CN110564733A - C8orf84基因、C8orf84蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供C8orf84基因，其全长mRNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中编码区如SEQ ID NO:2所示，还提供C8orf84蛋白，其包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，还提供特异性扩增C8orf84基因mRNA的引物对，其中正向引物如SEQ ID NO:4所示，反向引物如SEQ ID NO:5所示。本申请还提供该C8orf84基因和该C8orf84蛋白用于制备治疗膀胱癌的药物组合物的用途，以及该引物对用于制备膀胱癌检测试剂盒的用途。本申请亦提供包含该C8orf84基因或该C8orf84蛋白的药物组合物，以及包含该引物对的膀胱癌检测试剂盒。本发明在膀胱癌的治疗和检测上具有应用前景。

Description

C8orf84基因、C8orf84蛋白及其应用

技术领域

本申请属于肿瘤学和生物医学检测技术领域，具体涉及C8orf84基因、 C8orf84蛋白及其应用。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤。据统计，2015年中国新增膀胱患者 80,500例，因膀胱癌死亡32,900例^[1]。预计2018年全美新诊断膀胱癌患者81,190 例，因膀胱癌死亡17,240例^[2]。膀胱癌的组织病理学类型以尿路上皮癌为主，占所有新发病例的90％以上^[2]。目前对于膀胱癌诊断主要依赖于膀胱镜检查和尿细胞学检查。前者为诊断膀胱癌的金标准，但为侵入性的检查，患者依从性差，价格比较昂贵；后者虽然特异度高且无创，但对低度表浅性的肿瘤敏感性低，容易产生假阴性的结果^[3]。

临床上膀胱癌治疗以手术治疗为主，放化疗及生物治疗为辅。根据组织病理学形态及临床表现，膀胱癌可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌。非浸润性膀胱癌占新诊病例的70-80％，主要经尿道膀胱肿瘤切除术或激光手术进行治疗。浸润性膀胱癌临床上常采用膀胱部分切除术和根治性膀胱切除术进行治疗，病人预后不佳，五年生存率仅为20-40％^[4,5]。尽管经过手术切除和系统性治疗，超过50％肌层浸润性肿瘤患者将发生转移^[6,7]。转移性膀胱癌预后非常差，95％的晚期疾病患者的治疗失败，5年生存率只有6％^[8]。除手术治疗外，临床上也采用放射、化疗和生物治疗等手段方法对膀胱癌进行综合治疗，但膀胱癌对放化疗不敏感^[9]。总之，随着科技的进步，膀胱癌诊疗水平虽然有了很大的进步，但是在过去的20年中，转移性膀胱癌的总生存期并没有得到改善。

研究表明，膀胱癌的发生发展是一个复杂的、可能由不同的基因和信号通路控制的过程，其涉及到相关癌基因的激活、抑癌基因的表达缺失、DNA错配修复基因异常及其所处的环境中复杂的信号通路，这些信号通路的激活及相互作用介导了肿瘤的侵袭转移^[10]。近年来，使用高通量测序技术，癌症基因组图谱项目和国外一些团队已发现了一些新的与膀胱癌发生相关的突变基因及相关信号通路^[11-15]。本课题组使用基因组测序技术分析膀胱癌的外显子，发现染色质重塑相关基因在膀胱癌组织中的突变率高达59％^[16]，且膀胱癌中姐妹染色单体粘连及分离相关基因也频发突变^[13]。这些新的膀胱癌相关基因的不断发现与报道说明，人们对膀胱癌发生发展的分子机制研究还不完全，还有新的与膀胱癌相关的基因尚未被发现与报道^[10]。因此，寻找和发现新的与膀胱癌发生相关的基因，对膀胱癌侵袭转移机制深入探索，将有助于了解膀胱癌转移过程和识别有效的治疗靶标，实现从膀胱癌基础研究到临床应用的转化，具有重大的临床意义和社会意义。

C8orf84基因，即8号染色体开放阅读框84(Chromosome 8 open reading frame84)，又称SBSPO基因(生长调节素B和血小板反应蛋白1型结构域 (Somatomedin B andthrombospondin,type 1 domain containing)或RPESP基因 (RPE-spondin)，属于THBS(血小板反应蛋白)基因家族，位于染色体8q21.11，长约59Kb，共有5个外显子。该基因编码2个转录本NM_153225.3和 XM_005251178.1^[17,18]，其中NM_153225.3编码长度为264个氨基酸、分子量为 29.6kDa的蛋白质，为主要转录本。该转录本及其编码蛋白在人、猩猩、狗、小鼠和大鼠等哺乳动物之间具有高度同源性。生物信息学分析显示，在结构上， C8orf84蛋白包含生长调节素B结构域和血小板反应蛋白I型结构域。研究证实， THBS基因家族的表达异常与多种疾病有关^[19-21]，多个含THBS结构域的蛋白在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用^[22,23]。

发明内容

本发明人在研究中发现，C8orf84基因在膀胱癌组织和细胞中的表达下调，C8orf84基因低表达是一个独立的膀胱癌患者预后不良的风险因子。基于上述发现，本发明人开发了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供C8orf84基因，其全长mRNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中编码区如SEQ ID NO:2所示。

在第二方面，本发明提供C8orf84蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在第三方面，本发明提供用于特异性扩增C8orf84基因的部分mRNA序列或其编码区的引物对，其包括正向引物和反向引物。在本发明的一个具体实施方案中，正向引物为5’-CGGGCACACCTATGTTCCTG-3’(SEQ ID NO:4)，反向引物为5’-TCCATACAGTATCCAGCATCCTCT-3’(SEQ ID NO:5)。

