CN110623957A - 普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药制备领域，特别涉及普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用。普纳替尼对于真菌感染有治疗效果，尤其是与氟康唑联合使用时，对抗真菌感染不仅仅抑菌效果良好而且达到了杀菌的效果，此外还具有广谱的抗菌效果，对于临床上氟康唑的白色念珠菌耐药株、新型隐球菌和酿酒酵母等都具有良好的杀灭效果。本发明发现了基因PDR5和PMA1是普钠替尼抗真菌感染作用的药物靶点，为真菌感染的治疗及治疗药物的研究开发提供了新的发展方向和作用机理。

Description

普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用
技术领域
本发明属于医药制备领域，特别涉及普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用。
背景技术
真菌感染严重威胁人类健康，每年全世界有几十亿人遭受感染，致超过150 万人死亡。目前，临床用于真菌感染的药物大致有三大类：多烯类、唑类和棘白菌素类。多烯类，60年前问世，它通过结合真菌细胞膜上的麦角固醇从而发挥杀菌活性。唑类药物发现于40年前，是目前使用最广泛的抗真菌药，它抑制麦角固醇合成酶(羊毛甾醇14α-去甲基化酶)，引起麦角固醇合成受阻和C-14 甲基固醇的累积，达到抑制真菌生长的目的。棘白菌素类,10多年前问世，它抑制真菌细胞壁的主要成分(1,3)-β-葡聚糖的合成从而发挥抗真菌作用。
多烯类，在哺乳动物体内，此类抗菌药主要以原形从尿和胆汁中排出，长期使用会在肾组织中积聚，破坏肾组织中细胞膜的通透性，对肾脏、肾上腺造成直接伤害，严重的肾毒性限制了其临床应用，还可能导致低血钾、寒战与高热、血栓性静脉炎。唑类，在肝脏代谢，主要经胆汁排出，其主要毒性为肝毒性，也可能导致雄性激素水平降低和肾上腺功能抑制。棘白菌素类，分子量大，口服生物利用率不高，只能通过静脉给药且价格昂贵。这些药物的局限性以及近年来抗菌素的滥用等问题导致耐药菌株、超级细菌的频繁出现，现有的抗菌药物越来越不能满足临床的需求，而新的抗真菌药物的研发又需要很长的时间。例如：最新型的棘白菌素类药物从实验室到临床花了将近30年的时间。抗菌药物的更新速度与社会需要脱节，耐药菌株的日益增多已成为临床迫切需要解决的世界性难题。
关于真菌耐药问题的研究主要包括几个方面：首先，真菌能够在生物或者非生物表面聚集形成生物膜，保护其免受宿主的免疫攻击，降低对大多数抗真菌药物的敏感性(Hawser and Douglas,1995；Chandra et al.,2001；Ramage et al.,2002)。其次，真菌可以通过药物靶基因的突变来减少与药物的结合从而降低药效。例如，白色念珠菌ERG11基因的突变已经在临床上被证实能够有效抵抗唑类药物，这些突变通常存在于酶活性位点附近的热点区域。再次，真菌对抗真菌药物抵抗的另一种方法是通过细胞内药物激活外排泵，减少药物积累。白色念珠菌中，转录激活因子Tac1调控ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白CDR1和CDR2，是临床上重要的外排泵。据相关临床报道，少量Tac1获得性功能突变能够上调CDR1和CDR2的构成比例，增加药物排放，从而提高对唑类药物的耐受能力。最后，真菌还可以通过启动细胞应激反应来抵御抗真菌药物的杀伤作用。例如，由ERG3编码的5,6缺陷脱氢酶的变异可以将破坏细胞的14-α-甲基-3,6二固醇转变为促进细胞生长的14-α-甲基粪固醇。
目前，临床上可供使用的抗真菌药物种类有限，抗菌谱窄，副作用大，且极易产生耐药；而新型抗真菌药物的研发周期通常需要5-10年，很难在短期内解决临床上的难题。因此，如何在缩短研发周期的同时降低现有药物浓度并提高药效，已经成为抗真菌药物研发的一种有效策略。
普纳替尼(Ponatinib)是阿瑞雅德制药公司研制的一种口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂(CAS No.：943319-70-8)，于2012年12月在美国获得上市许可，于2013年7月在欧盟通过集中审批程序获得批准，用于治疗慢性粒细胞白血病和费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病，但是该药在真菌感染药物上的应用，未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供普纳替尼(Ponatinib)在制备治疗真菌感染药物中的应用。尤其是普纳替尼(Ponatinib)和三唑类药物联合使用，对于真菌感染不仅仅是抑菌而且达到了杀菌的效果。
普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用。
所述真菌为念珠菌属、隐球菌属、酵母菌属和曲霉菌属的菌株。进一步优选的，所述念珠菌属的菌株为白色念珠菌；所述隐球菌属的菌株为新型隐球菌；所述酵母菌属的菌株为酿酒酵母菌；所述曲霉菌属菌株为烟曲霉菌。
所述治疗真菌感染药物除含有普纳替尼还可含有其他有效成分。优选的，所述有效成分为三唑类药物。进一步优选的，所述三唑类药物为氟康唑或伏立康唑。
