CN110432240A - 一种复合检疫熏蒸处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合检疫熏蒸处理方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用其它用于杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。所述方法以高效率和减少的药剂量来杀灭有害生物，同时保证货物商业品质，特别适用于水果、蔬菜、种苗、花卉等鲜活植物产品的采后处理。

Description

一种复合检疫熏蒸处理方法
技术领域
本发明涉及一种复合检疫熏蒸处理方法，尤其地涉及一种针对水果、蔬菜、种苗、花卉等鲜活植物产品中携带的有害生物的新型处理方法。
背景技术
全球经济一体化、国际贸易形式多样化和世界政治经济格局的不断变化导致外来有害生物入侵的频率加大，对生态环境、农业生产和粮食安全构成巨大的潜在威胁。全球气候变化更进一步导致生态灾难频发，给世界各国造成重大经济损失。因此，如何有效防控外来有害生物入侵，已经成为全世界关注的焦点和热点。
为保证有害生物不随国际贸易传播，根据国际惯例，在国际贸易中必须对可能携带有害生物的产品实施检疫处理措施。由于产品的特殊性，水果、蔬菜、种苗、花卉等鲜活植物产品携带有害生物的风险极高，因而是国际社会和各国检疫部门关注的焦点。
目前对水果、蔬菜、种苗、花卉等鲜活植物产品的检疫处理技术主要包括熏蒸处理、热处理、冷处理和辐照处理。
熏蒸处理是指借助于熏蒸剂，在密闭空间内将有害生物杀灭的技术。熏蒸处理具有适用面广、高效等特点，被广泛应用到木材、粮食、水果、种子、苗木、花卉、树叶、药材、土壤、标本上的各类害虫、真菌、线虫、螨类及软体动物的除害处理上。目前检疫用的熏蒸剂主要有溴甲烷、磷化氢、硫酰氟等。
使用熏蒸剂溴甲烷进行熏蒸是国际上最为通用的处理技术。例如，美国农业部发布了大量溴甲烷熏蒸处理标准用于进境植物产品的处理(U.S.department ofagriculture,animal and plant health inspection service.2016.Treatment manual.http://www.aphis.usda.gov/import_export/plants/manuals/ports/downloads /treatment.pdf,Accessed 27 October 2016)。Cowley等人将溴甲烷蒸汽用于西瓜的实蝇处理，并取得了良好的效果[1]。但是由于溴甲烷对臭氧层的破坏作用，根据《蒙特利尔议定书》，虽然其检疫熏蒸用途可以继续使用，但基于环保考虑，应逐步减少其使用，而且其易对水果花卉等鲜活产品的品质造成不利影响。
磷化氢是一种杀虫性能较为优良的熏蒸剂，在防治储藏物害虫上已有60多年的应用历史[2]。传统的磷化氢熏蒸主要是通过含有氨基甲酸酯和磷化铝的磷化铝片剂在空气中水解缓慢释放磷化氢气体来杀灭害虫，虽具有杀虫谱广、穿透力强、毒力高、施药安全、生产成本低等特点，但由于以此产生的磷化氢混有一定量的氨气，易对鲜活产品产生药害等损伤，因此一直未能在鲜活产品的检疫除害处理中使用。随着磷化氢纯气制备技术的发展，其作为溴甲烷替代熏蒸剂在水果、蔬菜、花卉等货物的检疫处理上极具应用前景。有研究表明，在常温及低温条件下，纯的磷化氢气体熏蒸能够有效杀灭脐橙、枇杷、草莓、莴苣、鲜切花等携带的实蝇、西花蓟马和蚜虫等害虫[3,4]，并对水果和鲜花的品质没有影响[5]。但由于其处理时间较长(一般需要2-7天)，因此使用受到限制。
硫酰氟也是一种溴甲烷替代薰蒸剂，具有较好的杀虫效果，但其对水果、花卉等鲜活产品药害较大，一般不能用于鲜活植物产品的熏蒸处理。
热处理是使用热水、热空气等作为热传导介质，通过加热植物产品到指定温度，从而杀灭其中的有害生物的方法。由于许多有害生物的热致死温度与鲜活产品的热耐受阈值间差异较小，因而在热处理过程中必须精确控制温度，避免对鲜活产品的品质造成损伤。目前，热处理一般只能用于芒果、火龙果等少量热带水果的处理，例如，Heather 等报道了热空气处理澳大利亚芒果上的2种实蝇[6]。由于必须精确控温，处理设备也较为昂贵，难以大范围应用。
