CN110396515A - 一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用 - Google Patents

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CN110396515A CN201910333128.2A CN201910333128A CN110396515A CN 110396515 A CN110396515 A CN 110396515A CN 201910333128 A CN201910333128 A CN 201910333128A CN 110396515 A CN110396515 A CN 110396515A
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王树伟
肖云平
赵仕兰
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Biomedical Science And Technology Ltd Of Shanghai Ou Yi
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
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Abstract

本发明公开了一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用，所述构建方法通过增加用于反转录的起始总RNA量，无需使用PCR扩增步骤，从而可以减少冗余序列的产生；使用新的终载体质粒pSPR3na，后续可一步生成次级文库并可以多次生成；本发明所述构建方法可以实现降低酵母文库序列冗余度并可以反复生成次级文库的目的。本发明还公开了所述膜系统表达文库在进行膜蛋白‑膜蛋白、膜蛋白‑可溶性蛋白间的互作研究，用于表达文库的筛选，用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的研究中的应用。本发明还公开了一种新的酵母文库终载体质粒。

Description

一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用
关于优先权
本申请要求2018年04月24日提交的、申请人为“上海欧易生物医学科技有限公司”、申请号为201810375630.5、发明创造名称为：“降低冗余及文库假阴性率的膜系统建库方案”的中国发明专利申请的优先权。
技术领域
本发明涉及表达文库制备领域，具体涉及一种膜系统表达文库及其构建方法和应用。
背景技术
酵母双杂交(Yeast two hybrid)技术是目前用于分析蛋白相互作用的一种重要技术，被广泛应用在蛋白质组学功能基因组学及细胞信号转导等领域。人们不仅用该方法检测已知蛋白之间的相互作用，更重要的是可以用这种方法发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。
通过研究人们发现，酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular)，由两个或两个以上结构上可以分开的，功能上互相独立的结构域(domain)构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation doman，DNA-AD)。这两个结构域在分开时仍然分别具有各自的功能，但是由于空间上的距离，导致不能激活转录，只有当两个结构域通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与编码诱饵蛋白(Bait protein)的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein；将编码DNA-AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上，同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS和ADE等氨基酸，因此当将这种酵母培养在缺乏上述四种氨基酸的培养基时酵母无法生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析，以便确定诱饵蛋白和靶蛋白是否存在相互作用。
