CN110491444A - 一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法及应用，属于农业技术领域，该方法使用MYB10基因启动子序列分别为R6R6和R1R1的品种Red3×长富二号的F1分离群体作为研究对象，测定其熟期果肉的花色苷含量、构建遗传连锁图谱并鉴定出控制红肉颜色深浅性状的候选基因。本发明为标记辅助育种的一种，通过使用分子标记早期筛查红肉性状，可以极大地节省时间、人力与土地资源，极大地提高育种效率，加快育种进程。

Description

一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法及应用
技术领域
本发明属于农业技术领域，涉及一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法和应用方法。
背景技术
苹果(Malus domestica)是世界四大水果之一，在中国，苹果也深受人民喜爱，多年来一直保持着产量第一。苹果能成为如此著名的水果也并非徒有虚名，主要原因是苹果中含有大量易被人体吸收的可溶性营养元素——铜、碘、锰、锌和钾等，还有大量具有保健功能的维生素、多酚、类黄酮等有机化合物。此外，苹果还是一种低热量食物，每千克只有六百千卡的热量，而且比较容易使人产生饱腹感，很符合当下人们减少热量摄入，增加其他营养物质含量的饮食需求。
苹果是一种起源于欧洲中部、中亚及中国新疆地区的多年生乔木，属于温带落叶果树，由于其适应性强，广泛分布于世界温带地区。中国原产的苹果因其质量与风味较差而被1871年由山东烟台引进的西洋苹果全面取代，开创了我国苹果栽培的新纪元。
数十年前，人们发现了源自于新疆野苹果(Malus sieversii)变种的红肉苹果，其表现出的独有的红色果肉性状主要源自于果肉中花色苷的大量积累，而我们常见的白肉苹果果实中的花色苷一般只存在于果皮中。花色苷是一种类黄酮，具有良好的抗氧化能力，因此可用于抗癌、抗炎、抗突变和抗衰老等领域，也因此，越来越多的学者开始着手研究花色苷，红肉性状已经成为育种家们所追捧的优良性状。
苹果因其营养价值高、经济效益好而广泛栽培于世界各地，但是因为其童期时间长、自交不亲和、高度杂合等原因，基因改良进程缓慢。为了提高育种效率，更快的获得目标性状，标记辅助育种(MAS,Marker Assistant Selection)越来越广泛的被应用于苹果育种(Longhi et al.2014)。近十年来，越来越多的研究开始挖掘控制各种优良性状的数量性状基因和主效基因，如果实酸度(Zhang et al.2012；Khan et al.2013；Ma et al.2016)、抗病性(Xu and Korban 2002；Belfanti et al.2004；Le Roux et al.2010)、芽的休眠和打破休眠(Brunel et al.2002；Van Dyk et al.2010)。
红色果肉是苹果新的优良商品性状。果肉呈现红色的程度主要是由花色苷含量决定的，该性状呈数量性状遗传。已知主效基因MdMYB10启动子含R6序列时表现“红肉”，不含R6时则为“白肉”，其它决定红色程度的遗传位点还不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法及应用，使用MYB10基因启动子序列分别为R6R6和R1R1的品种‘Red3’ב长富二号’的F1分离群体作为研究对象，测定其熟期果肉的花色苷含量、构建遗传连锁图谱并鉴定出控制红肉颜色深浅性状的候选基因。
其具体技术方案为：
一种控制苹果红肉性状的分子标记，其核苷酸序列如SEQ：ID：NO：1所示。可以Marker为16号染色体上的Marker2175442，其序列为：
TTTTTCGCAGGCTGTTGGTTGAACTTAAGTCGGACTGAGTGATTTCTTCTCTCCATCCTTCGTGTTGCCTACTCTAATGTAAGGTGGAGGATGCTCCTTGCGGGCCTAGCCGCGAATGAACACTTCGCCTGGAAGTTTGGTCATGTTAACTATCGGAGTGTGGCCCCAACCGTGAATGTATGCTCGTCTGTGGGCCTAGTCAAAAGTGCACACTCATCCGCGCGCAGAGAAAAGAGTATACGTTATCTCAGGGACCCAATCGGGAGTGTACATTGCATGAATGGTCAGTTCGTGGCTGGTCGAGTGGCTGCTTGCTGGGACGCTGCTGGAGAGGTTCTTCTTTTGTCCTTG[A]TCCTACTTCGGGACACCTCATCTGGGGCCCATTGCATTTTGATACGCTGCAAAAGCTGGTTTACCAAGGTCGTCTATTGTGCAATGGTGCTTGTCAACTCTATGACTTGTCGAGACAAGTGTTGTTCTCCATTTGGGTTGGAAGAGTTTGGGAGGAATGGTCTCCTTGAGTAATGGAAGTGTGGTAGACTCCAGGCGCGAGATTTGAGTTGGAAAATGTCAAATCCGTGGAGAAATATGGTGAAAATGCCCCCGGTTCGATCGTAAGCCCATAAATTTGAAGCAGGGATGGTTAAACTAATCTTGGACCGATTTGGGCTGCTTGGAAGGTCACAGGAGCAGGCTGGGCCA
一种筛选苹果红肉性状的分子标记开发方法，包括以下步骤：
步骤1、实验材料准备：
实验材料选用I型红肉苹果(R6R6纯合)‘Red3’ב长富二号’(R1R1纯合)子一代，Red3是种质杂合分离群体，树龄均为6年，均为嫁接在‘M26’砧木上的嫁接苗；
用于提取DNA的植物材料样本于6月采集，每个个体取嫩叶或嫩芽收集，采集完毕后在液氮中速冻，使用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存。果实材料于7月开始收集，通过碘染色法来确认果实是否成熟，每周采收成熟果实，每株采三个生物学重复，每个生物学重复视结果情况采5-15个果实。果实采收后削皮去核，将果肉充分研磨混匀后在液氮中速冻，用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存；
步骤2、高效液相色谱仪测定果实花色苷含量
将果实样本从冰箱取出，每棵树的果实粉末分装至三个包装内做生物学重复。
步骤3、SLAF文库构建及测序
3.1植物基因组DNA提取
植物基因组的提取使用植物基因组DNA提取试剂盒；
3.2SLAF文库构建及测序
SLAF(Specific-locus amplified fragment)测序文库构建使用之前Zhang等(2013)和Ma等(2017)描述的方法。首先根据实验所用群体的基因组大小以及GC含量等信息，选取合适基因组进行酶切预测，并且基于实验数据计算两个相邻的限制酶切割位点，以使限制酶可以产生高质量、丰富、无重复的位点，并且均匀分布在基因组上为原则预测。为保证不同片段的测序深度一致，选择有限范围的片段测序(约30-50bp)，PCR扩增之后使用凝胶评估片段大小。如果在凝胶上没有检测到类似的特异性扩增条带，则需要重新设计预实验方案。
基因组DNA使用Rsa I和Hae III酶切，364-464bp的片段按操作手册上描述的方法从胶上切离、纯化并扩增。随后再连接Dual-index测序接头、纯化稀释使用北京百迈客生物技术公司(http://www.biomarker.com.cn/)的IlluminaHiSeqTM High-seq 2500测序平台(Illumina,Inc；San Diego,CA,U.S.)进行PE125bp测序。每个测序循环实时监控，保证Reads的质量值高于Q30(错误率0.1％)。此外，GC含量也被用于评估测序Reads的质量。
3.3SLAF数据分析及基因分型
SLAF测序数据按照Sun等(2013)描述的方法进行分析并分型。次要等位基因(MAF)被用来计算确定在每一个SLAF位点的等位基因。由于苹果是二倍体，每一个SLAF位点应该包括不超过4个标签，因此，超过4个标签的SLAF位点需要被筛除。包含2、3或4个标签的SLAF位点是多态性的，具有被开发为分子标记的潜力。
步骤4、高密度遗传连锁图谱构建及QTL定位
将所述由169个个体组成的F1群体数据使用JoinMap 4.0(Van Ooijen，2006)软件按照Ma等(2016)提到的方法构建遗传连锁图谱。分子标记间的遗传距离使用Kosambi作图函数计算，表示为厘摩(cM)距离。将分离标记在不同的连锁群上的LOD(Logarithm ofodds，优势对数)阈值设置为10。先分别构建亲本的遗传连锁图谱，之后再使用CP群体模型基于父母本的数据建立每个连锁群一致的图谱。QTL分析使用MapQTL 5.0软件(VanOoijen，2004)。果肉花色苷含量的候选QTLs检验使用Kruskal-Wallis(KW)，使用区间作图(Interval Mapping)确定。使用1000个置换测试在95％全基因组LOD值下计算显著水平。
进一步，步骤2具体为：具体操作如下:
1)使用液氮预冷实验用具，如镊子、捣锤、研钵和称量杯等；
2)称取0.55g左右的果肉于液氮预冷之后的研钵，记录称量的重量；
3)待液氮蒸发完全后，加入1.5mL酚类提取液(50％甲醇、48％水和2％甲酸)充分研磨；
