CN110522755A - 甾体类化合物或其药学上可接受的盐在促进鱼类的性反转中的应用 - Google Patents

甾体类化合物或其药学上可接受的盐在促进鱼类的性反转中的应用 Download PDF

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CN110522755A CN201811302669.0A CN201811302669A CN110522755A CN 110522755 A CN110522755 A CN 110522755A CN 201811302669 A CN201811302669 A CN 201811302669A CN 110522755 A CN110522755 A CN 110522755A
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Abstract

本发明公开了一种甾体类化合物或其药学上可接受的盐在促进鱼类的性反转中的应用，具体地，本发明公开了一种甾体类化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于促进鱼类的性反转。本发明的甾体类化合物或其药学上可接受的盐可显著促进鱼类(如斑马鱼)的性反转。

Description

甾体类化合物或其药学上可接受的盐在促进鱼类的性反转中 的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及甾体类化合物或其药学上可接受的盐在促进鱼类的性反转中的应用。
背景技术
斑马鱼作为模式生物，掌握使其性别反转的技术，对斑马鱼性别决定机制的相关研究带来了很多便利，掌握该项技术对分子生物学，细胞学相关研究提供了一定的技术手段。
然而，斑马鱼没有性染色体，目前无法通过基因型确定性别。只能在斑马鱼成年之后才能通过外形辨认性别。
目前利用Fadrozole进行斑马鱼性反转的实验，该实验采用喂食的方式，将Fadrozole混合在鱼饲料内对斑马鱼进行喂食，一天喂两次。然而该方法进行雌性斑马鱼性反转实验为期很长，并且雌性斑马鱼性反转成雄性后，与正常的野生型雌性斑马鱼无法交配并产生受精卵，并且雌雄斑马鱼交配之前需要停止Fadrozole给药一段时间。
因此，本领域迫切需要开发一种能够缩短性反转周期，并且可以与雌性鱼类交配产生受精卵，降低副作用的物质。
发明内容
本发明的目的是提供能够缩短性反转周期，并且可以与雌性鱼类交配产生受精卵，降低副作用的物质。
本发明的另一目的在于提供了快速使雌性斑马鱼性逆转的一种方法，并且经药物处理后，雌转雄的斑马鱼可以提供出有活力的精子，能成功受精。
本发明第一方面提供了一种甾体类化合物或其药学上可接受的盐的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于促进鱼类的性反转。
在另一优选例中，所述制剂为鱼类养殖添加剂。
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐的第3、17位均为酮基。
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ia结构：
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ib结构：
在另一优选例中，所述甾体类化合物选自下组：福美司坦、依西美坦、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物选自下组：药物组合物、饲料组合物、或其组合。
在另一优选例中，所述的组合物为饲料组合物。
在另一优选例中，所述组合物包括固体、液体、半固体组合物。
在另一优选例中，所述组合物包括固体剂型、或液体剂型。
在另一优选例中，所述的组合物含有(a)甾体类化合物或其药学上可接受的盐；以及(b)水产学或药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组分(a)占所述组合物总重量的0.1-99wt％，较佳地1-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组合物或制剂还包括其他可以促进鱼类性反转的药物。