在第四方面，本发明提供第一方面的C8orf84基因用于制备治疗膀胱癌的药物组合物的用途。

在第五方面，本发明提供第二方面的C8orf84蛋白用于制备治疗膀胱癌的药物组合物的用途。

在第六方面，本发明提供第三方面的引物对用于制备膀胱癌检测试剂盒的用途。

在第七方面，本发明提供一种治疗膀胱癌的药物组合物，其包含本发明第一方面的C8orf84基因。该药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的介质，例如脂质体。该药物组合物可以例如通过基因疗法手段导入膀胱癌患者的膀胱组织并在其中表达，提高其中的C8orf84蛋白水平，以治疗膀胱癌。

在第八方面，本发明提供一种治疗膀胱癌的药物组合物，其包含本发明第二方面的C8orf84蛋白。该药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的介质，例如注射用水或赋形剂。该药物组合物可以例如通过注射给药手段给予膀胱癌患者的膀胱组织，提高其中的C8orf84蛋白水平，以治疗膀胱癌。

在第九方面，本发明提供一种膀胱癌检测试剂盒，其包含本发明第三方面的引物对。该检测试剂盒还可以包含常用的引物扩增试剂，如DNA聚合酶、 dNTP、Mg²⁺、缓冲液。该检测试剂盒可用于C8orf84基因mRNA的特异性扩增以用于膀胱癌的检测，例如通过比较怀疑患有膀胱癌的受试者的膀胱组织与正常受试者的膀胱组织的C8orf84基因mRNA表达水平，来检测怀疑患有膀胱癌的受试者是否确实患有膀胱癌。

本发明的有益效果：

本发明人发现了C8orf84基因在膀胱癌组织和细胞中的表达下调，C8orf84 基因低表达是一个独立的膀胱癌患者预后不良的风险因子。C8orf84基因是膀胱癌的治疗靶标，可通过基因疗法向膀胱癌患者体内导入C8orf84基因，或者向膀胱癌患者体内给予C8orf84蛋白，有望治疗膀胱癌。特异性扩增C8orf84基因 mRNA的引物对可以用于膀胱癌的检测。

附图说明

图1显示膀胱癌组织中的C8orf84基因表达下调；

图2显示体外C8orf84d基因异位表达抑制了膀胱癌细胞增殖、克隆形成并诱导了细胞凋亡和细胞周期阻滞；

图3显示体外C8orf84d基因异位表达抑制了膀胱癌细胞迁移和侵袭；

图4显示体外沉默C8orf84基因表达促进了膀胱癌细胞增殖和克隆形成并抑制了细胞凋亡；

图5显示C8orf84蛋白与HSPA5和DNAJC10相互作用；

图6显示C8orf84蛋白对未折叠蛋白信号途径的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施方式并结合附图对本发明作进一步详细说明。

一、材料与方法

(1)研究对象与样品采集

2011年3月至2015年9月，在深圳市第二人民医院通过组织活检从确诊患有膀胱癌的患者获得了手术切除的膀胱癌组织和配对癌旁正常组织。从患者获得了知情同意书。膀胱癌的所有诊断均经组织病理学证实。从病历和病理报告中收集临床病理特征(包括年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、分化、组织学分期、肿瘤侵袭和淋巴结转移)的数据。根据美国癌症联合委员会分期手册评估膀胱癌的阶段。根据国家综合癌症网络(NCCN)指南进行随访。

(2)抗体与试剂

抗以下蛋白的抗体获自Santa Cruz Biotechnology Inc.：E-钙粘蛋白(目录号31020)、N-钙粘蛋白(目录号7939)、波形蛋白(目录号7557)、MEK(目录号436)、p-MEK(目录号7995)和DNAJC10(目录号100713)；抗以下蛋白的抗体获自Cell Signaling Technology：Akt(目录号9272)、p-Akt(Ser 473，目录号4060)、Snail(目录号3879)、P27(目录号3686)、P21(目录号2947)、 CyclinD1(目录号2978)、Chop(目录号2895)、PERK(目录号5683)、IRE1α(目录号3294)和ATF4(目录号11815)；抗以下蛋白的抗体获自Abcam： HSPA5(目录号21685)、β-肌动蛋白(目录号8227)；抗以下蛋白的抗体购自 Sigma-Aldrich：C8orf84(目录号029595)、Flag(目录号7425)、Myc-标签(目录号2276)购自proteintech。Zo-1(目录号sc-33725)和β-微管蛋白(目录号 sc-58886)购自Santa Cruz Biotechnology。

(3)免疫印迹和免疫沉淀

通过10％SDS-PAGE分离来自每个样品的60微克总蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore)上。封闭后，将膜与指定的特异性一抗孵育，然后洗涤并与HRP缀合的二抗孵育。使用增强的化学发光检测试剂盒(Tiangen Biotech)和图像分析仪ImageQuant LAS4000(GE Healthcare)使免疫反应蛋白可视化。对于免疫沉淀测定，将来自5×10⁶个细胞的细胞裂解物与1μg抗体在4℃下孵育过夜，然后加入30μl蛋白A/G缀合的琼脂糖珠粒(sigma-aldrich)，该琼脂糖珠粒用裂解缓冲液预洗涤4次。用免疫沉淀洗涤缓冲液(150mM NaCl、10mM HEPES,pH 7.4和0.1％Nonidet P-40)洗涤含有亲和结合蛋白的珠粒6次。将珠粒煮沸并离心。通过SDS-PAGE分离蛋白质并进行考马斯蓝染色后，对C8orf84相互作用条带进行质谱肽序列分析。

