CN110381953A - 硫化寡糖在制备治疗手术后肝细胞癌病患的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明系关于一种硫化寡糖在制备供根治性肝脏切除后的微小血管侵犯型肝细胞癌(HCC)患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途，且排除无血管侵犯型肝细胞癌患者及大血管侵犯型肝细胞癌患者。

Description

硫化寡糖在制备治疗手术后肝细胞癌病患的药物的用途

技术领域

本发明系关于肝细胞癌(HCC)，更进一步地系关于muparfostat在制备供手术切除肝脏后的肝细胞癌患者用于延长无疾病存活期的药物的用途。

背景技术

早期肝细胞癌病患的标准治疗为局部消融或手术切除(包括肝脏移植)，尽管根治性目的的手术切除在初期有效，但因为肝细胞癌复发的高风险，手术后的五年无疾病存活(DFS)率仅有20％～30％。

术后复发有两种特别的态样，一是从残余微转移(residual micrometastases)而来的复发，二是因剩余肝组织持续癌变而重新复发。由于肿瘤复发及其后伴随而来的死亡在肝细胞癌切除手术后并非罕见，许多辅助性治疗已被用于改善病患存活，包括全身性化学治疗、肝动脉化学栓塞疗法(transarterial chemoembolization)、干扰素α-2b、碘131标帜的碘化油、细胞激素、索拉非尼(sorafenib)及非环状类视黄醇等，然而都未能获得成功。因此，目前对于肝细胞癌切除手术后的有效辅助疗法仍然付之阙如而极需开发。

发明内容

于一方面，本发明系关于一种治疗有效量的muparfostat在制备供一肝脏切除后之一微小血管侵犯型肝细胞癌(HCC)患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途。

在一具体实施例中，于本发明的用途前，检验从肝细胞癌患者切除的肝肿瘤样本以确认该样本中存在微小血管侵犯。

在一具体实施例中，于本发明的用途前，评估肝细胞癌患者的肝肿瘤样本以确认该肝肿瘤样本是否具有微小血管侵犯。

在一具体实施例中，于本发明的用途后，该患者每三个月进行一次计算机断层扫描监控作为检查。

在一具体实施例中，本发明的用途系与一治疗有效量的一免疫检查点抑制剂在制备供一微小血管侵犯型肝细胞癌患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途合并使用。

在一具体实施例中，本发明的用途系与一治疗有效量的一附加抗癌剂在制备供一微小血管侵犯型肝细胞癌患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途合并使用。

在另一具体实施例中，该治疗有效量的muparfostat系该药物的唯一抗癌剂。

在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者于肝脏切除前具有不超过一个肿瘤。在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者的术后Child-Pugh总评分低于8分。在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者于该肝脏切除前的肝肿瘤大小不超过10公分。在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者于该肝脏切除前根据四级制肿瘤分级系具有一分化良好、中等分化或分化不良肿瘤。在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者具有乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝细胞癌或丙型肝炎病毒(HCV)引起的肝细胞癌。在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者对于乙型肝炎抗病毒药物的治疗无效。在另一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者的身体质量指数(BMI)系介于18.5至35公斤/米平方。

在本发明的一具体实施例中，该用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的药物系排除用于肝脏切除前具有退行性(anaplasia)肝肿瘤的微小血管侵犯型肝细胞癌患者。

在一具体实施例中，该药物的给药方案为每周至少连续四天，每四周中有三周给药。在一具体实施例中，该药物的给药方案为至少52周。在一具体实施例中，该微小血管侵犯型肝细胞癌患者系于肝脏切除后至少5.2周接受该药物。

于另一方面，本发明系关于一种治疗有效量的muparfostat在制备治疗一肝细胞癌(HCC)患者于肝脏切除后的药物的用途，其中该肝细胞癌患者具有以下特征：(a)一微小血管侵犯的征状；及(b)至少一种以下特征：(i)于肝脏切除前具有不超过单一个肿瘤；(ii)术后Child-Pugh总评分低于8分；(iii)于该肝脏切除前的肝肿瘤大小不超过10公分；及(iv)于该肝脏切除前根据四级制肿瘤分级系具有一分化良好、中等分化或分化不良肿瘤。

于另一方面，本发明系关于一种治疗有效量的muparfostat在制备治疗一微小血管侵犯型肝细胞癌(HCC)患者于肝脏切除后的一药物的用途，其中该药物排除用于治疗无血管侵犯型肝细胞癌患者及大血管侵犯型肝细胞癌患者。

于一具体实施例中，该免疫检查点系选自由细胞程序死亡受体1(PD1)、细胞程序死亡配体1(PD-L1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T细胞活化的V域免疫抑制因子(VISTA)、B-和T-淋巴细胞衰减因子(BTLA)、Ig和ITIM域蛋白T-细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体-1(LAIR1)、表面抗原分化簇160(CD160)、2B4、转化生长因子-β受体(TGFR beta)、癌症胚胎抗原细胞附着分子1(CEACAM-1)、癌症胚胎抗原细胞附着分子3(CEACAM-3)及癌症胚胎抗原细胞附着分子5(CEACAM-5)所组成的群。该免疫检查点抑制剂系选自由派姆单抗(Pembrolizumab)、纳武单抗(Nivolumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿维鲁单抗(Avelumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)及伊匹单抗(Ipilimumab)所组成的群。

前面的概述，以及本发明以下的详细描述，在结合图式一起阅读时将可以被更好地理解。为了说明本发明，所附图式示出一些，但不是所有的，可替代的具体实施例。然而，应该理解的是，本发明并不限于所示的精确安排和手段。这些图式，其被并入并构成说明书的一部分，有助于解释本发明的原理。