在另一优选例中，所述其他可以促进鱼类性反转的药物选自下组：fadrozole、17—甲基睾酮、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物为固体剂型，其中，所述组合物中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐的含量为0.1-0.8mg/g，较佳地，0.15-0.6mg/g，更佳地，0.2-0.5mg/g，更佳地，0.3-0.4mg/g。
在另一优选例中，所述组合物为液体剂型，其中，在所述组合物中，甾体类化合物或其药学上可接受的盐使用剂量为30-300μg/L，较佳地，40-250μg/L，更佳地，50-200μg/L，更佳地，90-120μg/L。
在另一优选例中，所述性反转为有繁殖能力的性反转。
在另一优选例中，所述的组合物通过以下方式施用于鱼类：口服、或浸泡法。
在另一优选例中，所述鱼类包括斑马鱼。
本发明第二方面提供了一种饲料，包括：
(a)甾体类化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构；
和
(b)水产学或渔业学上可接受的载体；
其中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ia结构：
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ib结构：
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐选自下组：福美司坦、依西美坦、或其组合。
在另一优选例中，所述饲料还包括其他可以促进鱼类性反转的药物。
在另一优选例中，所述其他可以促进鱼类性反转的药物选自下组：fadrozole、17-甲基睾酮、或其组合。
在另一优选例中，所述饲料包括固体饲料或液体饲料。
在另一优选例中，所述饲料为鱼类养殖添加剂。
在另一优选例中，所述饲料中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐的含量为30-300μg/L，较佳地，40-250μg/L，更佳地，50-200μg/L，更佳地，90-120μg/L。
在另一优选例中，所述饲料中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐的含量为0.1-0.8mg/g，较佳地，0.15-0.6mg/g，更佳地，0.2-0.5mg/g，更佳地，0.3-0.4mg/g。
在另一优选例中，所述饲料包括鱼饲料。
本发明第三方面提供了一种促进鱼类性反转的方法，包括步骤：
给需要的鱼类施用甾体类化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ia结构：
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ib结构：
在另一优选例中，所述甾体类化合物选自下组：福美司坦、依西美坦、或其组合。
在另一优选例中，所述鱼类包括斑马鱼。
在另一优选例中，施用剂量为30-300μg/L，较佳地，40-250μg/L，更佳地，50-200μg/L，更佳地，90-120μg/L。
在另一优选例中，施用频率为0.5-2次/天，较佳地1次/天。
在另一优选例中，施用包括一个或多个周期，各周期为1-5个月，较佳地2-4个月。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
本发明第四方面提供了一种制备性反转鱼类的方法，包括步骤：
在甾体类化合物或其药学上可接受的盐的存在下，饲喂鱼类，其中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
在另一优选例中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐的浓度为30-300μg/L，较佳地，40-250μg/L，更佳地，50-200μg/L，更佳地，90-120μg/L。
