CN110483357A - 一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法 - Google Patents
一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110483357A CN110483357A CN201910505202.4A CN201910505202A CN110483357A CN 110483357 A CN110483357 A CN 110483357A CN 201910505202 A CN201910505202 A CN 201910505202A CN 110483357 A CN110483357 A CN 110483357A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carotenoid
- tangerine peel
- isolation
- chromatography
- column chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C403/00—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone
- C07C403/24—Derivatives of cyclohexane or of a cyclohexene or of cyclohexadiene, having a side-chain containing an acyclic unsaturated part of at least four carbon atoms, this part being directly attached to the cyclohexane or cyclohexene or cyclohexadiene rings, e.g. vitamin A, beta-carotene, beta-ionone having side-chains substituted by six-membered non-aromatic rings, e.g. beta-carotene
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
本发明属于分离纯化技术领域，公开了一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，以桔皮类胡萝卜素皂化提取液为原料，采用丙酮沉淀‑硅胶柱层析‑氧化镁柱层析/半制备液相‑结晶等手段相结合对桔皮类胡萝卜素进行纯化，得到4种高纯度的类胡萝卜素结晶R1、R2、R3、R4，并利用薄层色谱法、C30柱及高效液相色谱‑二极管阵列检测‑大气压化学电离串联质谱法、核磁共振谱法对纯化得到的类胡萝卜素进行结构鉴定。本发明获得的β‑胡萝卜素、β‑隐黄素、叶黄素、玉米黄素的纯度达到98.79％、99.11％、96.59％、96.77％，得率分别为0.0025‰、0.0275‰、0.0066‰、0.0092‰。
Description
技术领域
本发明属于桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化技术领域，尤其涉及一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
由于要应用到食品、化妆品和制药领域的天然类胡萝卜素通常有一定的纯度要求，因此类胡萝卜素提取之后的分离纯化步骤必不可少。目前植物源类胡萝卜素分离纯化的技术主要有薄层层析(TLC)、柱层析(OCC)、制备或半制备液相色谱(HPLC)、结晶法等。TLC法仅适用于少量样品的分离(样品量低于1mg)；柱层析(OCC)法是从天然产物中制备类胡萝卜素(1mg～100g)的首选方法，可将提取物初步分离成含有相似极性基团的极性段，使其具有一定的纯度以便于下一步的纯化。HPLC主要用于分离和纯化单个类胡萝卜素，纯化得到的目标物纯度高。结晶法是获得类胡萝卜素纯品的必要步骤。通常类胡萝卜素的分离纯化首先是将不同极性段的类胡萝卜素混合物分开，再纯化单一的类胡萝卜素组分，要得到单一的类胡萝卜素纯品，通常需要多个分离纯化步骤和多种分离纯化方法的配合应用。桔皮中类胡萝卜素极性范围广，经提取皂化后得到的类胡萝卜素样品组分复杂，并含有其它脂溶性杂质，单一方法分离极其困难，因此本发明制定了特定的分离纯化程序。
综上所述，现有技术存在的问题是：
当前桔皮胡萝卜素分离纯化的相关研究通常采用硅胶柱层析(OCC)单一分离程序，所分离得到的类胡萝卜素仍含有大量杂质、纯度低、且种类单一，仅适用于桔皮主要类胡萝卜素的组分分析，不能得到高纯度的类胡萝卜素单体组分。
解决上述技术问题的意义：
本发明构建的丙酮沉淀-硅胶柱层析-氧化镁柱层析/半制备液相-结晶分离纯化程序可有效除去样品中脂溶性杂质，分离得到多种高纯度的类胡萝卜素纯品，有效解决了当前桔皮类胡萝卜素分离纯化中杂质多、纯度低、分离产物种类单一等技术难点；分离方法经济且操作简单，有利于进行了工业化生产；同时为拓宽天然类胡萝卜素的开发和应用途径提供了新的思路和参考，对缓解天然类胡萝卜素的供求压力和为柑桔加工废弃物的增值技术提供理论基础，具有良好的市场前景、重要的科研和生产指导意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法。
本发明是这样实现的，一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法包括以下步骤：
步骤一，以桔皮类胡萝卜素皂化提取液(SCE)为原料，采用丙酮沉淀-硅胶柱层析-氧化镁柱层析/半制备液相-结晶等手段相结合对桔皮类胡萝卜素进行纯化，得到4种高纯度的类胡萝卜素结晶R1、R2、R3、R4。
步骤二，利用薄层色谱法、C30-HPLC-DAD-APCI-MS、核磁共振谱法对纯化得到的类胡萝卜素进行结构鉴定。
进一步，步骤一中所述丙酮沉淀方法为：将所得色素浓缩液减压浓缩至干并称重，按20mL/g加入丙酮溶液，置于-80℃沉淀12h，离心去除沉淀，将上清液浓缩即得类胡萝卜素粗提物。