冷处理是将鲜活产品在较低温度下保存一定时间，进而杀灭其携带的有害生物的措施。冷处理主要用于苹果、柑橘类、杏、猕猴桃、樱桃、葡萄、柠檬等水果的除害处理。由于温带有害生物一般耐冷性较强，目前，国际上冷处理主要用于实蝇的检疫处理。Jang等人报道了冷处理地中海实蝇[7]。根据实蝇种类的不同，目前通行的处理标准为0-2℃下处理14-21天。长时间维持低温并进行温度监测带来的成本增加给冷处理的发展带来了很大的阻碍。由于冷处理对有害生物的杀灭作用是基于长时间的积累效应，所以在整个处理过程中，都必须保证植物产品的温度在指定的处理温度下，这对冷处理设施的稳定性和精度要求较高，同时也给国际贸易造成了较高的经济成本。
辐照处理利用离子化能照射有害生物，使之不能完成正常生活史或者不育，从而防止有害生物传播扩散或将其杀灭。由于其具有无毒、无害、无污染、不影响商品品质、安全等优点，已逐渐引起各国的重视。常用的离子化能有γ-射线、X-射线、高能电子束等。国际原子能组织(IAEA)和国际植物保护公约组织(IPPC)均在大力推进该技术的应用。目前该技术在进出口水果携带的实蝇和粉蚧类有害生物的检疫处理中研究较多。林朝森、Moy、Heather等人对低剂量60Coγ射线辐照杀灭昆士兰实蝇做了大量研究[8-10]。。辐照处理对水果贮藏品质影响的研究也有开展，一般500GY以下对水果损伤较小。但辐照处理也存在一些问题：
(1)射线在穿透整箱水果的过程中存在衰减，这样就会导致在一批被辐照的水果中，有些被照射的剂量较高，有些较低。通过工艺控制，一般在商业辐照中，可以将辐照剂量的不均匀度控制在2左右，也就是说，要保证全部水果接收了250GY的照射，其中部分水果已经最高接收了500GY的照射，这就接近或超过了部分水果的耐受阈值；
(2)传统辐照处理都是使用钴源等放射源进行，基于核安全性以及设备成本高昂的考虑，目前也开发了基于电能的X射线和电子束辐照技术，但电子束穿透能力有限，辐照不均匀度更高，上面提及的可能伤害水果的问题更加严重。
这些处理技术的联合使用也有报道。例如，荣晓东等报道了气调和溴甲烷熏蒸联合处理荔枝携带的桔小实蝇[11]。张凡华等报道了含有增加的二氧化碳和减少的氧气的气调处理与磷化氢熏蒸的联合使用对百合上的西花蓟马的协同杀灭作用，其中在5℃下，1.66mg/L(相当于1200ppm)磷化氢和12％二氧化碳联合处理16h可实现100％死亡率 [12]。
虽然这些处理技术的目的是为了杀灭有害生物，但更重要的是为了保障进出口贸易顺利进行，因此必须保证货物的商业品质不受影响。因此，本领域专家一直在研究如何尽量用对货物损伤更小的方法杀灭有害生物。
因此，本领域对植物产品中的有害生物的新型处理技术仍存在需要，其中所述技术以高效率和减少的药剂量来杀灭有害生物，同时保证货物商业品质，特别适用于水果蔬菜、种苗花卉等鲜活植物产品的采后处理。
发明内容
本发明人出人意料地发现，首先通过预处理来降低有害生物对各种检疫处理技术的耐受性，再使用较低剂量的药剂进行检疫处理，可以解决本领域存在的上述技术问题。另外，本发明人还出人意料地发现，对于各种无法完全杀灭目标有害生物的检疫处理技术，在首先通过预处理来降低有害生物对各种检疫处理技术的耐受性后，有效地提高了各种检疫处理技术的杀灭效果，显示出增效作用。
在一个实施方案中，所述预处理通过气态磷化氢(PH3)来进行。不受限于任何理论，认为磷化氢可以迅速抑制有害生物中抗逆基因的表达，使抗逆基因丧失对有害生物的保护作用，从而降低有害生物对各种检疫处理技术的耐受性。
在本发明的第一个方面，提供了一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用其它用于杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
在一个实施方案中，使用磷化氢预处理通过熏蒸进行，优选在5-25 ℃下进行，例如5℃、10℃、15℃、20℃或25℃，更优选在25℃下进行。
在一个实施方案中，所述磷化氢的浓度为50ppm-1200ppm，例如 50ppm、100ppm、200ppm、400ppm、800ppm、1000ppm、1200ppm。
在一个实施方案中，使用磷化氢预处理进行1-6小时，优选2-4小时，更优选3小时。
磷化氢熏蒸时影响其对昆虫毒力作用的因素主要有温度、气体浓度和处理时间。通过调整温度、气体浓度和处理时间的合适组合，可以实现最佳杀灭效果，这完全在本领域技术人员的能力范围内。
在本发明的上述任何一个实施方案中，所述其它处理程序选自熏蒸处理、热处理、冷处理、辐照处理以及本领域目前使用或未来开发的任何其它杀灭所述有害生物的处理程序。
在一个实施方案中，所述熏蒸处理包括使用熏蒸剂处理2-4小时；优选地，所述熏蒸剂选自溴甲烷、硫酰氟、环氧乙烷以及市售可得的任何其它熏蒸剂；优选地，所述溴甲烷的浓度为10-20g/m3，所述硫酰氟的浓度为5-25g/m3。
