CN110520778A - 光片显微镜 - Google Patents

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Abstract

介绍一种光片显微镜(10)，其包括：探测物镜(32)，该探测物镜用于对样本(44)的位于所述探测物镜(32)的焦点平面(54)中的目标区域(58)成像；照明物镜(20)，该照明物镜用于将照明光束(50)聚焦到所述样本(44)中，其中，所述探测物镜(32)和所述照明物镜(20)以它们的垂直于所述焦点平面(54)朝向的光轴(O2、O1)彼此相对，并且在它们之间规定了含有所述焦点平面(54)的样本空间(38)；样本保持器(40)，该样本保持器带有至少一个布置在所述样本空间(38)中的承载面(42)，所述样本(44)可放置在该承载面上；和带有转向面(48)的光转向装置(46)，该转向面在所述样本空间(38)中相对于所述探测物镜(32)的光轴(O1)侧向错开地布置，且被设计用来使得通过所述照明物镜(20)聚焦的照明光束(50)在垂直于所述探测物镜(32)的光轴(O1)的方向上转向，从而转向了的照明光束(50)形成聚焦到所述焦点平面(54)中的光片式的照明光分布(52)，其中，所述光转向装置(46)具有面向所述承载面(42)的碰撞区段(86)，该碰撞区段为所述承载面(42)规定了抵靠到所述光转向装置(46)上的机械的止挡，该止挡防止所述承载面(42)共平面地布置在所述焦点平面(54)中。所述承载面(42)以预定的倾斜角相对于所述焦点平面(54)倾斜，从而所述承载面(42)的一部分布置在所述焦点平面(54)中。

Description

光片显微镜
本发明涉及一种光片显微镜，其包括：探测物镜，该探测物镜用于对样本的位于探测物镜的焦点平面中的目标区域成像；照明物镜，该照明物镜用于将照明光束聚焦到样本中，其中，探测物镜和照明物镜以它们的垂直于焦点平面朝向的光轴彼此相对，并且在它们之间规定了含有焦点平面的样本空间；样本保持器，该样本保持器带有至少一个布置在样本空间中的承载面，样本可放置在该承载面上；和带有转向面的光转向装置，该转向面在样本空间中相对于探测物镜的光轴侧向错开地布置，且被设计用来使得通过照明物镜—优选聚焦的—照明光束在垂直于探测物镜的光轴的方向上转向，从而转向了的照明光束形成聚焦到焦点平面中的光片式的照明光分布，其中，光转向装置具有面向承载面的碰撞区段，该碰撞区段为承载面规定了抵靠到光转向装置上的机械的止挡，该止挡防止承载面共平面地布置在焦点平面中。本发明还涉及用于光片显微镜的改装套件。
近来，特别是在荧光显微术中，使用所谓的光片或光板片显微镜，其中，仅照射样本中的一个薄层。与传统的荧光显微镜相比，光片显微镜因而可实现更高的分辨率和更低的曝光量，从而减少了由于生物样本中的因褪色或光致应力而产生的并非所愿的效应。因此，光片显微镜可特别有益地用于活生物体的荧光研究。
从现有技术中已知用于实现光片显微镜的各种不同的光学布置。在本发明的上下文中，这里应特别提及通过两个分开的物镜进行照明和探测的布置。在这种情况下，照明物镜和探测物镜通常彼此垂直地布置。然而，各物镜的这种垂直布置尤其具有如下缺点：即其不能直截了当地集成到已有的显微镜系统例如共焦系统或扫描显微镜中。
为了避免该缺点，申请人以DE 10 2012 109 577 A1提出了一种布置，其中，不同于前述的垂直布置，照明物镜和探测物镜沿着竖直轴—例如在倒置式显微镜座架中实施—彼此相对。为了在这种布置中也能产生垂直于探测轴的光片，使得沿着竖直的座架轴穿过照明物镜的照明光束朝向反射镜系统，该反射镜系统使得照明光束以直角偏转，以便在探测物镜的水平的焦点平面中按常规方式以光片式的照明光分布来照射样本。样本的位于焦点平面中的目标区域于是通过探测物镜被成像到照相机传感器上。
前述的反射镜系统由两个反射镜部件构成，这些反射镜部件以45°的角度布置在探测物镜的光轴两侧。相应的反射镜部件的沿光轴测得的延展通过光横截面来确定，照明光束在反射镜部件的位置具有该光横截面。由于照明物镜被设计用来使得照明光束聚焦，从而该照明光束在样本的目标区域中沿着探测物镜的光轴具有其最小的延展，所以，相比于在样本的目标区域中，照明光束的光横截面在相应的反射镜部件的位置仍明显较大。因此，反射镜部件平行于探测物镜的光轴具有至少与光横截面的延展相应的延展，这需要比较繁琐的样本制备。因而所使用的样本保持器的通常设计成透明的盖玻片的承载面不能精确地位于探测物镜的用光片照明的焦点平面中，因为盖玻片在其到达焦点平面之前在其靠近探测物镜时与安置在探测物镜上的反射镜系统相撞。为了补偿在样本保持器的承载面与焦点平面之间的由此导致的轴向偏移，必须在设置于承载面上的基座上制备样本。尽管该基座只有几百微米高，但它特别是在从无基座的制备切换时使得样本制备变得困难，这种制备比如在宽视野显微术或共焦显微术中很常见。