最初该系统主要用于研究核蛋白的功能，后来经过改造，引入了分裂泛素技术，该技术是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，它提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。然而已有的泛素分裂建库技术由于需要的RNA起始量较低，因此建库过程依赖于PCR扩增，从而导致某些高表达的基因丰度增加，而一些低表达基因有可能会丢失。对于丰度高的基因常常需要采用均一化酶的处理，但是这一过程需要对每一个样本进行实验条件摸索，费时费力。同时，PCR容易造成一定程度的污染，使得其对于建库环境，试剂以及操作人员的要求较高。因此，降低膜系统表达文库序列冗余度并易于获得次级文库是建库中亟待解决的问题。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述技术问题，本发明在付诸创造性劳动及研究之后，提供了一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用，所述构建方法可有效降低膜系统表达文库序列冗余度并提高建库效率。本发明创新技术方案中，增加反转录时所使用的总RNA的量并分离mRNA，不再使用PCR进行扩增，使用改造后的新载体质粒pSPR3na作为文库的终载体。
本发明提出一种基于不需要PCR扩增步骤的膜系统表达文库的构建方法，且能实现降低膜系统表达文库序列冗余度并提高建库效率的有益效果。
本发明提出的膜系统表达文库的构建方法，包括如下步骤：
(1)分离mRNA；
(2)反转录及二链合成；
(3)cDNA加接头；
(4)连接接头的cDNA进行分级分离；
(5)将步骤(4)获得的cDNA与pDONR222质粒进行BP重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，经培养得到初级文库；
(6)检测所述初级文库质量；
(7)培养经检测合格的初级文库，抽提质粒即制备得到初级文库质粒；
(8)将所述初级文库质粒与新的次级文库终载体pSPR3na进行LR Clonase II重组酶重组，得到最终次级文库即目的产物所述膜系统表达文库。
进一步优选地，步骤(1)中，取抽提纯化的总RNA 100-500微克，采用OligotexmRNA Midi Kit方法分离mRNA，使用分离好的mRNA进行后续反转录实验。
本发明中，所述步骤(2)，将分离得到的mRNA进行反转录生成双链cDNA；其中，用于反转录的mRNA的量为1-5微克。通过采用1-5微克起始反转录，则后续无需使用PCR扩增获得足量的cDNA用于建库，可以降低文库的冗余度。
进一步优选地，所述步骤(2)中，具体包括：取步骤(1)中分离好的1-5微克mRNA，加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer 1微升，dNTP微升混匀，70℃保温5分钟，降温到45℃孵育2分钟，再用SuperScript III反转录酶45℃保温20分钟，再依次加入E.coli.DNALigase、E.coli.DNA Polymerase I、E.coli.RNaseH各2U-50U，16℃保温2小时，后加入T4DNA Polymerase1 10U，继续16℃保温5-10分钟，保温结束后，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混匀，静置1分钟，14,000rpm，室温离心5分钟，小心将上清加入新的离心管中，加入1/10体积醋酸钠及2.5倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置2小时后取出，最大转速20000×G离心3分钟。去上清后加入75％乙醇1毫升，短暂离心取上清，重复一次，室温晾干，加DEPC水重新溶解cDNA。
所述步骤(3)，对步骤(2)中生成的双链cDNA加上重组接头。进一步优选地，在一具体实施方案中，步骤(3)中，溶解的cDNA加入建库接头attB1Adapter F和R各4微克，加入T4连接酶1U，16℃连接16-24小时。
所述步骤(4)，获得片段长度合适的cDNA。进一步优选地，在一具体实施方案中，步骤(4)中，连接接头的cDNA文库进行分级分离，琼脂糖电泳分离cDNA，割胶切取大于1kb的cDNA片段进行回收。
所述步骤(5)，通过cDNA与载体重组获得初级文库。进一步优选地，在一具体实施方案中，步骤(5)中，回收的文库cDNA50-200纳克与pDONR222质粒150-600纳克，加入BPII enzyme mix 20-100U进行重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，加入SOC培养基1-4毫升培养0.5-3小时后，得到初级文库。
所述步骤(6)，对初级文库进行质检。进一步优选地，在一具体实施方案中，步骤(6)中，取10-50微升的初级文库稀释1000倍后涂板，过夜培养，检测文库容量，并随机挑选20-50个菌落进行文库插入片段长度检测，其中载体质粒有插入片段且插入长度大于1000bp的质粒为合格的初级文库质粒，检测合格的初级文库用于后续次级文库的构建。
所述步骤(7)，获得合格的初级文库质粒。进一步优选地，在一具体实施方案中，步骤(7)中，将检测合格的初级文库的剩余部分加入50-200毫升培养基，37℃过夜培养并抽提质粒，得到初级文库质粒。