一种治疗真菌感染的药物，其特征在于该药物通过PMA1(基因序列如SEQ ID NO.2所示)基因靶点或PDR5(基因序列如SEQ ID NO.1所示)基因靶点为药物靶点进行治疗的物质。
上述治疗真菌感染的药物，该物质的有效成分中包含普纳替尼。
所述物质的有效成分中除了含有普纳替尼外还含有其他有效成分。优选的，所述有效成分为三唑类药物。进一步优选的，所述三唑类药物为氟康唑或伏立康唑。
本发明的有益效果为：
1、普纳替尼对于真菌感染有抑菌效果，而且可协同氟康唑对于真菌感染不仅达到抑菌效果而且还达到了杀菌的效果，而且对于临床上耐氟康唑的白色念珠菌菌株仍有良好的杀灭效果；
2、本发明通过实验验证了普纳替尼细胞毒性较低，16μM及以下浓度为安全剂量；
3、本发明实验证明了普纳替尼可促进上皮细胞对白色念珠菌的杀菌作用，促进巨噬细胞对白色念珠菌的杀灭活性；
4、本发明结合耐药突变菌株的全基因组测序深入全面研究其协同氟康唑抗真菌感染的作用与机制，发现了PDR5为普纳替尼的细胞膜潜在作用靶点；当氟康唑和普纳替尼联用时，普纳替尼通过抑制PDR5，增加真菌胞内氟康唑的累积，从而抑制真菌生长；PMA1为普纳替尼的细胞内潜在作用靶点，为新型抗真菌药物提供可供选择的作用靶点，同时也为制备治疗治疗真菌感染药物提供了参考依据。
附图说明
图1是实施例2中，氟康唑和普纳替尼协同抑制白色念珠菌菌丝生长图。
图2是实施例3中，氟康唑作用于氟康唑耐药菌株的效果图。
图3是实施例4中，普纳替尼协同氟康唑抑制耐药株产生并将氟康唑的抑菌效果转化为杀菌效果，其中图3A为白色念珠菌接种在含有氟康唑和普纳替尼的固体培养基中培养72小时的抑菌效果图，图3B为通过平板菌落计数法对白色念珠菌的存活菌落的统计图。
图4为实施例5中，将不同浓度梯度的普纳替尼作用于FaDu上皮细胞的 LDH测试图。
图5为实施例6中，普纳替尼药物处理下，上皮细胞对白色念珠菌的效果图。
图6为实施例7中，普纳替尼对巨噬细胞杀伤白色念珠菌活性的效果图。
图7为实施例8中，氟康唑和普纳替尼联用时增加真菌胞内氟康唑的累积情况说明图，其中图7A为孔板中的拍照结果图；图7B为荧光显微镜下的观察结果图。
图8为实施例9中，测序鉴定普纳替尼耐药株的基因突变，其中，图8A 为PCR片段的凝胶电泳结果图；图8B为PCR片段的测序结果图。
图9为实施例9中，普纳替尼对PMA1基因的转录抑制作用图。
图10为实施例9中，普纳替尼作用于2336菌株后提取蛋白进行Western blot实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
本发明的实验所用的普纳替尼(Ponatinib)，购自Selleck公司；氟康唑(fluconazole,FLC)购自MCE公司。
实施例1
普纳替尼协同氟康唑对白色念珠菌的细胞和菌丝生长的抑制作用的实验
实验过程：在96孔板中，沿Y轴制备倍比稀释的氟康唑和沿X轴制备倍比稀释的普纳替尼，每孔最终体积100μl，然后将从-80℃复苏的白色念珠菌制成菌悬液(OD600＝0.02)，随后接种在含有药物的96孔板中(100μl/孔)，30℃孵育，16小时后酶标仪检测OD600。药物联合的FICI通过单个FIC值来确定(FIC＝[x]/MICx，其中[x]是联合用药时该药物的最低抑制浓度， FICI＝FICponatinib+FICfluconazole)。
氟康唑对白色念珠菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)为1.63μM，普纳替尼对白色念珠菌的MIC为4μM，当氟康唑与普纳替尼联合使用时，普纳替尼使白色念珠菌对氟康唑的敏感性增加了8倍，氟康唑的 MIC降为0.2μM，普纳替尼与不同浓度氟康唑联合使用的抑菌效果优于普纳替尼单独使用时的效果。根据美国临床和实验室标准协会CLSI的规定，我们检测了部分抑菌浓度指数(fractional inhibitoryconcentration index,FICI)，FICI为 0.14，小于0.5，因此抑菌效果呈现协同性。此外，该效果随着药物浓度的增加而增强，具体见表1；
表1氟康唑和普纳替尼作用于白色念珠菌
氟康唑(μM) OD<sub>600</sub> 普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub> 氟康唑+普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub> 氟康唑+普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub>
0 1.458 0 1.458 0.2+0 1.522 0+4 1.441
0.2 1.522 0.0625 1.539 0.2+0.0625 1.535 0.2+4 1.478
0.41 1.512 0.125 1.497 0.2+0.125 1.524 0.41+4 1.474
0.82 1.492 0.25 1.49 0.2+0.25 1.53 0.82+4 1.443
1.63 1.34 0.5 1.502 0.2+0.5 1.522 1.63+4 1.365
3.27 0.547 1 1.498 0.2+1 1.505 3.27+4 0.903
6.54 0.388 2 1.498 0.2+2 1.514 6.54+4 0.343
13.07 0.339 4 1.441 0.2+4 1.478 13.07+4 0.211
8 1.382 0.2+8 1.412
