CN110448542A - 包含紫杉烷的纳米颗粒及其用途 - Google Patents

包含紫杉烷的纳米颗粒及其用途 Download PDF

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Abstract

将对称和不对称支化均聚物在表面水平上用能够与紫杉烷形成聚集体的官能团进行改性，所述紫杉烷例如紫杉醇及其衍生物不溶于水或水溶性差。通过紫杉烷与均聚物的相互作用形成聚集体。这种聚集体改善了药物的溶解性、稳定性、递送和效力。

Description

包含紫杉烷的纳米颗粒及其用途
本申请是申请日为2014年2月1日，申请号为201480018957.7，发明名称为“包含紫杉烷的纳米颗粒及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本公开涉及表面改性的支化聚合物(MBP)或线性聚合物，其可以是表面改性的对称支化聚合物(SBP)、表面改性的非对称支化聚合物(ABP)、或具有至少一条链末端被疏水性基团改性的线性聚合物，其暴露于不溶于水或水溶性差的紫杉烷中可形成复合纳米颗粒或纳米聚集体，其中该药物在疏水性结构域(如在疏水性部分、片段或位点所在的表面或结构中)或附近分散或沉积。感兴趣的颗粒或聚集体是稳定的，例如，可以干燥和再水化。所述纳米颗粒或纳米聚集体的直径在约20nm至500nm的范围内。疏水的、静电的、金属配体相互作用、氢键和其他分子相互作用可参与到不溶于水或水溶性差的紫杉烷和均聚物的自发相互作用中以形成聚集体。感兴趣的颗粒或聚集体具有控制释放的特性，从而具有实用性，例如作为在宿主中控制释放紫杉烷的载体用于治疗合适的疾病等。例如，本公开涉及这类聚合物用于体内递送紫杉烷，如紫杉醇及其衍生物的用途，并且在治疗癌症中具有低毒性、改善的溶解性、更大的生物利用度以及提高的效率。
背景技术
对称支化聚合物
最近开发并研究了一类新的被称为树枝状聚合物(dendritic polymer)的聚合物——包括星形树枝状大分子(Starburst dendrimer)(或致密星状聚合物)和梳形树枝状接枝物(Combburst dendrigraft)(或超梳状支化聚合物)——的各种工业应用。这些聚合物通常具有：(a)定义明确的核心分子，(b)至少两个具有对称(相等长度)分支和分支连接点的同心的树枝状层(代)，以及(c)外表面基团，如在美国专利号4,435,548、4,507,466、4,568,737、4,587,329、5,338,532、5,527,524和5,714,166中记载的基于聚酰胺-胺(PAMAM)的支化聚合物和树枝状大分子。其他的实例包括聚亚乙基亚胺(PEI)树枝状大分子，如在美国专利号4,631,337中记载的那些；聚亚丙基亚胺(PPI)树枝状大分子，如在美国专利号5,530,092、5,610,268和5,698,662中记载的那些；Frechet型聚醚和聚酯树枝状大分子、核壳构造树枝状大分子(core shell tectodendrimer)和其他，例如在Newkome等编辑的“Dendritic Molecules”，VCH Weinheim，1996中；Frechet&Tomalia编辑的“Dendrimersand Other Dendritic Polymers”，John Wiley&Sons,Ltd.，2001；以及美国专利号7,754,500中记载。
梳形树枝状接枝物由核心分子和具有对称分支的同心层通过分步合成方法构建。与树枝状大分子不同，梳形树枝状接枝物或聚合物由单分散的线性聚合的构造块(building block)产生(美国专利号5,773,527、5,631,329和5,919,442)。此外，分支模式与树枝状大分子的不同。例如，梳形树枝状接枝物沿聚合物骨架(主链)形成分支连接点(链分支)，而星形树枝状大分子常常在末端形成分支(末端分支)。由于所使用的活性聚合技术，那些聚合物(核心和分支)的分子量分布(Mw/Mn)常常很窄。因此，通过在接枝上接枝(graft-on-graft)的方法制备的梳形树枝状接枝物中明确定义的Mw/Mn比例常常接近1。
SBP(如树枝状大分子)主要是经过发散或收敛合成方法通过重复的保护和去保护步骤制备。由于树枝状大分子利用小分子作为核心和分支的构造块，树枝状大分子的分子量分布常常是确定的。在低代的情况下，可获得单一分子量的树枝状大分子。尽管树枝状大分子常常利用小分子单体作为构造块，树枝状接枝物却使用线性聚合物作为构造块。
除了树枝状大分子和树枝状接枝物之外，其他SBP包括对称星形或梳形聚合物，如对称星形或梳形聚环氧乙烷(PEO)、聚乙二醇(PEG)、PEI、PPI、聚噁唑啉(POX)、聚甲基噁唑啉(PMOX)、聚乙基噁唑啉(PEOX)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚二甲基硅氧烷或其结合物。
不对称支化聚合物
与SBP不同，不对称支化聚合物(ABP)尤其是不对称支化树枝状大分子或规则的ABP(规则-ABP)常常具有核心、受控制的或明确定义的不对称(不同的长度)分支和不对称分支连接点，如美国专利号4,289,872、4,360,646和4,410,688中记载。
另一方面，无规ABP(无规-ABP)具有：a)无核心、b)外部和内部的官能团、c)无规/可变化的分支长度和模式(即末端分支和链分支)以及d)不均匀分布的内部空隙空间。
Jones等，J.Org.Chem.9，125(1944)；Jones等，J.Org.Chem.30,1994(1965)和Dick等，J.Macromol.Sci.Chem.，A4(6)，1301-1314，(1970)报道了无规-ABP的合成和机理，如由PEI制备的那些。Litt(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5),703-727(1975))和Warakomski(J.Polym.Sci.Polym.Chem.28,3551(1990))报道了由POX，即聚(2-甲基噁唑啉)和聚(2-乙基噁唑啉)制备的那些无规-ABP。无规-ABP的合成常常涉及一锅煮发散法(one-potdivergent)或一锅煮收敛法(one-pot convergent)。
均聚物
均聚物可涉及由相同重复单元构成的聚合物或聚合物骨架，也就是说，均聚物由相同的单体产生(例如，PEI线性聚合物、POX线性聚合物、PEI树枝状大分子、聚酰胺-胺(PAA)树枝状大分子或POX树枝状接枝物和无规支化聚合物)。所述单体可以是简单的化合物或复合物或化合物的组装物(assemblage)，其中所述组装物或复合物是均聚物中的重复单元。因此，如果一个组装物是由三种化合物A、B和C构成，则该复合物可被描述为ABC。另一方面，出于本公开的目的，由(ABC)-(ABC)-(ABC)…构成的聚合物是均聚物。均聚物可以是线性的或支化的。因此，在无规支化PEI的情况下，尽管存在不同长度的分支和随机存在的分支，出于本公开的目的，该分子是均聚物，因为支化聚合物是由单一的单体——亚乙基亚胺或氮丙啶重复单元——构成的。而且，可以将一种或多种单体或复合物单体组分进行改性、取代、衍生化等，例如经改性以携带官能团。出于本公开的目的，这类分子为均聚物，因为骨架由单一的简单或复杂的单体构成。
水溶性差的药物：紫杉烷
紫杉醇是一种不溶于水的药物，由Bristol-Myers Squibb以出售。紫杉醇来源于太平洋紫杉树，短叶红豆杉(Wan等，J.Am.Chem.Soc.93:2325，1971)。紫杉烷类，包括紫杉醇和多西紫杉醇，被用于治疗各种癌症，包括乳腺癌、卵巢癌和肺癌、以及结肠、和头部、颈部癌症等。
然而，紫杉醇的低水溶性已阻碍了其广泛应用。目前，使用乙醇:(聚乙氧基化蓖麻油)的1:1溶液配制和仿制药以使药物溶解。的存在与严重的过敏反应有关，因此患者需要服用皮质类固醇(例如，地塞米松)和抗组胺剂。
或者，缀合的紫杉醇——例如其通过将紫杉醇与人血清白蛋白混合而制备——已消除了对皮质类固醇和抗组胺注射剂的需求。然而，产生不良副作用，如严重的心血管作用，包括胸痛、心脏骤停、室上性心动过速、水肿、血栓形成、肺血栓栓塞、肺栓塞、高血压等，这阻止了高心血管风险的患者使用该药物。
水溶性差的药物的递送
尽管支化聚合物(包括SBP和ABP)已经被用于药物递送，但是尝试仍主要集中在药物与聚合物的化学连接，或这类药物通过单分子封装在内部的物理封装(美国专利号5,773,527、5,631,329、5,919,442和6,716,450)。
例如，如美国专利号5,338,532、5,527,524和5,714,166对致密星形聚合物和美国专利号5,919,442对超梳状支化聚合物的记载，认为树枝状大分子和树枝状接枝物使用单分子封装方法可物理包埋生物活性分子。类似地，Tomalia等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，1990，29，138，以及由Frechet&Tomalia编辑的“Dendrimers and Other DendriticPolymers,”John Wiley&Sons，Ltd.，2001，第387-424页报道了使用SBP对各种药物的单分子封装以形成“树枝状大分子盒(dendrimer box)”。
具有疏水核和亲水壳的支化核壳聚合物可通过分子封装来包埋水溶性差的药物。具有亲水核和疏水壳的无规支化和超支化核壳结构也可以通过单分子封装和预制的纳米胶束而用于携带药物(美国专利号6,716,450和Liu等，Biomaterials 2010，10，1334-1341)。然而，那些单分子和预制的胶束结构是在没有药物时产生的。
在实施方案中，观察到嵌段共聚物——如杂臂聚合物(即Y形/AB2-型星形聚合物)和线性(A)-树枝状(B)嵌段共聚物——与紫杉醇形成立体复合物(Nederberg等，Biomacromolecules 2009，10，1460-1468和Luo等，Bioconjugate Chem.2010，21，1216)。那些嵌段共聚物与传统的脂质或AB型线性嵌段共聚物极其相似，其是公知的用于产生胶束的表面活性剂。
然而，这类支化嵌段共聚物难以制备，因此不适于大生产。
没有用疏水性基团对支化或线性均聚物进行改性的说明，所述均聚物在暴露于难溶或不溶于水的药物中时，自发地形成稳定的聚集体，其适用于受控的药物递送。
发明内容
一方面，本公开涉及使用改性的支化聚合物(MBP)或线性聚合物以提高紫杉烷如紫杉醇及其衍生物的溶解性。
在本公开的另一方面，不对称支化聚合物(ABP)具有随机的或规则的不对称分支。无规ABP也可具有末端支化模式和链支化模式的混合。
在本公开的另一方面,ABP和SBP都可以在特定的时间被至少一个能够形成其他分支的分子或基团改性，使得可实现新材料的特性，其中还可连接另外的官能团。所有改性的聚合物可被定义为改性的SBP或ABP。
