CN110448733A - 一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医疗技术领域，尤其是一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，包括钛笼，所述钛笼的顶部设有中间层，所述中间层的顶面设有软骨层，所述钛笼为圆筒状，所述钛笼外径为6±0.05mm，所述钛笼的壁厚为1±0.05mm，所述中间层的厚度为1±0.05mm，所述软骨层的厚度为2±0.05mm。此次设计的三层一体化支架相比上一次专利所设计的支架不仅保留了原支架阻挡组织间细胞互相迁移、分隔软骨组织与骨组织，减少细胞种植次数简化操作步骤的优势且结构更加优化。

Description

一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，运用组织工程原理构建生物仿生支架修复关节软骨缺损。本发明应用生物友好型材料，通过模拟人体关节天然骨软骨组织结构，与种子细胞结合较好地修复关节软骨缺损，具体地涉及一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架。

背景技术

目前，应用模拟天然骨软骨组织多层渐变结构的一体化支架修复软骨缺损已经成为当下的研究热点之一。Levingstone等人以胶原和羟基磷灰石为原材料制作了三层一体化支架，较好地模拟了天然骨软骨组织中“软骨层-钙化层-骨层”的多层结构。Ding等人以丝素蛋白和羟基磷灰石为原材料制作了具有“软骨层-中间层-骨层”三层结构的一体化支架，较好地修复了关节软骨缺损。

虽然，应用多层一体化支架修复关节软骨缺损已经取得了可喜的成果，但是仍旧存在一些问题亟待解决。特别是在体外培养组织工程骨软骨复合组织块时，往往需要在一体化支架的不同层次中种植入对应其层次的细胞，或者将间充质干细胞分别诱导成对应其层次的细胞。Galperin等人在其设计的多层支架的骨层中首先种植入hBMSCs，待细胞完全黏附后，在软骨层中种植入由hBMSCs诱导而成的软骨细胞，最后在标准培养液中培养4周以构建出骨软骨复合组织块。该方法所使用的标准培养液为不含诱导因子的普通培养液，仅适合软骨细胞的黏附和增殖，但不能较好地诱导骨层中hBMSCs分化为成骨细胞，容易导致下方松质骨修复效果欠佳。Ding等人将脂肪间充质干细胞分别诱导分化为软骨细胞和成骨细胞后，将两种细胞分别植入多层支架的软骨层和骨层，然后在软骨和成骨分化培养液中分别培养7天和21天以构建组织工程骨软骨复合组织块。该团队所使用的方法虽然能够保证各层中的间充质干细胞能够完全分化为对应的细胞，但是该方法需要经过两次诱导分化和一段时间的共培养，操作步骤繁杂，成本高，耗时长。Soner等人首先在软骨支架中种植入软骨细胞，在软骨化培养基中培养2周，在骨层支架中种植入hBMSCs，在成骨化培养基中培养2周。然后将这两种支架与一种不含细胞的中间层支架通过物理方法连接成一个一体化多层支架并将该多层一体化支架放置于共培养液中继续培养了2周。该团队试图通过骨层和软骨层分开培养的方法保证各层中细胞的稳定分化和增殖，但是该方法破坏了多层支架的一体化特性，容易导致后期的培养过程中支架的分层和脱落。发明人在之前的研究中设计了一种模拟正常骨软骨区域“软骨层-钙化层-骨层”梯度渐变结构的三层一体化支架。该支架以低浓度壳聚糖/明胶溶液为软骨层，低浓度壳聚糖/明胶溶液为中间层，β-TCP为骨层(以下称为TCP支架)。发明人在该支架的软骨层中植入自体山羊软骨细胞，经过四周体外培养后，在该支架的骨层中植入山羊BMSCs后将支架-细胞复合物植入山羊关节软骨缺损区进行修复。虽然，该方法取得了令人满意的效果，但是需要从体内获取两种细胞，操作步骤多，且修复时间较长(6个月)。由此可见，通过在一体化支架的不同层次中种植入对应的细胞，并将其培养出骨软骨复合组织块来修复关节软骨缺损的方法操作复杂，费时费力，对细胞的种类要求高，细胞的植入次数多。