对于其它现有技术，参见出版物：Chen,B.-C.等人的“Lattice light-sheetmicroscopy:imaging molecules to embryos at high spatiotemporalresolution.Science 346,1257998(2014)”；Planchon,T.A.等人的“Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam planeillumination.,Nat.Methods 8,417(2011)”；和Wu,Y.等人的“Inverted selective planeillumination microscopy(iSPIM)enables coupled cell identity lineaging andneurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.PNAS 108,17708(2011)”。由这些出版物公开了一些布置，在这些布置中，照明物镜和探测物镜分别位于盖玻片的同一侧，并且相对于该盖玻片设置成45°的角度。
在DE 10 2013 107 297 A1中公开了一种光片显微镜，其中，照明物镜和探测物镜同样布置在盖玻片的一侧，其中，照明物镜或探测物镜相对于盖玻片所形成的相应角度借助相应物镜的数值孔径预先设定。
最后，由DE 10 2012 110 077 A1已知一种光片式显微镜，其中，照明物镜和探测物镜位于盖玻片的相反侧。在此，探测物镜像通常的那样垂直于盖玻片朝向。相比之下，照明物镜相对于盖玻片倾斜。
本发明的目的是，对开篇所述类型的光片显微镜加以改进，从而它能实现高精度地成像，并且样本制备简单。
本发明通过一种光片显微镜来实现该目的，该光片显微镜包括：探测物镜，该探测物镜用于对样本的位于探测物镜的焦点平面中的目标区域成像；照明物镜，该照明物镜用于将照明光束聚焦到样本中，其中，探测物镜和照明物镜以它们的垂直于焦点平面朝向的光轴彼此相对，并且在它们之间规定了含有焦点平面的样本空间；样本保持器，该样本保持器带有至少一个布置在样本空间中的承载面，样本可放置在该承载面上；和带有转向面的光转向装置，该转向面在样本空间中相对于探测物镜的光轴侧向错开地布置，且被设计用来使得通过照明物镜—优选聚焦的—照明光束在垂直于探测物镜的光轴的方向上转向，从而转向了的照明光束形成聚焦到焦点平面中的光片式的照明光分布，其中，光转向装置具有面向承载面的碰撞区段，该碰撞区段为承载面规定了抵靠到光转向装置上的机械的止挡，该止挡防止承载面共平面地布置在焦点平面中。根据本发明，承载面以预定的倾斜角相对于焦点平面倾斜，从而承载面的一部分布置在焦点平面中。
本发明因而规定，样本保持器的承载面相对于照明物镜和/或探测物镜的焦点平面倾斜，该焦点平面与通过光片式的照明光分布所形成的照明平面重叠，以便使得承载着样本的承载面的一部分位于照明物镜和/或探测物镜的焦点平面中。由此可以实现无基座地直接在样本保持器的承载面上制备或布置样本。这特别是当显微镜同时用作宽视野显微镜和/或共焦显微镜时明显便于使用光片显微镜工作，其中，通常本来就直接在承载面或载物片或盖玻片上且在无基座的情况下进行样本制备。
本发明的光转向装置例如以一个唯一的反射镜部件的形式来实现，该反射镜部件相对于探测物镜的光轴侧向偏移地布置，进而相对于样本的待通过探测物镜成像的目标区域侧向偏移地布置。在这种情况下，光转向装置也可以这样来设计：它具有多个反射面，以便能够根据意愿来改变在照明平面内部、进而在焦点平面内部的照明方向，以便例如从略微不同的方向对样本予以照明。
本发明的优点在于，本发明的样本照明无需样本基座的辅助也可以按简单的方式在本来就存在的显微镜系统上实现。只需要倾斜的承载面以及相应设计的可轻易地加装的光转向装置。
样本保持器的承载面优选至少部分地设计成透明，其中，照明物镜使得照明光束透过承载面的透明的部分指向转向面。尤其可行的是，样本保持器撇开其按照通常的盖玻片方式的承载面的倾斜姿态不看，即在其整体上透明地设计。通过至少部分透明地设计承载面，可以实现使得从照明物镜射出的照明光束在靠置于承载面上的样本附近透过样本保持器照射到光转向装置的转向面上，以便然后使得该照明光束为了产生光片而从旁侧垂直地在探测物镜的焦点平面中转向到该探测物镜的光轴上。
替代地或附加地，承载面—必要时与浸入介质和/或样本介质配合作用地—经过设计，从而照明光束的尽量少的部分在承载面上被反射。这尤其被考虑用来使得照明光束在经过承载面并且在转向面上转向之后又照射到承载面上。这可以按如下方式来实现：给承载面例如涂覆抗反射涂层，该抗反射涂层被设置或者被优化用于照明光的所采用的波长。使用浸入介质和/或样本介质—其折射率在很大程度上适配于样本保持器的折射率(或者相反，样本保持器的折射率适配于样本和浸入介质)—也能减小照明光束的反射份额。
在一种优选的实施方式中，照明物镜被设计用来使得照明光束—在照明光束首次照射在样本保持器或承载面上的情况下—在垂直的入射方向上朝向承载面的透明的部分。该实施方式考虑了当照明光束倾斜地穿过样本保持器的承载面时出现像差的情况。如果在探测物镜和承载面之间的样本介质所具有的折射率不同于处在承载面与照明物镜之间的介质，则所述像差会更严重。通过在该实施方式中规定光垂直地照射到承载面上，可以减小或者避免这种像差。