在本公开的另一方面，未改性的和改性的支化聚合物可通过发散或收敛方法制备，或可使用分步或一步合成方法。
在本公开的另一方面，所述SBP包括但不限于PAA树枝状大分子、PEI树枝状大分子、PPI树枝状大分子、聚醚树枝状大分子、聚酯树枝状大分子、梳形支化/星形支化聚合物，如PAA、聚环氧乙烷(PEO)、聚乙二醇(PEG)、PMOX、PEOX、聚甲基丙烯酸甲酯(PMA)、聚苯乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯和聚二甲基硅氧烷；梳形支化树枝状接枝大分子，如PEOX、PMOX、聚丙基噁唑啉(PPOX)、聚丁基噁唑啉、PEI、PAA等。
在本公开的另一方面，SBP可具有内部空隙空间，而ABP可具有不均匀分布的空隙空间。
在本公开的另一方面，混合支化聚合物也可以用于产生所述感兴趣的药物诱导的聚集体或纳米颗粒，所述混合支化聚合物包括上述SBP如树枝状大分子或树枝状接枝物，以及ABP如规则和无规支化聚合物，以及星形支化和梳形支化聚合物，或其组合。
在本公开的另一方面，支化聚合物被官能团改性，所述官能团例如但不限于NH2、NHR、NR2、NR3 +、COOR、COOH、COO-、OH、C(O)R、C(O)NH2、C(O)NHR或C(O)NR2，其中R可以为任意的脂族基团、芳族基团或其结合；脂族基团(例如烃链)，其可为支化的，可含有一个或多个双键和/或三键和/或可以被取代；芳族基团，其可含有多个稠合的或分离的环，所述环可以具有不同的大小和/或可包含取代基；全氟化碳链；糖和/或多糖，其可以具有不同的环大小，所述环可以含有杂原子如硫或氮原子，可以被取代，可以包含多于一种的糖，可以是支化的和/或可以是被取代的；聚乙二醇等。
所述MBP的分子量为约500至超过5,000,000、约500至约1,000,000、约1,000至约500,000、约2,000至约100,000。
在本公开的另一方面，将所述SBP和ABP的表面进行改性使表面基团的物理特性与紫杉烷更相容，从而使紫杉烷更混溶于MBP的表面基团区域、结构域、部分或片段。
在一个实施方案中，对支化聚合物或线性聚合物的链末端的改性是用疏水性官能团——如脂族链(例如包含1至约22个碳原子的烃链，不管是直链还是支链)、芳族结构(例如包含一个或多个芳族环，其可以是稠合的)或其结合——进行的。
与已知的药物载体相比，本发明的支化或线性聚合物结构不会把紫杉烷物理包埋在各聚合物分子内。相反，紫杉烷可被定位于或分散于各支化或线性聚合物的包含官能团的结构域/区域中。
任选地，可以保存所得的感兴趣的结构，例如通过冻干或其他形式的干燥，这可进一步稳定感兴趣的结构。一旦再溶解于水或缓冲液中，可获得直径为约50至约500nm的纳米颗粒。
多个、通常官能化的分支的存在使得分子内和分子间形成交联，这可以使包含紫杉烷的纳米颗粒稳定。在稀释时，所述物理聚集体或纳米颗粒解构(deconstruct)，以受控的速率释放药物。
在本公开的另一方面，也可以利用线性和支化的聚合物的混合物来封装紫杉烷。所述线性和/或支化的聚合物中至少一个端基是用疏水性部分或官能团改性的。疏水性部分或官能团可包括但不限于烃链(包含1-22个碳原子，具有饱和或不饱和的化学键)和包含芳烷基、芳族环、氟碳等的疏水性基团。
在本公开的另一方面，支化或线性聚合物可包含靶向部分/基团，包括但不限于抗体或其抗原结合部分、抗原、同源碳水化合物(cognate carbohydrate)(例如唾液酸)、细胞表面受体的配体、由细胞表面受体结合的部分(如前列腺特异性膜抗原(PSMA))、结合细胞表面糖的部分、细胞外基质的配体、细胞溶质受体配体、生长因子、细胞因子、肠降血糖素(incretin)、激素、凝集素、凝集素配体(如半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、甘露糖衍生物等)、维生素(如叶酸或生物素)、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、中性亲和素、DNA、RNA等。这类靶向纳米颗粒在优选的治疗位点释放药物，从而提高局部有效浓度，并且可以使不希望的副作用最小化。
在本公开的另一方面，在形成复合纳米颗粒用于靶向药物递送之前，将靶向部分/基团和官能团(包括疏水、亲水和/或离子官能团)与支化聚合物连接。
在本公开的另一方面，特定范围的单体:引发剂和聚合物:紫杉烷比例产生了适当大小的药物纳米颗粒，以便进行大规模的药物纳米颗粒的生产、药物纳米颗粒的灭菌，以及与其他单体:引发剂和/或聚合物:紫杉烷比例相比，产生了改善的药效。
本公开的其他特点和优点在以下详细说明和附图中描述，并且是显而易见的。
附图简要说明
下面对附图的说明和相应附图为描述证明本公开的各实施方案的非限制性实例。
图1描述了包括树枝状大分子、星形聚合物、树枝状接枝物和梳形聚合物的SBP。它们都具有一个核心，不管是球形的还是线性的。
图2描述对称支化的PPI树枝状大分子的化学结构。
图3描述对称支化的PPI树枝状大分子的化学修饰反应。数字8、16、32等表示树枝状大分子表面的反应基团的数目。
图4A和4B描述具有不对称分支连接点和模式的无规(A)和规则(B)ABP。
图5描述无规不对称支化PEI均聚物的化学结构。
图6A和6B描述合成方案。图6A给出无规不对称支化PEI均聚物的化学修饰反应。图6B描述用伯胺在共聚物的焦点(focal point)对无规支化聚(2-乙基噁唑啉)进行疏水改性的一锅合成方法。引发剂/表面基团(I)为溴代烃。该反应使噁唑啉开环。
图7示出将药物加载于支化聚合物(SBP和ABP)的表面结构域或表面区域之中或其上。在该图和其他图中，R表示表面基团，实心圆表示感兴趣的药物。
图8示出一类包含药物分子和支化聚合物的基于复合物的纳米颗粒。
图9示出不溶性或水溶性差的药物，其加载于支化聚合物(SBP和ABP)的疏水性表面基团中。在该图和其他图中，细波浪线代表疏水性表面基团。
图10示出了也携带至少一个靶向基团或部分如抗体的各种含药物的纳米颗粒，在这里和其他图中以“Y”描述。
图11示出了在盐水中聚合物浓度为25mg/mL和药物浓度为5mg/mL时，仅含聚合物的聚集体以及聚合物-药物聚集体的大小比较。所述聚合物为疏水改性的、无规支化的PEOX，所述药物为紫杉醇。
图12示出了在盐水中聚合物浓度为2.5mg/mL和药物浓度为0.5mg/mL时，仅含聚合物的聚集体和聚合物-药物聚集体的大小比较。所述聚合物为疏水改性的、无规支化的PEOX，所述药物为紫杉醇。
图13示出在盐水中聚合物浓度为250μg/ml和药物浓度为50μg/mL时，仅含聚合物的聚集体和聚合物-药物聚集体的大小比较。所述聚合物为疏水改性的、无规支化的PEOX，所述药物为紫杉醇。
图14示出在盐水中聚合物浓度为25μg/mL和药物浓度为5μg/mL时，仅含聚合物的聚集体和聚合物-药物聚集体的大小比较。所述聚合物为疏水改性的、无规支化的PEOX，所述药物为紫杉醇。
图15描述了暴露于三种紫杉烷制剂的正常细胞的存活率。
图16描述了暴露于三种不同紫杉烷制剂的A549肺癌细胞毒性。
图17描述了暴露于三种不同紫杉烷制剂的MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞毒性。
图18描述了暴露于三种不同紫杉烷制剂时OV-90卵巢癌细胞毒性。
图19描述了三种不同紫杉烷制剂的药物动力学(PK)特性，描述了血浆浓度随时间的变化。
图20描述了小鼠异种移植模型中用两种对照处理和暴露于三种不同的紫杉烷制剂时A549肺癌肿瘤体积。
图21示出了在小鼠中作为异种移植生长的与用两种对照和两种形式的紫杉烷处理的小鼠中的切除的肺癌细胞肿瘤的图像。
图22描述了在小鼠异种移植模型中，两个阴性对照和三种紫杉烷制剂对卵巢癌肿瘤大小的影响。
图23示出了在小鼠中作为异种移植生长的与用两种对照和三种形式的紫杉烷处理的小鼠中的切除的卵巢癌细胞肿瘤的图像。
具体实施方式
在本公开中药物溶解性被定义为溶解一份药物所需的溶剂的份数，<30(可溶)、30-100(难溶)、>100(不溶)。
为了本公开的目的，词语如“约”、“基本上”等被定义为与所述值或数字相差不大于10％的数值范围。“均聚物”如上文所述。
感兴趣的药物
所记载的感兴趣的药物为紫杉烷，包含紫杉醇以及其它紫杉烷衍生物，如多西紫杉醇。紫杉醇不溶于水，并且具有明确定义的性能特征，如在治疗各类癌症中的低最大耐受剂量(MTD)、PK特性和有限的效力。本公开涵盖了如先前描述的ABP在改进这些性能特性中的用途。
纳米复合物、纳米颗粒或纳米聚集体
纳米复合物是两种或更多的材料或组分(例如聚合物和紫杉烷)的物理混合物。在本公开中，这种混合物可包含以固体或液体形式的在紫杉烷和支化均聚物分子之间形成的不同的纳米级相或结构域。纳米复合物可包括疏松基质(bulk matrix)(例如支化均聚物和紫杉烷)和纳米二维相的结合，由于结构和化学的相异性(例如由紫杉烷和支化均聚物的表面基团形成的结构域以及由支化聚合物内部形成的结构域)，其可表现出不同的特性。由于结构域/相的溶解性可能不同，因此在将所述纳米复合物溶于水溶液中时，一个相可以比另一个相或其他相溶解更快，导致复合物聚集体逐渐解体，引起复合物组分的分级和控制释放，以及任选地，一种或多种组分再形成新的形式，如新的聚集体。术语“纳米复合物”、“纳米颗粒”和“纳米聚集体”是等同的，并且在本文中可以交换使用。
本公开中所述聚集体的大小为约10至约500nm的直径，约30nm至约300nm的直径。聚集体可以表现出与尺寸相关的特性，这与在微粒或疏松材料中观察到的那些显著不同。
图1描述了具有对称分支的SBP，其中所有感兴趣的均聚物都具有核心，并且在整个均聚物上具有由末端分支或链分支构成的对称分支连接点。官能团主要存在于外部。
通过在例如对称支化的PAMAM或PPI树枝状大分子(商购自Aldrich)、聚醚树枝状大分子、聚酯树枝状大分子、梳形-支化/星形-支化聚合物(如包含PEO、PEG、PMOX或PEOX、聚苯乙烯的那些)以及梳形-支化树枝状接枝物(如包含PEOX、PMOX或PEI的那些)上化学连接官能团可以获得改性的SBP。
使用可商购的试剂(例如，各代PPI树枝状大分子，图2)制备SBP/树枝状大分子的合成方法是已知的(参见，例如“Dendrimers and Other Dendritic Polymers,”Frechet&Tomalia编，John Wiley&Sons,，Ltd.，2001)，或者许多SBP是可商购的。梳形-支化和梳形聚合物的合成是已知的(参见，例如美国专利号5,773,527、5,631,329和5,919,442)。
SBP的较高支化密度使聚合物在明确定义的内部空隙空间下分子紧凑，其使得这种分子适合于作为将紫杉烷包埋或包封在其中的载体。