在一个实施方案中，所述热处理包括热蒸汽处理、热水处理、热空气处理等。
热蒸汽处理是利用热饱和水蒸气使农产品的温度提高到规定的要求，并在规定的时间内维持温度，通过水蒸气冷凝作用释放出来的潜热，均匀而迅速地使被处理的水果升温，使可能存在于水果内部的昆虫死亡。热蒸汽处理主要用于控制水果上的寄生性害虫。
热水处理可防治多种生物，主要有线虫、某些昆虫(如豆象和小蜂幼虫)和螨类，多用于鳞茎上的线虫和其他有害生物及带病种子的处理。热水浸泡在检疫处理中主要用于携带热带果蝇的水果的处理，也可以用于处理和防治菊科、报春花科、蔷薇科、凤仙花科、秋海棠科等花卉的线虫病害。有些处理方法提倡在热水中加入杀菌剂或湿润剂。福尔马林常常作为杀菌剂与热水混合处理鳞茎，在热水中可以更有效杀死线虫。
热空气处理一般在烤炉或者烤箱内进行，一般要求受害的植物材料要能承受较高的温度处理，在水果中应用还比较少。
根据热源不同，热处理还可分为干热处理和湿热处理。
在进一步的实施方案中，热处理通过浸入46-49℃的水中或暴露于 43-50℃的空气中1-2小时进行。
在一个实施方案中，所述冷处理包括在0-2℃下处理小于14天、小于12天、小于10天、小于8天、小于6天、小于5天、小于4天、小于3 天、小于2天或小于1天。优选地，所述冷处理包括在0-2℃下处理1-5 天。
在一个实施方案中，所述辐照处理以小于250GY、小于200GY、小于150GY、小于100GY、小于80GY、小于60GY、小于40GY或小于 20GY进行。优选地，所述辐照处理以5-20GY进行。
在一个实施方案中，所述植物产品选自水果、蔬菜、种苗和花卉。
在进一步的实施方案中，所述水果选自苹果、梨、桃、李、杏、山楂、枣、草莓、酸枣、脐橙、菠萝、番石榴等。
在进一步的实施方案中，所述蔬菜选自莴苣等。
在进一步的实施方案中，所述花卉是鲜切花。
在进一步的实施方案中，所述种苗选自蝴蝶兰。
在一个实施方案中，所述有害生物是昆虫。在一个实施方案中，所述有害生物选自桃小食心虫(Carposina sasakii Matsumura)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、山楂叶螨(Tetranychus viennensis Zacher)、桃蛀果蛾(Carposina sasakii Matsumura)、桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)、番石榴实蝇(Bactrocera correcta Bezzi)、柑橘大实蝇(Bactrocera minax Enderlein)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)和西花蓟马(Frankliniella occidentalis)等。
在本发明的第二个方面，提供了一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用其它熏蒸剂杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。本发明的第一个方面的任何实施方案适用于本发明的第二个方面。
在本发明的第三个方面，提供了一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用热处理杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。本发明的第一个方面的任何实施方案适用于本发明的第三个方面。
在本发明的第四个方面，提供了一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用冷处理杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。本发明的第一个方面的任何实施方案适用于本发明的第四个方面。
在本发明的第五个方面，提供了一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用磷化氢预处理，接着使用辐照处理杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。本发明的第一个方面的任何实施方案适用于本发明的第五个方面。