(4)异种移植肿瘤测定

从北京维通利华实验动物技术有限公司 (Beijing Vital River LaboratoryAnimal Technology Co.,Ltd.)购得总共30只5周龄、体重16-19克的雄性裸鼠(BALB/c-nu)。如下用Matrigel(BD Biosciences，目录号354234)注射细胞：T24(5*10⁶个细胞，50％Matrigel)或5637(5*10⁶个细胞，50％Matrigel)悬浮于100μl PBS中。然后在移植后14或21天(对于 T24细胞)或28天(对于5637细胞)处死免疫缺陷小鼠。对含有移植细胞的区域进行测量、称重并处理以进行IHC分析。通过游标卡尺测量肿瘤大小，并使用体积＝(长度*宽度²)*/6的公式计算肿瘤体积。

(5)免疫组织化学

由Alenabio Biotechnologies Co,Ltd.(中国陕西省西安市)提供了总共80个膀胱癌标本和配对的邻近正常膀胱组织标本。由Shanghai outdo biotech(中国) 提供了另一43个膀胱癌组织标本的组织微阵列。根据美国癌症联合委员会标准确定肿瘤分期。在研究之前从每位患者获得知情同意书。这些患者均未接受术前化疗和/或放射治疗。将石蜡包埋的切片在二甲苯中脱石蜡，以递降百分比的乙醇再水化，并在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中加热进行抗原回收。洗涤步骤后，用3.0％过氧化氢和10％山羊血清封闭载玻片，并与兔C8orf84抗体(1:500； Abcam，美国马萨诸塞州)在4℃温育过夜。应用抗兔辣根过氧化物酶缀合的二抗(Santa Cruz Biotechnology)。在与链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶复合物和二氨基联苯胺(DAB)连续温育后，将载玻片用苏木精复染，脱水并固定。最后，在光学显微镜下观察切片并成像。

由对患者状态不知情的经验丰富且独立的病理学家评估载玻片。将染色强度按0至3评分。染色的异质性按0至4评分，取决于阳性染色的肿瘤细胞的百分比。为了获得考虑IHC信号强度和阳性细胞频率的IHC评分，我们生成了全范围为0至12的复合表达评分(CES)。根据ROC分析，小于或等于7的CES 被认为是低C8orf84表达。

(6)免疫荧光和共聚焦显微术

将铺在玻璃盖玻片上的细胞在室温下在4％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟，并用0.1％Triton X-100/PBS在冰上透化5分钟。一抗孵育在4℃下进行过夜。用PBS洗涤盖玻片三次，然后与Alexa fluor二抗(1比500)(Life Technologies) 孵育。使用以下二抗缀合物实现结合一抗的免疫荧光检测：驴抗兔IgG-Alexa Fluor 594、山羊抗小鼠IgG AlexaFluor 488、链霉抗生物素蛋白-Alexa Fluor 488、链霉抗生物素蛋白-Alexa Fluor 568和抗羊IgG Alexa Fluor 594(均来自Invitrogen Molecular Probes)和山羊抗鸡IgY-DyLight 488(Abcam，ab96947)。用DAPI(Life Technologies)使细胞核可视化。使用Nikon90i显微镜(采用NIS元件软件)、Leica DM IRBE显微镜(采用Simple PCI6软件)或ZeissLSM780共聚焦显微镜(采用Zeiss ZEN2011软件)对载玻片成像。

(7)细胞系、慢病毒载体构建和稳定的细胞系

所有的人膀胱癌细胞系(SW780、T24、5637、UMUC3和TCCSUP)均获自ATCC，在补充有10％胎牛血清(FBS；Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基中常规培养。将细胞在37℃、5％CO₂下在潮湿的培养箱中生长。单独的慢病毒质粒pLVX-EGFP-3FLAG或具有C8orf84 cDNA的载体由Genechem(中国上海) 构建。通过DNA测序和PCR技术验证C8orf84基因cDNA。使用具有低可检测的C8orf84的T24细胞和5637细胞，根据制造商的说明，通过慢病毒感染产生稳定的细胞。还感染了相同量的阴性对照载体。12小时后，用新鲜的完全培养基替换含病毒的培养基。感染72小时后，向培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素 (Calbiochem)以选择稳定的细胞。通过荧光显微镜观察到稳定细胞系中GFP的荧光达到100％以上。通过qPCR和蛋白质印迹评估稳定细胞中的表达水平。

(8)siRNA转染

使用lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)在6孔板中用siRNA寡核苷酸转染SW780细胞和UMUC3细胞48小时。每个孔含有3×10⁵个细胞、5μl siRNA、5μl lipoRNAiMAX和500μl optiMEM (Invitrogen)。C8orf84 siRNA、HAPA5siRNA和乱序对照siRNA均由 (Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)合成。如qPCR所证实，我们基于最高的敲低效率从三个候选物中选择了一个siRNA序列。使用了以下靶序列：人C8orf84：GACAGAGTCCTTGACTCCTCACTGT；HSPA5： CGAGTGACAGCTGAAGACAAGGGTA。

(9)逆转录和定量实时PCR(qPCR)