在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了加药满3个月后，雌转雄斑马鱼与野生雌性斑马鱼交配后所产各皿的总的卵数与3天后孵化出的小鱼总数数量图。
图2显示了野生型精巢切片图。
图3显示了性反转后，雌转雄斑马鱼的性腺组织，即卵巢组织已向精巢组织发育，伴随着少数未凋亡的卵巢组织，大部分已经从卵巢组织发育成精巢组织。
图4显示了野生型卵巢切片图。
图5显示了加药满3个月后雌转雄斑马鱼与野生雌性斑马鱼交配后产生的已受精的卵。
图6显示了未受精的卵。
图7显示了未受精的卵。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，甾体类化合物或其药学上可接受的盐可有效促进鱼类(如斑马鱼)的性反转，此外，还意外的发现，性反转的鱼类与雌性鱼类进行杂交后可产生正常的受精卵。在此基础上，本发明人完成了本发明。
如本文所用，术语“fadrozole”的中文名为法倔锉，结构式为
活性成分
在本发明中，将甾体类化合物或其药学上可接受的盐用作活性成分，用于促进鱼类(如斑马鱼)的性反转。
在本发明中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
在一优选实施方式中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ia结构：
在一优选实施方式中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ib结构：
在一优选实施方式中，所述甾体类化合物选自下组：福美司坦(式Ia)、依西美坦(式Ib)、或其组合。
一类特别优选的甾体类化合物或其药学上可接受的盐为实施例所述的化合物，即依西美坦，如式Ib所示。
在本发明中，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。
性反转
在本发明中，鱼的性反转分为几个阶段，在加药处理两个半月的时候，我们能观察到雌鱼的外形发生了很明显的变化(出现了明显的雄性特征)，再次加药处理半个月后我们发现处理的“雌鱼”与正常雌鱼杂交能够产生受精卵，之后解剖处理过的“雌鱼”性腺基本呈现出精巢结构。
本发明的活性成分特别适合促进鱼类性反转，尤其可以促进有繁殖能力的性反转。
如本文所用，所述“有繁殖能力的性反转”指性反转的鱼类可与雌性鱼类进行杂交，并产生正常的受精卵。
组合物及其应用
本发明的甾体类化合物或其药学上可接受的盐以及含有本发明化合物为主要活性成分的组合物可用于促进鱼类性反转。
本发明所述的组合物包括(但并不限于)：药物组合物、饲料组合物等。
本发明的药物组合物或饲料组合物包含安全有效量范围内的甾体类化合物或其药学上可接受的盐以及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显促进鱼类性反转，并且不产生副作用。通常，药物组合物或饲料组合物为液体剂型，所述组合物中，其含有30-300μg/L的甾体类化合物或其药学上可接受的盐，较佳地，含有40-250μg/L的甾体类化合物或其药学上可接受的盐，更佳地含有50-200μg/L的甾体类化合物或其药学上可接受的盐，最佳地含有90-120μg/L的甾体类化合物或其药学上可接受的盐。
“水产学或渔业上可以接受的载体”指的是：一种适合于鱼使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性的载体。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。水产学或渔业上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明化合物或组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、浸泡法给药，优选浸泡法给药。
在本发明中，所述“浸泡法给药”是指购买了容量不等的塑料桶，用1L的量筒精确称量8.4L的系统水于桶内，并标记好刻度线，下一次可直接加水至刻度线，每组水箱专桶专用避免药物互相污染，此外准备一个5L的单筒用于添加水箱里的水。每次换水时将分装好的装有不同药物的离心管打开后放入相应的桶内，加满水后溶解彻底后将空管取出，放出原来水箱里的水，倒入混合好新药的水。
如上述，把配好的药物溶入一定体积水里，制成一定浓度(如100ug/L)的溶液，倒入系统里面，系统会把溶液均匀分配到每个养鱼的缸里，这样鱼生活的水体既是我们的溶液了，这就是浸泡。
用于口服给药的固体剂型包括粉剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、娇味剂和香料。
本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药(如fadrozole、17-甲基睾酮等)。
使用药物组合物或饲料组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要促进性反转的鱼类，其中施用时剂量为药学上或水产学上认为的有效给药剂量，对于鱼类而言，日给药剂量通常为30-300μg/L，较佳地，40-250μg/L，更佳地，50-200μg/L，更佳地，90-120μg/L。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现甾体类化合物或其药学上可接受的盐(如依西美坦)具有促进鱼类性反转的活性。
(2)本发明首次发现甾体类化合物或其药学上可接受的盐(如依西美坦)处理过的鱼与雌性鱼类进行杂交，可产生正常的受精卵。
(3)本发明首次发现，甾体类化合物或其药学上可接受的盐(如依西美坦)可显著缩短鱼类(如斑马鱼)的性反转时间，将性反转时间可缩短至3个月。
(3)甾体类化合物或其药学上可接受的盐(如依西美坦)具有成本低、容易获得、安全性好、无副作用的特点。
(4)本发明无需停药(依西美坦，EM)即可使雌转雄斑马鱼与野生雌性斑马鱼交配产卵。
(5)本发明的性反转实验的对象为4个月大的成年斑马鱼。
(6)本发明采用甾体类化合物或其药学上可接受的盐(如依西美坦)浸泡式给药的方式(如100mL/L)，使得每条鱼给药更均匀，避免了有些斑马鱼未吃食或吃食量难以统计的问题。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例中用到的材料和试剂如无特殊说明，均为市售产品。
浸泡法
购买了容量不等的塑料桶，用1L的量筒精确称量8.4L的系统水于桶内，并标记好刻度线，下一次可直接加水至刻度线，每组水箱专桶专用避免药物互相污染，此外准备一个5L的单筒用于添加水箱里的水。每次换水时将分装好的装有不同药物的离心管打开后放入相应的桶内，加满水后溶解彻底后将空管取出，放出原来水箱里的水，倒入混合好新药的水。
如上述，把配好的药物溶入一定体积水里，制成100ug/L的溶液，倒入系统里面，系统会把溶液均匀分配到每个养鱼的缸里，这样鱼生活的水体既是我们的溶液了，这就是浸泡。
实施例
材料与方法
1.1斑马鱼基本情况
1.1.1饲养情况
我们的斑马鱼养殖的系统水维持在27.8-28.3℃之间，光照时长为16小时(6：00-22：00)，黑暗时长为8小时(22：00—次日6：00)，利用系统水循环以保证水的卫生质量和溶氧量。每天上午和下午分别用新孵化的盐水丰年虫卵进行喂食(其主要成分是丰年虫卵，氯化钠和碳酸氢钠)。
1.1.2鱼的陈列
在实验开始前先利用斑马鱼的形态学特征判断出雌雄斑马鱼来，再将它们之间相互杂交，产生受精卵的鱼我们才用作实验用鱼，这样就避免了同雌或者同雄的情况出现，干扰后续实验结果。
采用海盛公司的标准养鱼缸(3L)，中间加一层多孔(孔径为4mm)的亚克力板用于隔离雌鱼和雄鱼，每个鱼缸一侧放置雄鱼，另一侧放置雌鱼，雌鱼雄鱼各3条。将各组斑马鱼都编上相应的号码1，2，3。
1.2药品的基本情况
1.2.1药品来源
β-雌二醇(E2)(≥98％纯度)购自Macklin Biochemical(上海化学工业园，中国上海)。
依西美坦(EM)(≥98％纯度)购自柏维塔生物制药有限公司。
二甲基亚砜(DMSO)(≥99％纯度)购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2.2药品的配制
EM的配制：
使用DMSO作为溶剂，EM(100ug/L)。将EM的10000×母液储存于-80℃冰箱中，母液的配备为用分析天平称取100mg的EM，再用量筒量取100ml的DMSO，将其溶解于蓝口试剂瓶内，将蓝色试剂瓶用锡箔纸包裹好，放在100rpm摇床上摇至完全溶解。将1340ul的母液分装到1.5ml离心管内，放置在-20℃冰箱里备存，使用的时候只需放置在水浴锅里融化即可(水温为25℃)。
E2的配制：
用分析天平称取10mg的E2,然后用量筒取100ml的DMSO，倒入试剂瓶中，放置于100rpm摇床上，直至完全溶解，溶解完毕后取100ul溶解于100ml的DMSO制成10000X母液。用的时候放置于水浴锅(水温为30℃)融化，并将1340ul母液分装在1.5ml离心管中。
DMSO的配制：
直接吸取1340ul DMSO分装在1.5ml离心管里。
1.3性反转正式实验方法
1.3.1各实验组情况及作用
分别设计EM组，EM+E2组和DMSO组进行实验验证，其中各组功能如下：
(1)依西美坦(EM)组：EM是芳香化酶抑制剂，可以抑制雌激素的合成，是使雌鱼性反转成雄鱼的主要试剂。预期结果是雌鱼转变成雄鱼，而原本的雄鱼将不产生任何变化。
(2)依西美坦(EM)+雌二醇(E2)组：EM+E2的预期结果是维持性别不变(因为E2是外源激素，吸收效率较低，会产生偏雄现象，但不会太过于偏雄)。
(3)二甲基亚砜(DMSO)作为空白对照，性别不产生变化。
其中，三个组每组3个重复，每个组内三对雌雄分开处理。
1.3.2换药方式
因为EM的最佳药效时长为22小时之内，所以有必要每日进行换水处理。我们一共有3组9个缸，
换药的流程：
购买了容量不等的塑料桶，用1L的量筒精确称量8.4L的系统水于桶内，并标记好刻度线，下一次可直接加水至刻度线，每组水箱专桶专用避免药物互相污染，此外准备一个5L的单筒用于添加水箱里的水。每次换水时将分装好的装有不同药物的离心管打开后放入相应的桶内，加满水后溶解彻底后将空管取出，放出原来水箱里的水，倒入混合好新药的水。
依次将上面养鱼缸中的水依次从排水沟倒出，留极少水，迅速放回系统，打开阀门让新的水流入，依次将所有的水换上。
该换药步骤每天于相同时间段重复，直至发生性反转为止。
1.3.3判断性反转成熟的方法
首先通过简单的外形判断是否性反转成功，然后可以对性反转的鱼做以下实验验证性反转效果。
(1)杂交实验
如果将性反转成功的斑马鱼用于和异性杂交，产生受精卵则说明产生了性反转。例如雌性斑马鱼性反转成雄性后，利用性反转后的斑马鱼与雌性斑马鱼杂交，产生受精卵则说明雌性斑马鱼性反转成雄性斑马鱼成功。
(2)相关基因的表达
与性别相关的基因在斑马鱼中有许多，我们可以关注与雌性或雄性相关基因的表达情况，有些基因在雌性中表达，而在雄性中是不表达的，有些基因在雄性中表达而在雌性中不表达，还有的基因在雌雄性中的表达量差异显著。对比加药组与空白组的相关基因是否表达或表达量的变化量判断是否产生性反转。
(3)性腺器官的石蜡切片
通过观察性反转的斑马鱼是否长出异性的性腺器官，通过石蜡切片来观察性腺器官的组织形态来判断是否性反转成功。
2.结果
2.1发现雌鱼外形向雄性变化
自从2018年3月19日开始进行加药处理，到2018年5月22日EM组发生了外形上的显著变化，处理的雌性斑马鱼出现了体色变红，体型由圆鼓型变成了扁平梭状等雄性特征，初步判断发生了性反转。
2.2验证性反转雌鱼是否能正常交配
本次实验将验证EM组雌鱼的性反转效果，一共有9条雌鱼，2，3号缸一共选了2条雌鱼，1号组选了一条雌鱼与野生型未药物处理的雌鱼(WT)杂交。其中不乏有2条雄性特征不太明显的，有3条基本已经转雄。
次日回收了昨天杂交的验证性反转的鱼卵，其中有3缸产卵了，这三缸的雄性特征比较明显，另外两条没有杂交出来，没杂交出来的鱼体型都比较大，推测体型大的雌鱼转雄时间较长。三缸卵的数量分别是236，162，11，卵没有明显的细胞结构，并呈现白色，图6和图7均为受精9小时拍摄，其中，图7是图6的放大版，集中观察卵内的受精失败后的结构。
这批鱼3月19日开始药物处理，已经两个月又一周了，一部分鱼已经开始发生性反转了，我们的到以下结论：
(1)产出的卵均未受精，但是刺激了野生型雌性斑马鱼产卵。
(2)没有受精的(卵中有白点的)推测精巢基本成熟，但产生的精子质量不好，无法有效的受精，需要药物处理一段时间，使其发育成成熟的精巢。
2.3验证产卵的来源
2018年5月27日产的的卵并没有受精，由于斑马鱼是体外受精的缘故，我们无法确切得知这些卵来自哪。推测以下情况：
(1)这些卵来自野生型的雌斑马鱼(期望情况)
(2)来自依西美坦(EM)处理的雌转雄斑马鱼，可能由于卵巢组织未发生完全凋亡，加上2个多月没有交配行为，导致其产卵。
所以我们设计以下实验进行论证：
(1)设计依西美坦(EM)雌鱼与野生雄性斑马鱼杂交：9对
实验目的：验证经过EM处理后的鱼完成了卵巢组织的凋亡，并不能产出卵子来。
预期结果：不能产出卵。
(2)设计DMSO雌鱼与DMSO雌鱼杂交：3对
实验目的：验证斑马鱼交配是因为视觉原因，当由雄鱼在时，雌鱼通过视觉能产卵；当两条雌鱼在时，通过视觉可能不会产卵，推测雌鱼会因为长期没有性行为而见到“鱼”(无论雄雌)都产卵。
DMSO已处理两个多月。
预期结果：不产卵。
其中，若没有办法区分雌雄的斑马鱼，我们进行了剪尾处理，而剪尾处理不会对斑马鱼的生理行为造成影响，而最后的结果是：
(1)依西美坦(EM)雌鱼与野生型雄鱼
9对产卵1缸，其中是1号缸产的卵，经过观察该雌鱼性反转不是太好，并且卵大部分都死了只有少量受精成功，推测可能是发生了卵巢的凋亡，导致产卵质量不好，其中这一缸卵的数量约为173颗，成功受精的约为20颗左右。
(2)二甲基亚砜(DMSO)雌鱼与二甲基亚砜(DMSO)雌鱼杂交
没有一缸产卵，符合预期假设，并且在交配的过程中没有发生明显的性行为，说明长时间没有性行为的雌鱼是不会因为有“鱼”的存在而自主产卵的。
2.4加药处理满三个月检验性反转效果
为了使性反转的效果更好一些，我们用药物处理了一个月，再次验证性反转效果。这次，我们随机在每个缸里挑出性反转雌鱼，一共挑了5条，进行杂交。
通过实验依西美坦(EM)雌鱼于野生型雄鱼杂交，其中有两对产卵了，并且是受精的，经过两天的观察是受精过的(图5)，其产卵个数分别是136颗和78颗(图1)，最终存活为112和72条小鱼。
由此可以得到以下三个结论：
(1)依西美坦(EM)处理过的雌鱼经过92天(3/19—6/18)处理发生稳定性反转。
(2)92天处理后依西美坦(EM)雌鱼于野生型雄鱼杂交可以得到受精卵，即形成了稳定的精巢组织。
2.5探究雌性斑马鱼性反转成雄性斑马鱼产卵受精的原因
这次我们将目标锁定在上次产卵的1号缸中，再次验证其性反转效果，利用依西美坦(EM)雌鱼与野生雄性斑马鱼的实验，最后的结果是只有一缸产了卵，一共产卵26颗，并且是受精的，而这条斑马鱼外形符合雄鱼特征，并且该鱼为上次产卵的鱼。
接下来将这条产卵的经过依西美坦(EM)处理的斑马鱼进行解剖，对其性腺组织进行切片观察，发现是一个精巢组织，不过这个精巢组织比较肥大，伴随一些凋亡的卵巢组织(不完全的卵巢组织)，那么这些受过精的卵来自于这些未凋亡的卵巢组织(图3)。从细胞层面捕捉到了卵巢凋亡和精巢生成的细胞切片，更加说明了产生性反转的成功性，图2，图4作为对照。
4.讨论
在本发明中，采用4个月的成年斑马鱼作为研究性反转的材料，斑马鱼作为模式生物，将其进行性反转对于研究性别相关问题具有重要意义。在自然状态下，斑马鱼从出卵到性成熟需要3个月的时间，性成熟的斑马鱼一般也将其称为成年斑马鱼，这个时期的斑马鱼性别基本确定了，不会产生较大变化。
为了使成年雌性斑马鱼性反转，我们采用甾体类化合物(如依西美坦)去抑制雌激素的产生，使其发生转雄的现象。为了保证雌鱼雄鱼的区分，从形态学方面做一个粗略区分，再将区分好的斑马鱼两两进行杂交，产卵的那对斑马鱼才将其作为实验材料。配置了依西美坦(EM)100uL/L采用浸泡法处理雌性成年斑马鱼，并设置依西美坦(EM)+雌二醇(雌激素，E2)为阴性对照，设置二甲基亚砜(DMSO)作为空白对照。
经过两个月零一周的药物处理，从形态学方面观察雌性斑马鱼已经显示出肚子变小，身体变得扁平和体色变红等雄性特征了，而作为对照的依西美坦(EM)+雌二醇(雌激素，E2)和二甲基亚砜(DMSO)这两组雌鱼外形上没有产生变化。在性反转的雌鱼中挑选了5条鱼，并将他们与野生型(未经药物处理)的雌性斑马鱼杂交，其中有三对产卵但未受精。考虑到交配的随机性和个体之间的差异，一般认为每次杂交中5对斑马鱼里面产卵且受精2对即可说明性反转成熟。最终的结果是5对斑马鱼杂交只产生了3皿鱼卵，而且没有受精。那么，这些卵的来源可能自野生型的雌斑马鱼；来自依西美坦(EM)处理的雌转雄斑马鱼，可能由于卵巢组织未发生完全凋亡，加上2个多月没有交配行为，导致其产卵。
接下来设计了验证实验，目的是验证这批卵的来源，是来自野生型的雌斑马鱼还是来自依西美坦(EM)处理的雌转雄斑马鱼；是否斑马鱼由于长时间没有性行为从而导致自发的产卵而非产生性行为后而产卵。为此设计依西美坦(EM)雌鱼与野生雄性斑马鱼杂交。结果是9对鱼里面有一对产了卵，而正常情况9对鱼杂交应该有4到5对产卵。并且受精率只有11％，相比于正常杂交明显少很多(其中正常杂交受精率约为40％—60％)，从一定程度上说明经过这段时间的药物处理，对雌激素的抑制产生了一定效果，而推动雌性斑马鱼向雄性斑马鱼的转变。此外还设计了二甲基亚砜(DMSO)雌鱼与二甲基亚砜(DMSO)雌鱼杂交，目的是验证是否斑马鱼由于长时间没有性行为从而导致自发的产卵而非产生性行为后而产卵。最终的结果是3对鱼杂交没有产卵现象，并且通过观察，没有发现杂交的鱼有明显的性行为。
最后我们加药处理到三个月，此时仿照之前的做法随机挑选5对依西美坦(EM)处理的雌转雄斑马鱼，并将他们与野生雌性斑马鱼杂交，其中5对里面有2对产卵，其产卵个数分别是136颗和78颗，并且都是受精的，这个现象基本说明3个月处理后，大部分的雌性斑马鱼性反转成了雄性。
由于前面的实验依西美坦(EM)雌鱼与野生雄性斑马鱼杂交中9对鱼有一对产卵(我们后面将产卵的鱼进行确认)，并将产卵的依西美坦(EM)处理的雌鱼所在的鱼缸里的3条依西美坦(EM)处理过的雌鱼与3条野生雌性斑马鱼杂交。最后3对里面有一对产卵，产卵26颗，并且是受精的。把这条鱼进行解剖，对其性腺组织进行切片观察，发现是一个精巢组织，不过这个精巢组织比较肥大，伴随一些凋亡的卵巢组织(不完全的卵巢组织)，那么这些受过精的卵来自于这些未凋亡的卵巢组织。从性腺切片观察到凋亡的卵巢组织和新产生精巢组织并存的现象，可以说明卵巢组织正在向精巢组织发育，更加说明了雌性斑马鱼向雄性发育的过程。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种甾体类化合物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于促进鱼类的性反转。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐的第3、17位均为酮基。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ia结构：
5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式Ib结构：
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物或制剂还包括其他可以促进鱼类性反转的药物。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述其他可以促进鱼类性反转的药物选自下组：fadrozole、17—甲基睾酮、或其组合。
8.一种饲料，其特征在于，包括：
(a)甾体类化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构；
和
(b)水产学或渔业学上可接受的载体；
其中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
9.一种促进鱼类性反转的方法，其特征在于，包括步骤：
给需要的鱼类施用甾体类化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
10.一种制备性反转鱼类的方法，其特征在于，包括步骤：
在甾体类化合物或其药学上可接受的盐的存在下，饲喂鱼类，其中，所述甾体类化合物或其药学上可接受的盐具有式I所示的结构：
式中，
R1为H、-OH、或-CH3；
R2为H、＝CH2、或-CH3；
表示单键或双键。
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