CN110570900A - 基于hla-kir基因检测结果评估hbv携带者肝癌风险的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于HLA‑KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法，包括以下步骤：步骤一、HBV携带者阳性被纳入评估对象；步骤二、采集评估对象的性别、年龄、籍贯、民族；步骤三、HLA/KIR基因分型；步骤四，建立HLA‑KIR基因名称基础数据库；步骤五、建立风险因素分类表；步骤六、根据表各项风险因素综合计算，从而评估携带HBV感染者发展为肝癌风险。本发明的评估结果更加准确。

Description

基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其是涉及一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是全球感染率最高的肝炎病毒。全球范围内超过50％的肝癌是由持续的HBV病毒感染引起，HBV病毒感染引起的慢性肝炎和罹患肝细胞癌的情况较为严峻，其直接原因尚未明确。
近年来自然杀伤细胞(natural killer,NK)研究成果表明，NK细胞作为天然免疫系统的关键组成部分，在机体早期抗病毒免疫和肿瘤免疫中发挥重要作用，而杀伤细胞免疫球蛋白受体(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)两个重要免疫相关基因在调节自然杀伤细胞活化过程中发挥重要作用。
现有技术中，有一些研究是针对HBV携带者不同HLA位点基因开展肝癌风险相关性研究，还有一些研究是针对HBV携带者不同KIR基因开展肝癌风险相关性研究，但存均在以下问题：
(1)以往KIR基因检测方法均为自行研发PCR引物，或者技术上主要以血清学和多聚酶链式反应序列特异性引物(polymerase chain reaction SSP-PCR)方法为主，结果的可靠性待确认；
(2)一些研究仅针对单个HLA基因或KIR基因进行了疾病相关性研究，并未考虑其它因素对结论判断的影响；
(3)据研究报导肝癌与发病性别、年龄、饮酒等多因素有关，但没有系统评估风险计算方法；
(4)虽然HLA和KIR基因在人体感染HBV病毒后，对人体的免疫过程的作用是已受公认的结果，但HLA和KIR基因具有高度的遗传多态性，涉及较复杂的分子生物学、遗传学、免疫学等多个学科，各学科知识相交叉十分复杂，在短时期内掌握并运用多个的知识对疾病的免疫发展过程评估较为困难，无法直接应用HLA和KIR基因检测结果来评估HBV携带者在发展为HCC的可能性，或评估结果没有数字化；
(5)迄今为止没有一个详细的评估方法，评估HLA-KIR基因在调控免疫时，其疾病发展为HCC过程中的风险有多大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的计算方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的计算方法，包括以下步骤：
步骤一、HBV携带者阳性被纳入评估对象；
步骤二、登记被评估者的性别、年龄、籍贯、民族；
步骤三、HLA/KIR基因分型；
步骤四，建立HLA-KIR基因名称基础数据库；
步骤五、建立风险因素分类表；
步骤六、根据各项风险因素综合计算，从而评估携带HBV感染者发展为肝癌风险。
作为优选方式，所述步骤三包括：
3.1用含EDTA抗凝剂血样管，采集被评估者外周血5ml，用5％EDTA抗凝，独立包装至－40℃保存，待用；
3.2基因组DNA制备：将3.1步抗凝血200μl，使用全自动核酸提取试剂制备全基因组DNA，测定DNA浓度30～100ng/μL，纯度A260/280为1.65～2.0；
3.3检测被评估者HLA-KIR基因型；采用通过资质评审的试剂供应商供应的HLA基因测序试剂盒及KIR PCR-SSP或基因测序试剂盒，按试剂盒操作说明完成被评估者HLA-KIR基因型检测。
作为优选方式，所述步骤六包括：
6.1采用贝叶斯网络计算模型建立风险因素贝叶斯信念网络图，各风险因素为输入状态，HLA-KIR易感基因为输出状态；
6.2计算有向无环图(DAG)的权重：风险因素贝叶斯网络结构G和条件参数θ(权重)两部分构成，基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法主要因素所组成的网络结构G已确定，只需不断学习调整各结点的概率，来确定权重参数θ，从而正向反馈得出肝癌的风险值，对于θ的计算采用EM(expectation-maximization process)过程来解决。首先，给定一个经验值，即初始化分布参数θ，再根据各结点的概率，来计算各个样本的联合概率，这个概率反映了，在概率密度函数的参数是θ时，得到这组样本的概率。我们需要找到一个参数θ，使得抽到的这组样本的概率最大，也就是说需要其对应的似然函数L(θ)最大。满足条件的θ叫做θ的最大似然估计量，记为θ^＝argmaxL(θ)，θ可通过求解计算来获得；
6.3风险因素概率计算公式如下:
本发明涉及一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法，与现有设计相比，其优点在于：本发明将携带HBV携带者的HBV病毒携带感染持续时间、性别、年龄、饮酒、HBV病毒携带家庭集聚史、反复发作肝炎症状、促癌基因的确诊以及血清甲胎蛋白检测结果结合起来，并根据本研究成果及公开发表的HLA、KIR基因易感基因研究结果，建立一个基于HLA-KIR基因检测结果全面、科学的评估体系，去评估HBV携带者发展为肝癌风险的计算方法，从而指导临床重视免疫治疗效果。本发明将HLA-KIR基因在HBV携带者中免疫作用数字化，特别发明中所建立的各表格方便没有掌握HLA-KIR基因检测知识者找到对应的评分数据，采用了分层贝叶斯模型，根据本发明中的计算公式做出科学的评估，为指导临床治疗提供科学辅助参考数据。本发明克服了了单一因素评估偏离的可能性，建立了一个全面、科学的评估体系。本发明中被评估者HLA-KIR基因型检测，须采用通过资质评审的试剂供应商供应的HLA及KIR基因测序试剂盒，检测受试者HLA-KIR基因型，提高了评估结果的准确性。本发明充分考虑了多个基因影响HBV携带者疾病转归因素的可能性。
附图说明
图1为本发明的风险因素贝叶斯信念网络示意图。
具体实施方式