4)液体装入离心管中，4℃、12000rpm离心15min，若沉淀不充分则适当延长时间
5)用注射器吸取上层清液，使用0.22μm有机溶剂过滤滤头过滤，装入2μL液相色谱样品瓶。
提取完毕后，使用岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪(Shimadzu Corporation，Tokyo，Japan)进行花色苷含量分析。分配色谱柱使用InertSustain AQ-C18保护柱(5.0μm，4.0mm×10mm,GL Sciences Inc.,Tokyo,Japan)，流动相A为10％的甲酸水溶液，流动相B为10％的甲酸乙腈溶液。柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量2μL。在520nm波长下检测矢车菊素-3-半乳糖苷(Cyanidin-3-galactoside)的吸光度。根据标样在分离柱中保留时间的标准曲线方程来确定待测物质的含量，标准曲线根据不同浓度标准样品出峰面积计算得到。
进一步，步骤3.1的具体操作方法为：
1).在缓冲液GP1中加入巯基乙醇使其浓度为0.1％，混匀后使用65℃水浴箱预热。在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇。
2).取植物的新鲜组织约100mg左右，将其置于液氮冷却过的研钵中，加入少量液氮充分碾磨。
3).将上一步研磨好的粉末迅速转移到65℃预热的装有700μL缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒摇晃，混匀后将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中多次颠倒离心管以混合样品。
4).向离心管中加入等体积的酚:氯仿/1:1溶液，摇匀。
5).在室温下12000rpm下离心5min，上清液转移至新的离心管中。
6).加入700μL氯仿，多次摇晃充分混匀，在12000rpm下离心5min。
7).将上一步所得的表层水相转入一个新的离心管中，需要谨慎操作，避免代入下层液体。在离心管中加入700μL缓冲液GP2，多次摇晃充分混匀。
8).将上一步混匀的液体装入吸附柱CB3中，在12000rpm下离心30sec，弃掉废液。
9).向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
10).向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3重新放入收集管中。
11).重复操作步骤10)，漂洗两次。
12).将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于通风橱放置几分钟，等吸附材料中残留的漂洗液彻底晾干。
13).将吸附柱CB3转移至一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
本发明所述筛选苹果红肉性状的分子标记开发方法在果树的早期育种过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明以红肉苹果"R1R6"杂交分离群体为研究对象，构建遗传连锁图谱，并鉴定出控制红肉颜色深浅性状的候选基因。遗传图谱对于识别和定位控制苹果重要经济性状的基因意义重大，对苹果的选育工作也有重要参考作用，而近年来流行的基于遗传图谱的标记辅助育种的应用更是可以极大地提高育种效率，加快育种进程。而研究并发展关于优良性状相关的分子标记并应用于果树的早期育种显得尤为重要(Longhi et al.2014)，通过早期筛查，可以极大地节省时间、人力与土地资源。
附图说明
图1为花色苷分离情况；A为升序排列的不同个体的花色苷含量示意图(纵轴为花色苷含量mg/g，横轴为个体)，B为在不同花色苷含量区间中的个体数量(纵轴为个体数量，横轴为花色苷含量区间mg/g)；
图2为遗传连锁图谱，其中，A为苹果所有连锁群的QTL定位结果，B为定位结果中第16连锁群的定位结果；
图3为QTL定位结果；
图4为分离群体Marker2175442位点上的不同基因型对花色苷含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1实验材料
实验材料选用I型红肉苹果(R6R6纯合)‘H3’ב长富二号’(R1R1纯合)子一代杂合分离群体，其中中共有结果果树169棵。实验材料位于于陕西省咸阳市武功县羊圈村苗圃园，树龄均为6年，均为嫁接在‘M26’砧木上的嫁接苗，树势健壮，生长状况一致，适合进行遗传研究。