使用TRIZOL Reagent(Invitrogen)，根据制造商的说明，提取细胞和组织的 RNA。用具有gDNA去除剂的Revertra Ace qPCR RT master mix(TOYOBO，日本)进行逆转录。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO，日本)，按以下条件进行qPCR：95℃10分钟；95℃15秒，50个循环；60℃1min。将 PCR产物用1％琼脂糖凝胶分离，并使用Quantity-One软件(Bio-rad，美国加州)定量相对的C8orf84表达水平。在每个qPCR测定中，进行编码β-肌动蛋白的持家基因的扩增，作为内部对照。qPCR一式三份进行，包括无模板对照。通过扩增后的解链曲线分析确认合适产物的扩增。使用比较循环阈值(CT)(2^-△△CT) 方法计算C8orf84的相对表达，以β-肌动蛋白作为内源对照以使数据归一化。使用Student t检验进行qPCR结果的统计学分析。本研究中使用的PCR正向和反向引物如下：人C8orf84，5'-CGGGCACACCTATGTTCCTG-3'(SEQ ID NO:4) 和5'-TCCATACAGTATCCAGCATCCTCT-3'(SEQ IDNO:5)；人HSPA5， 5'-CATCACGCCGTCCTATGTCG-3'和5'-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3’；人β-肌动蛋白，5'-TGAAGATCAAGATCATTGCTCCTC-3'和 5'-AACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAG-3’。

(10)细胞活力测定

用Cell Counting Kit 8(CCK-8；Dojindo Molecular Technologies，Inc.，Kumamoto，日本)进行比色测定以测定细胞增殖能力。将细胞接种到96孔板 (5x10³个细胞/孔)上。随后，在指定的时间点(1、2、3、4、5天)向每个孔中加入10μl CCK-8，并将板在37℃下孵育2小时。使用Multiskan Go(Thermo scientific，美国马萨诸塞州)在450nm下测量数据。

(11)集落形成测定

将SW780细胞、UMUC3细胞、T24细胞和5637细胞以2×10⁴个细胞/孔的密度接种在6孔板中。培养8天后，用4％聚甲醛固定细胞，用0.5％结晶紫溶液染色。计数每个集落具有超过50个细胞的集落。所有实验一式三份进行三次。

(12)细胞迁移和侵袭测定

使用具有包含matrigel涂覆膜的8.0微米孔径膜(BD Bioscience，美国马萨诸塞州)室的24-Multiwell插入板进行细胞侵袭测定。通过将细胞悬浮在无血清 DMEM中并将其添加到顶室中来制备细胞。将密度为40,000个细胞/100μl DMEM培养基的细胞置于transwell板的上室中，并将含有20％FBS的700μl DMEM培养基置于底室中以更好地让细胞接触。将板在37℃、5％CO₂气氛下孵育48小时后，用DAPI对侵入细胞进行染色并使用荧光显微镜计数。细胞迁移测定除没有使用matrigel外，按同样的方法进行。实验独立重复三次。

(13)伤口愈合分析

将细胞以5×10⁵个细胞/孔的密度接种在6孔板中并培养直至它们达到完全汇合。用移液管尖端刮擦细胞并用PBS缓冲液洗涤。在培养的第0、12和24小时在预标记点中拍摄照片用于比较。计数迁移到伤口区域中的细胞数。

(14)细胞周期和细胞凋亡测定

使用细胞周期染色溶液(BD Biosciences)对细胞进行染色并通过流式细胞术进行分析。通过离心沉淀大约2×10⁵个细胞并用PBS洗涤。在-20℃下将冷的75％乙醇(1ml)加入细胞中过夜。弃去乙醇，加入PBS使细胞再水化15分钟。在室温下将细胞与1ml DNA染色溶液一起温育，然后通过FACS Calibur(BD Biosciences，Flanklin Lakes，美国新泽西州)进行分选。使用ModFit 3.0软件 (Verity Software House，Topsham，美国缅因州)分析结果。使用PE Annexin V 凋亡检测试剂盒(BD Biosciences)检测细胞凋亡。离心收集细胞(1×10⁵个)并重悬于500μl的1×结合缓冲液中。加入5μl PE Annexin V和5μl 7-AAD，将细胞在室温下避光孵育15分钟，然后使用流式细胞术检查。

(15)统计分析

使用SPSS统计软件包(版本16.0；SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥)进行统计学分析。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。使用配对t检验、非配对Student t检验或Mann-Whitney U检验来比较各组之间的差异。使用Kaplan-Meier方法计算总体存活和无复发存活的累积概率；使用log-rank检验来评估其统计学意义。进行Cox比例风险模型单变量和多变量分析，以评估C8orf84表达与临床病理参数之间的关联对总体存活率的影响。所有实验重复至少3次，结果以平均值±SD表示。在所有分析中，概率(P)≤0.05被认为具有统计学意义。

二、结果与讨论

(1)C8orf84基因在膀胱癌组织和细胞中表达下调

本课题组前期通过分析22对膀胱癌组织及癌旁正常组织的转录组，发现与癌旁正常组织相比，C8orf84基因在癌组织中的表达显著下调(P<0.001)。我们发现C8orf84基因在肾癌细胞株中的表达也下调(图1a)。另外21对膀胱癌组织及癌旁正常组织中C8orf84基因mRNA表达水平也证实该结论(图1b)。分析 TCAG(The Cancer Genome Atlas)膀胱癌转录组数据库也发现，膀胱癌组织中的 C8orf84基因mRNA表达水平显著低于正常组织(图1c)。蛋白免疫印迹和免疫组化分析也证实C8orf84基因在肿瘤组织中表达明显降低(图1b和d)。免疫组化分析显示，C8orf84基因的表达水平与肿瘤分级(p＝0.018)和淋巴结转移 (p＝0.007)具有相关性，与患者的年龄、性别、临床分期无明显相关性(表1)。此外，C8orf84基因低表达是一个独立的膀胱癌患者预后不良的风险因子(图1e)。