样本保持器例如构造成显微镜载物台插入件，该显微镜载物台插入件在其尺寸上适配于或者基本上相同于其它被设置用于现有的显微镜载物台的插入件，因而可轻易地更换。这种插入件在其底部例如具有一个或多个透明的、倾斜的承载区段，在这些承载区段上可以放置样本。也可行的是，只把相应的承载区段的一部分设计成透明，并且照明光束透过该透明的部分照射到转向面上。承载区段的剩下的部分，特别是样本所在的部分，于是可以设计成不透明，并且例如设置有标记或模制部件，以便比如位置正确地定位样本、机械地引导样本和/或防止样本在倾斜的承载面上打滑。优选地，承载面与样本保持器和/或显微镜载物台配合作用地设有校准或编码标记，以便光片显微镜的控制机构识别出承载面相对于照明物镜和/或探测物镜的相对位置，并且由此能够计算出或者识别到盖玻片的当前高度。控制机构由此一方面识别出样本的位置，另一方面能够避免在转向反射镜与承载面(和/或照明物镜或探测物镜)之间的碰撞。
优选地，光转向装置安置在探测物镜的面向样本的部分上。因而将光转向装置例如设计成所谓的反射镜盖的形式，其可以就像由现有技术已知的反射镜盖那样安置在探测物镜上并且可以与其松开。然而，不同于常见的反射镜盖—其具有两个相对于探测物镜的光轴侧向地错开的反射部件，在该改进中，反射镜盖只有唯一的反射部件，以便能实现承载面的倾斜的姿态，而无需抵靠到反射镜盖上。
优选地，照明物镜和转向面配合作用，使得通过聚焦的照明光束在焦点平面中形成的光片式的照明光分布在探测物镜的光轴上具有其最小的轴向延展。光片沿着探测物镜的光轴的所述轴向延展越小，在成像中可实现的分辨率就越高。
样本保持器的承载面相对于焦点平面倾斜的预定的倾斜角，优选地处于从下限角度直至上限角度的角度范围内，在所述下限角度情况下，样本保持器的承载面与光转向装置的碰撞区段相抵靠。上限角度例如也通过使得承载面抵靠在光转向装置上来确定。
承载面与焦点平面相交时的倾斜角的顶点，优选位于图像区的面向转向面的边缘上，该图像区规定了通过探测物镜成像的目标区域。对于承载面的或样本保持器的上述校准或编码标记，可以相应地标明该顶点，从而光片显微镜的控制单元的顶点位置是已知的或者可以知道。
转向面的延展大小经过优选设计，使得转向面在探测物镜的光轴上的投影基本上等于照明光束在所述投影中在转向面上所具有的光横截面积或光直径。由此确保转向面的轴向延展局限于在转向面上转向之前照明光束的光横截面积，从而可以使得样本保持器的承载面相对于焦点平面倾斜的倾斜角保持比较小。
在一种优选的实施方式中，光片显微镜包含有布置在照明物镜之前的照明单元，该照明单元带有光源和光片产生器，该光片产生器被设计用来与照明物镜配合作用地从照明光束中产生光片式的照明光分布，该照明光束由光源产生。
在一种特别优选的设计中，光片产生器包括扫描单元。该扫描单元被设计用来使得由光源产生的照明光束转向，从而该照明光束在探测物镜的焦点平面中进行扫描运动，通过这种扫描运动形成光片。为此，扫描单元具有一个或多个扫描反射镜，这些扫描反射镜使得照明光束按所希望的方式转向。作为扫描单元，例如可以使用带三个扫描反射镜的共焦扫描器，其中的第一和第二扫描反射镜例如负责使得照明光束在x-方向上倾斜，第三扫描反射镜负责在y-方向上倾斜。在此，第一和第二x-扫描反射镜用来使得照明光束围绕位于y-扫描反射镜上的一点倾斜。第二x-扫描反射镜因而部分地补偿通过第一x-扫描反射镜引起的倾斜，从而照明光束在沿y-方向倾斜的第三扫描反射镜上保持在通常处于光轴上的固定的位置。在本发明的范畴内，这些反射镜也可以配合作用，从而照明光束既沿着x-方向偏移，又围绕y-方向倾斜，并且在照明光束首次照射在承载面或样本保持器上时垂直地射到相对于照明物镜的光轴倾斜的承载面上。(可能在下面：
在一种优选的实施方式中，照明物镜的光轴相对于探测物镜的光轴侧向地偏移。因而例如可行的是，照明物镜借助合适的适配器在物镜旋座中侧向地移动。
照明物镜的前述侧向偏移考虑到了如下情况：在没有这种偏移时，照明物镜的放大率肯定比较小，以便保证照明物镜以照明光束射到侧向偏移的转向面上。相比之下，如果让照明物镜实现侧向偏移，由此就会明显减小对照明物镜的放大率的要求。在照明物镜侧向偏移时，其入射光瞳不能完全利用照明光束予以照明，这种事实在优选的应用中是毫无问题的，因为优选在下面对入射光瞳进行照明，以便使得照明光束相对于照明物镜的光轴出现所希望的倾斜。
相应地，光片产生器经过优选设计，使得照明光束朝向照明物镜的入射光瞳的部分区域，该部分区域相对于照明物镜的光轴从入射光瞳的中心侧向地偏移。
此外，光片产生器经过优选设计，使得照明光束相对于照明物镜的光轴倾斜地朝向所述的部分区域。
在一种有利的设计中，承载面可沿着轴移动，以便使得焦点平面在样本内部移动，其中，所述轴可以通过探测物镜的光轴、与探测物镜的光轴垂直的轴或者垂直于承载面的轴规定。在此特别优选的是，承载面沿着垂直于承载面的轴移动。这种移动运动可以通过轴向移动和横向移动的叠加来实现。该移动运动导致具有梯形横截面的图像空间。承载面沿着照明光束的传播方向移动的另一优点在于，照明光束始终都射在转向面的同一侧。当承载面垂直于照明光束的传播方向移动时也是如此。