所述步骤(8)，与新构建的pSPR3na载体重组获得次级文库。进一步优选地，在一具体实施方案中，步骤(8)中，使用LR Clonase II重组酶，将所得到的200-400纳克初级文库质粒与200-400纳克新的终载体质粒pSPR3na在25℃保温16-36小时进行重组，得到最终次级文库，即目的产物所述膜系统表达文库。
其中，所述次级文库构建过程中使用改造过的新载体pSPR3na，所述新载体pSPR3na是在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的一段序列生成的；其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列是指三段DNA序列，即两段attr重组序列(CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG)和一段ccDB致死基因序列，其中两段attr重组序列连接在ccDB致死基因序列的两端，在重组酶作用下，两段attr重组序列可通过重组，使中间ccDB致死基因序列和另外质粒上的目标序列发生交换；由于ccDB致死基因的表达产物能够抑制普通大肠杆菌的生长，重组发生后，ccDB致死基因不能表达，大肠杆菌可以正常生长。
本发明还提出了按所述构建方法所制备得到的膜系统表达文库。所述膜系统表达文库为研究膜蛋白相互作用的一种文库，提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的研究。
本发明还首次创新地提出了一种载体pSPR3na即一种新的酵母文库终载体质粒，所述载体pSPR3na是在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的一段序列生成的质粒。
其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包括两段attr重组序列(CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG)和一段ccDB致死基因序列，将这两段attr重组序列分别放在一段DNA序列(ccDB致死基因序列)的两端，在重组酶作用下可通过重组，使这两段序列中间的DNA序列重组到另外一个同样带有该序列的DNA序列中。ccDB基因的表达产物能够抑制普通大肠杆菌的生长，当重组发生时，ccDB基因不能表达，大肠杆菌可以正常生长。pSPR3na载体是利用pPR3-N改造而来，通过添加attr和ccDB序列，使改造后的质粒能够用于质粒重组。
本发明还提出了一种所述膜系统表达文库、所述载体pSPR3na、所述构建方法的应用，所述应用包括构建膜系统表达文库为研究膜蛋白相互作用的一种文库，提供了不同于常规酵母双杂交系统的蛋白体内分析方法，使得分析膜蛋白间的互作成为现实。其主要特点是可以进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究。它既可以用于表达文库的筛选，也可以应用于两个已知蛋白(其中一个属于膜蛋白)间互作关系的验证。所述载体pSPR3na是在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的一段序列生成的质粒。改造后质粒的应用使次级文库的生成工作一步完成并可反复进行，与原方案相比，获得次级文库可一步完成，不需要重新建库。
与现有技术相比，本发明有益效果包括：本发明增加用于反转录的起始总RNA量，在反转录时使用100-500微克的总RNA分离mRNA进行反转录，构建过程中无需使用PCR扩增步骤，减少冗余序列的产生，避免了诸如序列扩增偏好及序列冗余等的缺陷。
初级文库与新的酵母文库终载体质粒重组生成次级文库，由初级文库生产次级文库可一步完成，而且可以反复获得次级文库，从而为后续筛库提供了便利。本发明通过增加反转录时所使用的总RNA并分离mRNA，不再使用PCR进行扩增降低膜系统表达文库冗余度，使用新的载体pSPR3na作为文库的终载体。
本发明改变了建库过程中的反转录方案及终载体序列，降低了文库的冗余度，可以支持反复获得次级文库，为后续筛库提供了便利。
本发明中，所采用的术语和方法如下：
本发明中，所述步骤(2)中，所述二链是指cDNA第二条链。
本发明中，所述步骤(3)中，所述接头为建库接头attB1Adapter F和R，选自英骏酵母文库操作手册。
本发明中，所述步骤(4)中，所述分级分离是指分选cDNA大片段。所述分离分级的步骤包括a.固定分级柱，将上盖打开，再打开下面的塞子；b.待柱子中储存液流尽，加0.8mlTEN Buffer清洗柱子，确定柱子流速为每30-40秒一滴，每滴25-35ul，否则需要更换柱子；c.重复b步骤3次；d.准备好2个新的1.5ml离心管，标记1，2；e.将三份各50ul的cDNA产物混匀加入柱子中，收集滤过产物于1号管；f.再向柱子中加入100ul的TEN Buffer，收集滤过产物与1号管；g.重复步骤f两次；h.向柱子中加入100ul的TEN Buffer，收集滤过产物与2号管；i将2号管补充TEN Buffer至1号管体积；
J.按下表加入各成分：
Glycogen(20ug/ul) 1ul
7.5M NH<sub>4</sub>OAc 0.5V