表1.C8orf84基因表达与膀胱癌患者的临床病理学特征的相关性

(2)C8orf84基因在膀胱癌中的生物学功能

为了检测C8orf84基因在膀胱癌中的生物学功能，我们构建了稳定表达 C8orf84基因的T24和5637细胞株(图2a)。结果显示，过表达C8orf84基因可以抑制肿瘤细胞生长(图2b)，并抑制细胞克隆形成能力(图2c)。采用流式细胞术进行检测发现，过表达C8orf84基因能显著增加膀胱癌细胞T24和5637的凋亡(图2d)，并导致G0/G1期细胞周期阻滞进而影响细胞增殖(图2e)。

为了探索C8orf84基因发挥功能的分子机制，我们研究了过表达C8orf84基因对几条肿瘤相关信号通路的影响。结果发现，过表达C8orf84基因导致p-MEK、 p-ERK、p-AKT有显著的下调(图2f)。此外，G1期门控蛋白p27和p21表达水平增高(图2g)。因此，C8orf84基因可能通过抑制MEK/ERK和AKT通路发挥抑制膀胱癌发生发展的作用。

进一步，我们通过Transwell小孔实验发现过表达C8orf84基因显著降低了膀胱癌细胞的侵袭和转移能力(图3a和b)。我们进一步通过细胞划痕证实了 C8orf84基因抑制膀胱癌细胞的迁移。EMT在肿瘤的侵袭和转移中起重要作用，我们探索了过表达C8orf84基因对EMT标志物的影响。结果发现，过表达C8orf84 基因后膀胱癌细胞中的上皮标志物E-cadherin表达量显著升高，而间质标志物 N-cadherin和Vimentin表达量则下降(图3c)。此外，过表达C8orf84基因抑制了膀胱癌细胞中EMT相关转录因子Zo-1和Snail(图3d)。

最后，我们探索了沉默C8orf84基因表达对膀胱癌细胞生物学功能的影响 (图4a)。我们发现，沉默C8orf84基因表达促进了膀胱癌细胞生长(图4b)，增加了细胞克隆形成能力(图4c)，促进了膀胱癌细胞从G1期进入S期(图4d)，抑制了膀胱癌细胞凋亡(图4e)。此外，Transwell实验也显示，沉默C8orf84基因表达促进了膀胱癌细胞的迁移和侵袭(图4f)。

(3)C8orf84蛋白通过结合HSPA5抑制HSPA5对PI3K的激活，从而抑制肿瘤的发生和转移

我们通过免疫共沉淀和质谱筛选出C8orf84蛋白的相互作用蛋白HSPA5和DNAJ10，结果为免疫共沉淀所证实(图5a,c,d)。免疫荧光则证实了C8orf84 蛋白定位于包浆，进一步发现C8orf84蛋白与HSPA5共定位内质网(图5b)。我们进一步发现了HSPA5的ATPase结构域与C8orf84蛋白的生长调节素B结构域相互作用(图5e-g)。

HSPA5是未折叠蛋白应答的关键性调控分子，其能结合PERK、IRE1α、ATF6 的内质网分子，维持Perk-eIF2α-ATF4、IRE1α-XBP1s和ATF6三条信号通路处于非活化状态。考虑到C8orf84与HSPA5的相互作用，我们采用蛋白印迹分析验证了过表达C8orf84基因后未折叠蛋白应答及其相关信号通路的变化。结果发现，过表达C8orf84基因的膀胱癌细胞中PERK、IRE1α、ATF6和CHOP蛋白表达水平均比空白载体对照组增高(图6)。这说明过表达的C8orf84蛋白可能可通过与HSPA5相互作用导致未折叠蛋白应答的激活。

由以上结果可见，C8orf84基因在膀胱癌组织和细胞中的表达下调，C8orf84 基因低表达是一个独立的膀胱癌患者预后不良的风险因子。C8orf84基因是膀胱癌的治疗靶标，可通过基因疗法向膀胱癌患者体内导入C8orf84基因，或者向膀胱癌患者体内给予C8orf84蛋白，有望治疗膀胱癌。

参考文献：

[1]Chen W,Zheng R,Baade PD,Zhang S,Zeng H,Bray F,Jemal A,Yu XQ,He J:Cancer statistics in China, 2015.CA:a cancer journal for clinicians 2016,66(2):115-132.

[2]Siegel RL,Miller KD,Jemal A:Cancer statistics,2016.CA:A CancerJournal for Clinicians 2016, 66(1):7-30.

[3]Thoma C:Bladder cancer:Noninvasive diagnosis and detection ofrecurrence.Nature reviews Urology 2016,13(5):240-241.

[4]Jacobs BL,Lee CT,Montie JE:Bladder cancer in 2010:how far have wecome？CA:a cancer journal for clinicians 2010,60(4):244-272.

[5]Ploeg M,Aben KK,Kiemeney LA:The present and future burden ofurinary bladder cancer in the world. World journal of urology 2009,27(3):289-293.

[6]Williams SG,Stein JP:Molecular pathways in bladdercancer.Urological research 2004,32(6):373-385.

[7]Rink M,Lee DJ,Kent M,Xylinas E,Fritsche HM,Babjuk M,Brisuda A,Hansen J,Green DA,Aziz A et al: Predictors of cancer-specific mortality afterdisease recurrence following radical cystectomy.BJU international 2012.

[8]Lei AQ,Cheng L,Pan CX:Current treatment of metastatic bladdercancer and future directions.Expert review of anticancer therapy 2011,11(12):1851-1862.

