CN110506708A - 一种阿尔茨海默症小鼠模型及评价方法 - Google Patents

Abstract

一种阿尔茨海默症小鼠模型，首先通过Zn²⁺与tau‑R3结合形成一种tau的寡聚体(Zn²⁺‑R3)，再将形成的寡聚体注射到六月龄C57小鼠的左脑皮层和右脑海马中。45天后，进行一系列的小鼠行为学和生化指标检测。本发明的阿尔茨海默症小鼠模型制备方法简单，价格低廉，历时较短，可作为一种理想的tau病理模型，为AD及其他tau病理疾病的机制探索和药物研究提供一定的实验基础。

Description

一种阿尔茨海默症小鼠模型及评价方法

技术领域

本发明涉及一种阿尔茨海默症小鼠模型。

本发明还涉及一种对上述阿尔茨海默症小鼠模型的评价方法。

背景技术

Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要功能是与微管蛋白结合组装成微管并保持微管的稳定、防止微管蛋白的解离。过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经纤维缠结(NFT)病理与多种中枢神经系统疾病密切相关，如阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、皮克病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、创伤性脑病、癫痫、额颞叶痴呆等，其中最常见的是AD。在这些疾病中，tau蛋白病理的分布和数量与认知功能损害的严重程度和表型密切相关。成功地对抗tau病理可能会阻止或减缓这些神经系统性疾病的进展。

AD是一种与年龄相关、不可逆转的神经退行性疾病，主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。随着人口老龄化的加剧，AD患者越来越多，在全球范围内已将近5000万，是除心脑血管病、糖尿病、癌症外严重影响人类健康的第4号杀手，给社会带来巨大的经济和人力负担。但是AD的病因和发病机制非常复杂，目前并不十分清楚。由于AD患者的脑组织标本极难获得，因此建立一个理想的动物模型对药物开发的临床前研究起着至关重要的作用。现用于AD研究的小鼠模型有多种，包括侧脑室注射Aβ蛋白、腹腔注射或灌胃给药AlCl₃、腹腔注射东茛菪碱、APP/PS1双转基因小鼠、三转基因小鼠、五转基因小鼠等。其中应用最广泛的是转基因小鼠模型，但由于其价格昂贵、耗时较久、非纯合子等缺陷，带来一定的研究限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种阿尔茨海默症小鼠模型。

本发明的又一目的是提供一种对上述阿尔茨海默症小鼠模型的评价方法。

为实现上述目的，本发明提供的阿尔茨海默症小鼠模型通过如下方法得到：

首先在体外通过Zn²⁺与tau-R3结合形成一种tau的寡聚体(Zn²⁺-R3)，再将形成的寡聚体注射到小鼠的左脑皮层和右脑海马中。

所述的阿尔茨海默症小鼠模型中，小鼠为六月龄C57小鼠。

所述的阿尔茨海默症小鼠模型中，形成的寡聚体中含有抗凝剂。

所述的阿尔茨海默症小鼠模型中，形成的寡聚体中，Tau-R3的终浓度为1539.5084μM，Zn²⁺的终浓度为769.754μM，抗凝剂的终浓度为117μM，将以上样品溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，于37摄氏度孵育24小时。

本发明提供的对上述阿尔茨海默症小鼠模型的评价方法，是将tau的寡聚体注射到小鼠的左脑皮层和右脑海马中，若干天后进行一系列的小鼠行为学和生化指标的检测。

所述的评价方法中，小鼠行为学和生化指标的检测内容包括：

旷场实验、高架十字迷宫实验、新物体识别实验、场景恐惧实验、血脂和血糖水平的检测、通过甘氨酸银浸镀神经染色试剂盒，检测各组小鼠脑组织切片的神经纤维缠结的含量、通过尼氏染色试剂盒检测各组小鼠脑组织切片的尼氏小体的数量与神经元的状态、以及利用透射电镜技术观察各组小鼠海马组织的神经元细胞及其细胞器。