表面改性可以提高所得改性的SBP的特性和用途。例如，利用合适的改性，不溶于水的SBP可以成为水溶性的，而具有高电荷密度的SBP可以改性为携带非常低或不带电荷的聚合物或聚合物表面。另一方面，可将水溶性SBP用疏水性表面基团改性以提高其表面溶解不溶于水或水溶性差的药物的能力。改性可以在聚合物的任意位点发生，例如在末端、分支、骨架残基等。
在本公开的一个实施方案中，SBP(例如，对称支化PEI树枝状大分子、PPI树枝状大分子、PAMAM树枝状大分子或对称支化PEI树枝状接枝物)可以用例如不同种类的伯胺基团改性，例如通过迈克尔加成反应(Michael addition)或将丙烯酸酯加成至均聚物的胺基上。因此，例如通过迈克尔加成反应，可将丙烯酸甲酯引入至PEI、PPI和聚赖氨酸(PLL)均聚物的伯胺和/或仲胺基团上。随后可使酯基进一步衍生，例如通过酰胺化反应。因此，例如，与例如乙二胺(EDA)的酰胺化反应可得到在新形成的分支末端上增加的氨基。均聚物的其他改性可使用已知的化学进行，例如，如“Handbook of Polymer Synthesis”，(A部分)，Kricheldorf编，New York，Marcel Dekker，1994中的“Poly(amines)and Poly(ammoniumsalts)”；和“Dendrimers and Other Dendritic Polymers,”Frechet&Tomalia编，JohnWiley&Sons，Ltd.，2001中提供。也可以使用EDA衍生物，并且EDA衍生物包括任何的分子实体，包括反应性EDA、取代EDA或例如聚亚乙基胺家族的其它成员，如二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺等，包括聚亚乙基胺、四甲基亚乙基二胺等。
在实施方案中，改性可包括有助于或提高聚合物或聚合物部分的疏水性的部分。例如，疏水官能团——如脂族链(例如包含1至约22个碳原子的烃链，不管饱和或不饱和、直链、环状或支链)、芳族结构(例如包含一个或多个芳族环，其可以是稠合的)或其结合——可用作改性剂并且加成至聚合物中，如在本文中此处提供的实施化学所教导的。
在这类加成后，形成改性的SBP(如改性的PEI、PPI、PAMAM树枝状大分子或PEI树枝状接枝物)。作为SBP如PPI和PEI的延伸，所得改性的SBP也是对称支化的。根据溶剂环境(即pH或极性)，表面官能团可携带不同的电荷和/或电荷密度和/或疏水基团。然后基于那些特征特性，分子形状和表面官能团的位置(即表面官能团后折式的)可被进一步调整。
在本公开的另一实施方案中，所述改性SBP可使用多种合成方案中的任一种来制备，例如已知易于与均聚物的合适位点反应的合成方案。此外，可在选择的合成方案中使用多种试剂中的任意一种以得到均聚物骨架的多种改性或加成中的任意一种。因此，例如在对上述的胺基进行迈克尔加成反应的情况下，可使用多种取代基中的任意一种进行加成，例如在烷基化阶段，使用例如多种丙烯酸化试剂中的任意一种，如包含烃取代基(例如包含1至约22个碳原子的饱和或不饱和烃，其可以是被取代的、脂族的、芳族的、环状的、在一个或多个键上饱和的或其组合)的丙烯酸酯。因此，合适的反应物包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸戊酯、丙烯酸己酯、丙烯酸庚酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸壬酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十一烷基酯、丙烯酸十二烷基酯等，及其混合物。类似地，在上面示例性的实例中的酰胺化阶段，可以使用多种胺中的任意一种。例如可以使用EDA、单乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷、烷基胺、烯丙基胺或任何氨基改性的聚合物，包括包含PEG、PEO、全氟聚合物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等的那些，及其混合物。
这种合成策略不仅允许分子的对称生长，其中可引入更多的具有不同化学组成的分支，还允许将多个官能团加至结构的外部。可以使用相同的或不同的合成方法连续地改性前体均聚物，直至获得具有适当分子量的和官能团的所需SBP。此外，可使用构建均聚物的适当的单体和合适的修饰反应而使这类聚合物的疏水和亲水特性以及电荷密度适应特定的应用需求。
在本公开的另一实施方案中，如果使用发散合成步骤，星形-支化或梳形-支化均聚物(如聚(2-取代噁唑啉)，包括例如聚(2-甲基噁唑啉)、聚(2-乙基噁唑啉)、聚(2-丙基噁唑啉)和聚(2-丁基噁唑啉)等)；PEI；PEO/乙二醇；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；聚磷酸酯；聚乙烯醇(PVA)或聚苯乙烯)的链末端可以用另一种小分子或聚合物改性以在均聚物的链末端产生不同官能团，所述官能团包括伯胺、仲胺或叔胺、羧酸酯、羟基、脂族(如烃链)、芳族、氟烷基、芳基、PEG、PEO、乙酸酯、酰胺和/或酯基团。或者，也可以使用多种引发剂，这样如果利用收敛合成方法，可以在链末端引入相同类型的官能团(“Dendritic Molecules”，Newkome等编，VCH，Weinheim，1996；“Dendrimers and Other Dendritic Polymers”，Frechet&Tomalia编，John Wiley&Sons，Ltd.，2001；和J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，第703-727页(1975))。
引发剂可以是疏水的亲电子分子，包括烃类、脂族烃、芳族烃或两者的组合，以及卤素官能团，如烷基卤化物、芳烷基卤化物、酰基卤化物或其组合。这种化合物的实例为单官能引发剂，如包含1至约22个碳原子的具有饱和或不饱和化学键的烃类，如碘甲烷/溴甲烷/氯甲烷、碘乙烷/溴乙烷/氯乙烷、1-碘/溴/氯丁烷、1-碘/溴/氯己烷、1-碘/溴/氯十二烷、1-碘/溴/氯十八烷(octadodecane)、苄基碘/溴/氯等。其他引发剂包括烯丙基溴化物/氯化物。也可以使用酰卤，如酰基溴/氯、苯甲酰溴化物/氯化物，和含甲苯磺酰基的化合物，例如对甲苯磺酸、甲苯磺酸甲酯和其他甲苯磺酸酯。可结合使用任意一种或多种引发剂。
在聚合期间，可使用引发剂以开始聚合反应。当使用时，可以使用单体与引发剂的不同摩尔比以获得特定聚合物。所述特定聚合物可具有不同的特性，如分子大小。因此，单体与引发剂的合适的摩尔比可以为20:1至80:1，如25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1或75:1包括21:1、22:1、23:1、24:1、26:1、27:1、28:1、29:1、31:1、32:1、33:1、34:1、36:1、37:1、38:1、39:1、41:1、42:1、43:1、44:1、46:1、47:1、48:1、49:1、51:1、52:1、53:1、54:1、56:1、57:1、58:1、59:1、61:1、62:1、63:1、64:1、66:1、67:1、68:1、69:1、71:1、72:1、73:1、74:1、76:1、77:1、78:1、79:1等。
在图4A和4B中描述了具有不对称分支的ABP，其中一些感兴趣的聚合物不具有核心，但在整个均聚物上具有由链和末端分支构成的不对称的分支连接点。所述官能团常常存在于外部和内部。然而，当使用较大的官能团(例如疏水或亲水的大基团)时，可能由于位阻效应，所述官能团常常优选地，也许必须连接至ABP的外部。因此，这种表面MBP可用于溶解不溶的或难溶的药物或与其形成聚集体。
例如通过在规则ABP、无规ABP上化学地连接官能团能获得改性ABP，所述规则ABP如聚赖氨酸(例如支化PLL)，所述无规ABP如PEI(商购自Aldrich、Polysciences或以商品名LuposalTM商购自BASF)或聚噁唑啉，其可根据Litt的步骤来制备(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，第703-727页，(1975))。其他ABP可包括但不限于聚丙烯酰胺、聚磷酸酯、PVP、PVA等。
可使用多种已知的起始材料。为制备这种改性的ABP。这种单体和聚合物可以中等成本大量地商购得到。例如，一种可用于合成感兴趣的均聚物的这样的前体单体是PEI。无规不对称分支PEI的合成是已知的(Jones等，J.Org.Chem.9，125(1944))。具有不同分子量的PEI可从不同的来源商购得到，例如Aldrich、Polysciences和BASF(以商品名LuposalTM)。无规不对称分支PEI主要是利用路易斯酸或布朗斯台德酸作为引发剂，通过具有环张力的环亚胺单体(例如氮丙啶(亚乙基亚胺)和氮杂环丁烷(亚丙基亚胺))的阳离子开环聚合反应来制备(Dermer等，“Ethylenediamine and Other Aziridines”，Academic Press，NewYork，(1969)；和Pell，J.Chem.Soc.71(1959))。由于许多的方法基本上是一锅煮的方法，因此容易制备大量无规ABP。无规支化聚(2-取代噁唑啉)聚合物可使用Litt的步骤制备(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，第703-727页，(1975))。
制备ABP的合成方法常常在大分子内产生多种分支连接点。即，末端分支连接点和链分支连接点的混合分布于整个分子结构中。与树枝状大分子和树枝状接枝物相比，无规ABP的支化密度可能较低，分子结构可能更开放。尽管分支模式是随机的，但是伯胺、仲胺和叔胺基团的平均比例相对地一致为1:2:1，如Dick等，J.Macromol.Sci.Chem.，A4(6)，1301-1314(1970)和Lukovkin，Eur.Polym.J.9，559(1973)中记载。
支化连接点的存在能使无规ABP(例如不对称支化PEI)形成具有可能的球形、卵圆形或类似形态的大分子。在球状结构内，存在由尚未完善的支化连接点在大分子内部形成不同大小的口袋。与树枝状大分子和树枝状接枝物——其中内部口袋总是环绕分子的中心核心定位——不同，无规ABP的口袋在整个分子不均匀地分布。因此，无规ABP既具有外部官能团，又具有不均匀分布的内部官能团，所述官能团可与多种分子进一步反应，从而形成新的大分子结构——感兴趣的改性的无规ABP。
尽管具有核心，但是规则的ABP的官能团也既分布于外部，也分布于内部，这与无规ABP非常类似。一种这样的均聚物为PLL，其可按照美国专利号4,289,872、4,360,646和4,410,688所记载的制备。这种均聚物也可以按照无规ABP、本文所教导的和本领域公知的类似方式来改性。