[9]Milowsky MI,Rumble RB,Booth CM,Gilligan T,Eapen LJ,Hauke RJ,Boumansour P,Lee CT:Guideline on Muscle-Invasive and Metastatic BladderCancer(European Association of Urology Guideline): American Society ofClinical Oncology Clinical Practice Guideline Endorsement.Journal of clinicaloncology:official journal of the American Society of Clinical Oncology 2016,34(16):1945-1952.

[10]Yao D,Dai C,Peng S:Mechanism of the mesenchymal-epithelialtransition and its relationship with metastatic tumor formation.Molecularcancer research:MCR 2011,9(12):1608-1620.

[11]Research TCGA:Comprehensive molecular characterization ofurothelial bladder carcinoma.Nature 2014.

[12]Solomon DA,Kim JS,Bondaruk J,Shariat SF,Wang ZF,Elkahloun AG,Ozawa T,Gerard J,Zhuang D,Zhang S et al:Frequent truncating mutations ofSTAG2in bladder cancer.Nature genetics 2013, 45(12):1428-1430.

[13]Guo G,Sun X,Chen C,Wu S,Huang P,Li Z,Dean M,Huang Y,Jia W,Zhou Qet al:Whole-genome and whole-exome sequencing of bladder cancer identifiesfrequent alterations in genes involved in sister chromatid cohesion andsegregation.Nature genetics 2013,45(12):1459-1463.

[14]Balbas-Martinez C,Sagrera A,Carrillo-de-Santa-Pau E,Earl J,Marquez M,Vazquez M,Lapi E,Castro-Giner F,Beltran S,Bayes M et al:Recurrentinactivation of STAG2in bladder cancer is not associated withaneuploidy.Nature genetics 2013,45(12):1464-1469.

[15]Cancer Genome Atlas Research N:Comprehensive molecularcharacterization of urothelial bladder carcinoma.Nature 2014,507(7492):315-322.

[16]Gui Y,Guo G,Huang Y,Hu X,Tang A,Gao S,Wu R,Chen C,Li X,Zhou L etal:Frequent mutations of chromatin remodeling genes in transitional cellcarcinoma of the bladder.Nature genetics 2011, 43(9):875-878.

[17]Wistow G,Bernstein SL,Wyatt MK,Fariss RN,Behal A,Touchman JW,Bouffard G,Smith D,Peterson K: Expressed sequence tag analysis of human RPE/choroid for the NEIBank Project:over 6000 non-redundant transcripts,novelgenes and splice variants.Molecular vision 2002,8:205-220.

[18]Ota T,Suzuki Y,Nishikawa T,Otsuki T,Sugiyama T,Irie R,WakamatsuA,Hayashi K,Sato H,Nagai K et al: Complete sequencing and characterization of21,243full-length human cDNAs.Nature genetics 2004, 36(1):40-45.

[19]Davis PJ,Sudha T,Lin HY,Mousa SA:Thyroid Hormone,Hormone Analogs,and Angiogenesis. Comprehensive Physiology 2015,6(1):353-362.

[20]Reinecke IR,Weber CF,Budde U,Seifried E,Miesbach WA:Prospectiveevaluation of ADAMTS-13 and von Willebrand factor multimers in cardiacsurgery.Blood coagulation&fibrinolysis:an international journal inhaemostasis and thrombosis 2016,27(8):886-891.

[21]Stein JJ,Iwuchukwu C,Maier KG,Gahtan V:Thrombospondin-1-inducedsmooth muscle cell chemotaxis and proliferation are dependent on transforminggrowth factor-beta2and hyaluronic acid synthase. Molecular and cellularbiochemistry 2013,384(1-2):181-186.

[22]Koskimaki JE,Karagiannis ED,Rosca EV,Vesuna F,Winnard PT,Jr.,Raman V,Bhujwalla ZM,Popel AS: Peptides derived from type IV collagen,CXCchemokines,and thrombospondin-1domain-containing proteins inhibitneovascularization and suppress tumor growth in MDA-MB-231breast cancerxenografts.Neoplasia 2009,11(12):1285-1291.

[23]Wang CH,Su PT,Du XY,Kuo MW,Lin CY,Yang CC,Chan HS,Chang SJ,Kuo C,Seo K et al: Thrombospondin type I domain containing 7A(THSD7A)mediatesendothelial cell migration and tube formation.Journal of cellular physiology2010,222(3):685-694.

以上应用了具体实例对本发明进行了阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。本发明所属技术领域的技术人员依据本发明的构思，还可以做出若干简单推演、变形或替换。这些推演、变形或替换方案也落入本发明的权利要求范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第二人民医院