在脊柱外科领域，人们利用“钛笼”进行植骨融合，它对于治疗椎体骨折、先天性和发育性畸形、椎间盘突出、关节炎和其他退行性疾病具有良好的疗效。钛笼是由钛合金制成的网笼状椎间融合器，它是一种管状中空的结构，两端呈锯齿状，能够紧密嵌压于上下椎体之间，限制椎体移动。中空部分可以植入自体松质骨，从而促进了植骨的融合。金属钛这种功能生物材料也由于其优良的生物相容性，极强的耐腐蚀性，理想的力学特性在临床上广泛应用。发明人从钛笼植骨术中获得启发，用“钛笼”来替代一体化支架中的骨层，通过在“钛笼”中埋植自体松质骨来替代骨层中细胞的植入。这样一来，既减少了对细胞类型的依赖，又降低了细胞植入的次数，操作简单，耗时较短。而且自体松质骨可以在短期内与周围宿主骨愈合，从而获得充分的营养血供，有利于上方组织工程软骨的生长和存活，防止组织工程软骨退变和纤维化。

发明人在之前的研究中利用壳聚糖和金属钛制作了以“钛笼”为基座的三层一体化支架。该三层支架的制作方法为：首先以金属钛为原料通过3D打印的方法制作了底部的“钛笼”，然后以高浓度壳聚糖为原材料通过第一次冷冻干燥法制作了致密的中间层，最后以低浓度壳聚糖为原材料通过第二次冷冻干燥法制作了上方的软骨层。该三层支架的“钛笼”为高6mm，外径6mm，内径1.5mm，顶部厚度1.5mm的中空杯状结构，中间层为高浓度壳聚糖制作而成的厚度为2mm的致密层，顶层为低浓度壳聚糖制作而成的厚度为2mm的软骨层。其中底部的“钛笼”用于埋植自体松质骨，通过这种方法省去传统支架在底层种植细胞的过程，简化了操作步骤。而中间的致密层模拟了天然骨软骨组织中的钙化层，可以阻挡软骨细胞向骨组织的长入以及骨组织向软骨区域的侵入。顶部的软骨层主要用于种植软骨细胞，经一段时间的体外培养后随支架种植入软骨缺损区进行修复。

三层支架的具体使用方法为：首先，在支架的软骨层中种植自体软骨细胞，体外培养8周。然后在患者软骨缺损处制作一个直径为6mm，深度为10mm(体积与所设计的修复支架直径一致)的圆形骨软骨缺损。将取出的自体骨软骨柱中的松质骨部分用咬骨钳咬碎(碎骨大小约1mm³)并埋植入“钛笼”中。最后，将修复支架植入骨软骨缺损中进行修复。

虽然应用该支架可以解决多层支架在修复软骨缺损过程中需要多次植入细胞的问题并且取得了一定的修复效果，但是随着研究的深入，发明人发现该支架仍旧存在一些问题需要改进。第一，底层松质骨愈合问题。在基于该支架进行的大动物(山羊)实验中发明人发现，在“钛笼”中植入自体松质骨后，经过3个月的修复，植入松质骨与宿主松质骨容易出现不愈合的情况，即埋植松质骨无法与宿主松质骨整合。在已进行的20例山羊关节软骨修复中共有12例出现了不愈合的情况，甚至有部分山羊出现了埋植松质骨坏死的情况。经过观察和研究发明人认为这可能与发明人所设计的“钛笼”内径过小，外壁过厚有关。由于“钛笼”的内径仅为3mm，而“钛笼”的外壁厚度高达1.5mm，使得埋植入“钛笼”内的松质骨与宿主松质骨的物理间隔过大(1.5mm)，导致宿主松质骨无法通过爬行替代的原理将“钛笼”内埋植的松质骨进行整合，最终出现骨层的不愈合。同时，也由于埋植入“钛笼”中的松质骨无法与宿主松质骨整合导致埋植的松质骨失去营养支持，最终出现坏死的情况。

第二，致密层过厚的问题。在基于三层一体化支架的大动物实验中，发明人发现所有的样本均未出现软骨向骨组织中长入或者骨组织向软骨中长入的情况，这表明发明人所设计的致密层能够较好地分隔开软骨组织和骨组织，起到了天然骨软骨组织中钙化层分隔两种组织的作用。但是，在部分样本中出现了新生软骨萎缩，修复效果不佳以及新生软骨与下层松质骨断裂的情况。经过研究发明人认为这可能与发明人所设计的致密层过厚有关。在天然骨软骨组织中，钙化层的厚度大约为0.5mm左右，而发明人所设计的三层支架致密层厚度高达2mm，虽然其确实起到了分隔骨与软骨组织的作用，但是过厚的致密层或多或少阻挡了上下层之间营养成分的输送，影响了下层组织对新生软骨的营养支持，导致新生软骨出现萎缩，修复效果下降的情况。同时，也由于致密层过厚，使得该层结构在短时间内无法在体内完全降解，新生软骨与新生软骨下骨长时间处于物理分离的情况，无法整合，在受到较大应力的情况下，容易在致密层出现分层的情况，导致新生软骨与下层松质骨断裂。