用于提取DNA的植物材料样本于6月采集，每个个体取嫩叶或嫩芽收集，采集完毕后在液氮中速冻，使用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存。果实材料于7月开始收集，通过碘染色法来确认果实是否成熟，每周采收成熟果实，每株采三个生物学重复，每个生物学重复视结果情况采5-15个果实。果实采收后削皮去核，将果肉充分研磨混匀后在液氮中速冻，用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存。
2高效液相色谱仪测定果实花色苷含量
将果实样本从冰箱取出，每棵树的果实粉末分装至三个包装内做生物学重复。酚类物质的提取参考Zhang等(2011)的方法。具体操作如下:
1)使用液氮预冷实验用具，如镊子、捣锤、研钵和称量杯等；
2)称取0.55g左右的果肉于液氮预冷之后的研钵，记录称量的重量；
3)待液氮蒸发完全后，加入1.5mL酚类提取液(50％甲醇、48％水和2％甲酸)充分研磨；
4)液体装入离心管中，4℃、12000rpm离心15min，若沉淀不充分则适当延长时间
5)用注射器吸取上层清液，使用0.22μm有机溶剂过滤滤头过滤，装入2μL液相色谱样品瓶。
提取完毕后，使用使用岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪(ShimadzuCorporation，Tokyo，Japan)进行花色苷含量分析。分配色谱柱使用InertSustain AQ-C18保护柱(5.0μm，4.0mm×10mm,GL Sciences Inc.,Tokyo,Japan)，流动相A为10％的甲酸水溶液，流动相B为10％的甲酸乙腈溶液。二元梯度洗脱程序如表1所示。
表1二元梯度洗脱程序详情
柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量2μL。在520nm波长下检测矢车菊素-3-半乳糖苷(Cyanidin-3-galactoside)的吸光度。根据标样在分离柱中保留时间的标准曲线方程来确定待测物质的含量，标准曲线根据不同浓度标准样品出峰面积计算得到。
3SLAF文库构建及测序
3.1植物基因组DNA提取
植物基因组的提取使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根，北京，中国)，操作方法参照其使用说明如表2列出。
表2植物基因组DNA提取试剂盒操作方法
3.2SLAF文库构建及测序
SLAF(Specific-locus amplified fragment)测序文库构建使用之前Zhang等(2013)和Ma等(2017)描述的方法。首先根据实验所用群体的基因组大小以及GC含量等信息，选取合适基因组进行酶切预测，并且基于实验数据计算两个相邻的限制酶切割位点，以使限制酶可以产生高质量、丰富、无重复的位点，并且均匀分布在基因组上为原则预测。为保证不同片段的测序深度一致，选择有限范围的片段测序(约30-50bp)，PCR扩增之后使用凝胶评估片段大小。如果在凝胶上没有检测到类似的特异性扩增条带，则需要重新设计预实验方案。
基因组DNA使用Rsa I和Hae III酶切，364-464bp的片段按操作手册上描述的方法从胶上切离、纯化并扩增。随后再连接Dual-index测序接头、纯化稀释使用北京百迈客生物技术公司(http://www.biomarker.com.cn/)的IlluminaHiSeqTM High-seq 2500测序平台(Illumina,Inc；San Diego,CA,U.S.)进行PE125bp测序。每个测序循环实时监控，保证Reads的质量值高于Q30(错误率0.1％)。此外，GC含量也被用于评估测序Reads的质量。
3.3SLAF数据分析及基因分型
SLAF测序数据按照Sun等(2013)描述的方法进行分析并分型。次要等位基因(MAF)被用来计算确定在每一个SLAF位点的等位基因。由于苹果是二倍体，每一个SLAF位点应该包括不超过4个标签，因此，超过4个标签的SLAF位点需要被筛除。包含2、3或4个标签的SLAF位点是多态性的，具有被开发为分子标记的潜力。
4密度遗传连锁图谱构建及QTL定位
将上文提到的由169个个体组成的F1群体数据使用JoinMap 4.0(Van Ooijen，2006)软件按照Ma等(2016)提到的方法构建遗传连锁图谱。分子标记间的遗传距离使用Kosambi作图函数计算，表示为厘摩(cM)距离。将分离标记在不同的连锁群上的LOD(Logarithm of odds，优势对数)阈值设置为10。先分别构建亲本的遗传连锁图谱，之后再使用CP群体模型基于父母本的数据建立每个连锁群一致的图谱。QTL分析使用MapQTL 5.0软件(Van Ooijen，2004)。果肉花色苷含量的候选QTLs检验使用Kruskal-Wallis(KW)，使用区间作图(Interval Mapping)确定。使用1000个置换测试在95％全基因组LOD值下计算显著水平。
