CN110538314A - 用于杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物 - Google Patents
用于杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物，所述抗菌肽组合物包含抗菌肽和促渗透因子，所述抗菌肽组合物对已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为80‑99%。由于促渗透因子的作用，根据本发明的抗菌肽能够顺利渗透到由铜绿假单胞菌形成的生物膜中，从而对铜绿假单胞菌进行高效杀灭。
Description
技术领域
本发明涉及药物组合物领域，更具体地涉及一种能够有效杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)在临床上常见于呼吸道和肺部感染，烧伤创面感染，尿路感染等，其检出率为16.8％。多重耐药P.a是最危险的六种多重耐药菌ESKAPE之一，导致的感染在临床上难以治愈，危及患者生命。统计表明，多重耐药P.a的细菌血症感染者的30天内死亡率达到40-60％。细菌耐药性问题日益突出，抗菌肽(antimicrobial peptides，AMP)被寄予了治疗耐药菌感染的厚望。抗菌肽的作用靶点为细菌细胞膜，具有广谱抗菌效果和较低的引起耐药性的可能。其作用原理是抗菌肽通过其正电荷区域与细菌细胞膜形成亲和作用，抗菌肽的疏水区域可以与细菌细胞膜的磷脂双分子层中的疏水层结合，导致细胞膜结构的破坏和穿孔。
呼吸道和肺部的P.a感染，占其检出的74％，常见于免疫力受损情况下的肺炎患者。P.a的呼吸道和肺部感染有着复杂的微环境。首先，P.a附着于呼吸道和肺部的表面，形成生物膜(biofilm)，分泌胞外高分子基质(extracellular polymeric substances，EPS)，其成分包括多糖，蛋白质和胞外eDNA等。P.a生物膜对外界的液体流动、药物等因素起着保护和屏障的作用，也使细菌可以通过休眠方式提高抗药性。其次，生物膜生长状态下，P.a的基因表达由非黏液型转变为黏液型，即藻酸盐(alginate)大量表达并成为EPS的主要成分。藻酸盐是由β-D-mannuronate和α-L-guluronate两种单体形成的多糖，细菌藻酸盐的特殊之处在于其O-乙酰化。由于含有大量带负电荷的-COO-基团，可以通过Ca2+等发生交联而粘度增大。第三，呼吸道的分泌物(如粘蛋白mucin等)与P.a生物膜混合，形成一个高粘性的含水大分子物质层，附着于呼吸道和肺部，难以排出。因此，黏液型P.a生物膜不仅使患者的呼吸大受影响，也使得抗菌肽及其他药物对P.a的杀灭作用被显著削弱。因此，提高抗菌肽在黏液型生物膜中的杀菌效率对控制和治疗P.a的肺部感染有着极其重要的意义。
目前的文献报道中生物膜对药物扩散的屏障作用得到较大的重视，如何促进抗生素和抗菌肽对生物膜杀菌效率也有文献报道，例如，抗生素与抗菌肽联合使用、两种抗菌肽联用、干扰生物膜形成的信号分子、酶降解金黄葡萄球菌生物膜的胞外基质EPS、缓释一氧化氮做为生物膜离散的信号分子、EDTA螯合金属离子等。然而，在目前提出的这些杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的方法中，铜绿假单胞菌的杀灭效率不高，且所用药物组合物成分较为复杂(例如联用抗生素和抗菌肽、联用抗菌肽等)。
因此，在本领域中仍然需要一种能够高效杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的简单、有效、成本低廉的抗菌肽组合物。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的一个目的在于提供一种用于杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物，所述抗菌肽组合物具有组分简单、对人体无毒、杀菌效率高、成本低廉等特点。
上述目的通过以下方案来实现：
在一方面，本发明提供一种用于杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物，所述抗菌肽组合物包含抗菌肽和促渗透因子，所述抗菌肽组合物对已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为80-99％。在一些优选实施方案中，所述抗菌肽组合物杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为90-99％。在进一步的优选实施方案中，所述抗菌肽组合物杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。
利用所述技术方案，由于促渗透因子的加入，使得抗菌肽能够有效渗透到由已形成生物膜的铜绿假单胞菌形成的中，从而大幅降低其耐药性，对已形成生物膜的铜绿假单胞菌进行有效杀灭。