第三，孔径无法精准控制的问题。该三层支架的软骨层与致密层通过两次冻干法制得，软骨层和致密层的孔径只能限定在某一个范围内，无法做到精准控制。比如发明人制作的软骨层孔径大小为50～150μm，但每个孔的孔径并不完全一致，而孔径的大小对细胞在支架中的迁移和生长有很大影响，细胞容易在具有合适孔径的小孔中迁移(一般认为为100μm)，过大和过小均不利于细胞的迁移。因此，孔径大小分布不均的支架势必容易出现细胞在支架内部的分布不均，最终导致组织工程软骨质量不佳。发明人制作的致密层孔径大小为20～40μm，但支架内部孔径并非完全一致，较大的孔径仍然无法完全阻挡细胞的迁移，因此，为了保证致密层的阻隔作用，发明人在设计初期认为增加了致密层的厚度，达到了2mm。如果发明人能保证致密层中孔径的精确统一，势必可以减少致密层的厚度。

第四，软骨层与致密层压缩模量低的问题。该三层支架的软骨层由低浓度壳聚糖，致密层由高浓度壳聚糖通过冷冻干燥法制得，经过检测软骨层和致密层在湿润状态下的压缩模量约为40KPa，远低于正常软骨和钙化层的压缩模量(约为10MPa)。主流理论认为组织工程支架的力学性能越接近正常组织的力学性能越有利于该组织的再生。该三层支架的力学性能显然不符合该理论。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在上述的缺点，而提出的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架。

为达到以上目的，本发明采用的技术方案为：一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，包括钛笼，所述钛笼的顶部设有中间层，所述中间层的顶面设有软骨层，所述钛笼为圆筒状，所述钛笼外径为6±0.05mm，所述钛笼的壁厚为1±0.05mm，所述中间层的厚度为1±0.05mm，所述软骨层的厚度为2±0.05mm。

优选的，所述钛笼为以金属钛作为原料通过3D打印方法制成的，所述钛笼为圆形筒状，所述钛笼底部为开口端、顶部为闭合端，所述中间层设在其闭合端顶面上。

优选的，所述中间层为以PLGA粉末(PLA：PGA＝50：50，摩尔质量＝100KDa)作为原料经过3D打印方法制成，孔径为30±1.5μm。

优选的，所述软骨层为以PLGA粉末(PLA：PGA＝50：50，摩尔质量＝100KDa)作为原料经过3D打印方法制成，孔径为100±5μm。

优选的，制备方法为：

S1、通过3D打印的方法，以钛金属为原料制成钛笼；

S2、通过3D打印的方法，以PLGA粉末作为原料在钛笼的顶部形成致密的中间层；

S3、通过3D打印的方法，以PLGA粉末作为原料在中间层的顶面上形成软骨层。

优选的，所述钛笼、中间层和软骨层均为圆柱形，所述钛笼、中间层和软骨层的外径相等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：此次设计的三层一体化支架相比上一次专利所设计的支架不仅保留了原支架阻挡组织间细胞互相迁移、分隔软骨组织与骨组织，减少细胞种植次数简化操作步骤的优势，而且还具有以下几点优势。第一，结构更加优化。支架的结构(包括各层的厚度以及各层的压缩模量)更加接近天然骨软骨组织结构，更有利于软骨缺损的修复。第二，通过增加“钛笼”内径，降低外壁厚度，有效解决了原支架底层松质骨无法整合的情况。第三，优化了制作方法，采用更加方便灵活的3D打印法替换两次冻干法，解决了原支架软骨层与致密层孔径无法精确控制的问题。

附图说明

图1为本发明的轴测图；

图2为本发明的正视图。

图中：钛笼1、开口端2、软骨层3、中间层4、闭合端5。

具体实施方式

以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。

如图1-2所示的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，包括钛笼1，钛笼1的顶部设有中间层4，中间层4的顶面设有软骨层3，钛笼1为以金属钛作为原料通过3D打印方法制成的，钛笼1为圆形筒状，钛笼1底部为开口端2、顶部为闭合端5，中间层4设在其闭合端5顶面上。中间层4为以PLGA粉末(PLA：PGA＝50：50，摩尔质量＝100KDa)作为原料经过3D打印方法制成，孔径为30±1.5μm。软骨层3为以PLGA粉末(PLA：PGA＝50：50，摩尔质量＝100KDa)作为原料经过3D打印方法制成，孔径为100±5μm。钛笼1为圆筒状，钛笼1外径为6±0.05mm，钛笼1的壁厚为1±0.05mm，中间层4的厚度为1±0.05mm，软骨层3的厚度为2±0.05mm。