16 1.287 0.2+16 1.321
32 1.067 0.2+32 1.115
64 0.719 0.2+64 0.698
在M199、Spider和YPD+10％serum培养基中，分别用二甲基亚砜、氟康唑(1.63μM)、普纳替尼(10μM)、氟康唑(1.63μM)+普纳替尼(10μM)处理白色念珠菌，显微镜下观察菌丝形态如图1所示，1.63μM氟康唑对菌丝生长有较小的影响，而10μM普纳替尼单独作用时对菌丝形态影响也较小，但是当两种药物联合使用的时候，其对菌丝的抑制效果明显优于氟康唑或普纳替尼单独使用的效果。
实施例2
普纳替尼协同氟康唑抑制其它类真菌(酿酒酵母、新型隐球菌、烟曲霉菌) 的作用
实验过程：在96孔板中，沿Y轴制备倍比稀释的氟康唑或伏立康唑和沿X 轴制备倍比稀释的普纳替尼，每孔最终体积100μl，然后将从-80℃复苏的菌株 (酿酒酵母、新型隐球菌、烟曲霉菌)制成菌悬液(OD600或OD530＝0.02)，随后接种在含有药物的96孔板中(100μl/孔)，30℃孵育，16小时后酶标仪检测OD600或OD530。药物联合的FICI通过单个FIC值来确定(FIC＝[x]/MICx，其中[x]是联合用药时该药物的最低抑制浓度，FICI＝FICponatinib+FICantifungal)。
氟康唑对酿酒酵母的MIC为52.29μM，当普纳替尼单独使用时对酿酒酵母的抑制作用不显著，但当氟康唑与普纳替尼联合使用时，普纳替尼使氟康唑对酿酒酵母的MIC降低了一半，为26.14μM，8μM普纳替尼与不同浓度氟康唑协同抑菌的效果明显优于氟康唑单药，FICI为0.25，抑菌效果呈剂量依赖型，氟康唑和普纳替尼可以协同抑制酿酒酵母的细胞生长，抑菌效果呈剂量依赖型。利用棋盘法，将氟康唑和普纳替尼在96孔板中联合作用于酿酒酵母，16小时后酶标仪检测OD600，最后结果见表2，并根据美国临床和实验室标准协会CLSI的规定，计算部分抑菌浓度指数(FICI)。
表2氟康唑和普纳替尼作用于酿酒酵母
氟康唑(μM) OD<sub>600</sub> 普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub> 氟康唑+普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub> 氟康唑+普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub>
0 1.291 0 1.291 26.14+0 1.383 0+8 1.412
3.27 1.414 0.25 1.43 26.14+0.25 1.441 3.27+8 1.475
6.54 1.445 0.5 1.373 26.14+0.5 1.433 6.54+8 1.481
13.07 1.434 1 1.402 26.14+1 1.444 13.07+8 1.465
26.14 1.383 2 1.381 26.14+2 1.423 26.14+8 1.455
52.29 1.057 4 1.38 26.14+4 1.458 52.29+8 0.816
104.58 0.371 8 1.412 26.14+8 1.455 104.58+8 0.266
209.15 0.253 16 1.462 26.14+16 1.45 209.15+8 0.209
32 1.489 26.14+32 1.416
64 1.477 26.14+64 1.214
128 1.558 26.14+128 0.764
氟康唑对新型隐球菌的MIC为1.63μM，普纳替尼对新型隐球菌MIC为 8μM，当氟康唑与普纳替尼联合使用时，也有明显的协同增效的效果，抑菌效果随着药物浓度的增加而增强。利用棋盘法，将氟康唑和普纳替尼在96孔板中联合作用于新型隐球菌，16小时后酶标仪检测OD600，最后结果见表3，并根据美国临床和实验室标准协会CLSI的规定，计算部分抑菌浓度指数(FICI)。
表3氟康唑和普纳替尼作用于新型隐球菌
氟康唑(μM) OD<sub>600</sub> 普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub> 氟康唑+普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub> 氟康唑+普纳替尼(μM) OD<sub>600</sub>
0 0.87 0 0.87 1.63+0 0.837 0+0.125 0.839
1.63 0.837 0.125 0.839 1.63+0.125 0.894 1.63+0.125 0.894
3.27 0.759 0.25 0.813 1.63+0.25 0.836 3.27+0.125 0.805
6.54 0.657 0.5 0.801 1.63+0.5 0.794 6.54+0.125 0.726
13.07 0.533 1 0.784 1.634+1 0.828 13.07+0.125 0.584
26.14 0.42 2 0.788 1.63+2 0.772 26.14+0.125 0.424
52.29 0.325 4 0.812 1.63+4 0.8 52.29+0.125 0.293
104.58 0.185 8 0.857 1.63+8 0.735 104.58+0.125 0.199
16 0.887 1.63+16 0.735