在本公开的一个实施方案中，通过例如迈克尔加成反应或将丙烯酸酯加成到聚合物的胺上来用不同种类的伯胺基团改性ABP(例如，无规不对称支化PEI或规则不对称支化PLL)。因此，例如通过迈克尔加成反应，可将本文提供的丙烯酸甲酯或其他丙烯酸酯引入至例如PEI和PLL均聚物的伯胺和/或仲胺基团上。随后，所述酯基可被进一步衍生化，例如通过酰胺化反应。因此，与例如EDA进行的酰胺化反应可得到在新形成的分支的末端上增加的氨基基团。使用已知的化学，例如在“Handbook of Polymer Synthesis”(A部分)Kricheldorf编，New York，Marcel Dekker，1994中的“Poly(amines)and Poly(ammoniumsalts)”中提供的，可进行对聚合物的其他修饰。
在这类加成后，形成改性的ABP(如改性的PEI或PLL均聚物)。作为ABP如PEI或PLL的延伸，所得的改性的ABP也是不对称支化的。根据溶剂的环境(即pH或极性)，表面官能团可携带不同的电荷和电荷密度。然后基于那些特征特性，可以进一步调整分子形状和官能团的位置(即官能团是后折式的)。
在另一实施方案中，可使用多种合成方案中的任意一种来制备改性的ABP，所述合成方案例如用于与均聚物的合适位点反应是已知的。此外，可在选择的合成方案中使用多种试剂中的任意一种以得到对聚合物骨架的多种修饰或加成中的任意一种。因此，例如在对上述的胺进行迈克尔加成反应的情况下，在烷基化阶段可使用如上文所提供多种取代基中的任意一种进行加成，例如丙烯酸酯，其包括饱和或不饱和的烃(如包含1个碳原子至约22个碳原子的烃，其可以是脂族的、支链的、饱和的、芳族的、环状的或其组合)。合适的反应物包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸戊酯、丙烯酸己酯、丙烯酸庚酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸壬酯、丙烯酸癸酯、丙烯酸十一烷基酯、丙烯酸十二烷基酯等，及其混合物。类似地，在上面示例性的实例中酰胺化阶段，在本文提供的和本领域公知的方法中可以使用多种胺中的任意一种。例如可以使用EDA、单乙醇胺、三(羟甲基)氨基甲烷、烷基胺、烯丙基胺或任何氨基改性的聚合物，包括PEG、全氟聚合物、聚苯乙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等，及其混合物。此外，通过使用例如环氧反应、酰胺化反应、迈克尔加成反应、包括使用-SH或-NH2基团与马来酰亚胺的反应、醛/酮-胺/肼偶联反应、碘/碘乙酰-SH偶联反应、羟胺-醛/酮偶联反应等，实现了疏水基团以及亲水基团至改性ABP的连接，所述疏水基团包括脂族(例如C1至约C22的烃)基团、芳族基团、聚乙烯聚合物、聚苯乙烯聚合物、全氟聚合物、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯，所述亲水基团包括OH基团、亲水性聚合物如PEOX、PEG、PEO等。这种合成策略不仅允许分子的不对称生长，其中引入更多的口袋，还允许在结构的内部和外部添加多个官能团。可使用相同或不同的合成方法对均聚物进行改性直至获得具有适当分子量和官能团的所需ABP。此外，可使用构建均聚物的适当的单体和合适的修饰反应而使这类聚合物的疏水和亲水特性以及电荷密度适应特定的应用需求。
在本公开的其他实施方案中，无规ABP如POX的焦点(在收敛合成期间由多个反应性链末端合并)可用其他小分子封端或与其他小分子反应从而在均聚物的链末端产生不同官能团，包括伯胺、仲胺或叔胺、羧酸酯、羟基、烷基、氟烷基、芳基、PEG、乙酸酯、酰胺和/或酯基团。或者，也可利用不同引发剂，使在收敛合成期间聚合开始时将相同类型的官能团引入至表面基团上(J.Macromol.Sci.Chem.A9(5)，第703-727页(1975))。
同上，可使用Litt和Warakomski步骤制备在支化聚合物焦点具有伯胺基团的烷基表面改性的、无规支化聚(2-乙基噁唑啉)。例如，可利用CH3(CH2)17-Br作为2-乙基噁唑啉聚合反应的引发剂，该聚合反应通过阳离子环的开环方法产生无规支化聚合物，随后用N-叔丁氧基羰基哌嗪(N-Boc-哌嗪)或EDA淬灭。用大大过量的EDA终止使该疏水改性的支化聚(2-乙基噁唑啉)聚合物能被伯胺基团在焦点处官能化(图6B)。或者，也可使N-Boc-哌嗪封端的疏水改性的支化聚(2-乙基噁唑啉)聚合物脱保护以在焦点处产生游离的氨基。如果不封端，则聚合物的焦点可水解，例如当溶于水时(例如，包含例如1N Na2CO3)形成羟基。
尽管将伯胺基团引入至疏水改性的支化聚(2-噁唑啉)均聚物提高药物溶解性并产生紫杉烷诱导的聚集体，伯胺基团也允许各种靶向基团(如抗体、其抗原结合部分、抗原或成对结合的成员)与疏水改性的支化聚(2-噁唑啉)聚合物连接(图10)。包含这种靶向基团及其修饰的这种聚集体或纳米颗粒可提供具有紫杉烷的聚集体的靶向能力，并且优选地或仅在需要的治疗位置释放紫杉烷。
如本文所教导的，可使用MBP(如疏水改性的均聚物，既包括SBP又包括ABP)产生封装聚合物或纳米胶囊，以使不溶于水或水溶性差的紫杉烷溶解，或使与不溶于水或水溶性差的紫杉烷如紫杉醇形成紫杉烷诱导的纳米颗粒。在有机溶剂的环境中，亲水性或两亲性内部可为聚(2-噁唑啉)；聚(2-取代噁唑啉)，包括聚(2-甲基噁唑啉)、聚(2-乙基噁唑啉)、聚(2-丙基噁唑啉)和聚(2-丁基噁唑啉)等；PEG；PEO；聚磷酸酯等。疏水性外部可包含脂族烃(如C1至约C22)、芳族烃、聚乙烯聚合物、聚苯乙烯聚合物、全氟聚合物、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯等。在水性环境中，情况正好相反。在水性环境下的药物诱导的聚集体中，药物分子如紫杉烷与MBP的疏水基团/结构域缔合(图9)。支化均聚物的支化密度(例如，从树枝状大分子或树枝状接枝物的低代——如星形和梳形均聚物——到高代)，以及疏水性表面基团的覆盖的量(例如0％至100％覆盖率)可显著地影响均聚物的溶解性，这反过来也影响溶解或吸附/吸收紫杉烷的能力。例如，支化密度和疏水性基团覆盖率的增加将使均聚物与紫杉烷更相容。
在一些情况下，具有约0.1至约30重量％或更多的表面疏水性组分的ABP和SBP在溶解或分散水溶性差或不溶于水的紫杉烷如紫杉醇方面是有效的。此外，所利用的支化均聚物(例如POX、PEOX、PMOX、PEO/PEG、聚丙烯酰胺、聚磷酸酯、PVP和PVA)溶于水和多种有机溶剂，有助于形成各种包含紫杉烷的纳米颗粒或聚集体。这些均聚物的良好的水溶性，以及在水溶液中与疏水药物的良好的混溶性(无论含或不含其他有机溶剂)，使这些均聚物可用于改善水溶性差的紫杉烷的溶解性。例如，通过减少配制步骤、缩短加工时间，并减少使用目前制药工业中使用的复杂和昂贵的装置的需要，所述感兴趣的均聚物简化了制造方法并降低了生产成本。如果需要额外的支化密度，可以首先用本文所述的其他基团对SBP或ABP进行改性，然后例如，与另外的疏水官能团连接以提高紫杉烷的溶解性。
在将疏水改性的SBP或ABP与不溶于水或水溶性差的紫杉烷如紫杉醇混合时，所形成的独特的物理聚集体的大小不同于仅由聚合物形成的聚集体(图11-13)。当均聚物和紫杉烷的浓度降低时，聚合物/紫杉烷聚集体的大小和分布变得与仅含聚合物的聚集体更类似，表明紫杉烷是从诱导的聚集体或纳米颗粒中释放的。仅含聚合物的聚集体的宽粒径分布与由脂质组成的其他结构中所观察到的类似，无论是否与紫杉烷缔合。另一方面，感兴趣的紫杉烷诱导的聚集体具有较窄分布的特定大小，即，产生具有一定大小的独特的聚集体。当聚集体中紫杉烷浓度降低、聚集体中均聚物浓度降低、聚集体浓度降低或其任意组合时，所述感兴趣的聚集体释放紫杉醇，如由聚集体大小的减小和/或聚集体大小的更宽分布所证实。更宽的分布是由仅含均聚物的聚集体和因释放紫杉烷而产生不同大小的聚合物/紫杉烷聚集体的混合物造成的，直至观察到的聚集体是仅具有仅含均聚物的聚合物的特征的那些。换句话说，被引入至宿主后，如在循环系统中，紫杉烷被逐渐地释放。该机理对各种药物的递送应用，包括静脉内(IV)、经口、经皮肤、经眼的、肌肉内的等给药模式以及其中需要延迟释放或持续释放特性的给药模式是重要的。
聚合物与紫杉烷的合适的重量比为6至8，如6.5、7或7.5，包括6.1、6.2、6.3、6.4、6.6、6.7、6.8、6.9、7.1、7.2、7.3、7.4、7.6、7.7、7.8、7.9等。
聚合反应中单体与引发剂的摩尔比和纳米颗粒中聚合物与紫杉烷的重量比的组合决定了药物纳米颗粒的大规模的可制造性、纳米颗粒大小以及作为减少肿瘤的治疗的效力。例如，使用以100:1的单体:引发剂的摩尔比合成的聚合物，以5:1的聚合物:紫杉烷重量比制备紫杉烷诱导的聚集体产生了更大的纳米颗粒，例如在冻干前在120-140nm的范围。在大量生产时，这样的大纳米颗粒难以通过0.2μm过滤器(注射必需的灭菌步骤)。
相比较而言，当将由60:1的单体:引发剂的摩尔比合成的聚合物与紫杉烷以7:1的聚合物:紫杉烷重量比混合时，所形成的纳米颗粒在冻干之前的大小为70至90nm，这使得所述颗粒几乎没有困难地通过0.2μm过滤器。
与较大颗粒相比，在冻干前尺寸为约100nm或更小的较小纳米颗粒可在更低的剂量浓度下减少肿瘤。例如，与较大的纳米颗粒相比，较小的纳米颗粒仅用1/5的紫杉烷含量就能实现相同的肿瘤治疗效力。因此，可使用较低剂量的药物并且使副作用的风险降到最小。
也可将紫杉烷诱导的聚集体与靶向部分或基团连接以形成缀合物，从而使靶向基团掺入至感兴趣的纳米复合颗粒中(图10)，所述靶向部分或基团包括但不限于，抗体(或其抗原结合部分)、抗原、同源碳水化合物(例如，唾液酸)、细胞表面受体配体、与细胞表面受体结合的部分(如前列腺特异性膜抗原(PSMA))、与细胞表面糖类结合的部分、细胞外基质配体、细胞溶质受体配体、生长因子、细胞因子、肠降血糖素、激素、凝集素、凝集素靶点(如半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、甘露糖衍生物等)、维生素(如叶酸、生物素等)、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、中性亲和素、DNA、RNA等。
药物制剂和纳米颗粒制剂
紫杉烷和改性的均聚物可在合适的浓度(如为体内使用而建立的浓度，通常为毫克量或纳克量)下，各自地悬浮于合适的缓冲液和/或溶剂中，如缓冲液、甲醇、丙酮、乙醇等。随后，在合适的温度(如室温或其他已知的为保持紫杉烷和均聚物的完整性而可接受的温度)下，将两种溶液混合一段合适的时间，如一小时、两小时等。由于感兴趣的聚集体一旦形成就是稳定的，所以其他孵育时间可在数分钟到数小时内变化。可用本领域已知的方法浓缩和收集所述聚集体，例如通过过滤、离心、蒸发、冻干、透析等。可以使聚集体干燥以延长保质期。