<120> C8orf84基因、C8orf84蛋白及其应用

<130> 19I20032

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3698

<212> RNA

<213> C8orf84基因全长mRNA序列

<400> 1

gtgcctcgcc ggccgctcgg gcagctcccg ggccgcggcc agccgaggat cagagcgctt 60

gccccggggg tctgtcgcgt cgcaggcgcc gccggagccc tggccatgag gaccctgtgg 120

atggcgctgt gcgcgctgtc gcggctgtgg cccggggccc aggccggctg cgccgaggcc 180

gggcgctgct gtcccggccg ggaccccgcc tgcttcgccc gcggctggag gctggacagg 240

gtctacggga cgtgtttctg cgaccaagcc tgtcgcttca ccggggactg ctgcttcgac 300

tacgacaggg cgtgcccagc tcgcccgtgc ttcgtggggg aatggagccc ctggagtggt 360

tgtgcagacc agtgcaagcc tacaacccgt gtgcggaggc gctcggtgca gcaggagcct 420

cagaacggcg gggcgccctg cccacccctg gaagagagag ctggctgcct ggagtactcc 480

accccgcagg gccaggactg cgggcacacc tatgttcctg cctttataac tacctctgca 540

ttcaacaagg agagaacacg acaagctacg tctccacact ggtctacaca cacagaggat 600

gctggatact gtatggagtt taagacagag tccttgactc ctcactgtgc tctggaaaac 660

tggcccttga ctagatggat gcagtatctc cgagagggat acacggtgtg tgtggattgt 720

cagcctccag ctatgaactc tgtgagcctt cgttgttctg gagatggcct ggactccgat 780

ggaaatcaga ctctccattg gcaagcaatt ggtaatcctc ggtgtcaagg aacttggaaa 840

aaagttcggc gagtagacca gtgttcttgt ccagctgttc acagttttat ttttatatag 900

atggtgatat aaatatttcc aaatgcattt gtaaacattc taaatattct caagtcatgt 960

tcaatgtttc ctaaaccttc aattttggcc aaagtcccca aacacatcat tgccacactc 1020

tgaagtagag aaagaaaatt taggggccag ttctcaagga acacaggtcc tttattttta 1080

ttttaactaa gttgaagacc cactcaaaaa gctcttgtgg ttttatgttc ttgacctttc 1140

aactggagtc ctctcattca gcaggtggcc cgtgagacac agaatacatg tctgtttgct 1200

aaagtaaaat tactgtaact cagtccgatt attggtgacg gaagtgtcat ttaaggggat 1260

ctatgttttg aaccttgcag tctattttat aatcttttaa aagtttctca ctttaaaaca 1320

tgtatacagg tatgcacact ctacacatat atttccatat atttaatatt ccataaattc 1380

tgaaataatt tcaagcaaat tatcacaaat aatttttcca cagggcaaat tatttaaaat 1440

tttagtaagc attctgtaat gaaaaaccaa gttatactaa aaacattttt tgaagaagaa 1500

attttttttt tgcttaagaa gtgaaaggat caaatgctca ttgtaggtca atgggagttc 1560

ttttaaatgt tataattttc atgaaaagaa atgttgacac cagtgaatga aacaattgct 1620

ttcattctga aaattctacc accatttgca tctaagatta tttccaaggc ttaaagcctg 1680

aagctgaata aaataatctt tcagagtcca gcttcaagtt tagttgatgt aagctcacta 1740

tttttttcct accgcatgca ttttctaatg tttggggtgg atggtgtgtc ggttatggaa 1800

ggcatagacg tcattacagg tgctacgatc tcacacacac acaaggaaat gttagtctcc 1860

ttattttatg attggaaaat caatgaccta gaggcaaaat ggcatgttta aggacctggg 1920

atgacaagtc attctgcagt cagccacaga gccaaatttg gactcctcaa ccagaactcc 1980

atgaaaagcc tgactttgcc aaacactgtg ctggaaaagc taagcccctt tcatttgtga 2040

agtaaatttt aaattcaaga tatttagttt agagaattga gtcttgagat gtaaactaca 2100

tgagatttct ttggtttcaa ttgaataata ttcactaaca aatgatttac taaaatacgt 2160

atttcttggt ccttatcatg taatgacaga ttcacaacag caataaggat ggagatttcc 2220

ccaataatta ataacaccga gagtagcaat attttttact gtattttcat ttaattgtca 2280

aagttgtttt tgtggaaaat taaattcttc agaaattaat aataaaatat gtgagtctca 2340

tcaaggctag caactttaag tcagtattaa cattttcata ctgtttctaa catttattaa 2400

gctagatttt tgaagctatg tctgggtaat ttccaatgtt acttaaaagt ttttttttct 2460

ttgagacaga gtctcactct gttgcccagg ctggagtgca gtggccccat ctcggctcac 2520

tgcaagctcc gcctcccggg ttcacgccat tcttctgcct cagcctccca agtagctggg 2580

actacaggcg ccgtcatcac gcctggctaa ttttttgttt ttttttttta gtagagacag 2640

ggtttcactg tgttagccag ggtggtctcg atctcctgac ctcgtgatcc acccacctcg 2700

gcctcccaag gtgctgggat tatgggcgtg agccactgcg cctggcctgt tacttaaaat 2760

ttttatacta gtaaataaac tttttgttca catttataaa agctctatat ttgtttgact 2820

agaaaataac ccaaattttc tggaccagtc agagaatgat aaaatttcac caaaaataaa 2880

acaaaaaaat ccttcagaac tgataggtat aggtacaaca actactaata gcaataaagc 2940

aatggtgctt ttatagttcc gatatgtgtt ataacattta acataattga ggtgtataaa 3000

ataaattttt caccttatgc atttaatttt tggtggatga ccagtaattg ctttcttatt 3060

gaagttaaat ttttgttatt tctattcttg agaaaatttt atgggctaga ggagttaact 3120

gttaaataac agttttgaaa agcttgttat taattttagc aaagcccaag ggaaatagtt 3180

cagaactgaa acatgtagtc caagtgatga atgaaaaacc aaaagttttt attttcaaat 3240

ttaaaaatca aagtatataa gacctcttgg cactcttttt taataagtac cttagtctta 3300

gggccctatc cccaggcact ctaaaaagat ttacgaactc taaaatccct taatagactg 3360

attttcaaaa gtgctcatgg aaaataattc gaacaaaaat aaatacagcc accaggaaag 3420

aagggaaaag aagcaaggga taatggccat ttttgaagag aaaagtgaaa aacaagtgaa 3480

ggaaaaaaag aatagaaaaa ggaataaggt aactataatc acagtattct ttttggagtt 3540

ttgctttggt ttttattcga gaatgttaca attaagcata aaccgcaaca gcaataattt 3600

aaagtgtttg gttatcatct ggcataaaaa tttcagttag ctatcttttc tagatgtgca 3660

caaaattgat gttaataaaa ctggttcctg ccctctaa 3698

<210> 2

<211> 795

<212> RNA

<213> C8orf84基因mRNA编码区

<400> 2

atgaggaccc tgtggatggc gctgtgcgcg ctgtcgcggc tgtggcccgg ggcccaggcc 60

ggctgcgccg aggccgggcg ctgctgtccc ggccgggacc ccgcctgctt cgcccgcggc 120

tggaggctgg acagggtcta cgggacgtgt ttctgcgacc aagcctgtcg cttcaccggg 180

gactgctgct tcgactacga cagggcgtgc ccagctcgcc cgtgcttcgt gggggaatgg 240

agcccctgga gtggttgtgc agaccagtgc aagcctacaa cccgtgtgcg gaggcgctcg 300

gtgcagcagg agcctcagaa cggcggggcg ccctgcccac ccctggaaga gagagctggc 360

tgcctggagt actccacccc gcagggccag gactgcgggc acacctatgt tcctgccttt 420

ataactacct ctgcattcaa caaggagaga acacgacaag ctacgtctcc acactggtct 480

acacacacag aggatgctgg atactgtatg gagtttaaga cagagtcctt gactcctcac 540

tgtgctctgg aaaactggcc cttgactaga tggatgcagt atctccgaga gggatacacg 600

gtgtgtgtgg attgtcagcc tccagctatg aactctgtga gccttcgttg ttctggagat 660

ggcctggact ccgatggaaa tcagactctc cattggcaag caattggtaa tcctcggtgt 720

caaggaactt ggaaaaaagt tcggcgagta gaccagtgtt cttgtccagc tgttcacagt 780

tttattttta tatag 795

<210> 3

<211> 264

<212> PRT

<213> C8orf84蛋白氨基酸序列

<400> 3

Met Arg Thr Leu Trp Met Ala Leu Cys Ala Leu Ser Arg Leu Trp Pro

1 5 10 15

Gly Ala Gln Ala Gly Cys Ala Glu Ala Gly Arg Cys Cys Pro Gly Arg

20 25 30

Asp Pro Ala Cys Phe Ala Arg Gly Trp Arg Leu Asp Arg Val Tyr Gly

35 40 45

Thr Cys Phe Cys Asp Gln Ala Cys Arg Phe Thr Gly Asp Cys Cys Phe

50 55 60

Asp Tyr Asp Arg Ala Cys Pro Ala Arg Pro Cys Phe Val Gly Glu Trp

65 70 75 80

Ser Pro Trp Ser Gly Cys Ala Asp Gln Cys Lys Pro Thr Thr Arg Val

85 90 95

Arg Arg Arg Ser Val Gln Gln Glu Pro Gln Asn Gly Gly Ala Pro Cys

100 105 110

Pro Pro Leu Glu Glu Arg Ala Gly Cys Leu Glu Tyr Ser Thr Pro Gln

115 120 125

Gly Gln Asp Cys Gly His Thr Tyr Val Pro Ala Phe Ile Thr Thr Ser

130 135 140

Ala Phe Asn Lys Glu Arg Thr Arg Gln Ala Thr Ser Pro His Trp Ser

145 150 155 160

Thr His Thr Glu Asp Ala Gly Tyr Cys Met Glu Phe Lys Thr Glu Ser

165 170 175

Leu Thr Pro His Cys Ala Leu Glu Asn Trp Pro Leu Thr Arg Trp Met

180 185 190

Gln Tyr Leu Arg Glu Gly Tyr Thr Val Cys Val Asp Cys Gln Pro Pro

195 200 205

Ala Met Asn Ser Val Ser Leu Arg Cys Ser Gly Asp Gly Leu Asp Ser

210 215 220

Asp Gly Asn Gln Thr Leu His Trp Gln Ala Ile Gly Asn Pro Arg Cys

225 230 235 240

Gln Gly Thr Trp Lys Lys Val Arg Arg Val Asp Gln Cys Ser Cys Pro

245 250 255

Ala Val His Ser Phe Ile Phe Ile

260

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> C8orf84基因正向引物

<400> 4

cgggcacacc tatgttcctg 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> C8orf84基因反向引物

<400> 5

tccatacagt atccagcatc ctct 24

Claims (10)

1.C8orf84基因，其特征在于，其全长mRNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的C8orf84基因，其特征在于，所述全长mRNA序列的编码区如SEQID NO:2所示。

3.C8orf84蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

4.引物对，包括正向引物和反向引物，其特征在于，用于特异性扩增根据权利要求1所述的部分mRNA序列或者根据权利要求2所述部分编码区；优选地，所述正向引物如SEQ IDNO:4所示，所述反向引物如SEQ ID NO:5所示。

5.根据权利要求1所述的C8orf84基因用于制备治疗膀胱癌的药物组合物的用途。

6.根据权利要求3所述的C8orf84蛋白用于制备治疗膀胱癌的药物组合物的用途。

7.根据权利要求4所述的引物对用于制备膀胱癌检测试剂盒的用途。

8.一种治疗膀胱癌的药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的C8orf84基因。

9.一种治疗膀胱癌的药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求3所述的C8orf84蛋白。

10.一种膀胱癌检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含根据权利要求4所述的引物对。