上述目的还通过一种用于光片显微镜的加装件来实现，该加装件具有样本保持器插入件和光转向装置。该样本保持器插入件和光转向装置在此按照上述设计并且特别是根据权利要求1～15中任一项来构造，且可加装到显微镜或光片显微镜中，使得承载面相对于焦点平面以预定的倾斜角倾斜，从而承载面的一部分布置在探测物镜的(和/或照明物镜的)焦点平面中。最后，根据本发明的加装件适合于把已有的传统的显微镜或光片显微镜构造成根据本发明的光片显微镜。从事于本领域的本领域技术人员在了解到上述介绍的情况下相应地设计这种加装件，因而参见说明书的前述部分，以避免赘述。
本发明将在下面借助附图予以详述。其中：
图1为根据本发明的光片显微镜的示意图；
图2示出光转向装置，其与样本保持器的按通常方式水平地朝向的承载面配合作用；
图3为与图2相应的视图，其带有样本保持器的根据本发明倾斜的承载面；
图4为通常按45°布置的承载面的示意图；
图5为与图4相应的视图，其带有根据本发明倾斜的承载面；
图6为示意图，其用来示出照明光束在物镜光瞳中的侧向偏移如何导致照明光束在聚焦平面中的倾斜；
图7为示意图，其用来示出照明光束在物镜光瞳中的倾斜如何导致照明光束在聚焦平面中的侧向偏移；
图8为与图7相应的视图，其中，照明物镜和探测物镜相互同轴地对准；
图9为示意图，其用来示出通过按最小的倾斜角布置的承载面的移动而产生的图像空间；
图10为与图9相应的视图，其中，承载面布置成最大的倾斜角；
图11为示意图，其用来示出使得承载面移动以便产生立体图像的各种不同的方案；
图12示出根据本发明的样本保持器的一个实施方式；和
图13分别示出通常的和根据本发明的使用显微镜载物台的样本保持器的实施方式。
图1示出光片显微镜10，它是本发明的一个实施例。
光片显微镜10包含照明单元12，该照明单元包括光源14、扫描单元16、管透镜18和照明物镜20。扫描单元16由三个扫描反射镜22、24和26以及一个扫描透镜28构成。
光片显微镜10还包含探测单元30，该探测单元具有探测物镜32、目镜34和照相机36。
在探测物镜32和照明物镜20—它们以其光轴O1和O2彼此同轴地相对设置—之间限定了样本空间38，样本保持器40位于该样本空间中。样本保持器40例如设计为平面平行的透明板，该样本保持器具有面向探测物镜32的承载面42，在该承载面上布置着要成像的样本44。
光片显微镜10还具有例如设计成反射镜盖的光转向装置46，该光转向装置安置在探测物镜32上，从而其以反射镜形式构造的转向面48横向地相对于探测物镜32的光轴O1错开。光转向装置46用于使得照明光束50转向，照明单元16按下述方式使得该照明光束射入到样本空间38中。
由光源14产生的照明光束50首先被输送给扫描单元16。在根据图1的实施例中，扫描单元16形成共焦扫描器，该共焦扫描器由三个扫描反射镜22、24和26形成。两个扫描反射镜22和24在此用于使照明光束50在第一方向上偏转，该第一方向参照根据图1的坐标系平行于x-轴。相比之下，在光传播方向上布置在两个x-扫描反射镜22、24之后的扫描反射镜26使得照明光束50在平行于y-轴的方向上偏转。三个扫描反射镜22、24和26配合作用，从而两个x-扫描反射镜22、24使照明光束50围绕位于y-扫描反射镜26上的点倾斜。通过这种方式，第二x-扫描反射镜24在一定程度上补偿了照明光束50的由第一x-扫描反射镜22引起的倾斜，从而照明光束在沿y-方向(垂直于图面)倾斜的y-扫描反射镜26上保持在固定的位置。该位置不一定位于光轴O2上。
y-扫描反射镜26使得照明光束50转向到扫描透镜28上，该扫描透镜使得照明光束50朝向管透镜18上。当该实施例中，照明光束50在进入到照明物镜20中时并不完全照明其入射光瞳。另外，照明光束50相对于照明物镜20的光轴O2侧向地偏移，并且在照明物镜20的入射光瞳中相对于光轴O2倾斜。
作为平行光束入射到照明物镜20中的照明光束50通过该照明物镜被聚焦，并指向光转向装置46的转向面48。布置在探测物镜32的光轴O1的旁侧的转向面48然后使得照明光束50基本上垂直于光轴O1向内转向到样本空间38中。由于照明物镜20的聚焦作用，于是在样本空间38内部产生了—特别是与扫描反射镜22、24配合作用—垂直于探测物镜32的光轴O1的光片状照明光分布52，该照明光分布在下面简称为光片。光片52规定了与探测物镜32的焦点平面重合的照明平面。样本44的利用光片52被照明的目标区域因而通过探测物镜32清晰地成像到照相机36上。相关地应该指出，为明了起见，图1中的光片52位于样本44的外部。然而不言而喻的是，光片52在实际成像中被聚焦到样本44内，以便照亮要成像的目标区域。
如图1中所示，样本保持器40在光片显微镜10中布置成使得其承载面42相对于照明平面倾斜，进而相对于探测物镜32的焦点平面倾斜。承载面42的这种倾斜是本发明的一个重要方面。然而，为了说明该方面，首先参见根据图2的示意图，其示出了承载面42在现有技术中目前通常水平的朝向和由此带来的缺点。
图2示出了光转向装置46，其反射镜面48相对于图2中未示出的探测物镜32的光轴O1侧向地错开。反射镜盖46具有端面86，该端面面向样本保持器40的在图2中纯示范性地作为虚线示出的承载面42。端面86形成用于承载面42的止挡，该止挡在承载面42水平地朝向的情况下防止承载面42共面地位于探测物镜32的焦点平面54中。
图2中还示出了图像区56，其垂直于探测物镜32的光轴O1具有宽度dFOV。样本的在图1中用58表示的目标区域位于图像区56内部，该目标区域位于焦点平面54中，并因此通过探测物镜32成像到图1中所示的照相机36上。侧向偏移的转向反射镜48相距图像区56的位于光轴O1上的中心具有的距离在图2中用dSK/2表示。另外，在图2中，参量AA表示探测物镜32相距焦点平面54的工作距离。
由于转向反射镜48具有使得照明光束50尽量无光损失地朝向图像区56的中心反射的功能，因此其轴向延展，即其在探测物镜32的光轴O1上的投影中的延展，不得小于照明光束50在转向反射镜48的位置处具有的光束横截面。然而由于照明光束50现在被聚焦到图像区56的中心，所以照明光束50的光束横截面在转向反射镜48处明显大于在图像区56的中心。这导致，由聚焦的照明光束50规定的并且与焦点平面54重叠的照明平面，沿着探测物镜32的光轴O1，相对于光转向装置46的水平端面86(在图2中向上)偏移。因为光转向装置46的端面86规定了承载面42接下来靠近焦点平面54，由此在承载面42和焦点平面54之间出现了在图2中用cSK表示的轴向的偏移量。在现有技术中，该偏移量cSK在样本制备的过程中借助于设置在承载面42上的基座(未示出)来补偿，该基座的在光轴O1方向上的高度恰好等于轴向的偏移量cSK。
在根据图3的示意图中示出，在其它方面与图2相同地布置情况下，如何通过承载面42的根据本发明的倾斜位置来实现无基座的样本制备。
如图2中所示，承载面42相对于焦点平面54倾斜一个倾斜角，该倾斜角处在从下限角度γmin到上限角度γmax的角度范围内。相对于焦点平面54的所述倾斜角在此与顶点B有关，该顶点由承载面42和焦点平面54之间的相交点规定。最小的倾斜角γmin是通过承载面42的抵靠到光转向装置46的端面86上的在图2中用A表示的止挡来确定的。相比之下，最大的倾斜角γmax是通过承载面42的抵靠到光转向装置46的一部分上的在图3中用C表示的止挡来确定的，该部分位于光转向装置46的背离转向反射镜48的侧面上。这意味着，承载面42可以在由两个机械的抵靠到光转向装置46上的止挡A和C限定的角度范围内相对于探测物镜32的光轴O1倾斜地布置。
从图3中的示图，特别是朝向止挡C观察，可以清楚地看到，根据本发明的光转向装置46仅具有一个唯一的转向部件，即在图3中布置在光轴O1左侧的转向反射镜48。只有这样才可以使得位于光轴O1另一侧的止挡C远离焦点平面54一定距离，从而可以规定足够大的倾斜角γmax。另外在图3中示出，照明光束50相对于光轴O1优选倾斜一定程度，使得该照明光束垂直地射到倾斜的承载面42上。因此，照明光束50在图3中以两个不同的入射方向被示出，其中一个入射方向与最小倾斜角γmin有关，另一个入射方向与最大倾斜角γmax有关。照明光束50的这种倾斜用于避免像差，该像差在照明光束50以其它方式倾斜地入射到承载面42上时总是发生，特别是当探测物镜32和承载面42之间的介质的折射率不同于位于承载面42和照明物镜20之间的介质的折射率时发生。
为了使照明光束50如上所述地为避免相像差而相对于探测物镜的光轴O1适当地倾斜，致使该照明光束垂直地射到承载面42上，转向反射镜48必须相应地倾斜，以确保在转向反射镜48上反射的照明光束50垂直于光轴O1朝向图像区56入射。这在图4和5中示出。
图4纯示意性地示出了常规布置中的转向反射镜48的朝向，在该布置中，照明光束50平行于光轴O1入射到转向反射镜48上。在这种布置中，转向反射镜48相对于光轴O1倾斜45°。
相比之下，图5示出了相应于图3的布置，在该布置中，照明光束50相对于光轴O1倾斜了角度γ，该角度等于承载面42的倾斜角。光线倾斜角为γ的结果是，转向反射镜48相对于通常的45°-方向倾斜了角度γ/2。
下面针对图3中所示的参量纯示范性地示出了对要使用的照明物镜20的某些要求。
最小倾斜角γmin由sinγmin＝cSK/((dSK-dFOV)/2)得到。
如果例如cSK值为500μm，dFOV值为330μm和dsk值为6mm，则γmin的值为9.1°。而如果dSK约为3.5mm，则γmin的值为15.1°。
对于数值孔径NAIO和照明物镜的工作距离AA，由此得到以下条件：
NAIO>sin(γ+αill)，
在γ＝γmin＝9.1°、αill＝arcsin(0.15/1.33)＝6.5°时，NAIO>0；27；
在γ＝γmin＝15.1°、αill＝arcsin(0.15/1.33)＝6.5°时，NAIO>0；37；