例如，将紫杉烷如紫杉醇以最高达40mg/mL的不同量溶解于甲醇或乙醇中。如本文所教导的制备烃(CH3(CH2)17)-改性的无规支化PEOX60(单体与引发剂之比＝60:1)，并且将其以最高达100mg/mL的不同浓度溶解于甲醇或乙醇中。
然后将这两种溶液以不同体积混合以使混合物中最终的均聚物与紫杉烷的重量比为2:1至10:1，并且旋转蒸发至干燥。随后将该混合物再溶解于水或盐水中，接着用0.2μM过滤器无菌过滤，并且根据体积冻干20至72小时，得到干燥粉末。
如由光散射法测定的，所述聚集体或纳米颗粒大小的直径范围为冻干前约50至约100nm、约60至约95nm、约70至约90nm(例如在3mg紫杉醇/mL下时)至冻干后约110至约150nm、约115至约145nm、约120至约140nm(例如在5mg紫杉醇/mL时)。
如本文公开的，配制本公开所用的药物组合物以与预期给药途径相容。给药途径的实例包括肠道外的，例如经静脉内、经真皮内、经皮下、经口(例如吸入)、经皮肤(局部)、经粘膜和经直肠给药。用于非肠道的、经真皮内或经皮下施用的溶液剂或悬浮剂可包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水、油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节渗透压的试剂，如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调节pH，如HCl或NaOH。肠道外制剂可封装在安瓿瓶、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多剂量药瓶中。通常，体内诊断剂通过经口、经直肠、经静脉内、经腹膜内等给药。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液剂或分散体以及用于即时制备无菌注射液或分散体的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。组合物通常是无菌的，并且是可达到注射程度的流体。组合物在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用下保存。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体PEG、聚山梨醇酯等)及其合适的混合物。可以例如通过使用如卵磷脂包衣，通过在分散体中保持所需的粒径、通过使用增稠剂和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸等)实现预防微生物的作用。组合物中可包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇或氯化钠)。通过在组合物包括延缓吸收的试剂(例如单硬脂酸铝或明胶)可以实现注射组合物的延长吸收。
可通过将活性化合物掺入至所需量的适当溶剂以及以上列举的一种成分或成分的结合物中制备无菌的可注射溶液剂，如果需要，接着进行过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入至包含基本分散介质和所需的其他成分(例如，以上列举且本领域已知的那些)的无菌载体中制备分散体。在用于制备无菌的可注射溶液剂的无菌粉末情况下，可以通过例如冻干法、真空干燥或冷冻干燥制备，所述方法使其从之前的无菌过滤的溶液得到活性成分和任何额外的所需成分的粉末。可储存感兴趣的制剂并且用合适的液体将其重新溶解使用。
经口的组合物通常包括惰性稀释剂、香料、调味剂或可食用的载体。该组合物可以包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗给药的目的，活性化合物可以掺入赋形剂并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。经口的组合物也可使用流体载体制备，以得到糖浆或液体制剂，或用作漱口水，其中流体载体中的化合物口服、含漱并吐出或吞服施用。
可以包括药物相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶(gum tragacanth)或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖，崩解剂如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于吸入给药，化合物从加压容器或分配器中以例如湿气溶胶或干气溶胶喷雾的形式递送，所述加压容器或分配器包含合适推进剂例如气体(如二氧化碳)、或喷雾剂或雾(mist)。
全身给药也可通过经粘膜或经皮的方式进行。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适用于待穿透的屏障的的渗透剂。这种渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如，对于经粘膜给药而言，洗涤剂、胆盐和夫西地酸衍生物。可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂实现经粘膜给药。对于经皮给药，通常如本领域中所已知的，将活性化合物配制成软膏、药膏、凝胶或乳膏。合适的载体包括二甲亚砜。
化合物也可以栓剂的形式(例如用常规的栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或用于直肠递送的保留灌肠的形式制备。
在一个实施方案中，活性化合物与保护该化合物免于被快速清除出体内的载体一起制备，例如控制释放制剂，包括埋植剂和微囊化的递送系统。可使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。
制备这种制剂的方法对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。该材料可从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc商购获得。
本聚集体可以局部的形式使用，例如乳膏、软膏、洗剂、油膏、其它化妆品等。可运载药物活性剂(PAA)，例如感兴趣的紫杉烷和其它生物活性或惰性化合物，包括软化剂、漂白剂、止汗剂、药物、保湿剂、气味剂、着色剂、颜料、染料、抗氧化剂、油、脂肪酸、脂类、无机盐、有机分子、遮光剂、维生素、药物、角质层分离剂、UV阻断剂、晒黑促进剂(tanningaccelerator)、脱色剂、除臭剂、香料、驱虫剂等。
以剂量单位的形式配制的经口或经肠道外的组合物有利于方便给药和剂量均匀性。本文使用的剂量单位形式是指适合作为单一剂量用于待治疗的受试者的物理分散单位；每个单位包含了经计算可产生所需治疗终点的预定量的活性化合物。
基于临床前和临床研究所获得的经验数据、本领域已知的实施方法，可获得剂量例如优选的给药途径和用量。剂量和给药形式可以由PAA的特性、聚合物、待实现的特定治疗效果、受体的特征和条件等决定，也可以不取决于此。对于在数天或更长的时间重复给药，根据状况，可以持续治疗直至达到所希望的终点。示例性给药方案在WO94/04188中公开。
可通过常规技术和分析以及患者输入来监测治疗的进程。
在容器、包装或分配器中可包括所述药物组合物以及给药说明书。
给药的另一方法包括将感兴趣的化合物添加至食物或饮料中，作为食物补充剂或添加剂，或与维生素类似，作为预防性基础服用的剂型。将感兴趣的聚集体封装为通过胃环境后仍有效的形式。这种形式通常是已知的，例如肠溶包衣制剂。或者，可使感兴趣的聚集体改性以提高半衰期，如用已知试剂进行化学修饰或组合以产生延迟、持续或控制释放，如本领域中已知的。
现在，将在下面的非限制性实施例中示例说明本公开。
实施例
材料
对称支化PPI树枝状大分子购自Sigma-Aldrich。根据美国专利号4,631,337、5,773,527、5,631,329和5,919,442所提供的步骤制备对称支化PEI树枝状大分子和树枝状接枝物。所有的抗体购自Sigma-Aldrich、Biodesign或Fitzgerald。不同代的PAMAM树枝状大分子购自Dendritech,Inc。
具有氨基官能团的改性对称支化PPI(m-SB-PPI-NH2-1.0)
使用以下试剂，包括对称支化PPI(SB-PPI-4、8、16、32、64；MW316、773、1,687、3,514和7,168)、丙烯酸甲酯(MA,FW＝86.09)、EDA(FW＝60.10)和甲醇。
向圆底烧瓶中加入1.0g PPI-64树枝状大分子(MW 7168)和20ml甲醇(溶液A)。向另一个圆底烧瓶中加入2.4g丙烯酸甲酯(MA)和10ml甲醇(溶液B)。在室温下边搅拌边将溶液A缓慢地滴入溶液B。允许所得溶液在40℃下反应2小时。反应完成后，通过旋转蒸发将溶剂和未反应的MA单体除去，并且随后使产物——2.5g MA-官能化PPI——再溶解于20ml甲醇中。
向圆底烧瓶中加入160g EDA和50ml甲醇，接着在0℃下慢慢添加MA-官能化PPI。然后允许该溶液在4℃下反应48小时。通过旋转蒸发将溶剂和过量的EDA除去。随后从乙醚溶液中析出粗产物，并且通过透析进一步纯化，得到约2.8g伯胺-官能化对称支化PPI(m-SB-PPI-NH2-1.0)，分子量约21,760。产物经1H和13C核磁共振(NMR)和尺寸排阻色谱(SEC)表征。
以类似的方式制备具有不同分子量的其他MA或伯胺-改性对称支化PPI树枝状大分子和对称支化PEI树枝状接枝物。
含混合羟基和氨基官能团的改性对称支化PPI(mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2)
使用氨基-官能化的对称支化PPI(m-SB-PPI-64-NH2-1.0)、MA、EDA、单乙醇胺(MEA，FW＝61.08)和甲醇。
向圆底烧瓶中加入1.0g氨基-改性PPI或由先前步骤制备的m-SB-PPI-NH2-1.0和20ml甲醇(溶液A)。向另一个圆底烧瓶中加入2.4g MA和10ml甲醇(溶液B)。然后在室温下边搅拌边将溶液A缓慢地滴入溶液B。允许所得溶液在40℃下反应2小时。反应完成后，通过旋转蒸发将溶剂和未反应的单体MA除去，随后将产物——2.5g MA-官能化m-SB-PPI-64-MA-1.5——再溶解于20ml甲醇中。
向圆底烧瓶中加入32g EDA、130g MEA和100ml甲醇(EDA:MEA的摩尔比为20:80)，接着在0℃下慢慢添加m-SB-PPI-64-MA-1.5。然后允许该溶液在4℃下反应48小时。通过旋转蒸发将溶剂和过量的EDA除去。随后从乙醚溶液中析出粗产物，并通过透析进一步纯化，得到约2.8g混合的羟基和氨基官能化(混合表面)SBP(mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2.0，具有平均20％NH2和80％OH表面基团，分子量约21,862)。