进一步，步骤一中所述硅胶柱层析进行类胡萝卜素粗分段方法包括：
用正己烷湿法装柱，干法上样，以(正己烷:丙酮＝20:1～6:1)梯度洗脱，每50mL收集一管，用TLC监控各管的分离情况，合并相同组分的色管并浓缩称重；桔皮类胡萝卜素粗提物经硅胶粗分段分离得到5个色段F1-F5。
进一步，步骤一中所述氧化镁柱层析方法包括：
硅胶柱层析粗分段得到的色段F1、F5经氧化镁柱层析进一步分离，所述氧化镁柱层析分离方法包括：按质量比1:1将氧化镁与硅藻土混合均匀，121℃烘箱活化2h；冷却后用石油醚充分浸泡，用玻璃棒混成匀浆后将填料装入层析柱，底部用真空泵抽真空，将填料压实，表面平整，加入约1cm的无水硫酸钠；用石油醚平衡层析柱两个柱体积；样品溶解后湿法上样，以石油醚/丙酮/甲醇梯度洗脱；每10mL收集一管，用TLC检测类胡萝卜素的分离情况，将相同组分合并后浓缩称重；F1、F5色段经氧化镁柱层析进一步分离,能分别得到较纯类胡萝卜素单体A5、B5。
进一步，步骤一中将硅胶柱层析粗分段色段F4进行半制备高效液相色谱分离，所述半制备型高效液相色谱条件为:采用ShimadzuC18色谱柱；柱温30℃，流速3mL/min；流动相乙腈:甲醇:二氯甲烷＝75:20:5；检测波长450nm。根据色谱图中单体出峰时间收集不同单体的洗脱液，多次进样，将同一单体的洗脱液合并后浓缩得到较纯类胡萝卜素单体C1、C2；
进一步，步骤一中，结晶方法包括：将分离所得的类胡萝卜素单体A5、B5、C1、C2用双溶剂法进行结晶，分别得到晶体R1、R2、R3、R4，称重并用HPLC测定纯度。
进一步，步骤二中，薄层层析方法包括：
将类胡萝卜素单体和标准品同时点样，比较两者薄层层析特征。薄层层析展开剂为正己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲醇＝16:2:1:1，10％硫酸-无水乙醇显色、紫外灯254nm及365nm下照射观察无色杂质的位置。
进一步，步骤二中C30-HPLC-DAD-APCI-MS条件包括：
HPLC：色谱柱为YMC-C30(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱；柱温：40℃；检测器SPD-M20A，波长450nm，紫外-可见光谱扫描范围250～600nm；进样量为10μL，流动相为甲醇(A):乙腈(B)＝8:2(V:V)，A、B均含有0.1％BHT。
MS：APCI源，离子源温度450℃；干燥气(氮气)流速5.0L/min；雾化气(氮气)流速4.0L/min；CDL温度：300℃；加热板温度：300℃；质谱仪全程采用正离子全扫描模式，m/z扫描范围为350～1200。
进一步，步骤二中，核磁共振氢谱方法方法包括：称取2mg样品溶解于CDCL3，并转移至核磁管中，置于核磁共振波谱仪中进行测定。
本发明目的在于提供一种实施所述桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化的方法。
本发明另一目的在于提供一种所述桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法在食品、化妆品和制药领域的应用。
本发明的优点及积极效果为：本发明的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，它能从桔皮中同时制备得到β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素4种天然类胡萝卜素，方法简单实用，分离效果好，分离产物纯度均高于96％，分离效率及产物纯度优于当前研究者对胡萝卜、辣椒、万寿菊等中类胡萝卜素的开发研究，可应用于其它植物源类胡萝卜素的工业化生产。
本发明以桔皮类胡萝卜素皂化提取液(SCE)为原料，采用丙酮沉淀-硅胶柱层析-氧化镁柱层析/半制备液相-结晶等手段相结合对桔皮类胡萝卜素进行纯化，得到4种高纯度的类胡萝卜素结晶R1、R2、R3、R4，并利用薄层色谱法、C30-HPLC-DAD-APCI-MS、核磁共振谱法对纯化得到的类胡萝卜素进行结构鉴定。结果包括：
(1)类胡萝卜素的分离纯化：经过TLC试验得出，类胡萝卜素TLC最佳展开条件为正己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲醇＝16:2:1:1，清晰展开9个斑点。类胡萝卜素粗提物经硅胶柱层析(正己烷:丙酮＝20:1～6:1)粗分段分离得到5个极性相近的色段F1-F5，经TLC和HPLC结合标准品对其类胡萝卜素组成进行分析得出：F1色段是β-胡萝卜素和其它脂溶性杂质的混合物；F2色段主要含两种类胡萝卜素，β-隐黄素含量很高；F4主要含有叶黄素和玉米黄素。色段F3、F5组分复杂，杂质较多，考虑分离难度和时间成本，在本研究中未进行下一步分离实验。色段F1经氧化镁柱层析(1％～5％丙酮/石油醚)可去除大量脂溶性杂质，分离得到较纯类胡萝卜组分A5，色段F2经氧化镁柱层析(石油醚-丙酮-甲醇＝99:1:0～70:25:5)除杂分离得到较纯类胡萝卜组分B5，色段F4经半制备液相分离得到类胡萝卜素较纯组分C1、C2，经TLC和HPLC结合标准品分析A5、B5、C1、C2纯度较分离前大大提升。类胡萝卜素组分A5、B5、C1、C2用双溶剂法进行结晶，分别得到晶体R1、R2、R3、R4，经HPLC面积归一法得出晶体R1、R2、R3、R4纯度分别为98.79％、99.11％、96.59％、96.77％。
(2)纯化后类胡萝卜素的鉴定：晶体R1、R2、R3、R4经薄层层析、C30-HPLC-DAD-APCI-MS、核磁共振氢谱、结晶的微观形态分析等方法鉴定为β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素。最终β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素的纯度达到98.79％、99.11％、96.59％、96.77％，得率分别为0.0025‰、0.0275‰、0.0066‰、0.0092‰。
附图说明