32 0.361 1.63+32 0.488
64 0.171 1.63+64 0.163
伏立康唑与普纳替尼联合使用时，对烟曲霉菌也有显著的协同增效的效果，如图5所示。伏立康唑和普纳替尼可以协同抑制烟曲霉菌的细胞生长，抑菌效果随着药物浓度的增加而增强。利用棋盘法，将伏立康唑和普纳替尼在96孔板中联合作用于烟曲霉菌，16小时后酶标仪检测OD530，最后结果见表4，并根据美国临床和实验室标准协会CLSI的规定，计算部分抑菌浓度指数(FICI)。
表4伏立康唑和普纳替尼作用于烟曲霉菌
实施例3
普纳替尼协同氟康唑对临床氟康唑耐药菌株的抑菌作用
实验过程：在96孔板中，沿X轴制备倍比稀释的氟康唑，每孔最终体积100μl，然后将从-80℃复苏的临床氟康唑耐药菌株制成菌悬液(OD600＝0.02)，随后接种在含有药物的96孔板中(100μl/孔)，30℃孵育，16小时后酶标仪检测OD600。
氟康唑对耐FLC白色念珠菌CCC49和CCC80的MIC分别为104.58μM和 52.29μM，将氟康唑以一定的浓度梯度作用于临床氟康唑耐药菌株，30℃孵育16 小时后酶标仪检测OD600，最后制成柱状图，如图2所示；
实验过程：在96孔板中，沿Y轴制备倍比稀释的氟康唑和沿X轴制备倍比稀释的普纳替尼，每孔最终体积100μl，然后将从-80℃复苏的临床氟康唑耐药菌株制成菌悬液(OD600＝0.02)，随后接种在含有药物的96孔板中(100μl/ 孔)，30℃孵育，16小时后酶标仪检测OD600。药物联合的FICI通过单个FIC 值来确定(FIC＝[x]/MICx，其中[x]是联合用药时该药物的最低抑制浓度， FICI＝FICponatinib+FICfluconazole)。
利用棋盘法，将氟康唑和普纳替尼在96孔板中联合作用于临床氟康唑耐药菌株，采用酶标仪连续测定OD600，最后结果见表5，并根据美国临床和实验室标准协会CLSI的规定，计算部分抑菌浓度指数(FICI)。当氟康唑与普纳替尼联合使用时，普纳替尼使临床氟康唑耐药菌株对氟康唑的敏感性提高了 16倍，氟康唑的MIC均降为6.54μM，FICI分别为0.07和0.14，其抑菌效果随着药物浓度的增加而增强。
表5氟康唑和普纳替尼作用于临床氟康唑耐药菌株
实施例4
普纳替尼协同氟康唑抑制耐药株产生并将氟康唑的抑菌效果转化为杀菌效果
将白色念珠菌接种在YPD固体培养基(二甲基亚砜、氟康唑104.58μM、普纳替尼32μM、氟康唑104.58μM+普纳替尼32μM)中，3天后观察耐药株的生长情况。实验发现普纳替尼协同氟康唑抑制耐药菌株产生的作用最强，如图 3A所示；
将白色念珠菌接种在YPD液体培养基(二甲基亚砜、氟康唑104.58μM、普纳替尼32μM、氟康唑104.58μM+普纳替尼32μM)中，分别于0、24、48小时通过平板菌落计数法对白色念珠菌的存活菌落形成单位(CFU)进行计数。通过菌落计数发现普纳替尼协同氟康唑药物组的存活菌落数量明显减少，具有显著的杀菌作用，如图3B所示。
实施例5
普纳替尼对哺乳动物细胞的毒性实验
当细胞膜受到毒性损伤时，LDH就会从细胞内释放到细胞培养液中，LDH 释放水平是评价细胞膜完整性的重要指标，数值越高，损伤越大。将普纳替尼以一定的浓度梯度作用于FaDu上皮细胞，通过LDH实验的测定结果评估普纳替尼对FaDu上皮细胞的损伤，结果显示16μM及以下浓度与对照组比较，差异不显著且无统计学意义，表明16μM及以下浓度为安全剂量，32μM及以上浓度与对照组比较，差异极显著，并且损伤随着浓度的增加而增大，表明普纳替尼对上皮细胞的损伤呈剂量依赖型增加，普纳替尼细胞毒性较低，16μM及以下浓度为安全剂量。将不同浓度梯度的普纳替尼作用于FaDu上皮细胞，用比色法测定细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)活性，根据测定结果制成柱状图如图4 所示。
实施例6
普纳替尼促进上皮细胞对白色念珠菌的杀伤作用
将预先用二甲基亚砜0.1％和普纳替尼(2μM、4μM)分别处理过的上皮细胞与白色念珠菌共培养一段时间之后(37℃，5％CO2，60分钟)裂解细胞，释放出上皮细胞内的活菌，并用平板菌落计数法对白色念珠菌的存活菌落形成单位(CFU)进行计数，根据实验结果制成柱状图如图5所示，将预先用二甲基亚砜和普纳替尼分别处理过的上皮细胞与白色念珠菌共培养，药物组和对照组比较，药物组处理过的上皮细胞释放出活的白色念珠菌数量少于对照组，内吞作用被促进，随着药物浓度的增加促进作用增强，差异有统计学意义，表明普纳替尼促进了上皮细胞对白色念珠菌的杀菌作用。
实施例7
普纳替尼对巨噬细胞杀伤白色念珠菌活性的测定
将预先用二甲基亚砜0.1％、氟康唑(3.27μM)、普纳替尼(2μM)、氟康唑(3.27μM)+普纳替尼(2μM)分别处理过的巨噬细胞与白色念珠菌共培养一段时间之后(37℃，5％CO2，2-3小时后置于冰上20分钟)裂解细胞，
释放出巨噬细胞内的活菌，并用平板菌落计数法对白色念珠菌的存活菌落形成单位(CFU)进行计数，根据实验结果制成柱状图如图6所示，处理组和对照组比较，氟康唑与对照组的巨噬细胞对白色念珠菌的杀灭活性差异无统计学意义，普纳替尼单药及氟康唑和普纳替尼联合药物组的巨噬细胞对白色念珠菌的杀灭活性比对照组更强，差异显著有统计学意义，联合药物组的巨噬细胞对白色念珠菌的杀灭活性最强，该结果表明普纳替尼可以促进巨噬细胞对白色念珠菌的杀灭活性。
实施例8
普纳替尼促进氟康唑在白色念珠菌细胞胞内累积