进一步优选地，所述所述促渗透因子选自海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、柠檬酸或三聚磷酸钠(sodium tripolyphosphate，STPP)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述抗菌肽的分子结构中带有正电荷区域。优选地，所述抗菌肽选自抗菌肽AA230、DPK-060或LL-37中的一种或多种。在一个优选实施方案中，所述抗菌肽为AA230，所述促渗透因子为柠檬酸、海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠中的一种或多种。在另一优选实施方案中，所述抗菌肽为DPK-060，所述促渗透因子为柠檬酸、海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠中的一种或多种。在再一优选实施方案中，所述抗菌肽为LL-37，所述所述促渗透因子为柠檬酸、海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠中的一种或多种。
在一个实施方案中，在所述抗菌肽组合物中，海藻酸酶的浓度可以为0.5-100U/ml，优选为1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95U/ml。在另一实施方案中，氯化铝的浓度可以为2-200mM，优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mM。在又一实施方案中，氯化铁的浓度可以为2-200mM，优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mM。在再一实施方案中，三聚磷酸钠的浓度可以为2-200mM，优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mM。在再一实施方案中，柠檬酸的浓度可以为5-200mM，优选为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mM。
利用所述实施方案，由于海藻酸酶能降解或破坏由铜绿假单胞菌形成的生物膜EPS基质，从而使得抗菌肽能够有效渗透到由铜绿假单胞菌形成的生物膜中，从而大幅降低其耐药性，对已形成生物膜的铜绿假单胞菌进行有效杀灭。同时，氯化铝或氯化铁的有效成分铝离子和铁离子能够中和由铜绿假单胞菌形成的生物膜中的负电荷，从而有利于抗菌肽能够有效渗透到由铜绿假单胞菌形成的生物膜中并对铜绿假单胞菌进行杀灭。此外，柠檬酸或三聚磷酸钠能够与抗菌肽形成复合物而屏蔽其所带正电荷，从而使抗菌肽能够顺利渗透到由铜绿假单胞菌形成的生物膜中并对其进行有效杀灭。
本发明的另一目的在于提供一种建立铜绿假单胞菌生物膜模型的方法，所述铜绿假单胞菌生物膜模型包括模拟抗菌肽与细菌之间的渗透屏障的藻酸盐模型、EPS模型；和模拟肺部感染中P.a生物膜与人体分泌的粘液形成的复杂感染微环境EPS-mucin模型，所述方法包括：1)将基质物质纯藻酸盐、EPS提取物或EPS-mucin分别溶于水中，通过加样孔加入作为模具的输注腔中；2)然后用CaCl2交联剂滴于加样孔上方并保持一定时间，使得Ca2+扩散至整个输注腔中的溶液形成凝胶；3)打开输注腔，将凝胶储存于一系列CaCl2/NaCl缓冲液中一定时间，使得凝胶与不同浓度的Ca2+达到膨胀-渗出平衡，并因此达到一定的凝胶密度。
通过该技术方案，能够建立具有复杂度递增且能够模拟复杂感染微环境的P.a生物膜模型，从而能够对对铜绿假单胞菌具有杀灭作用的抗菌肽或其辅助成分(例如促渗透因子)进行快速而准确的筛选，研究其对铜绿假单胞菌的杀菌机理，改善与铜绿假单胞菌有关的疾病治疗方案。
在一个实施方案中，藻酸盐凝胶由提纯的细菌藻酸盐(购于Dextra公司)制成，EPS凝胶由P.abiofilm提取的EPS制成，EPS-mucin凝胶由EPS提取物和mucin以(0.5-2)∶(0.5-2)比例制成。在另一实施方案中，所述输注腔的直径为5-15mm，厚度为0.5-3mm。在一个优选实施方案中，所述输注腔的直径为9mm，厚度为1mm。在一个实施方案中，CaCl2的浓度为10-30mM，并且优选为20mM。在一个实施方案中，在步骤2)中保持的时间为2-6小时，优选4小时。在另一实施方案中，在步骤3)中储存的时间为12-36小时，优选24小时。
通过上述技术方案，本发明能够实现如下良好的技术效果：
1)由于促渗透因子的加入，使得能够降解或破坏由铜绿假单胞菌形成的生物膜EPS，中和抗菌肽自身携带的电荷或生物膜EPS所携带的电荷，从而使抗菌肽能够渗入生物膜中，从而对已形成生物膜的铜绿假单胞菌进行高效杀灭；
2)根据本发明的抗菌肽组合物成分简单、杀菌效率高且成本低廉。
附图说明