图1是本发明实施提供的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法流程图。
图2是本发明实施提供的桔皮类胡萝卜素的分离纯化工艺图。
图3是本发明实施提供的不同TLC展开剂的展开效果图。
图4是本发明实施提供的类胡萝卜素柱层析分离色段(F1-F5、A5、B5)的薄层层析图。
图5是本发明实施提供的F1-F5、A5、B5、C1、C2的C30-HPLC检测图。
图6是本发明实施提供的晶体R1-R4的薄层层析图。
图7是本发明实施提供的结晶R1、R2、R3、R4的C30-HPLC检测图。
图8是本发明实施提供的晶体R1-R4的DAD光谱扫描图。
图中：a-1、b-1、c-1、d-1标准品β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素光谱图；a-2、b-2、c-2、d-2分别为晶体R1、R2、R3、R4光谱图。
图9是本发明实施提供的晶体R1-R4的质谱图。
图中：A-1、B-1、C-1、D-1标准品β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素质谱图；A-2、B-2、C-2、D-2分别为晶体R1、R2、R3、R4质谱图。
图10是本发明实施提供的晶体R1-R4核磁共振氢谱图。
图11是本发明实施提供的晶体R1-R4显微照片图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化效果差，含有杂质。
为解决上述问题，下面结合附图对本发明的技术方案作详细描述。
如图1所示，本发明提供实施例桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法包括以下步骤：
S101，以桔皮类胡萝卜素皂化提取液SCE为原料，采用丙酮沉淀-硅胶柱层析-氧化镁柱层析/半制备液相-结晶等手段相结合对桔皮类胡萝卜素进行纯化，得到4种高纯度的类胡萝卜素结晶R1、R2、R3、R4。
S102，利用薄层色谱法、C30-HPLC-DAD-APCI-MS、核磁共振谱法对纯化得到的类胡萝卜素进行结构鉴定。
在本发明实施例中，本发明提供的丙酮沉淀方法操作包括：
将所得色素浓缩液减压浓缩至干并称重，按20mL/g加入丙酮溶液，置于-80℃沉淀12h，离心去除沉淀，将上清液浓缩即得类胡萝卜素粗提物。
在本发明实施例中，本发明硅胶柱层析进行类胡萝卜素粗分段，用正己烷湿法装柱，干法上样，以(正己烷:丙酮＝20:1～6:1)梯度洗脱，每50mL收集一管，用TLC监控各管的分离情况，合并相同组分的色管并浓缩称重；桔皮类胡萝卜素粗提物经硅胶粗分段分离得到5个色段F1-F5。
在本发明实施例中，本发明提供的氧化镁柱层析方法包括：
硅胶柱层析粗分段得到的色段F1、F5经氧化镁柱层析进一步分离，所述氧化镁柱层析分离方法包括：按质量比1:1将氧化镁与硅藻土混合均匀，121℃烘箱活化2h；冷却后用石油醚充分浸泡，用玻璃棒混成匀浆后将填料装入层析柱，底部用真空泵抽真空，将填料压实，表面平整，加入约1cm的无水硫酸钠；用石油醚平衡层析柱两个柱体积；样品溶解后湿法上样，以石油醚/丙酮/甲醇梯度洗脱；每10mL收集一管，用TLC检测类胡萝卜素的分离情况，将相同组分合并后浓缩称重；F1、F5色段经氧化镁柱层析进一步分离,能分别得到较纯类胡萝卜素单体A5、B5。
在本发明实施例中，本发明将硅胶柱层析粗分段色段F4进行半制备高效液相色谱分离，所述半制备型高效液相色谱条件为:采用ShimadzuC18色谱柱；柱温30℃，流速3mL/min；流动相乙腈:甲醇:二氯甲烷＝75:20:5；检测波长450nm。根据色谱图中单体出峰时间收集不同单体的洗脱液，多次进样，将同一单体的洗脱液合并后浓缩得到较纯类胡萝卜素单体C1、C2。
下面结合具体实施例及实验方法对本发明作进一步描述。
实施例
1.材料、试剂与仪器
1.1材料：提取得到类胡萝卜素皂化提取液。
1.2试剂与仪器
表1实验试剂
表2实验仪器
2.实验方法
2.1类胡萝卜素的分离纯化流程：按优化的微波皂化法制备的桔皮类胡萝卜素皂化液(SCE)，类胡萝卜素的分离和纯化流程如图2所示。
2.2丙酮沉淀：丙酮沉淀法可有效除去类胡萝卜素粗提液中的部分中性脂杂质，增强随后的层析效率。将2.1所得色素浓缩液减压浓缩至干并称重，按20mL/g加入丙酮溶液，置于-80℃沉淀12h，离心去除沉淀，将上清液浓缩即得类胡萝卜素粗提物。
2.3薄层层析(TLC)：点样前将色素浓缩液适当稀释后待用，展开剂配制好后置于层析缸中平衡2min，用毛细血管吸取适量色素浓缩液点样于层析板上，随即放入层析缸中进行展开，当展开剂展开至层析板顶端1cm处，取出层析板，用吹风机冷风吹干，记录各斑点的位置。各斑点在层析板上的位置用Rf值(Rf＝斑点移动距离/展开剂前沿移动距离)表示。10％硫酸-无水乙醇显色、紫外灯254nm及365nm下照射观察无色杂质的位置。
2.4柱层析(OCC)：
2.4.1硅胶柱层析粗分段：选用规格为5×100cm的层析柱，称量200g硅胶，110℃烘箱活化2h，用正己烷湿法装柱，再用正己烷平衡柱子两个柱体积。称取5g类胡萝卜素粗提物，干法上样，以正己烷/丙酮梯度洗脱，每50mL收集一管，用TLC监控各管的分离情况，合并相同组分的色管并浓缩称重。桔皮类胡萝卜素粗提物经硅胶粗分段分离得到5个色段F1-F5。
2.4.2氧化镁柱层析：硅胶柱层析粗分段得到的色段F1、F5经氧化镁柱层析进一步分离，根据样品质量选择合适尺寸的层析柱。按质量比1:1将氧化镁与硅藻土混合均匀，121℃烘箱活化2h。冷却后用石油醚充分浸泡，用玻璃棒混成匀浆后将填料装入层析柱，底部用真空泵抽真空，将填料压实，保证表面平整，加入约1cm的无水硫酸钠。用石油醚平衡层析柱两个柱体积。样品溶解后湿法上样，以石油醚/丙酮/甲醇梯度洗脱。每10mL收集一管，用TLC检测类胡萝卜素的分离情况，将相同组分合并后浓缩称重。F1、F5色段经氧化镁柱层析进一步分离得到较纯类胡萝卜素单体A5、B5。