AA>dSK/2+x，x＝dSK/2sinγ，
在dSK≈6mm、γ＝γmin＝9.1°时，x＝0.47mm→AA>3mm+0.47mm≈3.5mm；
在dSK≈3.5mm、γmin＝15.1°时，x＝0.46mm→AA>1.75mm+0.46mm≈2.25mm。
因此，合适的照明物镜具有相对较大的自由工作距离，并且可以具有高达0.4或更大的数值孔径。
另外，照明物镜20应具有相对较小的放大率，以确保从照明物镜20射出的照明光束50射到光转向装置46的转向反射镜48上。如果又纯示范性地假定，共焦扫描器或扫描单元16(参见图1)的视场数大约为20mm，则在距离为dSK＝8mm或更大情况下，只有当照明物镜20具有最大为2.5的放大率时，反射镜才能被照明光束照射到。放大率约为2.5的照明物镜通常仅具有较小的数值孔径，例如0.07。另一方面，具有较高孔径0.3的物镜通常也具有较高的放大率，因此在共焦扫描器的给定视场数情况下，只有彼此相距较小距离dSK的光转向装置才能射到。因此当前规定，照明物镜20相对于探测物镜32的光轴O1例如借助于合适的适配器侧向地移动，以便减小对物镜放大率的要求。在图6中纯示意性地示出了相应的实施方式。
在根据图6的布置中，照明物镜20的光轴O2相对于探测物镜32的光轴O1侧向地偏移。因此，在下面对照明物镜20的入射光瞳84予以照明的照明光束50相对于光轴O2具有在图6中用箭头P1示出的侧向偏移。入射光瞳84位于照明物镜20的后焦点平面中，该入射光瞳中的这种侧向偏移导致照明光束50在图像平面中倾斜，进而在探测物镜32的焦点平面中倾斜。这种光束倾斜在图6中用箭头P2表示。照明光束50的倾斜度恰好调节成使得照明光束50垂直地射到样本保持器40上。
为了确保照明光束50射到光转向装置46的转向反射镜48上，有利的是，照明光束50附加地在照明物镜20的入射光瞳中倾斜，根据图3中的示图，该光转向装置通常位于图像区56的边缘。物镜光瞳中的这种附加的光束倾斜在图7中用箭头P3示出。该光束倾斜在焦点平面上导致照明光束50的在图7中用箭头P4表示的侧向偏移。
图7中所示的倾斜伴有照明光束50的偏移，这种倾斜当然不限于光轴O2相对于O1的偏移。如上所述，照明物镜20是否必须相对于探测物镜32偏移，主要由以下事实确定：转向面48在照明物镜20的图像区中必须与扫描单元16连接。图8中示出了一种替代性的布置，该布置在照明物镜20相对于探测物镜32没有侧向偏移的情况下就可应付得了。这通过如下方式来实现：相比于在根据图7的布置中，把用箭头P1表示的光偏移度以及用箭头P3表明的在物镜光瞳84中的光倾斜度选择得相应地较大。在这方面，图8中所示的布置相应于根据图1的实施方式，其中，那里示出的、由三个扫描反射镜22、24和26形成的扫描单元16负责使得照明光束50根据图8按照所希望的方式在入射光瞳中或者在照明物镜20的物镜光瞳84中侧向地偏移或倾斜。
在图9和10中示出，样本保持器40如何能够在样本空间38中移位，以便为了立体成像的目的连续地摄取一系列单个图像。参考图3，这里在图9中示出了一种布置，在该布置中，承载面42相对于焦点平面54以最小的倾斜角γmin倾斜。因此在这种布置中，也在图3中示出的止挡A起作用。相比之下，在图10中，承载面42相对于焦点平面54以最大的倾斜角γmax定位，由此止挡C起作用。
在图9和10中分别参照坐标系，其x'-轴平行于样本保持器40的承载面42，其z'-轴垂直于该承载面42。相应地，图9和10一方面示出了承载面42沿着x'-轴即平行于承载面42移动，另一方面沿着z'-轴即垂直于承载面42移动(分别用两个箭头表示)。由承载面42沿着x'-轴的移动产生单个图像，这些单个图像在整体上产生所检测的图像空间60。相应地，由承载面42沿着z'-轴的移动产生单个图像，这些单个图像在整体上产生图像空间62。
图11是纯示意图，其中总览性地示出了摄取一组单个图像64的四种方案。在此，图11在局部图a)中示出了一种布置，在该布置中，承载面42在z-方向上即沿着探测物镜32的光轴O1移动。图像空间的位于承载面42上方的区域用66表示，图像空间的位于承载面42下方的区域用68表示。
在图11的局部图b)中示出承载面42在x-方向上即平行于焦点平面64移动。这种移动不是优选的，因为通过该移动不能获得空间数据。
在图11的局部图c)中所示的布置情况下，承载面42在z'-方向上即在垂直于承载面42的方向上移动。由此可以产生垂直于承载面42的图像组，由该图像组的数据，通过适当的数据处理，例如采用所谓的切片重组-方法，可以获得平行于承载面42的图像，与在局部图a)中所示的情况不同，这些图像的沿着x-轴的位置不取决于z'。
最后在局部图d)中示出了承载面42沿x'-轴的移动。特别是当具体存在的几何条件使得不必担心布置在承载面42上的样本与光转向装置46碰撞时，这种移动是有利的。