以下将结合附图来具体描述本发明的一些优选实施方式。本领域的普通技术人员将会理解，这些附图仅用于举例说明的目的，而无意于以任何方式来限制本发明的范围。
图1显示了两种P.a生物膜模型(细菌藻酸盐凝胶和EPS凝胶)在DPK-060(200μM)和LL-37(200μM)溶液中的抗菌肽摄取量和抗菌肽渗透距离；
图2显示了以EPS凝胶为P.a生物膜模型进行促渗透因子的筛选中海藻酸酶、柠檬酸、氯化铝和氯化铁体现出促进荧光标记的抗菌肽渗透的作用；
图3显示了添加和不添加促渗透因子的情况下三种抗菌肽AA230、DPK-060和LL-37对P.a生物膜的杀菌率。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例来描述本发明的一些具体实施方式。本领域的普通技术人员会理解，提供这些实施例的目的仅仅是为了举例说明如何能够实施本发明的方案，而非以任何方式限制本发明的范围。
P.a生物膜中的胞外基质EPS是抗菌肽渗透和扩散的强大屏障。特别地，黏液型的P.a生物膜使得细菌对多种抗生素的耐受浓度提高近1000倍。例如，本申请的发明人在研究中发现，如果108细菌形成了生物膜，则其杀灭率只有40-60％，例如，在图3中示出的。对此，本申请的发明人进行了进一步的深入研究。结果，本申请的发明人出乎意料地发现，带负电的藻酸盐可以与带正电荷的药物结合，使之丧失与细菌的细胞膜相互作用并且杀死细菌的机会，药物的生物利用率大大降低，例如抗菌肽DPK-060和LL-37在P.a生物膜模型中的渗透受到了显著的限制。例如，在图1示出了细菌藻酸盐凝胶(凝胶密度为1.2％、1.6％、2.3％、3.5％、5.0％和6.0％)和EPS提取物凝胶(凝胶密度为0.75％、1.75％、2.85％和4.09％)作为P.a生物膜模型，分别与Alexa488荧光标记的DPK-060和LL-37抗菌肽相互作用。从共聚焦荧光显微镜图像中可以看出抗菌肽的渗透深度仅限于P.a生物膜模型的表面，而不依赖于凝胶的网络密度和交联度(即孔隙大小)。
因此，本申请的发明人推测，抗菌肽在P.a生物膜渗透过程中，阻碍作用主要来自于藻酸盐多糖的负电荷，而非抗菌肽的分子大小与凝胶网络密度。同时，本申请的发明人还认识到，EPS和抗菌肽的电荷作用是抗菌肽渗透屏障的主要因素。
据此，本申请的发明人提出了屏蔽EPS或抗菌肽的电荷以降低电荷作用从而促进抗菌肽渗透的策略，并且建立了复杂度递增的P.a生物膜模型来验证该策略。
此外，在研究过程中，本申请的发明人还总结出三种促抗菌肽渗透的作用机制，包括降解或离散EPS法、EPS电荷屏蔽法和抗菌肽复合物法，并通过所建立的P.a生物膜模型进行高效的筛选。例如，可以降解藻酸盐的藻酸酶，可以屏蔽EPS中的负电荷的铝离子和铁离子，以及通过与抗菌肽形成复合物而屏蔽其所带正电荷的柠檬酸根离子和多聚磷酸根离子。另外，本申请的发明人还意识到，继续提高抗菌肽的杀菌率仍有重要的临床意义。这是因为，即便是高达97％的杀菌率，也意味着P.a生物膜的108细菌中有大约3×106个细菌未被杀灭，仍是感染人体的毒性负荷所在并继续增殖。因此，不断提高抗菌肽的杀菌率对于抗菌肽的效用而言具有非常重要的意义。
正是基于该发现，本申请的发明人完成了本发明。
下面将结合实施例对建模方法进行更为详细的描述和说明。本领域的普通技术人员将会理解，提供这些实施例的目的只是用于示例性说明的目的，即使本领域的普通技术人员能够更好地理解本发明是如何实施的，而不是对本发明的范围构成任何限制。
实施例1
1)抗菌肽(AMP)
本申请中使用的抗菌肽包括LL-37、DPK-060和AA230。LL-37和AA230得自瑞典的PolyPeptide实验室。DPK-060得自瑞典的Pergamum AB公司。荧光标记的抗菌肽得自美国的Biopolymer公司。Alexa488荧光标记被以共价键偶联到抗菌肽LL-37和DPK-060的N端。由于AA230为环肽，因此无法获得荧光标记的AA230。
表1抗菌肽的相关数据
2)菌种和生物膜培养
本实施例使用铜绿假单胞菌(ATCC39324)，其来源是囊性纤维化患者的咳出脓液。将细菌菌株于37℃在Tryptic soya broth(TSB)中震荡培养过夜。对于P.a生物膜培养，将P.a菌悬液通过过滤接种于纤维素滤纸上(滤纸直径2.5mm，P.a细菌数量为107)使用添加了2％甘油的假单胞菌分离琼脂(Pseudomonas isolation agar，PIA)，在37℃下培养24小时。
3)P.a生物膜的胞外基质EPS提取
从纤维素滤纸上收集P.a生物膜并将其以1∶15比例悬浮于EDTA-PBS中(EDTA浓度为4mM)。将菌悬液震荡15分钟以确保细菌的分散。菌悬液以3000×g离心沉淀细菌，将溶有EPS的上清液移入透析管(截留分子量为6kD)，在流动的去离子水中透析24小时。然后将EPS溶液进行冷冻干燥，并收集所得的EPS。
对培养所得P.a生物膜，离心去除的细菌和提取所得EPS进行称重，计算得到P.a生物膜的EPS中固体物质含量约为2.9％。
4)P.a生物膜模型的制备