所述的评价方法中，小鼠行为学和生化指标的检测是在注射tau的寡聚体后45天。

本发明的阿尔茨海默症小鼠模型其制备方法简单，价格低廉，历时较短，可作为一种理想的tau病理模型，为AD及其他tau病理疾病的机制探索和药物研究提供一定的实验基础。

附图说明

图1旷场实验检测PBS、tau-R3、Zn²⁺和Zn²⁺-R3组小鼠的自发活动与探索能力；其中A小鼠探索穿过的格子数；B小鼠站立次数；C小鼠排便次数(n＝10,*p<0.05,**p<0.01)。

图2高架十字迷宫实验检测小鼠的焦虑情绪；其中A、E小鼠首次进入开放臂，闭合臂的时间；B、F小鼠在开放臂、闭合臂活动的总路程；C、G小鼠在开放臂、闭合臂停留的总时间；D、H小鼠进入开放臂、闭合臂的次数(n＝10,*p<0.05,***p<0.001)。

图3新物体识别实验检测小鼠的探索和记忆能力；其中A各组小鼠在熟悉期的总探索时间；B小鼠在测试期对新旧物体的分辨比(n＝10,*p<0.05,**p<0.01)。

图4场景恐惧实验检测学习、记忆不悦经历和环境之间关联的能力；其中A小鼠在关联测试期间的凝滞时间；B小鼠在变更关联测试期间的凝滞时间；C小鼠在听觉暗示测试期间的凝滞时间(n＝10,*p<0.05,**p<0.01)

图5四组小鼠的血脂和血糖；其中A小鼠的总胆固醇水平；B小鼠的血糖水平(n＝10,*p<0.05)。

图6甘氨酸银浸镀神经染色试剂盒检测各组小鼠海马CA1、CA3区和皮层区NFT的含量(bar:50μm)。

图7小鼠脑组织尼氏小体的检测；其中A尼氏染色检测各组小鼠海马CA1、CA3区和皮层区的尼氏小体；B尼氏染色阳性神经细胞的定量分析(n＝3,**p<0.01,***p<0.001,bar:50μm)。

图8透射电镜观察各组小鼠脑组织神经元的细胞(已被圈出)及其细胞器(M:线粒体，E:内质网，H:异染色质，N:细胞核)。

具体实施方式

1、本发明是在体外将Zn²⁺与tau-R3结合后注射到六月龄C57小鼠的左脑皮层和右脑海马中。45天后，进行一系列的小鼠行为学和生化指标的检测。

1.1、旷场实验：各组小鼠的跨越格子数、站立次数和排便次数。

1.2、高架十字迷宫实验：各组小鼠首次进入开放(闭合)臂的时间、进入开放(闭合)臂的总路程、在开放(闭合)臂的停留的时间和进入开放(闭合)臂的次数。

1.3、新物体识别实验：各组小鼠在熟悉期的总探索时间和在测试期对新旧物体的分辨比。

1.4、场景恐惧实验：各组小鼠在关联测试、变更关联测试和听觉暗示测试中的总凝滞时间。

1.5、各组小鼠血脂和血糖水平的检测。

1.6、通过甘氨酸银浸镀神经染色试剂盒，检测各组小鼠脑组织切片的神经纤维缠结的含量。

1.7、通过尼氏染色试剂盒检测各组小鼠脑组织切片的尼氏小体的数量与神经元的状态。

1.8、利用透射电镜技术观察各组小鼠海马组织的神经元细胞及其细胞器。

2、技术效果

2.1、鼠脑定位注射：小鼠未感染或死亡。

2.2、旷场实验：旷场实验又称敞箱实验，被广泛用于评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中穿越格子数和后肢站立次数，反映实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反映其紧张度。如图1，实验结果表明，与PBS组小鼠相比，本发明Zn²⁺-R3组小鼠在180s内穿过格子数显著减少(如图1A)，说明Zn²⁺-R3组小鼠的自发活动能力较PBS组小鼠弱；小鼠的站立次数减少(如图1B)，说明Zn²⁺-R3组小鼠对外界事物的探索欲降低。排便次数显著增加(如图1C)，说明Zn^{2 +}-R3组小鼠的焦虑情绪严重。而tau-R3组和Zn²⁺组小鼠与PBS组相比，无统计学差异。