2.5半制备液相色谱(HPLC)：将硅胶柱层析粗分段色段F4进行半制备高效液相色谱分离，根据色谱图中单体出峰时间收集不同单体的洗脱液，多次进样，将同一单体的洗脱液合并后浓缩得到较纯类胡萝卜素单体C1、C2。半制备型高效液相色谱条件为:采用ShimadzuC18(250×10mm)色谱柱；柱温30℃，流速3mL/min；流动相乙腈:甲醇:二氯甲烷＝75:20:5(含0.05％乙酸铵)；检测波长450nm。
2.6结晶实验：将上述步骤分离所得的类胡萝卜素单体A5、B5、C1、C2用双溶剂法进行结晶，分别得到晶体R1、R2、R3、R4，称重并用HPLC测定其纯度。4种单体结晶方法如表3所示。
表3类胡萝卜素结晶方法
2.7类胡萝卜素的鉴定：
2.7.1薄层层析(TLC)：将类胡萝卜素单体和标准品同时点样，比较两者薄层层析特征，方法同2.3。
2.7.2C30-HPLC-DAD-APCI-MS。
2.7.3核磁共振氢谱：称取2mg样品溶解于CDCL3，并立即转移至核磁管中，置于核磁共振波谱仪中进行测定。
2.7.4晶体的微观形态观察：用镊子挑取微量晶体于载玻片上，进行显微观察，并拍照记录。
2.8类胡萝卜素的得率及纯度计算：
(1)叶黄素、玉米黄素、β-隐黄素、β-胡萝卜素的含量通过相应标准品的标准曲线进行计算，类胡萝卜素的得率的计算公式包括：
式中：m，样品中类胡萝卜素的质量，g；M，桔皮粉质量，g。
表4类胡萝卜素的标准曲线
(2)类胡萝卜素的纯度的计算：HPLC面积归一法。
3、实验结果
3.1类胡萝卜素的分离与纯化：
3.1.1薄层层析展开剂的筛选：薄层体系的筛选是做好分离的首要工作。表5、图3为不同展开系统对类胡萝卜素粗提物的展开效果，由其可知，二元体系中正己烷-丙酮体系对色素的展开效果较好，由于桔皮类胡萝卜素成分复杂，三元、四元体系对类胡萝卜素的分离效果优于二元体系，最后筛选得到最佳展开体系为正己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲醇＝16:2:1:1，可将桔皮类胡萝卜素分离为9个斑点。
表5 TLC展开剂筛选结果表
3.1.2硅胶柱层析粗分段的色素组成分析：通过硅胶柱层析可将类胡萝卜素按极性从小到大的顺序分离成若干极性段，方便进一步分离。根据薄层层析体系的筛选结果，选用正己烷-丙酮为洗脱剂进行梯度洗脱，选择洗脱剂的配比原则是将目标物质在薄层板上的Rf值压至0.2左右，这样能达到较好的分离效果，调整洗脱剂的配比(正己烷:丙酮＝20:1～6:1)经硅胶粗分段分离得到5个色段，命名为F1-F5。图4-a为色段F1-F5的薄层色谱图(从左至右依次为硫酸显色前，荧光254nm，荧光365nm，硫酸显色后)，其中样品从左至右F1-F5、SA-SD依次为分离的5个色段F1-F5以及类胡萝卜素标准品(β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素)。图5-a为色段F1-F5的高效液相色谱图，HB为β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素混标。
通过薄层色谱和高效液相色谱分析，将F1-F5与4种类胡萝卜素标品的Rf、出峰时间进行比对可初步分析F1-F5的主要类胡萝卜素组分，并可通过观察薄层层析中硫酸显色、紫外灯测定判断无色杂质的存在。类胡萝卜素硫酸显色后通常呈淡蓝色或蓝白色，而脂溶性杂质在硫酸显色后通常呈土黄色、玫瑰红色以及紫色等；无色杂质吸收紫外线导致结合了荧光指示剂的层析板淬灭，从而在紫外照射亮的背景下产生暗点。综上可初步判断F1色段是β-胡萝卜素和其它脂溶性杂质的混合物，进一步分离重点是除去脂溶性杂质；F2色段主要含两种类胡萝卜素，β-隐黄素含量很高，并有杂质存在，可进一步分离、去除杂质得到β-隐黄素单体；F4主要含有叶黄素和玉米黄素，由于这两种类胡萝卜素极性极为相近，用柱层析法分离难度很大，考虑用HPLC进行分离。色段F3、F5组分复杂，杂质较多，考虑分离难度和时间成本，在本发明中未进行下一步分离实验。
3.1.3色段F1、F2、F4的分离纯化：色段F1在氧化镁层析柱中用石油醚-丙酮梯度洗脱(1～5％丙酮/石油醚)进行分离，得到5个馏分，命名为A1-A5，薄层色谱图如4-b图所示(从左至右依次为荧光254nm、365nm、硫酸显色)，样品从左到右依次为A1-A5、β-胡萝卜素标准品，由图可知色段A1-A4主要为无色杂质，色段A5呈现单斑点，硫酸显色和紫外检测未见杂质明显存在，纯度较高，并与β-胡萝卜素标品色谱行为一致；馏分A5进一步进行色谱分析，HPLC色谱图如图5-b所示，由图可知A5组分主峰与β-胡萝卜素标准品出峰时间一致，含有少量杂峰，综上色段F1经氧化镁柱层析分离后杂质含量降低显著，纯度进一步提高，按方法2.5结晶后得到类胡萝卜素晶体R1。
色段F2经氧化镁柱层析用石油醚-丙酮-甲醇梯度洗脱(99:1:0～70:25:5)进行分离，得到6个馏分，命名为B1-B6，薄层色谱如图4-c所示(从左至右依次为薄层层析硫酸显色前、荧光254nm、365nm、硫酸显色)，样品从左至右依次为F2、B1-B6、β-隐黄素标品。由图可知色段B1-B4含有大量无色杂质，色段B5呈现单斑点，硫酸显色和紫外检测未见明显杂质存在，纯度较高，图5-b可知B5主峰与β-隐黄素标品色谱行为一致，含有少量杂峰，按方法2.5结晶后得到类胡萝卜素晶体R2。
色段F4在半制备HPLC中根据出峰时间收集不同单体的洗脱液，多次进样，将同一单体的洗脱液合并后浓缩得到较纯类胡萝卜素单体C1、C2。C1、C2的HPLC色谱图如图5-b所示，由图可知F4组分经半制备色谱分离后，得到两种较纯的类胡萝卜素单体，单体C1、C2的主峰时间分别与叶黄素、玉米黄素标准品保持一致。按方法2.5结晶后得到类胡萝卜素晶体R3、R4。
3.2类胡萝卜素组分的结构鉴定：
3.2.1类胡萝卜素组分的薄层层析：图6为结晶R1、R2、R3、R4的薄层层析色谱图，从左至右依次为R2、β-隐黄素标品、R1、β-胡萝卜素标品、R3、叶黄素标品、R4、玉米黄素标品，由图6可知R1、R2、R3、R4均呈现单点，未见其它杂质，纯度较高，Rf值与对应标品相近，斑点形状、颜色与标准品吻合。