下文结合说明书附图1和具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明涉及一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法，包括以下步骤：
步骤一、被评估者纳入对象；
1.1 HBV携带者阳性被纳入评估对象；
1.1.1 HBV携带者阳性检测方法：采用酶联免疫吸附法(ELISA)和核酸检测法(NAT)双重检测评估对象。
1.1.2 HBV携带者阳性者判断：ELISA和NAT双重检测为阳性者为HBV携带者阳性，且肝功能检查，包括谷丙转氨酶，谷草转氨酶，谷氨酰转移酶，碱性磷酸酶，总胆红素，直接胆红素，间接胆红素，乳酸脱氢酶检测均在正常值范围内，并且进行了荧光定量PCRHBV核酸检测，HBsAg持续阳性超过20周以上，没有确诊为肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者，符合以上条件者，以下简称“HBV携带者”。
1.2根据国家卫计委印发《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》(以下简称规范)诊疗依据，经市级三甲医院确诊为肝癌患者不纳入本研究评估范围内。
1.3经市级三甲医院确诊为丙型肝炎病毒感染史(Hepatitis C virus,HCV)者不纳入本研究评估范围内。
1.4已接受免疫治疗的HBV携带者不纳入评估对象。
步骤二、采集评估对象的性别、年龄、籍贯、民族；
步骤三、HLA/KIR基因分型，为本评估方案的必要条件：
3.1用含EDTA抗凝剂血样管，采集被评估者外周血5ml，用5％EDTA抗凝，独立包装至－40℃保存，待用。
3.2基因组DNA制备：将3.1步抗凝血200μl，使用全自动核酸提取试剂(台湾瑞宝)制备全基因组DNA，测定DNA浓度，30～100ng/μL，纯度A260/280为1.65～2.0。DNA可在-20℃长期保存待用。
3.3检测被评估者HLA-KIR基因型:采用通过资质评审(营业执照、授权书、中国公共安全产品认证证书、质量管理体系认证书四证齐全)的试剂供应商供应的HLA基因测序试剂盒及KIR PCR-SSP或基因测序试剂盒，按试剂盒操作说明完成受试者HLA-KIR基因型检测。
3.4当遇有HLA/KIR基因突变，须自行设计HLA及KIR基因测序引物扩增其目的基因完成克隆测序，序列提交WHO基因命名委员会获得新基因命名，获得WHO基因命名委员会基因命名后方纳入评估。
3.5 HLA基因型分型结果要求精确到“:”冒号后两位即可。KIR基因分型结果精确到基因名称“*”后5位数字。
步骤四，建立HLA-KIR基因名称基础数据库；
4.1建立HLA、KIR基因座名称对照表，详见表1；
表1
注：
a.本表仅列出常见或本研究检出的等位基因.
b.其它等位基因命名详见：https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/，https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/
4.2建立HLA-C基因座分类对照表，详见表2；
HLA-C1组包括HLA-C*01、03、07、08、12、14、16等位基因，HLA-C2组包括HLA-C*02、04、05、06、15、17、18等位基因型。
表2
HLA-C基因座 HLA-C组
01:02 C1
03:01 C1
03:02 C1
03:03 C1
03:04 C1
04:01 C2
04:03 C2
04:82 C2
06:02 C2
07:02 C1
07:04 C1
07:06 C1
08:01 C1
08:22 C1
12:02 C1
12:03 C1
14:02 C1
14:03 C1
15:02 C2
4.3建立中国汉族人群南北方汉族对应表，详见表3；
表3
4.4建立HLA-KIR易感基因、评分依据数据表，详见表4；
HLA-KIR纳入标准及途径：国际著名文献数据库公开发表的SCI文献；本单位研究成果。
表4
步骤五、建立风险因素分类表；
本发明将多个风险因素归纳成一表，形成子数据库，每个风险因素均有说明，详见表5。
步骤六、根据表各项风险因素综合计算，从而评估携带HBV感染者发展为肝癌风险。
本发明所需公式：
6.1应用分层贝叶斯模型：
本发明所用到的贝叶斯网络计算模型建立风险因素贝叶斯信念网络图，如图1所示，表5中的23种风险因素为输入状态，另外HLA-KIR易感基因为输出状态。每个输入状态只跟与之直接相连的状态有关，而跟与它间接相连的状态没直接关系。状态之间弧用转移概率来表示，构成风险因素贝叶斯信念网络(Belief Network)。节点之间弧的权重确定，可以通过最大后验估计来得到，使用EM(expectation-maximization process)过程来解决。
计算有向无环图(DAG)的权重：风险因素贝叶斯网络结构G和条件参数θ(权重)两部分构成，基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法主要因素所组成的网络结构G已确定，只需不断学习调整各结点的概率，来确定权重参数θ，从而正向反馈得出肝癌的风险值，对于θ的计算采用EM(expectation-maximization process)过程来解决。首先给定一个经验值，即初始化分布参数θ，再根据各结点的概率，来计算各个样本的联合概率，，这个概率反映了，在概率密度函数的参数是θ时，得到这组样本的概率。我们需要找到一个参数θ，使得抽到的这组样本的概率最大，也就是说需要其对应的似然函数L(θ)最大。满足条件的θ叫做θ的最大似然估计量，记为θ^＝argmaxL(θ)，θ可通过求解计算来获得；
6.3风险因素概率计算公式如下:
步骤七、根据HLA/KIR基因最新或其研究结果可变动及更改风险因素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围所附权利要求及其等同物限定。
步骤八、本发明将生物技术与信息技术相结合，可通过计算机编程实现计算机计算查询和计算机自动计算模块，其步骤如下：
8.1建立数据录入模块对话框；
8.2分别将表1至4建立子数据库；
8.3分别将各风险因素分类建立子数据库；
8.4通过计算机语言完成数据查询、数据检索、数据输入、外部数据导入、HLA-KIR易感基因研究更新(风险因素更新)模块和数据计算等功能模块。