药物外排与氟康唑耐药密切相关，其中酿酒酵母中有16个基因：ADP1、 SUQ2、YCF1、PDR15、YOR1、VMR1、PDR11、NFT1、KPT1、YBT1、PDR18、 YOL075C、AUS1、PDR5、PDR10、PDR12。将普纳替尼(64μM)分别作用于野生型和16个外排泵基因单敲除的酵母菌株，16小时后酶标仪检测OD600，结果表明普纳替尼对PDR5基因敲除株的抑制作用最强，见表6。将52.29μM 的氟康唑单药作用于PDR5敲除株，52.29μM的氟康唑联合32μM的普纳替尼作用于野生型菌株，16小时后酶标仪检测OD600。WT代表酿酒酵母BY4742， pdr5△代表BY4742敲除PDR5基因，以此类推。32μM普纳替尼与52.29μM氟康唑联用对野生型菌株的抑制作用和单独氟康唑52.29μM作用于pdr5敲除株的抑制作用一致，见表7。
表6普纳替尼作用于野生型和16个外排泵基因单敲除的酵母菌株
表7氟康唑和普纳替尼对BY4742和pdr5Δ作用的比较
氟康唑52.29μM on pdr5Δ 氟康唑52.29μM+普纳替尼32μM on BY4742
OD<sub>600</sub> 0.235 0.21225
氟康唑和普纳替尼联用时增加真菌胞内氟康唑的累积，从而抑制真菌生长。预先用二甲基亚砜、白僵菌素和普纳替尼(4μM、8μM、16μM、32μM、 64μM)分别处理酿酒酵母BY4742之后加入相同浓度的罗丹明染料，在24孔板和荧光显微镜下观察罗丹明染料在胞内的累积情况，如图7所示，图7A为 24孔板中的拍照结果；图7B为荧光显微镜下的观察结果。
白僵菌素能够协同氟康唑抑制真菌生长，其作用靶点为PDR5，同时PDR5 能够运输一系列结构不相关的化合物，包括唑类和罗丹明，通过罗丹明6G染色实验，发现白僵菌素和普纳替尼都有效抑制了罗丹明6G的外排而在细胞内大量积累，从而使细胞呈现肉眼可见的红色，由此可以推断PDR5为普纳替尼潜在的作用靶点，普纳替尼通过抑制PDR5的外排活性，增加细胞内氟康唑的累积从而提高氟康唑的有效浓度，最终抑制真菌细胞的生长。
实施例9
全基因组测序和潜在靶点的鉴定
实验过程：将从-80℃复苏的2336菌株制成菌悬液(OD600＝5)，300μl菌悬液均匀涂抹于YPD平板上(普纳替尼64μM)，用锡箔纸包裹平板，培养温度为30℃，3天后挑选出10个耐药突变菌株并接种在普通YPD平板上，16 小时后用15％甘油保菌，放-80℃保存。
1、测序鉴定普纳替尼耐药株的基因突变
普纳替尼部分抑制PDR5敲除株的生长，暗示有可能存在另外的靶点介导了普纳替尼对氟康唑的协同抑菌效果。为排除外排泵对药物累积的影响，更好地找出药物靶点，我们使用了2336菌株，该菌株为缺失了16个药物外排泵的酿酒酵母菌。实验过程：分别用lysisBuffer分别提取2336和10个耐药突变菌株的DNA，并用聚合酶链式反应(PCR)对以上菌株的基因组DNA进行扩增，反应混合物包含10x PCR缓冲液(2μl)、2mM dNTPs(1.2μl)、50mMMgSO4 (0.6μl)、10mM引物(0.4μl)、5μM Taq酶(0.1μl)、DNA模板(2μl) 和无菌水13.3μl，总体积20μl，循环条件为95℃5min；94℃30sec；55℃30 sec；68℃6min和40sec，循环30次，68℃10min。扩增结束后，将3μl扩增产物和0.6μl Loading Buffer混合后依次加入预先配置好的琼脂凝胶，电压 120v进行电泳，1小时后紫外灯检测，并将扩增成功的产物送测序。RYO566 代表未敲除16个药物外排泵的野生型酿酒酵母菌，2336代表敲除16个药物外排泵的酿酒酵母菌，R1代表1号普纳替尼耐药突变菌株，以此类推。
对10个普纳替尼耐药的突变菌株进行了全基因组测序，将耐药株细胞裂解后提取DNA，通过PCR扩增DNA片段后进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定DNA 质量并对扩增DNA片段进行测序。其中9个菌株的PMA1氨基酸突变都是从 T到S，测序结果显示PMA1为潜在的作用靶点。其中图8A为PCR片段的凝胶电泳结果；图8B为PCR片段的测序结果。3和2336代表敲除16个药物外排泵的酿酒酵母菌，1和R1代表1号普纳替尼耐药突变菌株，以此类推。
3、普纳替尼对PMA1基因的转录抑制作用
实验过程：将从-80℃复苏的2336菌株制成菌悬液(OD600＝1)，加入DMSO、普纳替尼4μM或普纳替尼8μM在30℃下处理3小时，之后用氯仿提取RNA，并将RNA逆转录成cDNA，按比例混合sybr、引物、cDNA和DEPC水，使用Bio-Rad CFX96系统进行实时荧光定量，循环条件如下：95℃30sec；95℃5sec；60℃ 30sec，循环40次，基因相对表达量用2-ΔΔCt法计算，相对应的计算公式分别为：
为了更进一步鉴定潜在药物靶点，在全基因组测序的基础上，我们通过 qPCR实验检测了2336菌株在空白对照和普纳替尼处理后PMA1转录水平的表达，发现普纳替尼能够有效抑制PMA1的表达，且呈剂量依赖型，如图9 所示。
4、普纳替尼对Pma1蛋白的抑制作用