3.2.2类胡萝卜素结晶的C30-HPLC-DAD-APCI-MS分析：液质联用集液相高分离度与质谱高灵敏性、高专属性于一体，能够使类胡萝卜素样品的分离、定性、定量一次完成。目前C30-HPLC-DAD-APCI-MS技术是天然类胡萝卜素分析种最为活跃的技术，综合紫外-可见光谱特征、色谱和质谱信息，是类胡萝卜素鉴定的有效手段。图7、图8、图9为β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素标准品及结晶R1、R2、R3、R4的高效液相色谱图、DAD扫描光谱图以及质谱图。从图7可知，结晶R1、R2、R3、R4呈现单峰，无其他较大杂质峰出现，且结晶R1、R2、R3、R4分别与β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素标准品出峰时间相近。在4个晶体色谱峰峰前沿、峰左右两中段、峰顶点、峰后沿这5个位置采集光谱，发现这5个位置的光谱均保持一致，表明这些色谱峰为纯峰，光谱图如图8所示，由图可知晶体R1、R2、R3、R4分别与标准品β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素光谱扫描曲线极为相似。将色谱信息(出峰时间)、光谱信息(最大吸收波长λmax、光谱精细结构％III/II)、质谱信息(分子量、特征离子)与相应标准品对照，可以得出结晶的光谱、液相色谱和质谱特征与相应标准品基本保持一致，各晶体及标品的光谱、色谱、质谱信息总结于表6。
表6类胡萝卜素素晶体和标准品的光谱、色谱、质谱信息
3.2.3类胡萝卜素结晶的核磁共振氢谱分析：如图10(a-d)所示，晶体R11H-NMR(500MHz，CDCL3)δ:1.05(s，Me-16,17,16′,17′)，1.47(s,H-2,2′)，1.63(m,H-3,3′)，1.74(s,Me-18,18′),1.99(s,Me-19,20,19′,20′),2.03(m,H-4,4′),6.1-6.7(m,H-7,7′,8,8′,10,10′,11,11′,12,12′,14,14′,15,15′)。此外，1.0-2.0为烷烃＝CH-结构信号峰；2.0-3.0为烯烃-CH＝CH2信号峰；6.0-7.0为芳烃-CH2-CH＝信号峰；7.28为溶剂CDCL3的信号峰。从核磁共振氢谱分析该物质为β-胡萝卜素。该结果与文献报道基本一致。
晶体R21H-NMR(500MHz，CDCL3)δ:1.05(s，Me-16′，Me-17′)，1.09(s，Me-16，Me-17)，1.47(m,H-2′)，1.48(m,H-2β)，1.63(m,H-3)，1.74(s,Me-18′)，1.75(s,Me-18)，1.77(m,H-2α)，1.98(s，Me-19,Me-20,Me-19′,Me-20′),2.03(m,H-4′),
2.04(m，H-4β)，2.39(brdd,J＝16.6,4.3Hz,H-4α),4.01(m,H-3),6.01～6.20(m,H-7,H-7′,H-8,H-8′,H-10,H-10′),6.27(br,m,H-14,H-14′)，6.36(d,J＝15.0Hz,H-12′),6.37(d,J＝15.0Hz，H-12),6.63(brdd,J＝15,12Hz,H-11,H＝11′,H＝15,H＝15′)。从核磁共振氢谱分析该物质为β-隐黄素。该结果与文献报道基本一致。
晶体R31H-NMR(500MHz，CDCL3)δ:0.78,0.91(s,Me-1'),1.02(s,Me-1),1.21(dd,J＝9.5,8.8Hz,H-2'),1.27(t,J＝12.8Hz,H-2),1.65(s,Me-5'),1.67(s,Me-5),1.69(dd,J＝12.8,7.2Hz,H-2'),1.88(s,Me-9'),1.94(s,Me-9,Me-13,Me-13'),4.0(m,H-3),4.47(s,H-3'),5.46(s,H-4'),6.14(s,H-7,H-8),6.15(m,H-8',H-10'),6.24(m,H-14,H-14'),6.39(d,J＝14.5Hz,H-12,H-12'),6.71(m,H-11,H-11',H-15,H-15')。以上数据与参考文献报道基本一致，故鉴定其结构为叶黄素。
晶体R41H-NMR(500MHz,CDCL3)δ:1.48(s,H-2,H-2'),1.78(m,H-2,H-2'),2.06(m,H-4,H-4'),1.98(s,Me-9,Me-9',Me-13,Me-13'),2.39(m,H-4,H-4'),4.02(m,H-3,H-3'),6.13(s,H-7,H-7'),6.16(m,H-10,H-10'),6.18(s,H-8,H-8'),6.27(m,H-14,H-14'),6.37(s,H-12,H-12'),6.64(m,H-15,H-15'),6.65(m,H-11,H-11')。以上数据与参考文献报道基本一致，故鉴定其结构为玉米黄素。
3.2.4类胡萝卜素结晶的微观形态：图11为类胡萝卜素结晶R1、R2、R3、R4在光学显微镜下(目镜10X，物镜40X)的照片。从图11中可以看出，β-胡萝卜素素结晶为紫红色，呈六角棱柱状；β-隐黄素呈带有金属光泽的红色片状；叶黄素结晶呈带有金属光泽的黄色棱柱状；玉米黄素呈带有金属光泽的菱形片状。
3.3类胡萝卜素的得率及纯度估算：对“皂化-硅胶柱层析-氧化镁柱层析/半制备液相-结晶”体系中类胡萝卜素的得率及纯度进行初步计算，由表7可以看出，随着纯化的进行，类胡萝卜素得率逐渐下降，最终β-胡萝卜素、β-隐黄素、叶黄素、玉米黄素的纯度达到98.79％、99.11％、96.59％、96.77％，得率分别为0.0025‰、0.0275‰、0.0066‰、0.0092‰。由此可见，“皂化-硅胶柱层析-氧化镁柱层析/半制备液相-结晶”体系可以有效分离桔皮类胡萝卜素，得到高纯度的类胡萝卜素单体。
表7类胡萝卜素得率及纯度估算
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，所述桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法包括以下步骤：