本发明人通过转录组测序获得了对磷化氢处理后差异表达的 2168个黑腹果蝇基因，并根据这些基因参与的主要生命过程进行了聚类分析，结果表明与细胞组分、分子功能和生物学过程相关的许多基因会受到磷化氢预处理的调控(见图2)。因此，磷化氢预处理有效降低有害生物对各种检疫处理技术的耐受性的作用机理是复杂的，并且可能是多靶点的，包括抗逆基因。
因此，在本发明的第六个方面，提供了磷化氢通过抑制植物产品中所携带的有害生物的一种或多种抗逆基因表达，降低所述有害生物对外界应激的耐受性的用途。
抗逆基因的实例包括热激蛋白、抗冻蛋白、抗氧化酶、解毒酶或其组合。这些抗逆机制的有效激活，将导致有害生物很难被处理措施杀灭，人们只能使用更高的处理剂量或更严苛的处理条件，这样就容易对货物造成不利影响。
在一个实施方案中，所述外界应激包括本文所述的各种杀灭有害生物的处理程序，例如熏蒸处理、热处理、冷处理、辐照处理。在一个实施方案中，所述有害生物是昆虫，包括但不限于在第一个方面中列举的昆虫。
本文所使用的所有单词和术语应被认为具有本领域技术人员所通常给予其的相同含义，除非另一种含义从上下文显而易见。
本文使用的术语―包括”和―包含”以及其各种变体意指包括一种或多种要素的组合物还可包含未明确描述的其它要素。
尽管未明确指出，但本文中的所有数值都意图用―约”进行修饰，除非上下文清楚指明。在本文中，术语―约”意指目标值±20％，优选±10％。
如全文所用，范围用作用于描述该范围内的每个值和所有值的速记。可选择该范围内的任何值作为该范围的端值。
另外，本文引用的所有参考文献通过引用全部结合到本文中。若本公开中的定义与所引用参考文献的定义相冲突时，以本公开为准。
本发明还包括以下其它实施方案：
实施方案1.一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用其它用于杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
实施方案2.实施方案1的方法，其中使用气态磷化氢预处理1-6 小时，优选2-4小时，更优选3小时。
实施方案3.实施方案1或2的方法，其中所述气态磷化氢的浓度为约50ppm-约1200ppm。
实施方案4.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述预处理通过熏蒸进行，优选在5-25℃下进行。
实施方案5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述其它处理程序选自熏蒸处理、热处理、冷处理和辐照处理，以及其任何组合。
实施方案6.实施方案5的方法，其中所述熏蒸处理包括使用熏蒸剂进行处理2-4小时。
实施方案7.实施方案6的方法，其中所述熏蒸剂选自溴甲烷和硫酰氟，以及其组合。
实施方案8.实施方案7的方法，其中所述溴甲烷的浓度为约10- 约20g/m3。
实施方案9.实施方案7的方法，其中所述硫酰氟的浓度为约5- 约25g/m3。
实施方案10.实施方案5的方法，其中所述热处理包括热蒸汽处理、热水处理、热空气处理等。
实施方案11.实施方案5的方法，其中所述热处理包括干热处理和湿热处理等。
实施方案12.实施方案5的方法，其中所述热处理包括浸入46-49 ℃的水中或暴露于43-50℃的空气中1-2小时。
实施方案13.实施方案5的方法，其中所述冷处理包括在0-2℃下处理1-5天。
实施方案14.实施方案5的方法，其中所述辐照处理以5-20GY 进行。
实施方案15.一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用其它熏蒸剂杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
实施方案16.实施方案15的方法，其中使用气态磷化氢预处理 1-6小时，优选2-4小时，更优选3小时。
实施方案17.实施方案15或16的方法，其中所述气态磷化氢的浓度为约50ppm-约1200ppm。
实施方案18.实施方案15-17中任一项的方法，其中所述预处理通过熏蒸进行，优选在5-25℃下进行。
实施方案19.实施方案15-18中任一项的方法，其中使用熏蒸剂进行处理2-4小时。
实施方案20.实施方案19的方法，其中所述熏蒸剂选自溴甲烷和硫酰氟，以及其组合。
实施方案21.实施方案20的方法，其中所述溴甲烷的浓度为约 10-约20g/m3。
实施方案22.实施方案20的方法，其中所述硫酰氟的浓度为约 5-约25g/m3。