实验过程：将从-80℃复苏的2336菌株制成菌悬液(OD600＝0.2)，30℃下培养3小时，加入DMSO、普纳替尼4μM或普纳替尼8μM在30℃下再处理3 小时，之后用裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品浓度全部稀释至2mg/ml，蛋白与LDS(4×)变性液按4：1的比例混合后在72℃下煮10分钟使蛋白充分变性，然后冷却至室温，离心30秒进行蛋白印迹实验，实验条件如下：10％丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离蛋白，再将分离后的蛋白电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用0.1％吐温磷酸盐缓冲液(5％脱脂乳)进行封闭，用Pma1抗体(1:2000)检测Pma1水平和tubulin抗体(1:2000) 作为对照，通过ImageJ定量条带亮度。
我们还对Pma1蛋白的表达量进行测定，发现普纳替尼作用于2336菌株后明显抑制了Pma1的表达，且呈剂量依赖型，如图10所示，蛋白表达结果与基因表达结果相一致，通过二者实验结果的结合进一步证实Pma1可以作为潜在的药物靶点。
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效替换或修改，都落入本发明保护的范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院
<120> 普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用
<141> 2019-10-09
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4536
<212> DNA
<213> PDR5
<400> 1
atgcccgagg ccaagcttaa caataacgtc aacgacgtta ctagctactc ctccgcgtct 60
tcttctactg aaaacgctgc tgatctacac aattataatg ggttcgatga gcatacagaa 120
gctcgaatcc aaaaactggc aaggactctg accgcacaga gtatgcaaaa ctccactcaa 180
tcggcaccca acaaaagtga tgctcagtct atattttcta gcggtgtgga aggtgtaaac 240
ccgatattct ctgatcctga agctccaggc tatgacccaa aattggaccc caactccgaa 300
aatttttcta gtgccgcctg ggttaagaat atggctcacc taagtgcggc agaccctgac 360
ttttataagc cttattcctt aggttgcgct tggaagaact taagtgcttc tggtgcttcc 420
gcagatgtcg cctatcagtc aactgtggtt aatattccat acaaaatcct aaaaagtggg 480
ctgagaaagt ttcaacgttc taaagaaacc aatactttcc aaatcttgaa accaatggat 540
ggttgcctaa acccaggtga attgctagtc gttttaggta gaccaggctc tggctgtact 600
actttattaa aatccatctc ttcaaatact catggttttg atcttggtgc agatactaaa 660
atttcttaca gcggctactc aggtgatgat attaagaaac attttcgtgg tgaagttgtt 720
tacaacgcag aagctgatgt acatctgcct catttaacag tcttcgaaac tttggttaca 780
gtagcgaggt tgaaaacccc acagaaccgt atcaagggtg tcgataggga aagttatgcg 840
aatcatttgg cggaagtagc aatggcaacg tacggtttat cgcatacaag gaatacaaaa 900
gttggtaacg acatcgtcag aggtgtttcc ggtggtgaaa ggaagcgtgt ctccattgct 960
gaagtctcca tctgtggatc caaatttcaa tgctgggata atgctacaag gggtttggat 1020
tccgctaccg ctttggaatt tattcgtgcc ttaaagactc aagctgatat ttccaataca 1080
tctgccacag tggccatcta tcaatgttct caagatgcgt acgacttgtt caataaagtc 1140
tgtgttttgg atgatggtta tcagatctac tatggccccg ccgataaggc caagaagtac 1200
tttgaagata tggggtatgt ttgtccaagc agacaaacca ccgcagattt tttgacctca 1260
gttacaagtc cctctgagag aaccctgaac aaagatatgc taaaaaaagg tattcatata 1320
ccacagaccc cgaaggaaat gaacgattac tgggtaaaat ctccaaatta caaagagcta 1380