Claims (3)

1.一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、HBV携带者阳性被纳入评估对象；
步骤二、采集评估对象的性别、年龄、籍贯、民族；
步骤三、HLA/KIR基因分型；
步骤四，建立HLA-KIR基因名称基础数据库；
步骤五、建立风险因素分类表；
步骤六、根据表各项风险因素综合计算，从而评估携带HBV感染者发展为肝癌风险。
2.根据权利要求1所述的一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法，其特征在于，所述步骤三包括：
3.1 用含EDTA抗凝剂血样管，采集被评估者外周血5ml，用5％EDTA抗凝，独立包装至－40℃保存，待用；
3.2 基因组DNA制备：将3.1步抗凝血200μl，使用全自动核酸提取试剂制备全基因组DNA，测定DNA浓度30～100ng/μL，纯度A260/280为1.65～2.0；
3.3 检测被评估者HLA-KIR基因型；采用通过资质评审的试剂供应商供应的HLA基因测序试剂盒及KIR PCR-SSP或基因测序试剂盒，按试剂盒操作说明完成受试者HLA-KIR基因型检测。
3.根据权利要求1所述的一种基于HLA-KIR基因检测结果评估HBV携带者肝癌风险的方法，其特征在于，所述步骤六包括：
6.1 采用贝叶斯网络计算模型建立风险因素贝叶斯信念网络图，各风险因素为输入状态，HLA-KIR易感基因为输出状态；
6.2 计算有向无环图(DAG)的权重；
6.3 风险因素概率计算公式如下:
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111088349A (zh) * 2020-02-14 2020-05-01 深圳市宝安区妇幼保健院 Kir3dl1基因分型引物组及其应用

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