分别通过以下方法制备三种P.a生物膜模型，包括藻酸盐凝胶，EPS凝胶和EPS-mucin凝胶。藻酸盐凝胶由提纯的细菌藻酸盐(购于Dextra公司)制成，EPS凝胶由P.a生物膜提取的EPS制成，EPS-mucin凝胶由EPS提取物和mucin以1∶1比例制成。三种凝胶均采用CaCl2为交联剂。凝胶制备方法为：将基质物质即纯藻酸盐、EPS提取物或EPS-mucin分别溶于水(1wt％)中，通过加样孔加入作为模具的输注腔中(直径9mm和厚度1mm)，然后用CaCl2(20mM)交联剂滴于加样孔上方。4小时后，Ca2+扩散使整个腔中的溶液形成凝胶。打开输注腔，将凝胶储存于一系列CaCl2/NaCl缓冲液中(如表2所示)，24小时后，凝胶与不同浓度的Ca2+达到膨胀-渗出平衡，并因此达到一定的凝胶密度。凝胶的固体物质含量通过完全干燥和称重来测量。
表2.用于平衡P.a生物膜模型的CaCl2/NaCl缓冲液组分
5)抗菌肽在P.a生物膜模型中的渗透作用机制
抗菌肽在P.a生物膜模型中的摄入和渗透：LL-37和DPK-060溶液(200μM，其中2％带有N端标记Alexa488)。在不同的CaCl2/NaCl缓冲液中达到平衡的藻酸盐凝胶，EPS凝胶，EPS-mucin凝胶分别于两种抗菌肽溶液在轻微震荡和37℃下孵育1小时。在孵育结束时，抗菌肽溶液用BCA法进行定量。轻轻冲洗凝胶三次，然后用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)成像并比较抗菌肽的渗透深度。
6)筛选促抗菌肽渗透因子
制备含有候选促渗透因子的LL-37和DPK-060抗菌肽溶液，其中抗菌肽浓度为200μM，2％带有N端标记Alexa488。测试的候选促渗透因子包括dextranase(1U/ml)、alginase(1U/ml)、proteinase K(0.1％)、trypsin(0.1％)、DNase I(1U/ml，工作缓冲液)、exonuclease(100pM、10mM Mg2+，缓冲液)、EDTA(2mM、5mM、10mM)、FeCl3(5mM、10mM、20mM)、AlCl3(5mM、10mM、20mM)、CaCl2(200mM)、MgCl2(100mM、200mM)、三聚磷酸钠(STPP、10mM、20mM)、柠檬酸(10mM、20mM)、丁二酸(10mM、20mM)、草酰乙酸(10mM、20mM)、3-5bp DNA序列(5mM、10mM、20mM)、脂肪酸等。缓冲液中达到平衡的藻酸盐凝胶，EPS凝胶，EPS-mucin凝胶分别于两种抗菌肽-促渗透因子溶液在轻微震荡和37℃下孵育1小时。轻轻冲洗凝胶三次，然后用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)成像并比较抗菌肽的渗透深度。
7)生物膜的杀菌效率
在真实P.a生物膜中，将培养了P.a生物膜的纤维素滤纸切成5×5mm的正方形，注意舍弃滤纸边缘的生物膜。为了测试从P.a生物膜模型中选择的促渗透因子以及促渗透因子的组合，在游离态P.a和黏液型P.a生物膜上分别测试添加了促渗透因子的AA230，DPK-060和LL-37的抗菌效率。测试中，将肽溶液-促渗透因子制剂滴加到5x5mm的P.a生物膜滤纸上方。在浮游细菌的试验中，在肽溶液-促渗透因子制剂加入到与P.a生物膜中的细菌数量相当的菌悬液中(含108个细菌)。以利用Alarma Blue的代谢活性法、超声波打散-菌落计数法和Live/Dead染色法同时测定P.a细菌的存活数量。比较得出促渗透因子在杀菌效果上的促进作用。
8)测试结果
在24小时培养的真实P.a生物膜的杀菌测试中，筛选出的抗菌肽-促渗透因子组合可以使抗菌肽的杀菌效率得到显著提高。如图3所示，无促渗透因子的三种抗菌肽AA230、DPK-060和LL-37对P.a生物膜的杀菌率分别为58％、38％和64％。在添加促渗透因子(包括海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠或柠檬酸)后，三种目标抗菌肽的杀菌率均得到大幅提高，其中效果最佳的组合为AA230/氯化铁、DPK-060/柠檬酸和LL-37/海藻酸酶对P.a生物膜的杀菌率可以达到94％、96％和97％。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，这些修改均涵盖于由权利要求所限定的本发明保护范围内。
Claims (14)
1.一种用于杀灭已形成生物膜的铜绿假单胞菌的抗菌肽组合物，所述抗菌肽组合物包含抗菌肽和促渗透因子，其中所述抗菌肽组合物对已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为80-99%。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽组合物对已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为90-99%。