步骤一，以桔皮类胡萝卜素皂化提取液为原料，采用丙酮沉淀、硅胶柱层析、氧化镁柱层析/半制备液相、结晶方法相结合对桔皮类胡萝卜素进行纯化，得到高纯度的类胡萝卜素结晶R1、R2、R3、R4；
步骤二，利用薄层色谱法、C30-HPLC-DAD-APCI-MS、核磁共振谱法对纯化得到的类胡萝卜素进行结构鉴定。
2.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述丙酮沉淀方法包括：
将皂化所得色素浓缩液减压浓缩至干并称重，按20mL/g加入丙酮溶液，置于-80℃沉淀12h，离心去除沉淀，将上清液浓缩即得类胡萝卜素粗提物。
3.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤一中所述硅胶柱层析进行类胡萝卜素粗分段，用正己烷湿法装柱，干法上样，以正己烷:丙酮＝20:1～6:1混合液进行梯度洗脱，每50mL收集一管，用TLC监控各管的分离情况，合并相同组分的色管并浓缩称重；桔皮类胡萝卜素粗提物经硅胶粗分段分离得到5个色段F1-F5。
4.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，所述氧化镁柱层析方法包括：硅胶柱层析粗分段得到的色段F1、F5经氧化镁柱层析进一步分离，所述氧化镁柱层析分离方法包括：按质量比1:1将氧化镁与硅藻土混合均匀，121℃烘箱活化2h；冷却后用石油醚充分浸泡，用玻璃棒混成匀浆后将填料装入层析柱，底部用真空泵抽真空，将填料压实，表面平整，加入1cm的无水硫酸钠；用石油醚平衡层析柱两个柱体积；样品溶解后湿法上样，以石油醚/丙酮/甲醇梯度洗脱；每10mL收集一管，用TLC检测类胡萝卜素的分离情况，将相同组分合并后浓缩称重；F1、F5色段经氧化镁柱层析进一步分离，分别得到较纯类胡萝卜素单体A5、B5。
5.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤一中，将硅胶柱层析粗分段色段F4进行半制备高效液相色谱分离，所述半制备型高效液相色谱条件为:采用ShimadzuC18色谱柱；柱温30℃，流速3mL/min；流动相乙腈:甲醇:二氯甲烷＝75:20:5；检测波长450nm；根据色谱图中单体出峰时间收集不同单体的洗脱液，多次进样，将同一单体的洗脱液合并后浓缩得到较纯类胡萝卜素单体C1、C2；
步骤一中，结晶方法包括：将分离所得的类胡萝卜素单体A5、B5、C1、C2用双溶剂法进行结晶，分别得到晶体R1、R2、R3、R4，称重并用HPLC测定纯度。
6.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，薄层层析方法包括：将类胡萝卜素单体和标准品同时点样，比较两者薄层层析特征；薄层层析展开剂为正己烷:丙酮:乙酸乙酯:甲醇＝16:2:1:1，10％硫酸-无水乙醇显色、紫外灯254nm及365nm下照射获取无色杂质的位置。
7.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，C30-HPLC-DAD-APCI-MS的条件包括：
HPLC：色谱柱为4.6mm×250mm,5μm的YMC-C30色谱柱；柱温：40℃；检测器SPD-M20A，波长450nm，紫外-可见光谱扫描范围250～600nm；进样量为10μL，流动相为甲醇(A):乙腈(B)＝8:2(V:V)，A、B均含有0.1％BHT；
MS：APCI源，离子源温度450℃；干燥气流速5.0L/min；雾化气流速4.0L/min；CDL温度：300℃；加热板温度：300℃；质谱仪全程采用正离子全扫描模式，m/z扫描范围为350～1200。
8.如权利要求1所述的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法，其特征在于，步骤二中，核磁共振氢谱方法方法包括：称取2mg样品溶解于CDCL3，并转移至核磁管中，置于核磁共振波谱仪中进行测定。
9.一种实施权利要求1所述桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法的桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化设备。
10.一种如权利要求1所述桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法在食品、化妆品和制药领域的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910505202.4A CN110483357A (zh) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | 一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910505202.4A CN110483357A (zh) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | 一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110483357A true CN110483357A (zh) | 2019-11-22 |
Family
ID=68546210
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910505202.4A Pending CN110483357A (zh) | 2019-09-03 | 2019-09-03 | 一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110483357A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111579667A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种β-胡萝卜素标准样品及其制备方法和应用 |