实施方案23.一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用热处理杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
实施方案24.实施方案23的方法，其中所述热处理包括热蒸汽处理、热水处理、热空气处理等。
实施方案25.实施方案23的方法，其中所述热处理包括干热处理和湿热处理等。
实施方案26.实施方案23的方法，其中所述热处理包括浸入 46-49℃的水中或暴露于43-50℃的空气中1-2小时。
实施方案27.一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用冷处理杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
实施方案28.实施方案27的方法，其中所述冷处理包括在0-2℃下处理1-5天。
实施方案29.一种处理植物产品中所携带的有害生物的方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用辐照处理杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
实施方案30.实施方案29的方法，其中所述辐照处理以5-20GY 进行。
实施方案31.前述实施方案中任一项的方法，其中所述植物产品选自水果、蔬菜、种苗和花卉。
实施方案32.前述实施方案中任一项的方法，其中所述有害生物选自桃小食心虫(Carposina sasakii Matsumura)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、山楂叶螨(Tetranychusviennensis Zacher)、桃蛀果蛾 (Carposina sasakii Matsumura)、桔小实蝇(Bactroceradorsalis Hendel)、番石榴实蝇(Bactrocera correcta Bezzi)、柑橘大实蝇(Bactroceraminax Enderlein)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)和西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)。
实施方案33.气态磷化氢通过抑制植物产品中所携带的有害生物的一种或多种逆境响应基因的表达，降低所述有害生物对外界应激的耐受性的用途。
实施方案34.实施方案33的用途，其中所述逆境响应基因选自热激蛋白、抗冻蛋白、抗氧化酶、解毒酶或其任何组合。
附图说明
图1显示分别使用35g/m3溴甲烷(A)和1000ppm磷化氢+20g/m3溴甲烷(B)熏蒸的南丰蜜桔的照片。
图2显示模式昆虫黑腹果蝇经磷化氢处理后的差异表达基因的聚 类分析结果。
附图2中，1为细胞，2为细胞部分，3为外膜，4为细胞外区域， 5为细胞外区域部分，6为大分子复合物，7为膜封闭腔，8为细胞器， 9为细胞器部分，10为突触，11为突触部分，12为病毒体，13为病毒 体部分；14为抗氧化，15为结合，16为催化，17为电子载体，18为酶 调节剂，19为金属伴侣，20为分子转导物，21为营养贮库，22为蛋白 标签，23为结构分子，24为转录调节物，25为翻译调节物，26为运载 体，27为解剖学结构形成，28为生物学粘附，29为生物学调节，30为 细胞组分生物合成，31为细胞组分组构，32为细胞过程，33为死亡，为发育过程，35为建立定位，36为生长，37为免疫系统过程，38为 定位，39为移动，40为代谢过程，41为多\-生物过程，42为多细胞生 物过程，43为色素沉着，44为生殖，45为再生过程，46为对刺激的响 应，47为律动过程，48为病毒等复制。
具体实施方式
根据以下提供的具体实施例，本发明可应用的其它领域将会是显而易见的。尽管指出了本发明的优选的实施方案，但仅意图用于说明的目的而无意限制本发明的范围。
实施例1：制备磷化氢熏蒸气体
通过以下步骤制备磷化氢熏蒸气体：
(1)将重量比1:1000-3:1000的磷化铝与水加入气密性反应装置，反应温度设为50-70℃，反应12-24小时，得到纯度为99.00-99.995％的磷化氢气体；
(2)在密闭容器中将步骤(1)中制备的磷化氢气体按0.01％至0.15％的体积比与空气混合，制成熏蒸气体；或者在密闭容器中将磷化氢按照0.01％至0.15％的体积比与本领域常用的植物产品包装气体(含氧气、二氧化碳、氮气，通常比例为5％二氧化碳、3％氧气、其余为氮气) 混合，制成熏蒸气体。