以类似的方式制备具有不同羟基和氨基比例和不同分子量的其他改性无规AB-PEI和规则AB-PLL分子。
无规不对称支化PEI购自Aldrich和Polysciences。根据美国专利号4,289,872提供的步骤制备规则ABP。所有抗体购自Sigma-Aldrich、Biodesign或Fitzgerald。
具有氨基官能团的改性无规不对称支化PEI(m-ran-AB-PEI-NH2-1.0)
使用无规不对称支化PEI(ran-AB-PEI,MW2,000、25,000和75,000)、MA、EDA和甲醇。
向圆底烧瓶中加入1.0g PEI(MW2000)和20ml甲醇(溶液A)。向另一个圆底烧瓶中加入3.0g MA和10ml甲醇(溶液B)。然后在室温下边搅拌边将溶液A缓慢地滴入溶液B。允许所得溶液在40℃下反应2小时。反应完成后，通过旋转蒸发将溶剂和未反应的MA除去，随后将产物——MA-官能化PEI——再溶解于20ml甲醇中。
向圆底烧瓶中加入80g EDA和50ml甲醇，接着在0℃下慢慢添加MA-官能化PEI(1gMA溶于20ml甲醇)。然后允许该溶液在4℃下反应48小时。通过旋转蒸发将溶剂和过量的EDA除去。随后从乙醚溶液中析出粗产物，并且通过透析进一步纯化，得到约3.0g伯胺-官能化无规不对称支化PEI(m-ran-AB-PEI-NH2-1.0)，其分子量约7,300。产物经1H和13C NMR和SEC表征。
以类似的方式制备不同分子量的其他MA或伯胺-改性无规不对称支化PEI和规则不对称支化PLL聚合物。
含烃链的支化聚合物的改性
以含10％烃链的无规支化PEI的改性为例。将1g支化PEI(FW＝25000)溶于10mL甲醇中。向该溶液中加入0.23g 1,2-环氧己烷(FW＝100.16)，并将混合物在40℃下加热2小时。然后将溶剂旋转蒸发，并且使残留物再溶解于水中。透析后(截止于3,500)，产生改性PEI。
以类似的方式制备具有不同百分比和长度(例如C4、C12、C18和C22)的烃链的其他MBP，如PAMAM、PEI和PPI树枝状大分子和树枝状接枝物，以及不对称PLL。
具有混合羟基和氨基官能团的改性无规不对称支化PEI(m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2)
利用氨基-官能化无规不对称支化PEI(m-ran-AB-PEI-NH2-1.0)、MA、EDA、单乙醇胺(MEA，FW＝61.08)和甲醇。
向圆底烧瓶中加入1.0g氨基-改性PEI或由先前步骤制备的m-ran-AB-PEI-NH2-1.0和20ml甲醇(溶液A)。向另一个圆底烧瓶中加入3.0g MA和10ml甲醇(溶液B)。然后在室温下边搅拌边将溶液A缓慢地滴入溶液B。允许所得溶液在40℃下反应2小时。在反应完成后，通过旋转蒸发将溶剂和未反应的MA除去，随后将产物——MA-官能化的m-ran-AB-PEI-MA-1.5——再溶解于20ml甲醇中。
向圆底烧瓶中加入60g EDA、244g MEA和100ml甲醇(EDA:MEA的摩尔比为20:80)，接着在0℃下慢慢添加m-ran-AB-PEI-MA-1.5(1g MA溶于20ml甲醇)。然后允许该溶液在4℃下反应48小时。通过旋转蒸发将溶剂和过量的EDA除去。随后从乙醚溶液中析出粗产物，并且通过透析进一步纯化，得到约2.4g混合羟基和氨基官能化无规ABP(m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2.0，具有平均20％NH2和80％OH的表面基团，分子量约18,000)。
以类似的方式制备具有不同羟基和氨基比例以及不同分子量的其他改性无规AB-PEI和规则AB-PLL聚合物。
具有伯胺链末端基团的烷基-改性无规不对称支化聚(2-乙基噁唑啉)(PEOX)
提供CH3-(CH2)11-PEOX-ABP100(C12ABP100为任意名称(arbitrary name)，表示在最初反应中单体与引发剂的比例)的合成作为用于制备核壳结构的一般步骤。在N2下，用蒸馏头将CH3(CH2)11-Br(2.52g)于500ml甲苯的混合物共沸约15min除水。通过附加的漏斗滴加2-乙基噁唑啉(100g)，并且允许该混合物回流24至48小时。聚合完成后，将12.12g EDA加入至反应聚合物溶液(A)中以引入氨基官能团。POX链末端与EDA的摩尔比为1比20。
或者，可加入N-Boc-哌嗪或水(例如，含有1N Na2CO3)以终止该反应。也可向反应聚合物溶液(A)中加入吗啉或PEI以终止该反应。使粗产物再溶解于甲醇中，然后从大大过量的乙醚中析出。将底层再溶解于甲醇中，并且通过旋转蒸发和真空干燥得到不对称无规支化PEOX聚合物的白色固体(101g)。
以类似的方式制备其他不对称无规支化聚合物，如C6-PEOX ABP20、50、100、200、300和500，C12-PEOX ABP20、50、200、300和500，C22-PEOX ABP20、50、100、200、300和500和聚苯乙烯-PEOX等，以及未改性和改性的聚(2-取代噁唑啉)，如聚(2-甲基噁唑啉)。所有的产物经SEC和NMR分析。
具有伯胺链末端基团的烷基-改性无规不对称支化聚(2-乙基噁唑啉)(PEOX)
提供CH3-(CH2)17-PEOX-ABP60(C18ABP60为任意名称，表示在最初反应中单体与引发剂的比例)的合成作为用于制备核壳结构的一般步骤。在N2下，用蒸馏头将CH3(CH2)17-Br(5.61g)于500ml甲苯的混合物共沸约15min除水。通过附加的漏斗滴加2-乙基噁唑啉(100g)，并且允许该混合物回流24至48小时。聚合完成后，将10.1g EDA加入至反应聚合物溶液(A)中以引入胺基官能团。聚噁唑啉反应链末端与EDA的摩尔比为1比10。
或者，可加入N-Boc-哌嗪或水(例如，含有1N Na2CO3)以终止该反应。也可向反应聚合物溶液(A)中加入吗啉或PEI以终止该反应。将粗产物再溶解于甲醇中，然后从大大过量的乙醚中析出。将底层再溶解于甲醇中，并且通过旋转蒸发和真空干燥得到不对称无规支化PEOX聚合物的白色固体。
以类似的方式制备其他不对称无规支化聚合物，如C18-PEOX ABP20、40、50、70、80、100、120、300、500等，以及未改性和改性的聚(2-取代噁唑啉)，如聚(2-甲基噁唑啉)。所有的产物经SEC和NMR分析。
混合表面改性的对称支化聚合物-IgG缀合物
提供混合表面(OH/NH2混合)改性对称支化PPI–IgG缀合物(mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2-IgG缀合物)的制备作为用于制备聚合物抗体的一般步骤。
也可以类似的方式获得其他缀合物，例如m-SB-PPI-4-NH2-1-IgG、m-SB-PPI-8-NH2-1-IgG、m-SB-PPI-16-NH2-1-IgG、m-SB-PPI-32-NH2-1-IgG、m-SB-PPI-4-NH2-2-IgG、m-SB-PPI-8-NH2-2-IgG、m-SB-PPI-16-NH2-2-IgG、m-SB-PPI-32-NH2-2-IgG、m-SB-PPI-4-NH2-3-IgG、m-SB-PPI-8-NH2-3-IgG、m-SB-PPI-16-NH2-3-IgG、m-SB-PPI-32-NH2-3-IgG、mix-m-SB-PPI-4-NH2/OH-1(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-8-NH2/OH-1(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-16-NH2/OH-1(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-32-NH2/OH-1(OH/NH2mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-4-NH2/OH-2(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-8-NH2/OH-2(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-16-NH2/OH-2(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-32-NH2/OH-2(OH/NH2mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-4-NH2/OH-3(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-8-NH2/OH-3(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-16-NH2/OH-3(OH/NH2 mix)-IgG、mix-m-SB-PPI-32-NH2/OH-3(OH/NH2 mix)-IgG以及伯胺和混合OH/NH2改性梳形PEI树枝状接枝物(0-5代)。以类似的方式也获得其他靶向部分连接至感兴趣的改性SBP的合成。
LC-SPDP-混合表面m-SB-PPI-64-NH2/OH-2
向混合表面无规支化mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2(4×10-7mol)于400μl磷酸盐缓冲液(20mM磷酸盐和0.1M NaCl，pH 7.5)中加入400μL水中的4.0×10-6mol磺基-LC-SPDP(Pierce、IL)。将该混合物涡旋振荡并且在30℃下培养30分钟。通过凝胶过滤色谱纯化LC-SPDP-mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2并且用缓冲液A(0.1M磷酸盐、0.1M NaCl和5mM EDTA，pH6.8)平衡。将产物进一步浓缩得到465μL浓度约为0.77nmol的溶液。
巯基化mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2
将LC-SPDP mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2(在65μl缓冲溶液A中50nmol)与100μL二硫苏糖醇(DTT)(在缓冲液A中50mM)混合，并且在室温下培养15分钟。通过凝胶过滤用缓冲液A将过量DTT和副产物除去。该产物在10K Centricon浓缩器中浓缩，得到390μL巯基化mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2，其可用于与活化抗体缀合。