| CN112920101A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种纯化分离万寿菊中叶黄素的方法 |
| CN115078590A (zh) * | 2022-07-16 | 2022-09-20 | 福建省产品质量检验研究院(福建省缺陷产品召回技术中心) | 一种二维液相色谱法测定8种类胡萝卜素种类的检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011241197A (ja) * | 2010-05-21 | 2011-12-01 | National Agriculture & Food Research Organization | カロテノイド組成物の製造方法、高濃度カロテノイド組成物の製造方法、高純度遊離型カロテノイド組成物の製造方法、カロテノイド組成物、高濃度カロテノイド組成物、及び高純度遊離型カロテノイド組成物 |
| CN108641972A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-10-12 | 西南大学 | 一种可产类胡萝卜素类红色素的鲁氏不动杆菌及其应用 |
-
2019
- 2019-09-03 CN CN201910505202.4A patent/CN110483357A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011241197A (ja) * | 2010-05-21 | 2011-12-01 | National Agriculture & Food Research Organization | カロテノイド組成物の製造方法、高濃度カロテノイド組成物の製造方法、高純度遊離型カロテノイド組成物の製造方法、カロテノイド組成物、高濃度カロテノイド組成物、及び高純度遊離型カロテノイド組成物 |
| CN108641972A (zh) * | 2018-03-21 | 2018-10-12 | 西南大学 | 一种可产类胡萝卜素类红色素的鲁氏不动杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 方明 等: "微波皂化法提取桔皮中类胡萝卜素及其组分分析", 《食品与发酵工业》 * |
| 胡建中: "柑橘中类胡萝卜素的提取、分离、鉴定及其稳定性研究", 《华中农业大学硕士学位论文》 * |
| 蒋国玲: "温州蜜柑皮β--隐黄素的提取、纯化及稳定性研究", 《西南大学硕士学位论文》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112920101A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种纯化分离万寿菊中叶黄素的方法 |
| CN112920101B (zh) * | 2019-12-06 | 2022-05-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种纯化分离万寿菊中叶黄素的方法 |
| CN111579667A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种β-胡萝卜素标准样品及其制备方法和应用 |
| CN115078590A (zh) * | 2022-07-16 | 2022-09-20 | 福建省产品质量检验研究院(福建省缺陷产品召回技术中心) | 一种二维液相色谱法测定8种类胡萝卜素种类的检测方法 |
| CN115078590B (zh) * | 2022-07-16 | 2023-08-04 | 福建省产品质量检验研究院(福建省缺陷产品召回技术中心) | 一种二维液相色谱法测定8种类胡萝卜素种类的检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110483357A (zh) | 一种桔皮主要类胡萝卜素的分离纯化方法 | |
| Wang et al. | Systematic separation and purification of iridoid glycosides and crocetin derivatives from Gardenia jasminoides Ellis by high‐speed counter‐current chromatography | |
| Dobrev et al. | Purification and determination of plant hormones auxin and abscisic acid using solid phase extraction and two-dimensional high performance liquid chromatography | |
| Patel et al. | Introduction to hyphenated techniques and their applications in pharmacy | |
| Zhou et al. | Large-scale isolation and purification of geniposide from the fruit of Gardenia jasminoides Ellis by high-speed counter-current chromatography | |
| Zhou et al. | Simultaneous determination of 17 disperse dyes in textile by ultra-high performance supercritical fluid chromatography combined with tandem mass spectrometry | |
| Pinckard et al. | A comparative study of the three stereoisomeric 1, 4-diphenylbutadienes | |