实施例2：磷化氢熏蒸结合热处理对苹果中桃小食心虫的杀灭效果以及对水果品质的影响
在25℃，用实施例1制备的熏蒸气体对携带不同虫态桃小食心虫的苹果进行熏蒸处理，其中磷化氢浓度分别为100ppm、200ppm、 400ppm、800ppm、1200ppm，熏蒸时间为6小时，散气后再热处理2 小时，即，保证苹果中心温度达到43℃处理30分钟，对照组为仅进行43℃热处理的带虫苹果，试验结果如表1所示。结果表明，仅使用热处理不能完全杀灭苹果中的桃蛀果蛾幼虫。而在热处理之前采用不同浓度磷化氢熏蒸则能够有效提升热处理的杀虫效果。使用 400-1200ppm磷化氢熏蒸6小时之后进行果心温度43℃热处理30分钟能完全杀灭苹果中携带的各虫态桃小食心虫。
表1：磷化氢熏蒸结合热处理对苹果中桃小食心虫的杀灭效果
为了进一步考察该处理方法对水果品质的影响，分别在0ppm处理组和1200ppm处理组中放置了同样的不带虫苹果，并以未进行任何处理的苹果为对照，按上述方法处理后，在25℃储藏10天，检测上述处理对水果品质的影响。实验结果表明，与未处理相比较，各处理组苹果品质指标无显著差异，表明苹果能够耐受1200ppm磷化氢熏蒸 6小时及之后水果中心温度43℃热处理30分钟的处理条件(表2)。综合表1的结果，可确定400-1200ppm磷化氢熏蒸6小时及之后水果中心温度43℃热处理30分钟能够完全杀灭苹果中携带的各虫态桃小食心虫，且对水果品质无不利影响，可用于苹果中携带桃小食心虫的检疫处理。
表2：磷化氢熏蒸结合热处理对苹果品质的影响
表中数据均为3次独立实验数据的平均值。
实施例3：磷化氢熏蒸对桃小食心虫热激蛋白90(HSP90)表达量的影响
在25℃使用400ppm磷化氢熏蒸携带桃小食心虫老熟幼虫的苹果6小时，散气1小时后进行热处理，分别在磷化氢熏蒸2小时、4小时、6小时和果心温度升至40℃时收集活虫，使用实时PCR检测桃小食心虫热激蛋白90基因(HSP90)表达量的变化情况，HSP90和对照基因的引物见表3。以未实施熏蒸处理的桃小食心虫幼虫为对照。
表3：桃小食心虫的实时PCR引物
实验结果表明(表4)，对照组在放置6小时的过程中，桃小食心虫HSP90基因的相对表达量无显著变化，而果心温度升至40℃时，HSP90 基因的相对表达量显著上升，这与许多研究报道的热激蛋白的表达受到热处理诱导一致。与对照组相比，使用400ppm磷化氢熏蒸2小时，桃小食心虫HSP90基因的相对表达量就降至较低水平，在整个熏蒸过程中也一直维持在较低水平。当果心温度上升到40℃时，虽然HSP90 基因的相对表达量比熏蒸过程中也有一定上升，但与对照组相比，仍维持在较低水平。这些结果表明，桃小食心虫热激蛋白的表达可以被热处理诱导，在热处理的过程中起到保护作用；而磷化氢熏蒸可以迅速抑制热激蛋白的表达，使热激蛋白丧失对昆虫的保护作用；这就是磷化氢熏蒸结合热处理措施可以在较低温度下杀虫的分子基础。
表4：磷化氢熏蒸对桃小食心虫HSP90基因相对表达量的影响
处理组 2h 4h 6h 果心温度40℃
熏蒸组 0.15±0.02 0.09±0.01 0.07±0.02 0.27±0.04
对照组 0.20±0.03 0.22±0.04 0.21±0.03 2.28±0.14
表中数据均为3次独立实验数据的平均值。
实施例4：磷化氢熏蒸结合冷处理对脐橙中桔小实蝇的杀灭效果以及对水果品质的影响
用实施例1制备的熏蒸气体在25℃对携带不同虫态桔小实蝇的脐橙进行熏蒸处理，磷化氢浓度分别为250ppm、500ppm、1000ppm和 1500ppm，熏蒸时间为4小时，散气后再在1℃冷处理5天，对照组为仅进行1℃冷处理的带虫脐橙，试验结果如表5所示。
结果表明，仅进行冷处理不能完全杀灭脐橙中的桔小实蝇。在冷处理之前采用不同浓度磷化氢熏蒸能够有效提升冷处理的杀虫效果。使用500-1500ppm磷化氢熏蒸4小时及之后1℃冷处理5天能完全杀灭脐橙中携带的各虫态桔小实蝇。
表5：磷化氢熏蒸结合冷处理对脐橙中桔小实蝇的杀灭效果
为了进一步考察该处理方法对水果品质的影响，分别在0ppm处理组和1500ppm处理组中放置了同样的不带虫脐橙，并以未进行处理的脐橙为对照，按上述方法处理后，在25℃储藏5天，检测了上述处理对水果品质的影响。实验结果表明，与未处理相比较，各处理组脐橙品质指标无显著差异，表明脐橙能够耐受1500ppm磷化氢熏蒸4小时及之后1℃冷处理5天的处理条件(表6)。综合表5结果，可确定 500-1500ppm磷化氢熏蒸4小时结合1℃冷处理5天能完全杀灭脐橙中携带的各虫态桔小实蝇，且对水果品质无不利影响，因此可用于脐橙中携带桔小实蝇的检疫处理。