100％ethanol 2.5V
-80℃，静置30n；13000rpm，4℃，离心20in，去上清；
k.加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀；13,000rpm，常温离心3min，去上清；
l.加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀；13,000rpm，常温离心3min，去上清；
m.室温晾干cDNA至透明；
n.用13ul的DEPC水反复吹打30-40次，溶解cDNA。
本发明中，所述步骤(5)中，所述BP重组是指回收的文库cDNA与pDONR222质粒150-600纳克，加入BPII enzyme mix 20-100U进行重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，加入SOC培养基1-4毫升培养0.5-3小时后，得到初级文库。
本发明中，所述步骤(6)中，对所述初级文库进行检测的步骤包括取转化后细菌原液10ul(原有3ml)稀释1000倍后，从中取出50ul涂布LR平板(含相应抗性氨苄青霉素)，第二天计数。
CFU/ml＝平板上的克隆数/50ul×1000倍×1×103ul
文库总CFU＝CFU/ml×文库菌液总体积(ml)
重组率和插入片段长度鉴定
随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，在Microtube中配制如下反应液：
ddH<sub>2</sub>O 16.2ul
10×PCR Buffer 2.0ul
dNTP(10mM) 0.5ul
pGADT7F(20uM) 0.5ul
pGADT7R(20uM) 0.5ul
DNA Polymerase(5U/ul) 0.3ul
Total 20ul
在Thermal Cycler PCR仪上按以下条件进行PCR反应：
扩增产物用1％Agarose胶电泳鉴定(图2)。文库插入片段长度大于1000bp,空载体数量为0，重组率为100％。
本发明中，所述步骤(7)中，对所述初级文库进行培养的步骤包括采用100ml肉汤培养基，摇菌，30℃过夜培养，第二天中抽质粒，质粒测OD并电泳检测。
本发明中，所述步骤(8)中，所述LR Clonase II重组酶重组是指初级文库质粒300ng，pSPR3na质粒300ng，LR Clonase II Mix 4μl，水14μl至总体积20μl，混匀后置于25℃，16-20小时。
本发明的有益效果在于，本发明改变了建库过程中的反转录方案及终载体序列，本发明通过增加反转录时所使用的总RNA的量并分离mRNA，不再使用PCR进行扩增，降低了文库的冗余度，使用改造后的新载体质粒pSPR3na作为文库的终载体，可用重组方式生成次级文库，能够多次生成次级文库，提高建库的效率。
附图说明
图1表示本发明终载体pSPR3na的示意图。
图2表示膜体系次级文库插入片段大小及充足率质检图；其中，右图中，采用DL2,000DNA Marker，从下到上DNA片段大小依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1构建膜体系表达文库
构建过程，如以下具体步骤：
(1)取抽提纯化的水稻组织总RNA 450微克，采用Oligotex mRNA Midi Kit方法分离mRNA，使用分离好的mRNA进行后续反转录实验；
(2)取3微克mRNA，加入biotin-attB2-Oligo(dT)Primer 1微升，dNTP 1微升混匀，70℃保温5分钟，降温到45℃孵育2分钟，再用SuperScript III反转录酶45℃保温20分钟，再依次加入E.coli.DNA Ligase10U、E.coli.DNA Polymerase I 40U、E.coli.RNaseH各2U，16℃保温2小时，后加入T4DNA Polymerase1 10U，继续16℃保温10分钟，保温结束后，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混匀，静置1分钟，14,000rpm，室温离心5分钟，小心将上清加入新的离心管中，加入1/10体积醋酸钠及2.5倍体积无水乙醇混匀，-20℃放置2小时后取出，最大转速20000×G离心3分钟。去上清后加入75％乙醇1毫升，短暂离心取上清，重复一次，室温晾干，加DEPC水重新溶解cDNA；
(3)溶解的cDNA加入建库接头attB1Adapter F和R各4微克，加入T4连接酶1U 16℃连接18小时；
(4)连接接头的cDNA文库进行分级分离，琼脂糖电泳分离cDNA，割胶切取大于1kb的cDNA片段进行回收；
(5)回收的文库cDNA与pDONR222质粒160纳克，加入BPII enzyme mix30U进行重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，加入SOC培养基3毫升培养2小时后，得到初级文库；