atgaaagaag tcgaccaacg attattgaat gacgatgaag caagccgtga agctattaag 1440
gaagcccaca ttgctaagca gtccaagaga gcaagacctt cctctcctta tactgtcagc 1500
tacatgatgc aagttaaata cctattaatc agaaatatgt ggagactgcg aaataatatc 1560
gggtttacat tatttatgat tttgggtaac tgtagtatgg ctttaatctt gggttcaatg 1620
tttttcaaga tcatgaaaaa gggtgatact tctacattct atttccgtgg ttctgctatg 1680
ttttttgcaa ttctattcaa tgcattttct tctctgttag aaatcttttc gttatatgag 1740
gccagaccaa tcactgaaaa acatagaaca tattcgttat accatccaag tgctgacgct 1800
tttgcatcag ttctatcaga aataccctca aagttaatca tcgctgtttg cttcaatata 1860
atcttctatt tcttagtaga ctttagaaga aatggtggtg tattcttttt ctacttatta 1920
ataaacattg tcgcggtttt ctccatgtct cacttgttta gatgtgttgg ttccttaaca 1980
aagacattgt cagaagctat ggttcccgct tctatgttat tgttggctct atccatgtat 2040
accggttttg ctattcctaa gaagaagatc ctacgttggt ctaaatggat ttggtatatc 2100
aatccgttgg cttacttatt cgaatctttg ttaattaacg agtttcatgg tataaaattc 2160
ccctgcgctg aatatgttcc tcgtggtcct gcgtatgcaa acatttctag tacagaatct 2220
gtttgtaccg tggttggagc tgttccaggc caagactatg ttctgggtga tgatttcatt 2280
agaggaactt atcaatacta ccacaaagac aaatggcgtg gtttcggtat tggtatggct 2340
tatgtcgtct tctttttctt tgtctatcta ttcttatgtg aatacaacga gggtgctaaa 2400
caaaaaggtg aaatattagt tttcccacgc agtatagtta aaagaatgaa gaaaagaggt 2460
gtactaactg aaaagaatgc aaatgacccc gaaaacgttg gggaacgtag tgacttatcc 2520
agcgatagga aaatgctaca agaaagctct gaagaggaat ccgatactta cggagaaatt 2580
ggtttatcca agtcagaggc tatatttcac tggagaaacc tttgttacga agttcagatt 2640
aaggccgaaa caagacgtat tttgaacaat gttgatggtt gggttaaacc aggtacttta 2700
acagctttaa tgggtgcttc aggtgctggt aaaaccacac ttctggattg tttggccgaa 2760
agggttacca tgggtgttat aactggtgat atcttggtca atggtattcc ccgtgataaa 2820
tctttcccaa gatccattgg ttattgtcag caacaagatt tgcatttgaa aactgccact 2880
gtgagggagt cattgagatt ttctgcttac ctacgtcaac cagctgaagt ttccattgaa 2940
gaaaagaaca gatatgttga agaagttatt aaaattcttg aaatggaaaa atatgctgat 3000
gctgttgttg gtgttgctgg tgaaggttta aacgttgaac aaagaaaaag attaaccatt 3060
ggtgttgaat taactgccaa accaaaactg ttggtctttt tagatgaacc tacttctggt 3120
ttggattctc aaactgcttg gtctatttgt cagctaatga aaaagttggc aaatcatggt 3180
caagcaattc tatgtactat tcaccaaccc tctgctattt tgatgcaaga attcgatcgt 3240
ttactattta tgcaacgtgg tggtaagact gtctactttg gcgacttggg cgaaggttgt 3300
aaaactatga tcgattattt tgaaagccat ggtgctcata aatgccctgc tgacgccaac 3360