5结果与分析
5.1果肉花色苷含量在分离群体中的变化
‘H3’ב长富二号’的F1群体成熟果实的果肉花色苷含量使用HPLC定量，详细分离情况见图1，花色苷含量向右的正偏态分布。果实的果肉花色苷含量出现显著的变化，含量最低低于液相量程，最高30.26mg/g FW(FreshWeight，鲜重)，平均含量为2.03mg/gFW。138个(82％)个体的果肉花色苷含量低于3mg/g FW。具体花色苷含量见附录1。
5.2分离群体的SNP基因型
通过预实验得到了123513个SLAF标签，均匀分布在整个苹果基因组上，平均密度为每5.7kb一个标签，各染色体上的标签分布详见附录2。随后使用Illumina GoldenGateTM高通量测序，获得总计108.49Gb数据，包含511132997个双端测序reads。Q30(表示碱基测序质量值高于30，即只有0.1％的可能错误)率94.07％，GC(鸟嘌呤-尿嘧啶)含量40.32％。在高质量测序数据里，9.69Gb来自于母本数据，包含32344591reads；9.35Gb来自于父本，包含31244571reads。这些被定位在参考的苹果基因组上reads也被认为是可以映射为有效的单位点的SLAF(Daccord et al.2017)。分离群体的169个个体的reads总数从827976到6466221，平均2648188个(529Mb)。得到的这些SLAF标记被装配到参考的苹果基因组(Daccord et al.2017)上，可以被装配到单一位点的SLAF标记被认为是有效的标记。本研究中82.47％的reads可以被准确定位到特定的染色体区域。分离群体的SLAF标签数量从117677到160529，平均152603。在上述的这些SLAF标签里，120974个具有多态性，占全部的70.14％，剩下的51499个没有多态性或者是重复的。
总共在苹果基因组上检测到7997517个高质量SNP，其中2956895在亲本中未被检查到或者没有多态性，剩余的SNP中有368914个没有在F1中分离(分离类型包括aa×aa、aa×bb、bb×aa和bb×bb)。最终有8599个有效的SNP被分为4种类型：ef×eg(0.03％)、hk×hk(2.77％)、lm×ll(48.32％)和nn×np(48.88％)。这些有效的SNP根据其多态性被分为四类——I型、II型、III型和IV型。II型表示A/G或T/C颠换，也是所有类型中最丰富的一种，占全部有效SLAF的70.67％。I型表示A/C或T/G颠换，占全部有效SNP的17.86％，III型和IV型分别表示A/T和C/G转换，分别占全部有效SNP的6.58％和4.89％。
5.3锁图谱构建
上文提到的8599个有效的SNP被用来构建连锁群，但是其中有969个SNP被排除，因为他们与相邻标记的分离模式相冲突或是它们不能定位到任何连锁群中。最终我们获得了一个包含了17个连锁群、7630个位点的遗传连锁图谱。每个连锁群上的标记从255个(8号连锁群)到780个(5号连锁群)，平均448.8个。8号连锁群上的分子标记最少，只有255个标记，总长92.15cM；反之，5号连锁群有着最多的标记，共有780个，总长197.66cM。10号连锁群包含703个标记，拥有最高的平均标记间距——0.19cM；17号连锁群包含272标记，拥有最低的平均标记间距——0.73cM，这表示了10号连锁群和17号连锁群分别有着最低和最高的杂合性。除了10号连锁群和17号连锁群，标记的平均距离从0.21cM(9号连锁群)到0.48cM(15号连锁群)。每条染色体上的标记分布情况详见附录3。
每个连锁群的长度从92.15cM(8号连锁群)到197.66cM(5号连锁群)，遗传图谱的总长度为2,270.21cM，标记平均间距0.30cM。在全部的7630个SNP标记中，3925个和3903个分别被定位在‘H3’和‘长富二号’的遗传图谱上，‘H3’和‘长富二号’的遗传图谱长度分别为1855cM和2384cM，标记平均距离分别为0.47cM和0.61cM。
实验构建的遗传连锁图谱如图2所示，纵轴为标记位置，横轴为连锁群编号，每条细横杠为一个标记。
5.4果肉花色苷QTL定位