其中，所述pDONR222质粒、大肠杆菌DH10B感受态细菌、SOC培养基等均是现有技术内容。
其中，所述初级文库是指整合了全部水稻组织cDNA的pDONR222的质粒，为一个质粒集合。
(6)取转化后细菌原液10ul(原有3ml)稀释1000倍后，从中取出50ul涂布LR平板(含相应抗性氨苄青霉素)，第二天计数。
CFU/ml＝平板上的克隆数/50ul×1000倍×1×103ul
文库总CFU＝CFU/ml×文库菌液总体积(ml)
重组率和插入片段长度鉴定
随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，在Microtube中配制如下反应液：
ddH<sub>2</sub>O 16.2ul
10×PCR Buffer 2.0ul
dNTP(10mM) 0.5ul
pGADT7F(20uM) 0.5ul
pGADT7R(20uM) 0.5ul
DNA Polymerase(5U/ul) 0.3ul
Total 21ul
在Thermal Cycler PCR仪上按以下条件进行PCR反应：
扩增产物用1％Agarose胶电泳鉴定(图2)。文库插入片段长度大于1000bp,空载体数量为0，重组率为100％。
(7)将鉴定合格的初级文库的剩余部分(3ml-10ul＝2990ul)加入100毫升培养基37℃过夜培养并抽提质粒得到初级文库质粒；
(8)用所得到的300纳克初级文库质粒与300纳克pSPR3na载体质粒使用LRClonase II重组酶，在25℃保温20小时进行重组，得到最终次级文库。
通过以上步骤构建所得到的最终次级文库是指能够用来筛选的最终文库。
次级文库构建过程中使用改造过的新载体，即新载体pSPR3na是在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的一段序列生成的，如图1所示。
该载体的构建过程，通过PCR扩增attr及ccDB序列，并通过同源重组将片段连接进入pPR3-N，从而生成pSPRna。其中，attr重组序列是指两段DNA序列：CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG，将这两段序列分别放在一段DNA序列的两端，在重组酶作用下可通过重组使这两段序列中间的DNA序列重组到另外一个同样带有该序列的DNA序列中。ccDB基因的表达产物能够抑制普通大肠杆菌的生长，当重组发生时，ccDB基因不能表达，大肠杆菌可以正常生长。
实施例2本发明建库方案具有低冗余
现有技术建库方案：按照原有的膜体系文库的构建方法，采用1-3微克总RNA起始建库，不进行mRNA的分离，反转录得到cDNA后再通过PCR扩增，获得足够的cDNA以满足后续实验，通过对cDNA和pPR3-N的酶切连接生成最终的膜体系文库。这种文库空载体率偏高，后续文库不能反复生成。另外就是文库的冗余序列多，其中S-1和S-20是同一条序列，S-10和S-22及S-23是同一条序列，(见表1)。
本发明建库方案：改造后的实验方案采用100-500微克总RNA起始建库，先使用总RNA进行mRNA的分离，再用获得的mRNA进行后续反转录，得到cDNA之后对cDNA进行接头连接，连接后的cDNA可以和pDONR222进行第一次重组，获得初级文库，后续再用本发明改造的pSPR3na和初级文库进行重组，获得次级文库。这种文库空载率低，文库冗余度低(见表2)，24条随机抽取的序列无冗余，重复率为0％。后续的次级文库可以多次生成。
冗余序列比较：分别用原建库方案和改造后的建库方案对同一份材料进行文库构建，对获得的两个文库各随机挑选24个克隆进行测序，测序结果表明：现有技术的建库方案冗余率12.5％，本发明改造后的建库方案无冗余。
表1
表2改造后建库方案文库测序结果
与现有技术相比，本发明有益效果包括：本发明在反转录时使用100-500微克的总RNA分离mRNA进行反转录，构建过程中不使用PCR，本发明利用高RNA起始量(100-500微克)做反转录，避免了PCR扩增，避免了由PCR带来的冗余序列的产生，减少扩增偏好及序列冗余等的缺陷。初级文库与pSPR3na终载体通过一步重组生成次级文库，而且可以多次由初级文库生成次级文库，为后续筛库提供便利。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
序列表
<110> 上海欧易生物医学科技有限公司
<120> 一种降低文库冗余度的膜系统表达文库及其构建方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
caactttgta caaaaaagct gaac 24
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gttcagcttt cttgtacaaa gttgg 25

Claims (9)

1.一种膜系统表达文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
(1)分离mRNA；
(2)反转录及二链合成；