ccagctgaat ggatgctaga agttgttggt gcagctccag gctctcatgc aaatcaagat 3420
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agatctccag attatttatg gtcgaagttt attttaacta ttttcaatca attgttcatc 3660
ggtttcactt tcttcaaagc aggaacctcg ctacagggtt tacaaaatca aatgttggct 3720
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tttatcttcg ctcaaatatt cgtggaagtt ccatggaata tattggcagg tactattgct 3900
tattttatct actattatcc aattggattt tactccaacg cgtctgcagc tggccagttg 3960
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ttgttgttta caatgtcttt gtctttttgt ggtgttatga ctaccccaag tgccatgcct 4140
agattttgga tattcatgta cagggtttca cctttgactt atttcattca ggctctgttg 4200
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gtgcctaaaa agaacggtaa actctccaag aaataa 4536
<210> 2
<211> 2757
<212> DNA
<213> PMA1
<400> 2
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ccaactcaag aaaagcctgc taagacttac gatgacgctg catctgaatc ttctgacgat 120
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caagaattcc aagctggttc tattgtcgat gaattgaaaa agactttggc taacactgct 540
gttgttatca gagacggtca attggttgaa attccagcca acgaagtcgt cccaggtgat 600
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tgtttcttgc aaatcgatca atctgctatt actggtgaat ctttggctgt cgacaaacat 720
tacggtgacc aaactttctc ttcttccact gttaagagag gtgaaggttt catggttgtt 780
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ggtggtcaag gtcatttcac tgaagttttg aacggtattg gtattatctt attggttttg 900
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gcctttgaca gattgatgaa cggtaagcca atgaaggaaa agaagtctac cagaagtgtc 2700
gaagacttca tggctgctat gcaaagagtc tctactcaac acgaaaagga aacctaa 2757

Claims (11)

1.普纳替尼在制备治疗真菌感染药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述真菌为念珠菌属、隐球菌属、酵母菌属和曲霉菌属的菌株。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述念珠菌属的菌株为白色念珠菌；所述隐球菌属的菌株为新型隐球菌；所述酵母菌属的菌株为酿酒酵母菌；所述曲霉菌属菌株为烟曲霉菌。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物除含有普纳替尼还含有其他有效成分。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述有效成分为三唑类药物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述三唑类药物为氟康唑或伏立康唑。
7.一种治疗真菌感染的药物，其特征在于该药物通过PMA1基因靶点或PDR5基因靶点为药物靶点进行治疗的物质。
8.根据权利要求7所述的治疗真菌感染的药物，其特征在于，该物质的有效成分中包含普纳替尼。
9.根据权利要求7所述的治疗真菌感染的药物，其特征在于，该物质的有效成分中除了含有普纳替尼外还含有其他有效成分。
10.根据权利要求9所述的治疗真菌感染的药物，其特征在于，所述有效成分为三唑类药物。
11.根据权利要求10所述的治疗真菌感染的药物，其特征在于，所述三唑类药物为氟康唑或伏立康唑。
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