顺丁烯二酰亚胺R(MAL-R)-活化抗体
向在PBS中的抗体(310μL、5.1mg或34nmol)中加入20.4μL MAL-R-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液(在水中10mM)。将该混合物涡旋振荡，并在30℃下培养15分钟。通过凝胶过滤用缓冲液A纯化产物。顺丁烯二酰亚胺-R-活化抗体用于与巯基化mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2缀合。
mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2-抗体缀合物
向巯基化mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2(310μL或35.7nmol)加入MAL-R-活化抗体(4.8mL或34nmol)。将该反应混合物浓缩至约800μL，然后在4℃培养过夜和/或在室温培养约1小时。完成后，用100μL乙基顺丁烯二酰亚胺(50mmolar溶液)淬灭反应，随后在羧甲基纤维素(CM)柱(5ml)上用在pH 6、20mM磷酸盐缓冲液中的阶梯性梯度氯化钠对缀合物分级。用氯化钠梯度洗脱缀合物，并且用阳离子交换色谱、UV光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。
通过抗体的还原性偶联还原的缀合
向2.1mg或14nmol抗体于160μL缓冲液B(包含0.1M磷酸钠、5mM EDTA和0.1M NaCl、pH 6.0)中加入40μL DTT(50mM于缓冲液B中)。允许该溶液在室温下静置30min。通过凝胶过滤在用缓冲液B平衡的Sephadex G-25柱中纯化该产物。将还原的抗体浓缩至220μL，并且将其用于缀合。
MAL-R-混合表面改性SBP
向pH 7.4的400μL(400x10-9 mol)混合表面改性SBP加入400μL MAL-R-NHS(10mM于水中)。将其混合并且在30℃培养15min。终止后，在用缓冲液B平衡的Sephadex G-25柱中纯化该产物。收集MAL-R-混合表面改性SBP，并将其以等分试样保存在相同的缓冲液中，在-40℃下储存。
混合表面改性SBP–抗体缀合物
边搅拌边向还原抗体(14nmol于220μL)中加入MAL-R-mix-m-SB-PPI-64-NH2/OH-2(154μL、16.6nmol)。通过添加12.5μL碳酸钠(1.0M溶液)将pH调整至约6.8，该反应在室温下继续1小时，通过加入100μL半胱胺(0.4mM溶液)终止反应。在CM纤维素柱上用氯化钠梯度洗脱纯化缀合混合物。
IgG-不对称无规支化聚合物缀合物
提供了无规支化混合表面(OH/NH2混合)m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2-IgG缀合物的制备作为制备聚合物抗体缀合物的一般步骤。
其他的缀合物如PEI-IgG、m-ran-AB-PEI-NH2-1-IgG、m-ran-AB-PEI-NH2-2-IgG、m-ran-AB-PEI-NH2-3-IgG、m-ran-AB-PEI-NH2-4-IgG以及m-ran-AB-PEI-NH2/OH-1(OH/NH2mix)-IgG、m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2(OH/NH2 mix)-IgG、m-ran-AB-PEI-NH2/OH-3(OH/NH2mix)-IgG、规则聚赖氨酸聚合物、含伯胺链末端的烷基-改性无规支化聚(2-乙基噁唑啉)都以类似的方式合成。含不对称无规支化PEOX聚合物的多种蛋白质缀合物的合成也以类似的方式进行。
LC-SPDP-混合表面m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2
向混合表面无规支化m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2(4x 10-7mol)于400μL磷酸盐缓冲液(20mM磷酸盐和0.1M NaCl，pH 7.5)中加入于400μL水中的4.0×10-6mol磺基-LC-SPDP(Pierce，IL)。将其涡旋振荡并且在30℃下培养30分钟。用凝胶过滤色谱纯化LC-SPDP-m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2并且用缓冲液A(0.1M磷酸盐、0.1M NaCl和5mM EDTA，pH 6.8)平衡。将产物进一步浓缩得到浓度约为0.77nmol/μmol的465μL溶液。
巯基化m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2
将LC-SPDP m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2(50nmol于65ml缓冲溶液A中)与100μL二硫苏糖醇(DTT)(50mM于缓冲液A中)混合，并且允许在室温培养15分钟。通过凝胶过滤用缓冲液A将过量DTT和副产物除去。将该产物在10K Centricon浓缩器中浓缩，得到390μL巯基化m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2，其可用于与活化抗体缀合。
将如上所述制备的顺丁烯二酰亚胺-R-活化抗体用于与巯基化m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2缀合。
m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2-抗体缀合物
向巯基化m-ran-AB-PEI-NH2/OH-2(310μL或35.7nmol)中加入MAL-R-活化抗体(4.8mL或34nmol)。将该反应混合物浓缩至约800μL，允许在4℃下培养过夜和/或在室温下培养约1小时。完成后，该反应用100μL乙基顺丁烯二酰亚胺(50毫摩尔溶液)淬灭，随后在CM纤维素柱(5ml)上用在pH 6、20mM磷酸盐缓冲液中的阶梯性梯度的氯化钠对缀合物进行分级。将缀合物用氯化钠梯度洗脱，并且经阳离子交换色谱、UV光谱和聚丙烯酰亚胺凝胶电泳表征。
紫杉醇制剂和纳米颗粒制剂
作为一般的步骤，将紫杉醇溶解于甲醇至浓度最高达40mg/mL。将C18PEOXABP60聚合物单独溶解于甲醇至浓度最高达100mg/mL。然后使这两种溶液以不同体积混合以使混合物中聚合物与紫杉醇的最终摩尔比为3:1至10:1。随后根据体积将该混合物冻干20至96小时。
通过光散射法测量的聚集体的大小的直径范围为冻干之前70nm至90nm，冻干之后为120-140nm。
或者，可将紫杉醇和C18PEOXABP60聚合物溶解于共同的溶剂中，如丙酮、甲醇或乙醇，然后滴加至水中，同时进行搅拌或超声，接着用0.22μm过滤器无菌过滤。随后通过冻干产生最终产物，并用光散射法测量聚集体的大小。
可以类似的方式制备使用不同疏水表面改性的支化聚合物的其他紫杉烷诱导的聚集体或纳米颗粒，疏水表面改性的支化聚合物例如C4、C6、C12或C22烃-改性无规支化PEOX、PEI和PPI聚合物；C4、C6、C12、C18和C22烃-改性PAMAM、PEI和PPI树枝状大分子和树枝状接枝物；以及C4、C6、C12、C18和C22烃-改性的支化PLL/聚合物。
C18PEOXABP60聚合物:紫杉醇之比为7:1的纳米颗粒
将C18PEOXABP60(700mg)溶于9.33mL甲醇，得到75mg/mL溶液。将100mg紫杉醇溶解于6.67mL甲醇，得到15mg/mL紫杉醇溶液。将这两种溶液混合20分钟，得到每mL含有6.25mg紫杉醇和43.75mg聚合物的溶液，提供具有聚合物:药物之比为7:1的溶液。将该混合物放置于旋转蒸发仪上，除去甲醇至干燥。边搅拌边将所得的固体再溶解于33.3mL水中至紫杉醇的最终浓度为3mg/mL。使溶液制剂经过0.8μm过滤器，然后经过0.22μm过滤器。根据用量，将滤液在24-72小时内冻干。将小瓶用塞子塞住，并且在室温下储存该即用型白色粉末。将这种制剂命名为FID-007。
纳米颗粒测量
使用Malvern Zetasizer Nano-ZS Zen3600粒径分析仪通过动态光散色法测量各种聚合物、仅含聚合物的聚集体、以及药物诱导的聚合物聚集体的大小。
活性测试
在活细胞中的代谢会产生“还原等同物”，如NADH或NADPH。这种还原性化合物将电子传递至中间电子转移试剂，其可使四唑产物MTS(Promega)还原为有色的水溶性甲臜产物。在死亡时，细胞迅速丧失还原四唑产物的能力。因此有色甲臜产物的产生与培养物中的活细胞数成正比。
CellTiterAqueous产品(Promega)是用于测定培养物中活细胞数的MTS试验。MTS四唑与MTT四唑相似，优势为MTS还原的甲臜产物溶解于细胞培养基质中，并且不需要使用增溶溶液。使用以20μl试剂与100μl培养基质的推荐比直接加入至测试孔中的单一试剂。在37℃孵育细胞1-4小时，然后在490nm测量吸光度。
纳米包封的紫杉醇/ABP60(FID-007)的毒性和效力
如先前所述，用C18ABP60聚合物来制备纳米包封的紫杉醇，聚合物与紫杉醇比例为7:1。在用正常人真皮成纤维细胞系和各种癌细胞系的细胞毒性的研究中，以及体内毒性研究(最大耐受剂量、MTD)和在三种小鼠异种移植模型的肿瘤生长抑制研究中，将这种制剂(命名为FID-007)与Taxol以及Abraxane进行比较。
FID-007的体外活性
在体外细胞毒性实验中，在正常人成纤维细胞和各种癌细胞系上用Taxol和Abraxane测试FID-007。FID-007在体外抑制多种人癌细胞系的增殖，包括来源于乳腺、卵巢和肺癌细胞的细胞系，同时，FID-007表现出对正常细胞的较低的毒性，与在Taxol和Abraxane中观察到的水平相似(图15)。整体上，FID-007对正常细胞的毒性比对肿瘤细胞的低10倍，表现出大于100μM的非常高的EC50。FID-007在72小时的人肺癌细胞系A549的细胞毒性测试中具有活性，IC50为2.8ng/mL(图16)。FID-007对正常细胞的细胞毒性与Taxol和Abraxane的细胞毒性相当。FID-007对MDA-MB-231(三阴性乳腺癌细胞)有细胞毒性，IC50为4.9ng/mL(图17)；FID-007对OV-90(卵巢癌细胞)有细胞毒性，IC50为5.0ng/mL(图18)。对于所有的三种癌细胞系，FID-007的细胞毒性与Taxol和Abraxane的细胞毒性相当。
FID-007的体内活性