果肉的花色苷含量QTL定位分析使用显著水平为0.01的KW检验，通过区间作图法鉴定潜在QTL位点并通过建立多重QTL模型并将LOD最低值设为3.0。最终果肉花色苷QTL位点被定位在‘Red3’的第16连锁群上，这个QTL占14.4％的表型变异，峰值LOD为4.49。QTL定位如图3所示，上部分为整个基因组的定位，确认QTL位点处于16号连锁群，图的横轴为标记，纵轴为LOD值。此外，这个QTL位点处于两个标记之间，Marker2187260和Marker2173766，我们检查了在最接近LOD峰值的SNP基因型不同的个体间的平均花色苷含量的统计学差异。在第16连锁群上的Marker2175442最接近这个QTL，并且这个位点的基因型在分离群体中分为两组，含有ll基因型的纯合个体花色苷含量显著(P<0.05)高于基因型为lm的杂合个体，如图4。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttcgcag gctgttggtt gaacttaagt cggactgagt gatttcttct ctccatcctt 60
cgtgttgcct actctaatgt aaggtggagg atgctccttg cgggcctagc cgcgaatgaa 120
cacttcgcct ggaagtttgg tcatgttaac tatcggagtg tggccccaac cgtgaatgta 180
tgctcgtctg tgggcctagt caaaagtgca cactcatccg cgcgcagaga aaagagtata 240
cgttatctca gggacccaat cgggagtgta cattgcatga atggtcagtt cgtggctggt 300
cgagtggctg cttgctggga cgctgctgga gaggttcttc ttttgtcctt gatcctactt 360
cgggacacct catctggggc ccattgcatt ttgatacgct gcaaaagctg gtttaccaag 420
gtcgtctatt gtgcaatggt gcttgtcaac tctatgactt gtcgagacaa gtgttgttct 480
ccatttgggt tggaagagtt tgggaggaat ggtctccttg agtaatggaa gtgtggtaga 540
ctccaggcgc gagatttgag ttggaaaatg tcaaatccgt ggagaaatat ggtgaaaatg 600
cccccggttc gatcgtaagc ccataaattt gaagcaggga tggttaaact aatcttggac 660
cgatttgggc tgcttggaag gtcacaggag caggctgggc ca 702

Claims (4)

1.一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、实验材料准备：
实验材料选用I型红肉苹果R6R6纯合Red3×长富二号R1R1纯合子一代杂合分离群体，树龄均为6年，均为嫁接在M26砧木上的嫁接苗；
用于提取DNA的植物材料样本于6月采集，每个个体取嫩叶或嫩芽收集，采集完毕后在液氮中速冻，使用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存；果实材料于7月开始收集，通过碘染色法来确认果实是否成熟，每周采收成熟果实，每株采三个生物学重复，每个生物学重复视结果情况采5-15个果实；果实采收后削皮去核，将果肉充分研磨混匀后在液氮中速冻，用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存；
步骤2、高效液相色谱仪测定果实花色苷含量
将果实样本从冰箱取出，每棵树的果实粉末分装至三个包装内做生物学重复；
步骤3、SLAF文库构建及测序
3.1植物基因组DNA提取
植物基因组的提取使用植物基因组DNA提取试剂盒；
3.2 SLAF文库构建及测序
SLAF测序文库构建的方法；首先根据实验所用群体的基因组大小以及GC含量的信息，选取合适基因组进行酶切预测，并且基于实验数据计算两个相邻的限制酶切割位点，以使限制酶能产生高质量、丰富、无重复的位点，并且均匀分布在基因组上为原则预测；为保证不同片段的测序深度一致，选择有限范围的片段测序，PCR扩增之后使用凝胶评估片段大小；如果在凝胶上没有检测到类似的特异性扩增条带，则需要重新设计预实验方案；
基因组DNA使用Rsa I和Hae III酶切，364-464bp的片段按操作手册上描述的方法从胶上切离、纯化并扩增；随后再连接Dual-index测序接头、纯化稀释使用北京百迈客生物技术公司进行PE125bp测序；每个测序循环实时监控，保证Reads的质量值高于Q30；此外，GC含量也被用于评估测序Reads的质量；