表6：磷化氢熏蒸结合冷处理对脐橙品质的影响
表中数据均为3次独立实验数据的平均值。
实施例5：磷化氢熏蒸对桔小实蝇热激蛋白表达量的影响
在25℃使用500ppm磷化氢熏蒸携带桔小实蝇三龄幼虫的脐橙4 小时，散气1小时后进行1℃冷处理，分别在磷化氢熏蒸1小时、2 小时、4小时和冷处理2天时收集活虫，使用实时PCR检测桔小实蝇热激蛋白基因(HSP40、HSP70和HSP90)表达量的变化情况，热激蛋白和对照基因的引物见表7。以未实施熏蒸处理的桔小实蝇三龄幼虫为对照。
表7：桔小实蝇实时PCR引物
实验结果表明(表8)，对照组在放置4小时的过程中，桔小实蝇三种热激蛋白编码基因的相对表达量无显著变化，而冷处理2天后，三种基因的相对表达量显著上升，这与许多研究报道的热激蛋白的表达受到冷处理诱导相一致。与对照组相比，使用500ppm磷化氢熏蒸1 小时，桃小食心虫HSP90基因的相对表达量就有明显下降，2小时后降至最低水平，此后也一直维持在较低水平。即使冷处理2天后，三种基因的表达量也均维持在较低水平。这些结果表明，桔小实蝇热激蛋白的表达可以被冷处理诱导，在冷处理的过程中起到保护作用；而磷化氢熏蒸可以迅速抑制热激蛋白的表达，使热激蛋白丧失对昆虫的保护作用；这就是磷化氢熏蒸结合冷处理措施可以较快杀虫的分子基础。
表8：磷化氢熏蒸对桔小实蝇热激蛋白编码基因相对表达量的影响
表中数据均为3次独立实验数据的平均值。
实施例6：磷化氢熏蒸结合热处理对花卉中害虫的杀灭效果以及对花卉品质的影响
在20℃下，用实施例1制备的一系列磷化氢浓度的熏蒸气体对携带蓟马类害虫西花蓟马成虫的鲜切菊花、康乃馨进行熏蒸处理，磷化氢浓度分别为50ppm、100ppm、200ppm和400ppm，二氧化碳含量为 5％，氧气为3％，其余为氮气，熏蒸时间为1小时，散气后，44℃热处理60分钟，以未进行熏蒸处理的带虫花卉为对照，观察其杀灭效果，试验结果如表9所示：
表9：磷化氢熏蒸结合热处理对花卉携带西花蓟马的杀灭效果
结果表明，仅使用热处理不能完全杀灭花卉上携带的西花蓟马。在热处理之前采用不同浓度磷化氢熏蒸能有效提升热处理的杀虫效果。使用100-400ppm磷化氢熏蒸1小时结合44℃热处理60分钟能完全杀灭花卉上携带的西花蓟马。
取各品种的鲜切菊花和康乃馨各10-20支，使用400ppm磷化氢 熏蒸1小时结合44℃热处理60分钟的条件进行联合处理，处理后置 于25℃-60％RH的环境中，1天后测定失重率，并持续观察在水中的 瓶插寿命，以花茎和叶色泽花型(开放度)呈衰老状，花瓣干枯，为瓶插寿命的终点。结果见表10。
表10：磷化氢熏蒸结合热处理对花卉品质的影响
表中数据均为3次独立实验数据的平均值。
对联合处理后花卉品质的分析表明，使用400ppm磷化氢熏蒸1 小时结合44℃热处理60分钟的联合处理对各品种菊花、康乃馨的失重率、瓶插寿命等品质指标没有影响，也不会导致药害等外观品质变化，是一种可以在鲜切花卉上广泛使用的处理技术。
实施例7：磷化氢熏蒸+溴甲烷熏蒸杀灭脐橙的桔小实蝇
分别使用1000ppm磷化氢(PH3)和不同浓度溴甲烷(MB)单独、同时和序贯熏蒸脐橙中的桔小实蝇幼虫，其中磷化氢熏蒸3h，溴甲烷熏蒸2.5h，结果表明(表11)，使用磷化氢+溴甲烷的序贯熏蒸模式明显优于单独使用的累加作用，具有很好的增效作用，增效系数最高可达7.6。
表11：磷化氢和不同浓度溴甲烷单独、同时和序贯熏蒸脐橙中的桔小实蝇幼虫的比较
如果单独使用溴甲烷熏蒸，需要35g/m3以上浓度的溴甲烷才能 100％杀灭桔小实蝇幼虫，但如果先使用1000ppm磷化氢熏蒸3h，仅需20g/m3溴甲烷即可完全杀灭。
尽管溴甲烷和磷化氢同时熏蒸存在增效，但我们使用桔小实蝇为处理对象，比较了MB单独熏蒸，MB和PH3同时熏蒸，以及先PH3 熏蒸再MB熏蒸的杀虫效果。结果表明，虽然MB和PH3同时熏蒸确实存在一定增效，但是先PH3熏蒸再MB熏蒸的增效效果更好。如果要100％杀灭桔小实蝇，单独MB熏蒸需要35g/m3，MB和PH3同时熏蒸需要使用30g/m3MB，而先PH3熏蒸再MB熏蒸仅需20g/m3MB。