(3)cDNA连接接头；
(4)连接接头的cDNA进行分级分离；
(5)将步骤(4)获得的cDNA与pDONR222质粒进行BP重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，经培养得到初级文库；
(6)检测所述初级文库；
(7)制备初级文库质粒：培养经步骤(6)检测合格的初级文库，抽提质粒即得到初级文库质粒；
(8)将步骤(7)得到的初级文库质粒与载体pSPR3na进行LR Clonase II重组酶重组，得到最终次级文库，即所述膜系统表达文库；
其中，所述载体pSPR3na的构建步骤为：在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列所生成的质粒；
其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用Oligotex mRNAMidi Kit方法从100-500微克总RNA中分离mRNA；所述步骤(2)中，用于反转录的mRNA的量为1-5微克。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，使用biotin-attB2-Oligo(dT)Primer进行反转录获得cDNA。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述接头为attB1Adapter F和R。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(7)中，步骤(6)检测合格的文库cDNA50-200纳克与pDONR222质粒150-600纳克，加入BPII enzyme mix 20-100U进行重组，重组后电激转化入大肠杆菌DH10B感受态细菌，加入SOC培养基1-4毫升培养0.5-3小时后，得到初级文库。
6.如权利要求1～5之任一项所述的构建方法所制备的膜系统表达文库。
7.一种载体pSPR3na，其特征在于，所述载体是在pPR3-N载体的多克隆位点插入包含attr重组序列和ccDB致死基因序列在内的序列所生成的质粒；其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。
8.一种载体pSPR3na的构建方法，其特征在于，所述构建方法的步骤为：在pPR3-N载体的多克隆位点连接入包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的一段序列所生成的质粒；其中，所述包含attr重组序列和ccDB致死基因在内的序列包含CAACTTTGTACAAAAAAGCTGAAC和GTTCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGG两段attr重组序列、以及一段ccDB致死基因序列，其中所述两段attr重组序列连接在所述ccDB致死基因序列的两端。
9.一种如权利要求1～5之任一项所述的构建方法、或如权利要求6所述的膜系统表达文库、或如权利要求7所述的载体pSPR3na进行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白间的互作研究，用于表达文库的筛选，用于两个已知蛋白间互作关系的研究中的应用。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103849638A (zh) * 2014-02-21 2014-06-11 江苏省农业科学院 用于cDNA文库构建筛选的质粒载体及其构建方法与应用
WO2014134685A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 The University Of Sydney Assay and method for identifying compounds to treat tauopathies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014134685A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-12 The University Of Sydney Assay and method for identifying compounds to treat tauopathies
CN103849638A (zh) * 2014-02-21 2014-06-11 江苏省农业科学院 用于cDNA文库构建筛选的质粒载体及其构建方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
崔晓燕等: "大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建", 《植物病理学报》 *

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