在小鼠中进行了一系列实验以确定静脉(I.V.)给药的FID-007的体内耐受性、活性和基本药物代谢动力学，如与Taxol和Abraxane相比。FID-007被良好地耐受，最高达每日剂量150mg/kg。为了证实抗肿瘤活性，在三种不同的小鼠异种移植模型(包括肺癌、卵巢癌和乳腺癌)中，每天将FID-007以良好耐受的剂量由I.V.给药。整体上，在小鼠异种移植模型中，FID-007比有相似靶点的标准细胞毒性剂(如Taxol和Abraxane)被更好地耐受，并能选择性地抑制肿瘤生长。
使用优化的HPLC方法测定小鼠中FID-007的半衰期为约9.3小时。肝和脾、以及血液是在1小时时具有最高FID-007浓度的器官。FID-007、Taxol和Abraxane的PK曲线在图19中示出。
在研究中比较FID-007的单剂量MTD以及Taxol和Abraxane的单剂量MTD，其中在几周内将不同剂量的药物通过健康CD-1和SCID(免疫缺陷)小鼠的尾静脉给药。向对照小鼠给予盐水。发现Taxol、Abraxane和FID-007对CD-1小鼠的单剂量MTD分别为20mg/kg、240mg/kg和175mg/kg。在所有存活的小鼠中没有观察到重大副反应。然而，与对照组(用盐水处理)相比，在所有Abraxane和FID-007处理组中观察到体重增加。120mg/kg及以上的Abraxane引起剂量依赖性的体重增加。在FID-007的剂量为150mg/kg及以上时可观察到相同的现象。
类似地，通过将FID-007(100和150mg/kg)在第0天、第3天和第6天经由尾静脉给药至健康CD-1和SCID小鼠(10周、雌性)，测定FID-007的多剂量MTD。每天监测动物两次，并且每3天称重。测定FID-007的多剂量MTD在CD-1小鼠中为100mg/kg，SCID中为30mg/kg，注射后立即出现一些副反应。与对照组相比，FID-007多剂量组没有过度的增加体重。
在人肺癌、乳腺癌和卵巢癌的肿瘤异种移植小鼠模型中，比较FID-007与Taxol和Abraxane的抑制肿瘤生长的体内效力。在60只雌性和雄性SCID小鼠(6-8周，20-26克，Charles River，40只雌性小鼠用于乳腺癌和卵巢癌、20雄性小鼠用于肺癌)躯干的两侧(左侧和右侧)各注射0.1mL肺癌A549、乳腺癌MDA-MB-231或卵巢癌OV90细胞于无血清培养基的悬液。之前将细胞在加湿培养箱(37℃、5％CO2、95％空气)中培养。每个小鼠肿瘤使用的剂量为3×106(A549)、107(MDA-MB-231)和5×106(OV-90)个细胞。在处理开始前允许肿瘤生长7至9天，所有的肿瘤体积测量是使用数字测径器(VWR Inc.)获得的。肿瘤体积通过式(W2 xL)/2计算，其中W为最大肿瘤宽度，L为最大肿瘤长度。在第一次处理前的当天获得肿瘤和体重测量值，然后每隔三天一次。第0天被指定为处理的第一天。在第0天，将形成肿瘤的动物随机分为五组[每组约4只小鼠(8种肿瘤)]，各处理组代表宽范围的肿瘤尺寸。
对于每次注射，Abraxane(80mg/kg)、FID-007(20mg/kg)、Taxol(20mg/kg)和C18ABP60聚合物起始原料(被指定为纳米载体001-B)(20mg/kg)是新鲜制备的。使用盐水作为载体对照。每三天通过尾静脉注射给予药物或盐水。基于先前确定的单剂量MTD和多剂量MTD，选择对所有的处理组为等毒性的药物剂量。肺癌、乳腺癌和卵巢癌组各接受总计4次注射。在整个研究中，对照、Abraxane和FID-007的注射体积为每次注射0.1mL。由于Taxol制剂的粘度，对于20mg/kg剂量，每次注射给予0.2mL。通过平均同一组中的所有动物来计算平均体重和肿瘤体积测量值。在对肺癌和卵巢癌的最后处理后的21天，和在对乳腺癌最后处理后的10天，用异氟醚使小鼠安乐死。收集血液和分离的血清、以及肿瘤组织和肝并且在-80℃下储存。
总之，对肺癌(A549)异种移植组，在任何处理组中没有发生死亡。可能是由于Taxol的毒性，在处理后的最初30分钟可观察到几只小鼠出现沉重的呼吸和不活动。通过平均同一组中所有的动物来计算平均体重和肿瘤体积测量值。盐水对照、Taxol、FID-007和纳米载体对照的整体平均体重增加分别为6.05％、5.87％、6.38％和12.3％。然而，在Abraxane组中所有小鼠都具有严重的神经毒性，并且失重>20％。那些小鼠在第13天被处死。对于盐水对照组，肿瘤体积增加1827mm3，纳米载体001B载体对照组增加1311mm3，Taxol组增加305.8mm3。然而，FID-007组的肿瘤体积减少39.7mm3(图20)。图21和22示出了处理组的肿瘤的代表图像。
对于乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植组，在任何处理组中没有发生死亡。可能是由于Taxol的毒性，在处理后的最初30分钟可观察到沉重的呼吸和不活动。在Abraxane组中，所有的小鼠在三次处理后显示出后腿无力和体重减轻20％的副作用，导致停止该组第4次处理的决定。通过平均同一组中所有的动物来计算平均体重和肿瘤体积测量值。对于盐水、Taxol、FID-007和纳米载体-001B，整体平均体重增加分别为3.76％、0.46％、1.8％和4.2％。对于Abraxane组，平均体重下降为7.66％。在盐水和纳米载体-001B组中肿瘤体积分别增加328.6mm3和458.8mm3。在FID-007、Taxol和Abraxane组中，肿瘤体积分别减少108.7mm3、75.5mm3和70.2mm3。肿瘤体积的观测示于图23中。图24和25为处理组的肿瘤的代表图像。
对卵巢癌(OV-90)异种移植组，Taxol处理组在处理后的最初30分钟可观察到两只小鼠显示出一定的毒性(沉重的呼吸和不活动)。盐水对照、Taxol、Abraxane、FID-007和纳米载体-001B对照组的平均体重增加分别为3.23％、17.1％、13.5％、15.4％和2.24％。在盐水对照、纳米载体-001B对照和Taxol组中，肿瘤体积分别增加652.7mm3、271.9mm3和9.1mm3，而FID-007组中肿瘤体积减少93.1mm3，在Abraxane(80mg/kg)组中减少72.4mm3。图26总结了各处理组的肿瘤体积的观察结果。图27和图28为解剖之前和之后肿瘤的代表图像。
FID-007表现出与已建立的抗肿瘤药Taxol和Abraxane的相似的对肺癌、乳腺癌和卵巢癌细胞系的体外细胞毒性，同时保持了对正常细胞的低水平的毒性。在人肺癌、乳腺癌、和卵巢癌的小鼠异种移植模型中，FID-007的抑制肿瘤生长和降低肿瘤质量的体内效力与这两种批准的药物一样好，或显著地优于这两种批准的药物。
本文引用的所有参考文献以引用的方式全文纳入本文。
应当理解的是，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本文的教导进行各种变化和修改。

Claims (21)

1.一种药物组合物，包括
聚集体，其包括
a)聚噁唑啉，其包含至少一个用疏水部分改性的第一末端基团，其中所述聚噁唑啉还包含线性部分、支化部分或两者，并且所述支化部分包含对称支化聚合物、不对称支化聚合物或其组合；其中所述聚噁唑啉包括的单体与引发剂之比为60:1至80:1，以及
b)紫杉烷，其中所述聚噁唑啉和所述紫杉烷的聚合物/紫杉烷重量比为6:1至8:1；并且所述聚集体在冻干之前大小为70nm至90nm；
以及
一种或多种药物上可接受的载体。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述引发剂包括疏水性亲电子分子。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述引发剂包括烃。
4.权利要求3的药物组合物，其中所述烃包含2至约22个碳原子，所述烃是饱和的或不饱和的。
5.权利要求1的药物组合物，其中所述引发剂包括脂族烃、芳族烃或两者的组合。
6.权利要求1的药物组合物，其中所述引发剂包含卤素官能团。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述引发剂包括烷基卤化物、芳烷基卤化物、酰基卤化物或其组合。
8.权利要求1的药物组合物，其中所述引发剂包括碘甲烷、溴甲烷、氯甲烷、碘乙烷、溴乙烷、氯乙烷、1-碘丁烷、1-溴丁烷、1-氯丁烷、1-碘己烷、1-溴己烷、1-氯己烷、1-碘十二烷、1-溴十二烷、1-氯十二烷、1-碘-十八烷、1-溴-十八烷、1-氯-十八烷、苄基碘、苄基溴、苄基氯、烯丙基溴、烯丙基氯、酰基溴、酰基氯、苯甲酰溴或苯甲酰氯。
9.权利要求1的药物组合物，其中所述引发剂包含甲苯磺酰基。
10.权利要求1的药物组合物，其中所述聚噁唑啉还包含至少一个第二末端基团，所述第二末端基团包含由乙二胺或其衍生物改性的位点。
11.权利要求1的药物组合物，其中所述紫杉烷与所述第一末端基团缔合。
12.权利要求1的药物组合物，其中所述聚噁唑啉包括聚(2-取代噁唑啉)。
13.权利要求1的药物组合物，其中所述聚噁唑啉包括聚(2-甲基噁唑啉)、聚(2-乙基噁唑啉)、聚(2-丙基噁唑啉)或聚(2-丁基噁唑啉)。
14.权利要求1的药物组合物，其中所述聚集体还包含靶向部分。
15.权利要求14的药物组合物，其中所述靶向部分包括抗体、其抗原结合部分、抗原、细胞受体、细胞受体配体或凝集素配体。
16.权利要求1的药物组合物，其中所述紫杉烷包括紫杉醇或多西紫杉醇。
17.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物通过如下途径给药至患者：经肠道外、经静脉内、经真皮内、经皮下、经口、经吸入、经皮肤、经局部、经粘膜、经直肠给药，或其组合。
18.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌的。
19.聚集体和一种或多种药物上可接受的载体用于制备治疗疾病的药物的用途，其中所述聚集体包括
a)聚噁唑啉，其包含至少一个用疏水部分改性的第一末端基团，所述疏水部分包括烃，其包含2至约22个碳原子且是饱和的或不饱和的；
其中所述聚噁唑啉还包含线性部分、支化部分或两者，并且所述支化部分包含对称支化聚合物、不对称支化聚合物或其组合；其中所述聚噁唑啉包括的单体与引发剂之比为60:1至80:1，以及
b)紫杉烷，其中所述聚噁唑啉和所述紫杉烷的聚合物/紫杉烷重量比为6:1至8:1；并且所述聚集体在冻干之前大小为70nm至90nm。
20.权利要求19的用途，其中所述聚噁唑啉还包含至少一个第二末端基团，所述第二末端基团包含由乙二胺或其衍生物改性的位点。
21.权利要求19的用途，其中所述疾病包括癌症。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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