2.3、高架十字迷宫实验：高架十字迷宫有一对开放臂和一对闭合臂。小鼠在新鲜环境中出于好奇心和探索性会在开放臂中活动；但高架十字迷宫距离地面较高，相当于人站在峭壁上，小鼠由于对高悬敞开臂的恐惧和趋暗性又会倾向于在闭合臂中活动。如图2，实验结果表明，相较于PBS组小鼠，Zn²⁺-R3组小鼠在开放臂活动的总路程(如图2B)、在开放臂停留的总时间(如图2C)，进入开放臂的次数(如图2D)及进入闭合臂的次数(如图2H)均显著降低，而其首次进入开放臂的时间(如图2A)以及在闭合臂中的停留时间(如图2G)显著性地增加，说明Zn²⁺-R3组小鼠在新异环境中的探索性明显降低，焦虑情绪严重。Zn²⁺-R3与PBS组小鼠在首次进入闭合臂的时间(如图2E)以及在闭合臂活动的总路程(如图2F)无显著性差异。tau-R3组小鼠及Zn²⁺组小鼠与PBS组相比，各指标均无显著性差异。

2.4、新物体识别实验：新物体识别实验利用的是小鼠对新鲜物体的探索本性，来检测小鼠的记忆能力。与水迷宫相比，新物体识别实验对小鼠的刺激性更小。如图3，实验结果表明，与PBS组小鼠相比，Zn²⁺-R3组小鼠在熟悉期对两物体的探索时间显著性地降低(如图3A)，说明其对新鲜事物的好奇心和探索欲望降低。同时，Zn²⁺-R3组小鼠在测试期对新旧物体的分辨比显著性地降低(如图3B)，说明Zn²⁺-R3组小鼠的记忆能力明显下降。

2.5、场景恐惧实验是测定动物学习、记忆不悦经历和环境之间关联的能力。用声音或者厌恶性刺激(如足电击)配对出现，小鼠会学会声音和电击之间存在联系(听觉暗示条件恐惧)，而且知道电击和周围环境之间也存在某种联系(关联条件恐惧)。当小鼠动物经历恐惧时，会出现一动不动的现象(凝滞)来进行防御。凝滞被认为是评价啮齿类动物恐惧的可靠指标。正常情况下，小鼠在听觉暗示中的凝滞行为要比关联测试的多，在变更关联测试中，由于关联条件箱已被改造得“面目全非”，小鼠对周围环境的关联几乎不存在，因此，凝滞行为最少。如果小鼠在第二天的关联测试和听觉暗示测试中出现凝滞，而在变更关联测试中不表现凝滞行为，则可认定：动物的感觉和运动功能均正常；能记住前一天与厌恶刺激配对出现的暗示信号；能分辨前一天不与厌恶刺激配对出现的暗示信号，说明动物具有正常的记忆。这些测试中的任何一项增强或减弱，提示调节记忆情感部分的神经解剖、神经递质和基因可能发生变化。通过对小鼠进行场景恐惧实验，发现(如图4)，与PBS组的小鼠相比，Zn²⁺-R3组小鼠在关联测试和听觉暗示测试中凝滞行为减少(如图4A，图4C)，而在变更关联测试中凝滞行为增多(如图4B)，表明Zn²⁺-R3组小鼠的感觉、运动和记忆能力出现一定的损伤。

2.6、通过检测小鼠的血脂和血糖发现，Zn²⁺-R3组小鼠的总胆固醇(如图5A)和血糖水平(如图5B)与PBS组相比均显著性地升高(如图5)。

2.7、神经纤维缠结(NFT)含量的升高几乎是所有tau疾病的一个共同特点。通过甘氨酸银浸镀神经染色试剂盒，本发明检测了各组小鼠脑组织切片的神经纤维缠结的含量，如图6，结果表明，Zn²⁺-R3组小鼠海马的CAI区、CA3区，以及皮层区的NFT的含量明显高于PBS组。