| Qi et al. | Qualitative and quantitative analysis of Radix Astragali products by fast high-performance liquid chromatography-diode array detection coupled with time-of-flight mass spectrometry through dynamic adjustment of fragmentor voltage | |
| Weber et al. | Simple method for the extraction and reversed-phase high-performance liquid chromatographic analysis of carotenoid pigments from red yeasts (Basidiomycota, Fungi) | |
| Báthori | Purification and characterization of plant ecdysteroids of Silene species | |
| He et al. | Separation of two constituents from purple sweet potato by combination of silica gel column and high-speed counter-current chromatography | |
| Shehzad et al. | State-of-the-art separation of ginsenosides from Korean white and red ginseng by countercurrent chromatography | |
| CN105891316A (zh) | 一种同时筛查分析纺织品中禁限用染料的方法 | |
| Lu et al. | Effective two-dimensional counter-current chromatographic method for simultaneous isolation and purification of oridonin and ponicidin from the crude extract of Rabdosia rubescens | |
| CN105891364A (zh) | 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法及试剂盒 | |
| Zhang et al. | Cost-efficient and process-efficient separation of geniposide from Gardenia jasminoides Ellis by high-performance counter-current chromatography | |
| Awuchi et al. | Hyphenated techniques | |
| Peng et al. | Flow rate gradient high-speed counter-current chromatography separation of five diterpenoids from Triperygium wilfordii and scale-up | |
| Strohschein et al. | Hyphenation of high performance liquid chromatography with nuclear magnetic resonance spectroscopy for the characterization of β-carotene isomers employing a C30 stationary phase | |
| Zhao et al. | A multidimensional chromatography/high-resolution mass spectrometry approach for the in-depth metabolites characterization of two Astragalus species | |
| Luo et al. | Predictable and linear scale-up of four phenolic alkaloids separation from the roots of Menispermum dauricum using high-performance counter-current chromatography | |
| CN110950774B (zh) | 蛋白质定量标记试剂及其制备方法与应用 | |
| Joshi et al. | Hyphenated technique-a BOON to analytical world | |
| Zhu et al. | Comprehensive screening and separation of cyclooxygenase-2 inhibitors from Pterocephalus hookeri by affinity solid-phase extraction coupled with preparative high-performance liquid chromatography | |
| Jinno et al. | Separation and identification of higher fullerenes by high‐performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization mass spectrometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20191122 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |