髓内小胶质细胞和浸润单核细胞比例较vehicle对照组有升高趋势，但差别均无统计学意义(P>0.05)。
由图7免疫荧光染色结果可知，相对于vehicle，重组ADAMTS13预防性给药明显减轻EAE小鼠脊髓组织内中性粒细胞浸润。
由图8免疫荧光染色结果可知，相对于vehicle，重组ADAMTS13预防性给药不影响EAE小鼠脊髓组织内小胶质细胞和单核细胞(Iba-1)平均荧光强度。
综上所述，本实施例首次证明重组ADAMTS13对EAE小鼠的保护作用。重组ADAMTS13预防给药和治疗给药均可减轻EAE小鼠的临床评分和神经功能缺损；组织病理学分析显示重组ADAMTS13显著减轻EAE小鼠脊髓的脱髓鞘损伤和炎性细胞浸润；流式细胞术和免疫荧光检测发现，重组ADAMTS13药物降低EAE小鼠脊髓内T淋巴细胞和中性粒细胞的百分比。
实施例四
(1)伊文思蓝检测血脊髓屏障：小鼠免疫后22天尾静脉注射伊文思蓝溶液，3h后，腹腔注射0.3％戊巴比妥0.2ml，待小鼠麻醉后，经心脏灌流1*PBS溶液，直至从右心房流出的液体由蓝色变澄清为止。迅速取出小鼠脊髓组织，用生理盐水轻轻冲洗，用滤纸吸干，精密称重，置于1ml二甲酰胺溶液中采用手动研磨棒匀浆，37℃恒温箱中避光孵育24h，使兰染的脊髓标本退色。21,000g离心30min，留取上清兰染液。然后绘制伊文思蓝标准曲线，分光光度计记录样品溶液于620nm和740nm处吸光度，计算样品中Evans blue浓度(ug/ml)。最后，根据脊髓组织质量(mg)，求出单位重量脊髓组织所含伊文思蓝的量(ug/mg)。
(2)免疫印迹(western blot)技术：采集和制备脊髓蛋白样品后，采用蛋白BCA法将蛋白的浓度定量2ug/μl，然后进行SDS-PAGE电泳。
(3)实时荧光定量PCR：提取脊髓组织总RNA，逆转录生成cDNA，然后再进行Real-time PCR反应，最后对反应数据进行分析。
(4)酶联免疫吸附测定：采集和制备脊髓蛋白样品，并采用BCA法检测脊髓组织上清液蛋白含量，然后进行ELISA检测。
(5)流式细胞分析：制备脾脏单细胞悬液，然后进行胞外和胞内染色，染色后进行上机检测。
实验结果
由图9可知，伊文思蓝检测血脊髓屏障的结果在预防实验终止时(免疫后第22天)，尾静脉注射伊文思蓝染色液后，EAE小鼠脊髓组织可见多发性局灶性伊文思蓝渗出和蓝染(图1A)；与小鼠脊髓组织伊文思蓝含量(0.336±0.067，n＝5)相比，vehicle组EAE小鼠脊髓组织伊文思蓝含量为(7.258±0.654，n＝6)，显著升高(P<0.001)，与vehicle组EAE小鼠脊髓组织伊文思蓝含量相比，ADAMTS13组EAE小鼠脊髓组织伊文思蓝含量显著降低提示EAE模型小鼠血脊髓屏障功能受损(图1B)，显示ADAMTS13对血脊髓屏障通透性的保护作用，可能其抑制EAE小鼠CNS炎性细胞浸润和脱髓鞘损伤的机制之一；Western blot检测紧密连接蛋白occludin的表达变化的结果显示(图1C)，与
Figure BDA0002246575400000102
小鼠脊髓组织相比，EAE小鼠脊髓组织可见occludin的表达明显下调，与EAE模型小鼠evans blue检测到的血脊髓屏障通透性增加的结果相一致，与vehicle组EAE小鼠相比，ADAMTS13组EAE小鼠脊髓组织可见occludin的表达上调，所以occludin紧密连接蛋白表达上调可能是重组ADAMTS13降低血脊髓屏障通透性进而抑制EAE小鼠CNS炎性细胞浸润和脱髓鞘损伤的机制之一。
由图10实时荧光定量PCR的结果可知，重组ADAMTS13治疗性干预也可以降低EAE小鼠脊髓内CXCL1、CCL2和IL-1β的表达水平，进而抑制EAE小鼠CNS炎性细胞浸润和脱髓鞘损伤。
由图11ELISA技术检测炎性因子浓度的结果可知，重组ADAMTS13既可以降低IL-1β的表达水平，又可以降低EAE小鼠脊髓内IL-1β的蛋白水平；重组ADAMTS13给药可显著降低EAE小鼠脊髓内IL-17的浓度，IFN-γ的浓度略有下降，但差异无统计学意义。
由图12可知，与vehicle相比，重组ADAMTS13未显著影响EAE小鼠脾脏内T细胞、中性粒细胞和单核细胞的比例。
由图13可知，与vehicle相比，重组ADAMTS13未显著影响EAE小鼠脾脏内Th1(IFN-γ+CD4+)、Th17(IL-17+CD4+)细胞的比例。
由图14可知，与vehicle相比，重组ADAMTS13未显著影响EAE小鼠外周血T细胞、中性粒细胞、单核细胞的比例。
综上所述，本实施例结果表明重组ADAMTS13预防性和治疗性干预均可减轻EAE小鼠脊髓内炎性反应和脱髓鞘损伤。其炎性抑制作用可能是通过多种途径实现的，包括特异性免疫反应和非特异性免疫反应。首先重组ADAMTS13可以减轻抑制EAE小鼠血脊髓屏障的破坏；其次，重组ADAMTS13减轻EAE小鼠脊髓内趋化因子CXCL1和CCL2水平，从而抑制炎性细胞的CNS浸润的级联正反馈；此外，重组ADAMTS13治疗组EAE小鼠脊髓内IL-1β、IL-17的分泌明显下降。重组ADAMTS13的免疫抑制作用，为髓鞘再生创造有利条件。在MS/EAE中，CNS内的髓鞘碎片和炎性反应不利于少突胶质细胞的分化、成熟和髓鞘再生。重组ADAMTS13侧脑室注射抑制EAE小鼠脊髓内炎性反应、创造有利于髓鞘再生的环境，为制备治疗自身免疫性脑脊髓炎和MS的药物提供新的靶点。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (8)

1.重组ADAMTS13在制备治疗自身免疫性脑脊髓炎药物中的应用。
2.重组ADAMTS13在制备保护神经的药物中的应用。
3.重组ADAMTS13在制备减轻血脊髓屏障损伤的药物中的应用。
4.重组ADAMTS13在制备抑制脊髓内炎症反应的药物中的应用。
5.一种治疗自身免疫性脑脊髓炎的药物，其特征在于，包含重组ADAMTS13。
6.一种保护神经的药物，其特征在于，包含重组ADAMTS13。
7.一种减轻血脊髓屏障损伤的药物，其特征在于，包含重组ADAMTS13。
8.一种抑制脊髓内炎症反应的药物，其特征在于，包含重组ADAMTS13。
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