2.8、尼氏染色是用碱性染料染神经元胞体内的嗜碱性物质，包括核仁和粗面内质网，也称为尼氏体。尼氏小体的功能主要是合成蛋白质，在神经变性过程中，神经元的形态可能发生改变，以尼氏体的减少为特征。通过对各组小鼠脑组织切片进行尼式染色发现，PBS组的小鼠脑切片的CAI区、CA3区，以及皮层区的神经元数量多(图7B)，排列紧密规整，形态完整；尼氏体饱满丰富，染色均匀；核大、圆(图7A)。而Zn²⁺-R3组各区神经元明显减少(图7B)，且形态不完整，细胞肿胀或皱缩，轮廓模糊，界限不清晰(图7A)。结果提示，Zn²⁺-R3组小鼠脑组织的海马和皮层神经元出现了严重的损伤。

2.9、利用透射电镜技术直观观察各组小鼠脑组织的神经元细胞及其细胞器(如图8)，发现PBS组的小鼠脑组织神经元的胞质内细胞器数量丰富；线粒体呈圆形或椭圆形，线粒体嵴丰富；粗面内质网均匀分布在胞质内；细胞核核膜清晰完整，细胞核呈正常的圆形。而Zn²⁺-R3组小鼠脑组织神经元细胞膜破损，胞质内细胞器明显变少，且细胞器膜破裂，内容物溶出，损伤严重；线粒体膜局部破损，嵴消失；内质网扩张；核膜凹陷，核内异染色质结块。结果进一步说明了Zn²⁺-R3组小鼠脑组织的神经元出现明显损伤。

3、实施例

3.1、Zn²⁺与tau-R3的结合体的制备，Zn²⁺、Tau-R3和抗凝剂Heparin(肝素)，将以上成分溶解在PBS(phosphate buffered solution，磷酸盐缓冲液)溶液中，于37摄氏度孵育24小时，其中Tau-R3的终浓度为1539.5084μM，Zn²⁺的终浓度为769.754μM，肝素的终浓度为117μM。

3.2、鼠脑定位注射：

将小鼠用异氟烷麻醉。把已麻醉的小鼠固定于鼠脑立体固定装置，使小鼠脑部平稳固定于仪器上，并确认小鼠颅骨与工作台平行。酒精消毒小鼠头部，用医用剪刀剪开小鼠颅骨上的皮肤，让颅骨暴露出来；以小鼠颅顶的前囟点作为参照点，将1μl的PBS、tau-R3、Zn²⁺或者Zn²⁺-R3注射到小鼠左脑的体感皮层(x：+2.0mm，y：-1.9mm，z：-1.2mm)以及右脑的海马CA1区(x：-1.0mm，y：-1.9mm，z：-1.9mm)，合tau-R3的量为5μg/位点。注射速度为0.4μl/min，针在注射部位停留5分钟，再慢慢抽出，缝合小鼠颅骨上的皮肤。每天对手术后动物进行监测。

3.3、旷场实验：将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察3min后停止摄像。清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)影响下次测试结果。更换动物，继续实验。观察指标：单位时间内动物越过的格子数，后肢站立次数，尿便次数。

3.4、高架十字迷宫实验：

实验前为了提高小鼠入臂总次数，避免小鼠总是躲在闭臂中，先将小鼠放在开阔场地中适应5min后再放入迷宫。实验开始时将小鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫，记录5分钟内的活动情况。实验完成后将小鼠取出，将两臂清理干净，喷洒酒精除去气味。进入开放臂次数及停留时间与小鼠的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越短，说明老鼠的焦虑情绪越严重。