3.根据权利要求2所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽组合物对已形成生物膜的铜绿假单胞菌的杀菌率为90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述促渗透因子的有效成分选自海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠或柠檬酸中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的抗菌肽组合物，其特征在于，在所述抗菌肽中，海藻酸酶的浓度为0.5-100U/ml。
6.根据权利要求4所述的抗菌肽组合物，其特征在于，在所述抗菌肽中，氯化铝的浓度为2-200mM。
7.根据权利要求4所述的抗菌肽组合物，其特征在于，在所述抗菌肽中，氯化铁的浓度为2-200mM。
8.根据权利要求4所述的抗菌肽组合物，其特征在于，在所述抗菌肽中，三聚磷酸钠的浓度2-200mM。
9.根据权利要求4所述的抗菌肽组合物，其特征在于，在所述抗菌肽中，柠檬酸的浓度为5-200mM。
10.根据权利要求1至3中任一项所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽的分子结构中带有正电荷区域。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽选自抗菌肽AA230、DPK-060或LL-37中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽为AA230，所述促渗透因子为柠檬酸、海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠中的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽为DPK-060，所述促渗透因子为柠檬酸、海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠中的一种或多种。
14.根据权利要求11所述的抗菌肽组合物，其特征在于，所述抗菌肽为LL-37，所述促渗透因子为柠檬酸、海藻酸酶、氯化铝、氯化铁、三聚磷酸钠中的一种或多种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 1701, building B2, block B, phase II, Baoneng Science Park (South District), Qinghu Industrial Zone, Gangtou community, Bantian street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant after: Shenzhen Bi Code Technology Co.,Ltd. Address before: 518000 floor 20, block B, building 6, Baoneng Science Park, Longhua street, Longhua New District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant before: Shenzhen Bi Code Technology Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20240313 Address after: 200000 Building 1, No.1 Haikun Road, Fengxian District, Shanghai Applicant after: Shanghai Mima Life Science Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: 518000 room 1701, building B2, zone B, phase II, Baoneng Science Park (South District), Qinghu Industrial Zone, Gangtou community, Bantian street, Longgang District, Shenzhen City, Guangdong Province Applicant before: Shenzhen Bi Code Technology Co.,Ltd. Country or region before: China |
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| TA01 | Transfer of patent application right |