图12示出了样本保持器70，该样本保持器例如形成用于显微镜载物台的插入件，并且具有多个倾斜的承载面72、74、76。在每个所述承载面72、74、76上都可以布置样本78、80或82。样本保持器70例如被设计为使得它可以容易地插入到现有的显微镜载物台中。为了能够实现让照明光束50透过，样本保持器70在其整体上透明地设计，或者也可以仅仅部分地透明地设计。例如可行的是，仅仅把相应的倾斜的承载面72、74、76的透过照明光束50的部分设计成透明，而余下的部分不透明。由此可以实现在样本保持器70的不透明的部分上例如设置一些标记或模制件，相应的样本78、80、82机械地穿过它们，以便避免样本在倾斜的承载面上滑动。
图13在部分a)中示出了用于样本保持器的常规的显微镜载物台插入件90，中间是俯视图，左边是沿着在俯视图中示出的线A-A剖切的剖视图，右边是立体图。在图13的部分b)中示出了用于本发明的样本保持器(未示出)的根据本发明的显微镜载物台插入件90，中间是俯视图，左边是沿着在俯视图中示出的线A-A剖切的剖视图，右边是立体图。
在图13a)所示的常规显微镜载物台插入件90中，可以将—具有标准尺寸的—载物片或盖玻片插入到嵌入式设计的边缘区域92中并且易于更换。样本位于载物片或盖玻片上。显微镜载物台插入件90具有侧壁94，该侧壁用于例如在显微镜载物台插入件90的内部区域中添加水性样本介质，以便样本(在图13中未示出)在用显微镜检查时处于尽量真实的环境中。嵌入式设计的边缘区域92与部分圆形的插入区域96的表面基本上平行地设计。部分圆形的插入区域96用于将显微镜载物台插入件90插入到在显微镜载物台(图13中未示出)上相应地构造的凹口中。
在图13b)所示的根据本发明的显微镜载物台插入件90中，同样可以将样本所位于的载物片或盖玻片插入到嵌入式设计的边缘区域92中。该显微镜载物台插入件90也具有侧壁94，该侧壁94用于例如在显微镜载物台插入件90的内部区域中添加水性样本介质，以便样本(在图13中未示出)在用显微镜检查时处于尽量真实的环境中。嵌入式设计的边缘区域92相对于部分圆形的插入区域96的表面基本上形成倾斜角γ。就此而言，插入到嵌入式设计的边缘区域92中的带有承载面的盖玻片或载物片相对于探测物镜的焦点平面以预定的倾斜角γ布置。
通过显微镜载物台插入件90的突出超过部分圆形的插入区域96的圆周的两个侧向区域98，可以确保显微镜载物台插入件90总是以规定的方向插入到具有相应凹口的显微镜载物台中。优选地，显微镜载物台和显微镜载物台插入件90被适当地校准，使得在规定的显微镜载物台位置，光片显微镜的控制机构的盖玻片的高度是已知的，特别是以便避免转向反射镜和盖玻片之间的碰撞。
最后要特别地指出，上述实施例仅用于描述要求保护的教导，但该教导并不局限于这些实施例。特别地，本说明书中包含的所有特征和/或其功能、作用和特性，在此可以视为单独公开和/或相互组合地公开，本领域技术人员必要时在其专业知识的辅助下会单独地或组合地规定它们，以便实现客观目的或解决与其相关的问题。
附图标记清单
10 光片显微镜
12 照明单元
14 光源
16 扫描单元
18 管透镜
20 照明物镜
22 扫描反射镜
24 扫描反射镜
26 扫描反射镜
28 扫描透镜
30 探测单元
32 探测物镜
34 目镜
36 照相机
38 样本空间
40 样本保持器
42 承载面
44 样本
46 光转向装置
48 转向面
50 照明光束
52 光片
54 (32)的焦点平面
56 图像区
58 目标区域
60 图像空间
62 图像空间
64 单个图像
66 图像空间的部分
68 图像空间的部分
70 样本保持器
72 承载面
74 承载面
76 承载面
78 样本
80 样本
82 样本
84 入射光瞳
86 (46)的端面
90 显微镜载物台插入件
92 (90)的边缘区域
94 (90)的侧壁
96 (90)的插入区域
98 (90)的侧向区域
O1 光轴
O2 光轴
A 止挡
B 顶点
C 止挡
AA (32)的工作距离

Claims (16)

1.一种光片显微镜(10)，包括：
探测物镜(32)，该探测物镜用于对样本(44)的位于所述探测物镜(32)的焦点平面(54)中的目标区域(58)成像；
照明物镜(20)，该照明物镜用于将照明光束(50)聚焦到所述样本(44)中，
其中，所述探测物镜(32)和所述照明物镜(20)以它们的垂直于所述焦点平面(54)朝向的光轴(O2、O1)彼此相对，并且在它们之间规定了含有所述焦点平面(54)的样本空间(38)；
样本保持器(40)，该样本保持器带有至少一个布置在所述样本空间(38)中的承载面(42)，所述样本(44)可放置在该承载面上；和
带有转向面(48)的光转向装置(46)，该转向面在所述样本空间(38)中相对于所述探测物镜(32)的光轴(O1)侧向错开地布置，且被设计用来使得通过所述照明物镜(20)聚焦的照明光束(50)在垂直于所述探测物镜(32)的光轴(O1)的方向上转向，从而转向了的照明光束(50)形成聚焦到所述焦点平面(54)中的光片式的照明光分布(52)，
其中，所述光转向装置(46)具有面向所述承载面(42)的碰撞区段(86)，该碰撞区段为所述承载面(42)规定了抵靠到所述光转向装置(46)上的机械的止挡，该止挡防止所述承载面(42)共平面地布置在所述焦点平面(54)中，