注意事项：实验充分触摸小鼠，动物必须对实验者和实验环境完全适应没有恐惧感；如果动物掉落在地，则将此动物剔除；实验者距离迷宫至少1米。

3.5、新物体识别实验：

主要由3个阶段组成：适应期、熟悉期和测试期。有A、A’、B三个物体，其中A、A’物体完全一样，B物体与A、A’物体完全不同。

3.5.1、适应期：将小鼠依次放入没有任何物体的实验装置中3min，使其自由探索以便适应进行实验的环境，以减少动物进行实验时的应激性。

3.5.2、熟悉期：将A、A’两个物体放在一侧壁的左右两端，小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度要一致。小鼠放入3min，放入后立即开启录像设备，实验者立即离开测试房间，记录小鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2-3cm范围内探究的时间(前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体等均属探究物体，摆个架势或爬到物体上不动不能算是对新物体的探究)。

3.5.3、测试期和熟悉期过程类似，只是将两个完全相同的物体中的A’换成另一个不同物体B，相对于熟悉期的两个物体测试期时的物体分别被称为熟悉物体A和新奇物体B。在测试期实验时，为了防止实验动物对某个物体或某个位置特别偏爱导致实验误差出现的现象，小鼠依次进行实验时熟悉物体A和新奇物体B位置要相互交换。此外，为了排除气味的影响，物体和实验箱体要及时清洗。物体识别实验中最基本的指标是各组小鼠在熟悉期的总探索时间和在测试期对新旧物体的分辨比，“分辨比”一般用DR表示，具体的计算公式是：DR＝N/(N+F)，“N”表示测试期时动物对新奇物体的探索时间，“F”表示测试期时动物对熟悉物体的探索时间。

3.6、场景恐惧实验：

3.6.1、训练阶段(第一天)

3.6.1.1、调试仪器，以确保格栅地板有电流刺激，扩音器有声音刺激，并分别记录电流强度和声音强度(分贝)。

3.6.1.2、将小鼠放入条件恐惧箱2min，记录这最初2min内动物的凝滞(freezing)时间作基线。

3.6.1.3、接着加入卡嗒声，80Db,30s。

3.6.1.4、紧接着再给予电击，0.35mA，2s。

3.6.1.5、无刺激，20s。

3.6.1.6、将小鼠移开操作箱，用75％的酒精彻底清洁操作箱，以备进行下一只动物的训练。

3.6.2、测试阶段在训练后的第二天进行，包括关联测试、变更关联以及条件刺激测试。测试阶段没有电击刺激。关联测试和变更关联测试中也没有听觉条件刺激，但每只动物所用的操作箱与训练阶段的相同。

3.6.2.1、关联测试：将动物放入箱内2min，计算机自动记录动物的凝滞行为。用在这一阶段记录到的、动物在同一操作箱内的凝滞时间测量动物的关联条件恐惧。此为关联测试。观察结束后将动物放回笼内，75％的酒精清洁操作箱，进行下一只动物的观察。

3.6.2.2、变更关联测试和听觉条件刺激测试：关联测试1h后进行。操作如下：

3.6.2.2.1、将计算机调至所需程序。

3.6.2.2.2、操作箱进行如下改造：用平滑塑料板取代关联条件箱内的格栅地板；在箱的对角线加一块有色塑料板，这样将长方体的操作箱变成三角体；改变嗅觉暗示，用4％醋酸溶液彻底清洁操作箱。然后开始变更关联和听觉条件刺激实验。

3.6.2.2.3、将动物放入经改造后的关联箱(从关联实验中的第一只动物开始)。

3.6.2.2.4、无刺激2min。

3.6.2.2.5、加入听觉条件刺激2min。

3.6.2.2.6、无刺激60s。

3.6.2.2.7、将动物放回笼子，用4％醋酸溶液清洁操作箱，进行下一只动物的测试。

3.7、血脂和血糖水平的检测：小鼠眼球取血，用可孚血糖仪测量血糖；3000r，15min离心取上清，用Imagic-M7生化分析仪检测血脂的水平。

3.8、神经纤维缠结染色：步骤同Servicebio甘氨酸银染试剂盒，具体为：小鼠脑组织的冰冻切片用蒸馏水洗多遍，洗干净；切片入酸性甲醛处理5min，蒸馏水洗3次；切片入甘氨酸银液(已提前37摄氏度预热好)中处理3-5min；将切片取出，迅速甩掉组织上残余的甘氨酸银液，放入还原液Ⅰ(已提前45摄氏度预热好)中，时刻观察还原效果，数秒后取出切片并迅速甩一下将切片入还原液Ⅱ(已提前45摄氏度预热好)中，数秒后快速拿出，蒸馏水洗。如遇到染色背景过深需要用硫代硫酸钠溶液处理，并用蒸馏水洗3次；切片依次放入无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-正丁醇5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片剂封片；显微镜镜检，图像采集分析。