本次设计中，发明人将底层钛笼1的高度由原来的6mm改为7mm，外径不变，内径由原来的1.5mm改为1mm，顶层厚度由原来的1.5mm改为1mm。这样一来，有效缩短了埋植松质骨与宿主松质骨之间的距离，增加了两者整合的可能性，同时由于高度和内径增加，顶层变薄，钛笼1中可埋植的松质骨体积增加，进一步增加骨层愈合的可能性。由于致密层由原来的冻干法修改为3D打印制作，因此致密层中的孔径可以进行精确控制，发明人将致密层中的孔径设定为30μm，根据之前的研究结果，发明人认为这一孔径可以有效阻挡细胞的迁移。同时，由于孔径的大小得以保证，发明人将致密层的厚度由原先的2mm修改为1mm。这一厚度更加接近生理状态下骨软骨组织中钙化层的厚度，缩短了新生软骨与新生骨之间的距离，有利于骨与软骨之间营养成分的输送，降低了新生软骨萎缩的可能性并增加了整合的可能性。同时由于致密层的体积减小，缩短了体内降解的时间，进一步加快了新生软骨与骨之间的整合，降低了修复过程中断裂的可能性。发明人将软骨层的孔径设定为100μm，由于软骨层采用3D打印法进行制作，因此各孔的孔径大小均匀，有利于细胞在支架内部的均匀分布，提高了组织工程软骨的质量。根据生物力学的检测结果发明人发现软骨层和致密层的压缩模量显著提高接近了天然软骨的压缩模量，钛笼1的压缩模量约为80MPa，在天然松质骨的刚度范围内，根据主流理论，发明人认为该新型支架相比于发明人之前所设计的支架更能促进软骨缺损的修复。

制备方法为：

S1、通过3D打印的方法，以钛金属为原料制成钛笼1；

S2、通过3D打印的方法，以PLGA粉末(PLA：PGA＝50：50，摩尔质量＝100KDa)作为原料在钛笼1的顶部形成致密的中间层4；

S3、通过3D打印的方法，以PLGA粉末(PLA：PGA＝50：50，摩尔质量＝100KDa)作为原料在中间层4的顶面上形成软骨层3。

钛笼1、中间层4和软骨层3均为圆柱形，钛笼1、中间层4和软骨层3的外径相等。

三层支架的具体使用方法为：首先，在支架的软骨层中种植自体软骨细胞，体外培养8周。然后在患者软骨缺损处制作一个直径为6mm，深度为10mm(体积与所设计的修复支架直径一致)的圆形骨软骨缺损。将取出的自体骨软骨柱中的松质骨部分用咬骨钳咬碎(碎骨大小约1mm³)并埋植入钛笼1中。最后，将修复支架植入骨软骨缺损中进行修复。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，包括钛笼(1)，所述钛笼(1)的顶部设有中间层(4)，所述中间层(4)的顶面设有软骨层(3)，其特征在于，所述钛笼(1)为圆筒状，所述钛笼(1)外径为6±0.05mm，所述钛笼(1)的壁厚为1±0.05mm，所述中间层(4)的厚度为1±0.05mm，所述软骨层(3)的厚度为2±0.05mm。

2.根据权利要求1所述的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，其特征在于，所述钛笼(1)为以金属钛作为原料通过3D打印方法制成的，所述钛笼(1)为圆形筒状，所述钛笼(1)底部为开口端(2)、顶部为闭合端(5)，所述中间层(4)设在其闭合端(5)顶面上。

3.根据权利要求1所述的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，其特征在于，所述中间层(4)为以PLGA粉末作为原料经过3D打印方法制成，孔径为30±1.5μm。

4.根据权利要求1所述的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，其特征在于，所述软骨层(3)为以PLGA粉末作为原料经过3D打印方法制成，孔径为100±5μm。

5.根据权利要求1所述的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，其特征在于，制备方法为：

S1、通过3D打印的方法，以钛金属为原料制成钛笼(1)；

S2、通过3D打印的方法，以PLGA粉末作为原料在钛笼(1)的顶部形成致密的中间层(4)；

S3、通过3D打印的方法，以PLGA粉末作为原料在中间层(4)的顶面上形成软骨层(3)。

6.根据权利要求1所述的一种三层一体化高仿生软骨缺损修复支架，其特征在于，所述钛笼(1)、中间层(4)和软骨层(3)均为圆柱形，所述钛笼(1)、中间层(4)和软骨层(3)的外径相等。