CN110554195A - 来源于人外周血cd8+t细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来源于人外周血CD8+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用。所述生物标志物选自CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种。

Description

来源于人外周血CD8+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的 应用

技术领域

本发明涉及来源于人外周血CD8+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用。

背景技术

胰腺癌是目前世界上发病率第十二、死亡率第七的癌症，胰腺癌的预后极差，每年发病人数和死亡人数接近1:1。世界卫生组织2012年统计结果显示，胰腺癌是目前世界上发病率第十二和死亡率第七的癌症，全世界每年新增胰腺癌病人33万人，每年因胰腺癌死亡的病人有33万人，胰腺癌的发病人数和死亡人数的比值接近1:1。胰腺癌包括内分泌胰腺癌和外分泌胰腺癌，大部分的胰腺癌病人属于外分泌胰腺癌，其中胰腺导管腺癌病人占胰腺癌病人的90％左右。胰腺癌进展非常快，病人预后极差，胰腺癌病人的平均生存期仅为6-9个月，一年生存率为28％，五年存活率为7％；有20％的胰腺癌病人可以进行手术切除，但是可以进行手术切除的病人中有很大一部分会发生癌症复发和转移，这部分患者的中位生存期为12-19个月，五年生存率为20％，胰腺癌有“癌中之王”之称。

尽管从1975到2017年之间美国胰腺癌病人的五年生存率从3.0％上升到8.5％，但目前胰腺癌患者的5年生存率依然不足10％，不容乐观。早期诊断难、预后差、发生发展快，大部分诊断为胰腺癌的病人都到了晚期。手术切除是目前彻底治愈胰腺癌的唯一有效手段，但是手术切除患者胰腺癌复发比例很高。及早发现、及早治疗对于治愈胰腺癌十分关键，而且手术切除后的患者追踪对于术后及时干预提高患者生存率至关重要。

2011年，Douglas和Robert更是将逃脱免疫监视或者抑制免疫反应列为癌症的十大特征之一。在胰腺癌的发生发展过程中，肿瘤细胞和免疫系统相互博弈。一方面，机体的免疫系统会识别肿瘤细胞表面特异的分子诱发免疫反应，杀死肿瘤细胞，例如CD8+T细胞和NKT细胞；另一方面，肿瘤细胞自身会发生某种突变并借助Treg等免疫细胞，抑制机体的免疫反应，最终逃脱免疫系统的监控，形成明显的肿瘤块和新的转移灶。其中，多个免疫细胞参与这个过程，包括肿瘤相关的巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)、髓系来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)、肿瘤相关的中性粒细胞(tumor-associated neutrophils，TMN)、肥大细胞(MC)、树突状细胞(DC)、肿瘤渗透的淋巴细胞(Treg、CD4+T和CD8+T细胞)，这些细胞一起构成肿瘤细胞的免疫调控系统。

相比组织，外周血获取是无创的，样本采集方便容易。而外周血中的免疫细胞作为机体系统免疫中的一部分，一定程度上反应了机体免疫系统的状态。研究胰腺癌病人外周血中免疫细胞的变化有助于理解和研究胰腺癌发生过程中免疫系统发挥的作用。

发明内容

本发明提供选自以下的蛋白质作为检测对象在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD8+T细胞中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种。

在一个或多个实施方案中，所述蛋白质选自：人外周血CD8+T细胞中的CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种，优选为人外周血CD8+T细胞中的CD7、RAB25和WNK3。

在一个或多个实施方案中，所述蛋白质还包括：人外周血CD8+T细胞中的H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种。

本发明提供选自以下蛋白质的检测试剂在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD8+T细胞蛋中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为：人外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为与外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3的检测试剂。

在一个或多个实施方案中，所述检测试剂还包括：人外周血CD8+T细胞中H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

在一个或多个实施方案中，所述检测试剂为与所述蛋白质特异性结合的试剂，如抗体或其抗原结合片段。

本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒含有：人外周血CD8+T细胞蛋中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有：人外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为与外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3的检测试剂。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有：人外周血CD8+T细胞中H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有：与所述蛋白特异性结合的试剂，包括抗体或其抗原结合片段；和任选的用于从血液中分离出CD8+T细胞的试剂和用于CD8+T细胞的试剂。

在一个或多个实施方案中，所述试剂包括利用凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、BCA法、胶体金法、Western blot、ELISA和液相色谱-串联质谱中的一种或多种检测所述蛋白的含量中使用到的试剂。

在某些实施方案中，本发明提供CD7蛋白或其片段、RAB25蛋白或其片段和WNK3蛋白或其片段在制备用于胰腺癌病人预后的试剂或试剂盒中的应用。

在某些实施方案中，本发明提供与CD7蛋白特异性结合的试剂、与RAB25蛋白特异性结合的试剂和与WNK3蛋白特异性结合的试剂在制备用于胰腺癌病人预后的试剂或试剂盒中的应用。

在一个或多个实施方案中，所述试剂为抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体，以及抗体的抗原结合片段。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有与CD7蛋白特异性结合的试剂、与RAB25蛋白特异性结合的试剂以及与WNK3蛋白特异性结合的试剂。

在某些实施方案中，本发明还提供一种预测胰腺癌病人术后病情发展的方法，所述方法包括检测该病人外周血CD8+T细胞中CD7、RAB25和WNK3蛋白的表达量的步骤，其中，与胰腺癌患者CD8+T细胞中CD7、RAB25和WNK3蛋白各自的平均表达量相比，所述CD7、RAB25和WNK3蛋白的表达量都下降表明该病人的预后差。

附图说明

图1：病人外周血中CD8+T细胞FACS检测结果，结果显示3个病人外周血CD8+T细胞的FACS检测结果。

图2：QC样本和DIA样本中11条iRT标肽(SEQ ID NO:1－11)的出峰时间。A、15个QC的DDA样本中11条iRT标肽的出峰时间；B、49个CD8+T细胞DIA样本中11条iRT标肽的出峰时间。

图3：生存和死亡胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中106个差异蛋白质富集到的T细胞受体信号通路。

图4：CD8+T细胞中18个差异蛋白质和挑选的3个差异蛋白质的ROC。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

定量蛋白质组学被广泛用于各种癌症的生物标志物的发现。经典的蛋白质组学生物标志物的研究方法是比较癌组织与远端正常组织(或癌旁组织)之间的蛋白质的差异表达。为了获得重复性好、数据信息丰富、数据质量高和能高通量的数据，本发明首次采用数据非依赖采集(Data-independent acquisition，DIA)的扫描模式，打破了传统的用流式细胞仪研究癌症病人外周血中CD8+T细胞的限制，为癌症以及其他疾病临床研究外周血中CD8+T细胞提供了新的思路，同时构建了一个全新的完整的关于胰腺癌病人外周血中CD8+T细胞中生物标志物的大库。本发明采用DIA扫描模式，基于无标记定量蛋白质组学策略研究32例胰腺癌患者的外周血中CD8+T细胞的蛋白质组。根据术后9-15个月的随访周期，根据病人存活状态将病人分为生存组和死亡组，在两组外周血中CD8+T细胞的蛋白质组中发现了包括CD7、RAB25和WNK3可作为胰腺癌病人预后的生物标志物，其表达量的下调和差的预后有关。

因此，本发明提供预测胰腺癌病人术后病情发展或疾病恶性程度的方法。可根据不同胰腺癌病人的病情实施不同的外科手术，包括但不限于胰头十二指肠切除术、扩大胰头十二指肠切除术、保留幽门的胰十二指肠切除术和全胰腺切除术等。术后的不同时间段，可分析胰腺癌病人外周血CD8+T细胞蛋白质组中作为生物标志物的蛋白表达情况，来评估、预测该病人癌症恶性程度或术后病情发展情况。本文中，可作为生物标志物用以评估、预测该病人癌症恶性程度或术后病情发展情况的蛋白质包括人外周血CD8+T细胞蛋白质组中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种(如至少2种、至少3种或更多)。

本文中，所述CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1具有本领域公认的含义。例如，CD7是免疫球蛋白超家族成员，是一个跨膜蛋白质；RAB25是原癌基因RAS超家族的一员，参与膜运输以及细胞存活；RPL18是核糖体60S亚基中的L18E家族成员。这些蛋白的氨基酸序列和基因序列都可从已知的数据库例如Genbank或中找到。例如，在中，CD7的GCID为GC17M082314，RAB25的GCID为GC01P156061，WNK3的GCID为GC0XM054235。

应理解的是，不同个体中，CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1可能会存在突变，但只要突变后的蛋白仍然被本领域公认为上述蛋白，则这类突变蛋白的检测及其结果的应用也在本发明范围之内。

在某些实施方案中，本文所述的方法包括检测胰腺癌患者外周血CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种的表达水平。在某些实施方案中，本文所述的方法包括检测胰腺癌患者外周血CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3蛋白的表达水平。

本文所述的方法中，下调的CD7、RAB25和WNK3的表达水平表明病人的预后差或疾病恶性程度高，需要采取进一步的治疗手段。

在某些实施方案中，本文各实施方案所述的方法还包括检测胰腺癌患者外周血CD8+T细胞蛋白质组中H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的表达水平。H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的表达下降表明该患者术后预后差或疾病恶性程度高。

本文所述的“表达下降”和“表达上升”可以与不同对照进行比较，例如，可与病人自身术前的表达水平进行比较，或与病人自身术后最近一次的表达水平或最近几次的表达水平(包括平均表达水平)进行比较。或者，也可与术后一段时间内胰腺癌患者群体的平均表达水平进行比较。例如，可采集一定数量的胰腺癌患者群体术后一个时间段(例如术后1-15个月，或术后9-15个月)的每种蛋白的表达水平，获得每种蛋白的平均表达水平。或者，可采集一定数量的胰腺癌患者群体术后特定时间(例如术后每个月检测一次，尤其包括术后第9到第15个月的检测)每种蛋白的表达水平，计算每种蛋白在该特定时间的平均表达水平，然后检测病人对应时间段(如术后每个月)每种蛋白的表达水平，与对应时间段的平均表达水平进行比较。应理解，可进行上述一种或多种比较。

通常，与对照相比，“表达下降”的蛋白的表达水平下降得越多和/或“表达上升”的蛋白的表达水平上升得越多，表明预后越差或疾病恶性程度越高。

蛋白的定量方法为本领域所周知。例如，可采用常规的凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法、BCA法、胶体金法、Western blot、ELISA和液相色谱-串联质谱进行蛋白质定量。在某些实施方案中，可采用多重反应监控(MRM)技术测定，该技术可以和以合成肽段为基础的绝对定量技术(AQUA)相结合，这样就可以直接对多个样品中的某个或某些蛋白质直接进行绝对含量的检测。例如，要检测样品中的某多肽含量，可先合成所述多肽，并用重同位素(如¹³C)对其进行标记；然后将一定量的所述经重同位素标记的多肽加入待测样品中，用多重反应监控技术检测样品中所述多肽(或其片段)的强度，通过比较未标记多肽(即样品中的多肽)或其片段的强度与经重同位素标记的多肽的强度，确定样品中所述多肽的含量。

因此，本文所述的方法通常可包括：获得病人的外周血，从外周血中分离出CD8+T细胞，裂解CD8+T细胞，以及检测本文所述的蛋白质的表达水平。

本发明还提供检测试剂盒或诊断试剂盒，用于检测胰腺癌患者外周血中CD8+T细胞中的CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种(如至少2种)的表达水平。在某些实施方案中，所述试剂盒含有在测定人外周血CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3蛋白中的任意一种或任意多种的表达水平中使用到的试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒含有在测定人外周血CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3蛋白的表达水平中使用到的试剂。在某些实施方案中，所述试剂盒还含有在测定人外周血CD8+T细胞蛋白质组中H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的表达水平中使用到的试剂。

试剂盒中所含的用于检测所述蛋白的表达水平的试剂可以是辅助试剂，例如用于从血液中分离出CD8+T细胞的试剂、用于裂解CD8+T细胞的试剂、以及检测过程中用到的试剂，也可以是直接检测试剂，例如与所述蛋白特异性结合的抗体或其抗原结合片段。适合用于从血液中分离出CD8+T细胞的试剂以及用于裂解CD8+T细胞的试剂包括本领域周知的试剂，包括但不限于SDT裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl pH7.6，0.1M DTT)。检测过程中用到的试剂可以是例如为制备合适的待检测蛋白溶液而使用到的试剂，包括如用于制备肽段样品的试剂，如对细胞裂解液的蛋白进行FASP酶解所需的酶解试剂以及对肽段进行脱盐所需的试剂。在进行液相色谱-串联质谱时，所述试剂还包括相应的流动相，如0.1％FA的水溶液和0.1％FA的ACN溶液。

在某些实施方案中，可采用免疫组化方法定量检测本文所述蛋白质的表达量。免疫组化方法是本领域常规的方法，通常利用抗原与抗体的特异性结合，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，从而确定感兴趣蛋白的存在和/或含量的方法。可利用本文所述的各可作为生物标志物的蛋白质各自的特异性抗体来实施本方法或用途。这类特异性抗体可以是已知的市售抗体。或者，也可根据已知技术(例如杂交瘤技术)自行制备它们各自的特异性抗体。抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体；优选单克隆抗体。也可使用抗体的抗原结合片段。因此，在某些实施方案中，本文试剂盒的各实施方案中所述的试剂可以是与所述各蛋白质特异性结合的抗体，以及任选的实施免疫组化方法所需的其它试剂

在某些实施方案中，采用多重反应监控(MRM)技术结合以合成肽段为基础的绝对定量技术(AQUA)定量测定本文所述蛋白质。因此，试剂盒中和含有待测蛋白或其相应肽段。对于本文所述的可作为生物标志物的各蛋白质，其标志性的肽段会依酶解方法不同而不同，并可由本领域技术人员采用本领域常规技术手段容易确定。

在某些方面，本文也涉及人外周血CD8+T细胞蛋白质组中CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。尤其是，本文包括胰腺癌患者外周血CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种(如至少2种)作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。更进一步地，本文包括胰腺癌患者中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。更进一步地，本文包括胰腺癌患者中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3以及选自H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种作为检测对象在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用

本文所述的应用包括在制备合适的制剂或试剂盒中的应用。例如，所述应用包括本文所述的生物标志物或其片段在制备评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度用的制剂或试剂盒中的应用，与本文所述的生物标志物特异性结合的试剂(如抗体或其抗原结合片段)在制备评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度用的制剂或试剂盒中的应用。在某些实施方案中，本文所述应用还包括能与本文所述各种生物标志物特异性结合的试剂(如抗体或其抗原结合片段)在评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度中的应用。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明。实施例中所提到的各种方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。

实验步骤

实验样本搜集

第二军医大学附属长海医院的胰腺癌患者被邀请参加了该项目。从2016年1月6号到2016年5月4号，共计75名胰腺癌患者入组，根据分离的外周血中CD8+T细胞的数量、纯度以及病理信息和预后信息的完整性，确立32例胰导管腺癌患者作为正式实验分析样本，用于蛋白质组学分析。截止到2017年5月4号，32个胰腺癌病人中有22个胰腺癌病人癌症生存，10个胰腺癌病人死亡。在蛋白质组学分析中，使用非配对t-test的统计学分析方法，并采用HCA和PCA的聚类方法对蛋白质进行聚类分析，同时展示差异蛋白质富集的信号通路。患者的临床资料见下表1。

表1

外周血中CD8+T细胞的分离

从上海医院收集胰腺癌病人术中新鲜血浆，Ficoll-Paque Plus法从新鲜血液中分离PBMC细胞，用美天旎公司的CD8+T Cell Isolation Kit从PBMC中分离CD8+T细胞。每次实验PBMC作为阴性对照，用CD3-APC和CD8-FITC抗体染CD8+T细胞，其中PBMC、PBMC-CD3-APC、PBMC-CD8-FITC作为阴性对照去确定细胞群参数设置。方法参考试剂盒说明书。

肽段样品制备

CD8+T细胞中加入SDT裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris-HCl pH7.6，0.1M DTT)，沸水5min，200w超声3min。使用295nm激发波长和350nm吸收光的色氨酸荧光发射测定蛋白质浓度〔Suman S.Thakur、T.G.,Bhaswati Chatterjee、Peter Bandilla、Florian Fro¨hlich、Juergen Cox和Matthias Mann，Deep and Highly Sensitive Proteome Coverageby LC-MS/MS Without Prefractionation，Mol Cell Proteomics，2011.16(7):p.1-9〕。所有样本FASP酶解(FASP方法参考Wisniewski,J.R.等，Universal sample preparationmethod for proteome analysis，Nat Methods，2009，6(5):p.359-62)，肽段StageTip脱盐(方法参考Rappsilber,J.、M.Mann和Y.Ishihama，Protocol for micro-purification,enrichment,pre-fractionation and storage of peptides for proteomics usingStageTips，Nat Protoc，2007，2(8):p.1896-906)。

所有DDA样本(包括QC样本)和DIA样本中取3ug肽段，加入1ul稀释后iRT标肽(Biognosys，序列见SEQ ID NO:1－11)。从CD8+T细胞中肽段量比较多的样本中取出5ug混成混合物，作为DIA样本采集过程中的QC样本。另外肽段量较多样本中取出3ug，采用DDA数据采集模式，搜库，利用DDA搜库结果建立DIA谱图库。在DIA样本采集过程中，每跑10个DIA文件跑一针QC的DDA作为质控。共49对CD8+T细胞样本，98个DIA样本；15个QC的DDA样本；共19个DDA样本，其中四个跑了两次，共计23个预计建库DDA样本。23个建库DDA文件和15个QC的DDA文件一起搜库，作为最后建立DIA谱图库的DDA文件。

液相色谱-串联质谱

肽段通过EASY-nLC 1000色谱(Thermo Fisher Scientific)进行分离，流动相A液为0.1％FA的水溶液，B液为0.1％FA的ACN溶液。C18反相色谱柱为自制75μm×150mm，3μm填料。色谱梯度为(％B)：时间，(2-4)：2min，(4～30)：100min，(30～45)：8min，(45～90)：5min，(99～90)：5min，分离时间2h，流速250nL/min。DDA和DIA采用的质谱仪器为ThermoOrbitrap Fusion，数据采集为“高-高”模式。

DDA数据采集参数设置，一级全扫为orbitrap检测器(300-1500m/z)，分辨率为120,000@m/z 200，AGC target设置为2E5，maximum IT为50ms；二级扫描为数据依赖型采集模式(DDA，top 20)，HCD碎裂，分辨率为15,000@m/z 200，AGC target设置为5E4，maximumIT为54ms，isolation window为1.2m/z，33.0％NCE，orbitrap检测器(200-2000m/z)检测。动态排除设置为：重复次数，1；重复时间，30s；排除时间，120s。所有数据通过Xcalibur软件进行采集。

DIA数据采集参数设置，一级全扫为orbitrap检测器(300-1500m/z)，分辨率为240,000@m/z 200，AGC target设置为2E5，maximum IT为50ms；二级扫描为数据依赖型采集模式(DIA)，HCD碎裂，分辨率为15,000@m/z 200，AGC target设置为5E4，maximum IT为70ms，33.0％NCE，orbitrap检测器(100-2000m/z)检测。根据预计建库的23个DDA样本文件搜库结果，保证每一个DIA窗口内离子数量基本一致，最大化仪器的检测效率，采用可变窗口采集离子。对于300-892m/z的离子，数目较多，isolation window为16m/z，共37个窗口；对于892-1444m/z的离子，因为离子数目少，采用300m/z的窗口进行采集，3个窗口分别为805-1150m/z，931-1231m/z，1144-1444m/z。合计，DIA二级采集了40个窗口，整个DIA采集过程包括：full scan-18 MS2-full scan-19 MS2-full scan-3 MS2。

DDA文件数据库搜索和DIA的DDA谱图库构建

38个DDA Raw文件通过MaxQuant 1.5.2.8软件进行数据检索〔Cox,J.等，Apractical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-basedquantitative proteomics，Nat Protoc，2009，4(5):p.698-705〕，数据库为Swiss-Prot人类数据库(2016年03月下载)。固定修饰设置，半胱氨酸Carbamidomethyl；可变修饰设置oxidized methionine，N-acetylation。蛋白质选择trypsin/P，最多允许2个酶切缺失位点，肽段first search和main search的质量容忍度分别设置为20ppm和4.5ppm，肽段和蛋白质的FDR均设置0.01。

所有DIA Raw文件通过Skyline 3.6.0.10162进行处理〔Egertson,J.D.等，Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline，Nat Protoc，2015，10(6):p.887-903〕，谱图库由23个预计建库样本和15个QC样本的DDA搜库结果建立。Peptide setting：酶选择Trypsin[KR|P]，最多允许2个酶切缺失位点，背景蛋白质是Swiss-Prot人类数据库(2016年03月下载)，允许的肽段长度为7-45个氨基酸。固定修饰设置，半胱氨酸Carbamidomethyl；可变修饰设置oxidized methionine，N-acetylation。建库时保留38个DDA文件搜库结果中打分最高的修饰肽段，cut-off 0.99，不保留冗余库(减少import DIA文件时间)。Transition setting：母离子2、3、4价态，子离子1、2、3价态，离子类型为p、b、y离子，离子匹配时候只匹配b4、b5…bn-1、y2、y3、y4…yn-3，同时利用DIA前体离子窗口进行筛选。库中ion match tolence设置为0.02m/z，从满足条件的子离子中挑选强度前5的子离子。Full scan中，MS1 filtering中同位素峰按count计算最大为3个，前体离子用orbitrap检测，分辨率240,000@200m/z；MS/MS filtering中，数据采集方式选择DIA，子离子分析器orbitrap，isolation scheme设置为Thermo OrbitrapFusion上的DIA窗口，分辨率60,000@200m/z，用谱图库中肽段出峰时间±2.5min内的时间对保留时间进行过滤。完成上述参数设置后，构建谱图库，添加谱图库肽段对应的decoy库，用于控制肽段的FDR。

DIA文件谱图库匹配

Skyline软件完成谱图库构建后，导入DIA文件，通过skyline内置的mProphet算法对DIA和谱图库中的谱图匹配程度进行打分，优化拟合的模型，完成DIA的数据库检索。导出的DIA匹配结果，q值<0.01的肽段即为高可信的肽段，用于后续的肽段和蛋白质定量，同一条肽段对其所有母离子强度进行加和作为肽段强度，蛋白质有定量信息的所有肽段的强度加和作为蛋白质强度，蛋白质定量结果用于后续差异蛋白质筛选〔Reiter,L.等，mProphet:automated data processing and statistical validation for large-scale SRMexperiments，Nat Methods，2011，8(5):p.430-5〕。

统计与生物信息学分析

对蛋白质的定量结果进行线性矫正(纵向中位数矫正)，不同组之间Mix为相同样本，组间用Mix横向校正，数据分析和统计学检验利用软件R或者Excel完成，通路富集用DAVID软件完成。

(1)层次聚类分析(hierarchical clustering analysis，HCA)：利用软件R中的pheatmap包完成，根据样本之间蛋白质表达水平计算距离，将距离较近的样本聚集在一起。

(2)主成分分析(principal components analysis，PCA)：利用软件R中的prcomp函数完成，将大量相关的变量转化为一组很少的不相关的变量，降低变量的维度，同时尽可能多的保留原始数据信息。

结果

实验流程和数据概览

实验流程如下所述。从医院取得的新鲜血液通过Ficoll密度梯度离心分离PBMC细胞，接着用分离CD8+T细胞的试剂盒分离CD8+T细胞。分离的CD8+T细胞用细胞计数仪计数，对于细胞比较多的T细胞取0.5-1*10⁶个细胞进行FACS检测，测定分离的细胞纯度。最后选择CD8+T细胞数目均大于10⁶的样本作为正式实验样本。

正式样本中蛋白质较多的样本中取出5ug混合成混合物作为QC样本，同时取出3ug作为初始建库和构建DIA isolation window。根据23个预计建库样本的DDA文件构建的隔离窗口在Thermo Orbitrap Fusion上编辑DIA方法，采集98个样本的DIA文件，每跑10个DIA文件接一个mix的DDA作为质量控制。最后共有23个样本的DDA(19个加上4个重复)、15个mix作为QC的DDA、98个DIA文件。为提高98个DIA文件的鉴定结果，将38个DDA文件合并搜库构建一个相对大的谱图库。用Skyline软件导入DIA文件，通过内置的mProphet算法，对DIA谱图和DDA谱图库中谱图的匹配程度进行打分，根据两者的强度、保留时间差异、保留时间差异平方、库强度点积、峰型、共洗脱、信噪比等构建一个综合打分，拟合最优的模型，最后筛选q值<0.01的肽段即为可信肽段。肽段定量是将该肽段满足筛选条件的所有二级子离子强度进行加和，蛋白质的定量是将蛋白质所属的所有肽段强度进行加和。对得到的蛋白质定量结果进行质量控制，去除定量信息比较少的样本，同时结合病人的病理和预后信息，最后确定分析32个胰腺癌病人。

取其中部分样本进行FACS检测，检测结果如图1所示。在FACS检测的样本中，几乎所有分离得到的CD8+T细胞的纯度在90％以上。

最后用23个预计建库样本和15个QC的DDA文件构建DIA的谱图库，库中包含4881条蛋白质，30916条肽段，36063个前体离子和284149个母离子-子离子的离子对。DIA数采集模式受色谱条件影响非常大，所以在所有样本中均加入了11条iRT的标准肽。用谱图库中肽段的保留时间校正鉴定到的可信的肽段和蛋白质数目要优于iRT校正的保留时间，所以后续所有数据均用谱图库中的保留时间作为DIA肽段保留时间校正。

对QC样本和DIA样本中11条iRT标肽的出峰时间进行了统计，统计结果如图2所示。在98个DIA文件中通过模型拟合优化保留q值<0.01的可信肽段，11条iRT标肽的出峰时间也和DDA的出峰时间基本一致，误差在5min以内，说明整个DIA文件采集过程中色谱状态非常稳定，DIA结果受色谱状态影响较小。

结合病理和预后信息，最后确定正式分析32个胰腺癌病人，30个胰腺癌病人外周血CD8+T细胞DIA中共定量到4579个可信蛋白质，所有CD8+T细胞中重叠的蛋白质有1601个，一半以上CD8+T细胞中有定量信息的有3321个蛋白质。对CD8+T细胞中一半以上有定量信息的蛋白质分进行别缺失值填充，用于后续数据分析。

生存组和死亡组胰腺癌病人CD8+T细胞差异蛋白质分析

按生存组和死亡组进行t-test假设检验，以p值<0.05和FC≥1.2的筛选标准，生存和死亡组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中有差异表达的106个蛋白质，在死亡组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中上调的蛋白质有2个，下调的蛋白质有104个，说明CD8+T细胞某些功能的缺失与极差的预后相关。结果显示，这些差异蛋白质的HCA和PCA基本可以将生存组和死亡组胰腺癌病人区分开。

生存和死亡组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中有106个差异蛋白质，死亡组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞的蛋白质与生存组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞的蛋白质的比值大于1.2的取正值，小于0.83的取负值，对其中的T细胞受体信号通路(T cell receptorsignaling pathway)进行展示。免疫系统在胰腺癌的发生发展过程中起着十分重要的作用，免疫系统作为机体重要的防御系统，识别和清除外来抗原物质(如病原微生物和病毒等)，识别清除生物体内有害成分(如发生突变的癌细胞、衰老细胞和死亡细胞等)，通过自身免疫耐受和免疫调节维持机体内环境的稳定。在死亡组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中下调的104个蛋白质显著富集到T细胞受体信号通路，其中NFkB蛋白质表达量下调(见图3)，导致CD8+T细胞的增殖、分化和免疫响应降低，同时产生的抗肿瘤效应的IL2、IL4、IL5和IFNγ分子的表达量也下调，最终机体总体的免疫效应受到抑制，肿瘤发生侵袭和转移，造成病人死亡。

为获得可靠有效的生物标志物，按照p值<0.01和FC≥1.5的筛选标准在生存组和死亡组胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中筛选到17个差异更显著的蛋白质(见表2)，其中有12个蛋白质的变化倍数在2倍以上，而且17个差异更显著的蛋白质的HCA和PCA可以将生存和死亡胰腺癌病人区分开。

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(SMG-1)属于磷脂酰肌醇3激酶相关的激酶家族成员，参与人体中胰腺癌的肿瘤发生和肿瘤进展过程，实验证明SMG-1在胰腺癌组织和胰腺癌细胞中的表达量很高，而抑制SMG-1的表达会抑制胰腺癌细胞系的增殖以及对吉西他滨和顺铂类药物的敏感性。本实验结果表明，这17个差异表达的蛋白质对于区分胰腺癌病人预后有明显的区分效果。从HCA结果上看，生存胰腺癌病人聚集成两簇，而死亡胰腺癌病人17个蛋白质表达图谱比较接近，有一簇生存胰腺癌病人的表达谱逐渐远离另一群生存胰腺癌病人并向死亡胰腺癌病人的表达谱靠近，我们预测这部分胰腺癌病人的预后情况不容乐观。此外，PCA结果和HCA结果类似，死亡胰腺癌病人之间非常聚集，而存活胰腺癌病人很离散，从另一方面说明了癌症恶化过程中的异质性以及复杂性，而到了癌症病人死亡阶段，癌症之间的差异相对小一些。我们的数据中这些差异蛋白质组合可以作为胰腺癌病人癌症恶性程度的生物标志物。

从图4可以看出，差异更显著的17个蛋白质的ROC的AUC为1，挑选的CD7、RAB25和RPL18的AUC是0.936，3个蛋白质组合和全部17个蛋白质组合的ROC的AUC没有显著性差异，能严格的将生存和死亡胰腺癌病人分开，可以作为有效的预后标志物，去预测胰腺癌病人术后生存时间以及进行及时的术后干预，提升病人生存时间。

表2：生存和死亡胰腺癌病人CD8+T细胞中p值<0.01且FC≥1.5的17个差异蛋白质

死亡胰腺癌病人外周血CD8+T细胞表面的CD7蛋白质表达量下调，而CD7是免疫球蛋白超家族成员，是一个跨膜蛋白质，存在于胸腺和成熟的T细胞中，在T细胞激活以及早期淋巴细胞发育过程中T/B细胞相互作用中发挥重要作用，CD7在CD8+T细胞中的表达量的下调势必会影响CD8+T的抑肿瘤效应，而且CD7蛋白质的缺失和Aggressive natural killer-cell leukemia(ANKL)显著相关。

RAB25是原癌基因RAS超家族的一员，参与膜运输以及细胞存活，肾上皮细胞癌、卵巢癌和肝癌细胞中RAB25的上调和癌症细胞的侵袭、增殖以及迁移有关，在CD8+T细胞中RAB25的会影响CD8+T细胞的增殖和存活，使得CD8+T细胞的抑肿瘤效应受到损伤，影响病人发挥正常的免疫反应，最终死亡。

RPL18是核糖体60S亚基中的L18E家族成员，核糖体参与机体内一系列蛋白质的翻译，核糖体的功能显著影响机体能否翻译正常的蛋白质执行正常的生物学功能，在胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中核糖体蛋白质RPL18的表达量显著下调，使得CD+8T细胞无法正常合成蛋白质，导致机体CD8+T细胞的抑癌作用受到明显抑制，最终病人因癌症死亡。

综上，CD8+T细胞中CD7、RAB25和RPL18组合可以作为胰腺癌预后的生物标志物，在胰腺癌病人外周血CD8+T细胞中CD7、RAB25和RPL18的表达量下调和差的预后有关。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 来源于人外周血CD8+T细胞的生物标志物在胰腺癌预后中的应用

<130> 180411

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Asp Val Thr Pro Ala Asp Phe Ser Glu Trp Ser Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Gly Leu Asp Ala Ala Ser Tyr Tyr Ala Pro Val Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Ala Gly Ser Ser Glu Pro Val Thr Gly Leu Asp Ala Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Thr Phe Ile Ile Asp Pro Ala Ala Val Ile Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Thr Phe Ile Ile Asp Pro Gly Gly Val Ile Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Leu Phe Leu Gln Phe Gly Ala Gln Gly Ser Pro Phe Leu Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Leu Gly Gly Asn Glu Gln Val Thr Arg

1 5

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Thr Pro Val Ile Ser Gly Gly Pro Tyr Glu Tyr Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Thr Pro Val Ile Thr Gly Ala Pro Tyr Glu Tyr Arg

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Glu Ala Thr Phe Gly Val Asp Glu Ser Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Tyr Ile Leu Ala Gly Val Glu Asn Ser Lys

1 5 10

Claims (10)

1.选自以下的蛋白质作为检测对象在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD8+T细胞中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质选自：人外周血CD8+T细胞中的CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种，优选为人外周血CD8+T细胞中的CD7、RAB25和WNK3。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述蛋白质还包括：人外周血CD8+T细胞中的H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种。

4.选自以下蛋白质的检测试剂在制备用于评估、预测胰腺癌病人术后病情发展或癌症恶性程度的试剂或试剂盒中的应用：人外周血CD8+T细胞蛋中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为：人外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为与外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3的检测试剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述检测试剂还包括：人外周血CD8+T细胞中H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

7.如权利要求4-6中任一项所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为与所述蛋白质特异性结合的试剂，如抗体或其抗原结合片段。

8.一种试剂盒，所述试剂盒含有：人外周血CD8+T细胞蛋中的CD7、RAB25、WNK3、H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：人外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3中的任意一种或任意多种的检测试剂，优选为与外周血中CD8+T细胞CD7、RAB25和WNK3的检测试剂；

优选还含有：人外周血CD8+T细胞中H1F0、ALDOC、BRD2、ALDH9A1、GALK2、RPL18、RFTN1、TMEM167A、PSMB7、RNPEP、PPAN、PNO1、RPS6KB2和CHORDC1中的一种或多种的检测试剂。

10.如权利要求8-9中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：与所述蛋白特异性结合的试剂，包括抗体或其抗原结合片段；和任选的用于从血液中分离出CD8+T细胞的试剂和用于CD8+T细胞的试剂。