3.9、尼氏染色：步骤同Solarbio尼氏染色试剂盒，具体为：冰冻切片用乙醇固定30min，蒸馏水洗3次；用甲基紫染色液涂片，染色10-20min，蒸馏水洗3次；用NisslDifferentiation分化4-8s，直到大部分染色被消除；直接经过无水乙醇至二甲苯，封片剂封片，显微镜下观察。

3.10、透射电镜：

3.10.1、取材固定：新鲜组织确定取材部位，尽量减小牵拉、挫伤与挤压等机械损伤，组织体积一般不超过1mm×1mm×1mm，迅速投入电镜固定液4摄氏度固定2-4h。0.1M磷酸缓冲液PB(pH＝7.4)漂洗3次，每次15min。

3.10.2、后固定：1％的锇酸·0.1M磷酸缓冲液PB(pH＝7.4)室温(20摄氏度)固定2h。0.1M磷酸缓冲液PB(pH＝7.4)漂洗3次，每次15min。

3.10.3、脱水：组织依次入50％-70％-80％-90％-95％-100％-100％酒精-100％丙酮-100％丙酮上行脱水，每次15min。

3.10.4、渗透：丙酮:812包埋剂＝1:1 2-4h，丙酮:812包埋剂＝1:2渗透过夜，纯812包埋剂5-8h，将纯812包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后37摄氏度烤箱过夜。

3.10.5、包埋：60摄氏度烤箱聚合48h。

3.10.6、切片：超薄切片机切片60-80nm超薄切片。

3.10.7、染色：铀铅双染色(2％醋酸铀饱和酒精溶液，枸橼酸铅，各染色15min)，切片室温干燥过夜。

3.10.8、透射电子显微镜下观察，采集图像分析。

Claims (7)

1.一种阿尔茨海默症小鼠模型，通过如下方法得到：

首先在体外通过Zn²⁺与tau-R3结合形成一种tau的寡聚体，再将形成的寡聚体注射到小鼠的左脑皮层和右脑海马中。

2.根据权利要求1所述的阿尔茨海默症小鼠模型，其中，小鼠为六月龄C57小鼠。

3.根据权利要求1所述的阿尔茨海默症小鼠模型，其中，形成的寡聚体中含有抗凝剂。

4.根据权利要求3所述的阿尔茨海默症小鼠模型，其中，形成的寡聚体中，Tau-R3的终浓度为1539.5084μM，Zn²⁺的终浓度为769.754μM，抗凝剂的终浓度为117μM，将以上样品溶解在磷酸盐缓冲液溶液中，于37摄氏度孵育24小时。

5.权利要求所述阿尔茨海默症小鼠模型的评价方法，将tau的寡聚体注射到小鼠的左脑皮层和右脑海马中，若干天后进行一系列的小鼠行为学和生化指标的检测。

6.根据权利要求5所述的评价方法，其中，小鼠行为学和生化指标的检测内容包括：

旷场实验、高架十字迷宫实验、新物体识别实验、场景恐惧实验、血脂和血糖水平的检测、通过甘氨酸银浸镀神经染色试剂盒，检测各组小鼠脑组织切片的神经纤维缠结的含量、通过尼氏染色试剂盒检测各组小鼠脑组织切片的尼氏小体的数量与神经元的状态、以及利用透射电镜技术观察各组小鼠海马组织的神经元细胞及其细胞器。

7.根据权利要求5所述的评价方法，其中，小鼠行为学和生化指标的检测是在注射tau的寡聚体后45天。