3.3SLAF数据分析及基因分型
SLAF测序数据的方法进行分析并分型；次要等位基因MAF被用来计算确定在每一个SLAF位点的等位基因；由于苹果是二倍体，每一个SLAF位点应该包括不超过4个标签，因此，超过4个标签的SLAF位点需要被筛除；包含2、3或4个标签的SLAF位点是多态性的，具有被开发为分子标记的潜力；
步骤4、高密度遗传连锁图谱构建及QTL定位
将所述由169个个体组成的F1群体数据使用JoinMap4.0软件构建遗传连锁图谱；分子标记间的遗传距离使用Kosambi作图函数计算，表示为厘摩cM距离；将分离标记在不同的连锁群上的LOD阈值设置为10；先分别构建亲本的遗传连锁图谱，之后再使用CP群体模型基于父母本的数据建立每个连锁群一致的图谱；QTL分析使用MapQTL5.0软件；果肉花色苷含量的候选QTLs检验使用Kruskal-Wallis，使用区间作图确定；使用1000个置换测试在95％全基因组LOD值下计算显著水平。
2.根据权利要求1所述的快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法，其特征在于，步骤2具体为：具体操作如下:
1)使用液氮预冷实验用具，如镊子、捣锤、研钵和称量杯；
2)称取0.55g的果肉于液氮预冷之后的研钵，记录称量的重量；
3)待液氮蒸发完全后，加入1.5mL酚类提取液充分研磨；
4)液体装入离心管中，4℃、12000rpm离心15min，若沉淀不充分则适当延长时间
5)用注射器吸取上层清液，使用0.22μm有机溶剂过滤滤头过滤，装入2μL液相色谱样品瓶。
提取完毕后，使用使用岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪进行花色苷含量分析；分配色谱柱使用InertSustain AQ-C18保护柱，流动相A为10％的甲酸水溶液，流动相B为10％的甲酸乙腈溶液；柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量2μL；在520nm波长下检测矢车菊素-3-半乳糖苷的吸光度；根据标样在分离柱中保留时间的标准曲线方程来确定待测物质的含量，标准曲线根据不同浓度标准样品出峰面积计算得到。
3.根据权利要求1所述的快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法，其特征在于，步骤3.1的具体操作方法为：
1).在缓冲液GP1中加入巯基乙醇使其浓度为0.1％，混匀后使用65℃水浴箱预热；在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇；
2).取植物的新鲜组织100mg，将其置于液氮冷却过的研钵中，加入少量液氮充分碾磨；
3).将上一步研磨好的粉末迅速转移到65℃预热的装有700μL缓冲液GP1的离心管中，迅速颠倒摇晃，混匀后将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中多次颠倒离心管以混合样品；
4).向离心管中加入等体积的酚:氯仿/1:1溶液，摇匀；
5).在室温下12000rpm下离心5min，上清液转移至新的离心管中；
6).加入700μL氯仿，多次摇晃充分混匀，在12000rpm下离心5min；
7).将上一步所得的表层水相转入一个新的离心管中，需要谨慎操作，避免代入下层液体；在离心管中加入700μL缓冲液GP2，多次摇晃充分混匀；
8).将上一步混匀的液体装入吸附柱CB3中，在12000rpm下离心30sec，弃掉废液；
9).向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
10).向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3重新放入收集管中；
11).重复操作步骤10)，漂洗两次；
12).将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液；将吸附柱CB3置于通风橱放置几分钟，等吸附材料中残留的漂洗液彻底晾干；
13).将吸附柱CB3转移至一个新的的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
4.权利要求1所述快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法在果树的早期育种过程中的应用。
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