其特征在于，所述承载面(42)以预定的倾斜角相对于所述焦点平面(54)倾斜，从而所述承载面(42)的一部分布置在所述焦点平面(54)中。
2.如权利要求1所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述承载面(42)至少部分地设计成透明，其中，所述照明物镜(20)使得所述照明光束(50)透过所述承载面(42)的透明的部分而指向所述转向面(48)，和/或，所述承载面(42)—必要时与浸入介质和/或样本介质配合作用地—经过设计，从而所述照明光束(50)的尽量少的部分在所述承载面(42)上例如通过抗反射涂层被反射。
3.如权利要求2所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述照明物镜(20)被设计用来使得所述照明光束(50)在垂直的入射方向上朝向所述承载面(42)的透明的部分。
4.如权利要求3所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述样本保持器构造成显微镜载物台插入件。
5.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述光转向装置(46)安置在所述探测物镜(32)的面向所述样本(44)的部分上，或者安置在所述照明物镜(20)上。
6.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述照明物镜(20)和所述转向面(48)配合作用，使得通过聚焦的照明光束(50)在所述焦点平面(54)中形成的光片式的照明光分布(52)在所述探测物镜(32)的光轴(O1)上具有其最小的轴向延展。
7.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述预定的倾斜角处于从下限角度直至上限角度的角度范围内，在所述下限角度情况下，所述承载面(42)与所述碰撞区段(86)相抵靠。
8.如权利要求7所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述承载面(42)与所述焦点平面(54)相交时的倾斜角的顶点，位于图像区(56)的面向所述转向面(48)的边缘上，该图像区规定了通过所述探测物镜(32)成像的目标区域(58)。
9.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述转向面(48)的延展，在所述探测物镜(32)的光轴(O1)上的投影中，基本上等于所述照明光束(50)在所述投影中在所述转向面(48)上所具有的光横截面积。
10.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于布置在所述照明物镜(20)之前的照明单元(12)，该照明单元带有光源(14)和光片产生器(16)，该光片产生器被设计用来与所述照明物镜(20)配合作用地从所述照明光束(50)中产生光片式的照明光分布(52)，该照明光束由所述光源(14)产生。
11.如权利要求10所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述光片产生器包括扫描单元(16)。
12.如权利要求10或11所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述照明物镜(20)的光轴(O2)相对于所述探测物镜(32)的光轴(O1)侧向地偏移。
13.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述光片产生器(16)被设计用来使得所述照明光束(50)朝向所述照明物镜(20)的入射光瞳(84)的部分区域，该部分区域相对于所述照明物镜(20)的光轴(O2)从所述入射光瞳(84)的中心侧向地偏移。
14.如权利要求13所述的光片显微镜(10)，其特征在于，所述光片产生器(16)被设计用来使得所述照明光束(50)相对于所述照明物镜(20)的光轴(O2)倾斜地朝向所述入射光瞳(84)的所述的部分区域。
15.如前述权利要求中任一项所述的光片显微镜(10)，其特征在于，为了使得所述焦点平面(54)在所述样本(44)内部移动，所述承载面(42)可沿着轴移动，该轴通过所述探测物镜(32)的光轴、与所述探测物镜(32)的光轴(O1)垂直的轴或者垂直于所述承载面(42)的轴来规定。
16.一种用于光片显微镜(10)的加装件，带有样本保持器插入件和光转向装置(46)，其中，所述样本保持器插入件和所述光转向装置(46)按照前述权利要求中任一项来构造，且可加装到显微镜或光片显微镜中，使得所述承载面(42)相对于所述焦点平面(54)以预定的倾斜角倾斜，从而所述承载面(42)的一部分布置在所述焦点平面(54)中。
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