我们分别测定溴甲烷单独熏蒸和磷化氢+溴甲烷序贯熏蒸后的桔小实蝇的过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的活性，并与未经任何处理的桔小实蝇比较，结果表明溴甲烷单独熏蒸激活了CAT和SOD的活性，说明昆虫可以通过提高抗氧化酶的活性响应溴甲烷的毒性；而经过磷化氢预处理的桔小实蝇再经过溴甲烷熏蒸， CAT和SOD的活性明显比溴甲烷单独处理低，说明磷化氢通过抑制昆虫抗氧化酶的激活，削弱了昆虫对逆境的抵抗能力。结果见表12。
表12：溴甲烷单独熏蒸和磷化氢+溴甲烷序贯熏蒸对桔小实蝇的抗氧化酶活性的影响
此外，分别使用35g/m3溴甲烷和1000ppm磷化氢+20g/m3溴甲烷熏蒸脐橙，结果表明，高浓度溴甲烷会导致药害，而联合使用对柑橘品质无影响(见图1)。
实施例8：磷化氢熏蒸+硫酰氟熏蒸杀灭脐橙中的桔小实蝇
分别使用1000ppm磷化氢(PH3)和不同浓度的硫酰氟(SF)单独、同时和序贯熏蒸桔小实蝇幼虫，其中磷化氢熏蒸3h，硫酰氟熏蒸2.5h，结果表明(表13)，使用磷化氢+硫酰氟的序贯熏蒸模式明显优于单独使用的累加作用，具有很好的增效作用，增效系数最高可达3.3。
表13：磷化氢和不同浓度的硫酰氟单独、同时和序贯熏蒸桔小实蝇幼虫的比较
如果单独使用硫酰氟熏蒸，需要60g/m3以上浓度的硫酰氟才能 100％杀灭桔小实蝇幼虫，但如果使用先磷化氢再硫酰氟熏蒸，仅需 25g/m3硫酰氟即可完全杀灭。
我们比较了SF单独熏蒸，SF和PH3同时熏蒸，以及先PH3熏蒸再SF熏蒸的杀虫效果。结果表明，虽然SF和PH3同时熏蒸确实存在一定增效(增效系数1.1)，但是先PH3熏蒸再SF熏蒸的增效效果更好。如果要100％杀灭桔小实蝇，单独SF熏蒸需要60g/m3以上， SF PH3同时熏蒸需要使用45g/m3SF，而先PH3熏蒸再SF熏蒸仅需 30g/m3SF。
实施例9：磷化氢熏蒸+辐照处理杀灭脐橙中桔小实蝇
分别使用1000ppm磷化氢(PH3)和不同剂量的辐照单独和序贯熏蒸脐橙中的桔小实蝇幼虫，其中磷化氢熏蒸3h，结果表明(表14)，使用磷化氢+辐照的联合处理模式明显优于单独使用的累加作用，具有很好的增效作用，增效系数最高可达3.3。
表14：磷化氢和不同剂量的辐照单独和序贯处理桔小实蝇幼虫的比较
如果单独使用辐照，需要80GY以上剂量才能100％使桔小实蝇幼虫不能羽化，但如果先使用1000ppm磷化氢熏蒸3h，仅需20GY 即可完全抑制实蝇羽化。
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Claims (8)

1.一种复合检疫熏蒸处理方法，所述方法包括使用气态磷化氢预处理，接着使用硫酰氟杀灭所述有害生物的处理程序的步骤。
2.权利要求1的方法，其中使用气态磷化氢预处理1-6小时，优选2-4小时，更优选3小时。
3.权利要求1或2的方法，其中所述气态磷化氢的浓度为约50ppm-约1200ppm。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述预处理通过熏蒸进行，优选在5-25℃下进行。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中使用硫酰氟进行处理2-4小时。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述硫酰氟的浓度为约5-约25g/m3。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述植物产品选自水果、蔬菜、种苗和花卉。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述有害生物选自桃小食心虫(Carposinasasakii Matsumura)、苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、山楂叶螨(Tetranychus viennensisZacher)、桃蛀果蛾(Carposina sasakii Matsumura)、桔小实蝇(Bactrocera dorsalisHendel)、番石榴实蝇(Bactrocera correcta Bezzi)、柑橘大实蝇(Bactrocera minaxEnderlein)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)和西花蓟马(Frankliniellaoccidentalis)。
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