附图说明

图1为临床试验设计流程图。

图2A及B为意向分析中以Kaplan–Meier评估的无疾病存活曲线图，其中(图2A)为依据独立中央影像判读的评估结果，(图2B)为依据各试验地点的在地影像判读的评估结果。

图3A至D为符合方案分析中依据独立中央影像判读结果以Kaplan–Meier评估的无疾病存活曲线图，其中(图3A)为所有患者，(图3B)为大血管侵犯型患者，(图3C)为微小血管侵犯型患者，(图3D)为无血管侵犯型患者。

图4A至C为符合方案分析中依据独立中央影像判读结果以Kaplan–Meier评估“更合适”病患群体的无疾病存活曲线图，其中(图4A)为微小血管侵犯型患者，(图4B)为无血管侵犯型患者，(图4C)则合并呈现微小血管侵犯型患者及无血管侵犯型患者(即图4A与图4B迭加)。“更合适”病患群体具有以下特征：仅有单一个肿瘤(不超过一个肿瘤)；术后Child-Pugh总评分低于8分；最大肿瘤大小不超过10公分；属分化良好、中等分化或分化不良肿瘤；身体质量指数(BMI)介于18.5至35公斤/米平方；于肝脏切除后至少5.2周接受首次治疗；以及复发发生于首次治疗24周后。

图5显示在持续投予试验药物muparfostat(PI-88)52周后，该药物对于微小血管侵犯型肝细胞癌患者的次族群产生显著的保护效果。

图6(6-1至6-3)为一表格(表1-1至1-3)，显示意向分析中，安慰剂组与muparfostat(PI-88)组在基线人口统计学和临床特征的比较。

图7(7-1至7-3为一表格(表2-1至2-3)，显示符合方案分析中，安慰剂组与muparfostat(PI-88)组在基线人口统计学和临床特征的比较。

图8(同表3)显示在符合方案分析下藉由时间相依共变量拟合Cox模型的多变量分析来验认接受安慰剂或muparfostat(PI-88)病患其无疾病存活期的预测因子。

图9(9-1至9-2)为一表格(表4-1至4-2)，显示根据系统器官分类(SOC)及偏好编码用词，安慰剂组与muparfostat(PI-88)组发生治疗相关不良事件(AEs)的比较。

图10显示在持续投予抗乙型肝炎病毒药物60周后，该药物在无血管侵犯型肝细胞癌患者的次族群产生延迟保护效果。

具体实施方式

定义

在本说明书中所使用的名称，在本发明的背景以及各该名称被使用的特定背景内具有于该领域的通常意义。部份用于描述本发明的名称讨论如后，或如本说明书的其他部份，以提供相关人员对于本发明叙述的额外引导。为了方便起见，部份名称可能被特别标注，例如使用斜体字和/或引号，这些标注方式并不影响该名称的范围或意义。在相同的背景下，一名称不论是否被特别标注，其范围与意义是相同的。同一事物可用不止一种方式被提及，因此，替代语言和同义字可能在此被用于任一或多个名称，且一名称不论是否在此被详尽阐述或讨论，皆不代表赋予其任何特殊的重要性。在此提供一些名称的同义字，列举一或多个同义字不代表排除其他同义字的使用。本说明书中使用的例示，包括此处讨论的任一名称例示都仅是说明性的，并非用以限制本发明或任何例示名称的范围与意义。同样的，本发明不限于说明书中提供的各种具体实施例。

除非另有定义，所有在此使用的技术及科学术语，具有与本发明所属领域的通常知识者一般所理解的意义相同的意义。当有所冲突时，以本文件及其所定义者为准。

于此处所使用者，“约”、“大约”、或“大概”一般应指一特定数值或范围的20％以内，较佳10％以内，及更佳5％以内。在此所使用的数值为近似值，代表若未明示地陈述，“约”、“大约”、或“大概”等词可以被推断适用。

“受试者”一词指一人类或一非人类动物。

“治疗”或“疗法”一词指提供一受试者所需的一有效量的一治疗剂，该受试者患有癌症或感染，或具有一疾病的症状或倾向，并带有治疗、减轻、缓和、去除、改善或预防该疾病、症状或倾向的目的。此一受试者系根据任何适当的诊断方法的结果，透过一健康照护专业人员加以确定。

“有效量”一词指一活性化合物给予接受治疗的受试者一治疗效果所需的量。如本领域技术人员所认可的，有效剂量将依据给药途径、赋型剂使用以及与其他治疗方式共同使用的可能性而异。

名词“基线事件率”与治疗组及安慰剂组主要疗效指标(无疾病存活期)的统计假设有关。

名词“相对危险比”乃指某一事件发生在治疗组与发生在对照组(安慰剂组)的机率比。相对危险比包含两个重要特征：(i)两个“暴露组”间风险的比较，以及(ii)各组有其适当的母群并藉此来确认其为何项“暴露”。

名词“设限”乃一统计名词。设限是指某状态下其量测或观察值只有部分被知悉。这种情况会发生在例如某个个体在指标达到前就退出试验，设限(某状态下量测或观察值只有部分被知悉)的问题与缺失数据(某观察值为未知)的问题具关连性。

“PI-88”与“muparfostat”一词是可以互相替代的。

“OS”一词指整体存活率，即在治疗开始后一特定时间，存活病患的百分比。

“DFS”一词指无疾病存活期，即从治疗开始后一病患不具疾病症象的时间长度，最常作为决定性手术后的辅助治疗的试验指标。虽然整体存活期是大多数辅助治疗的传统指标，但当存活期可能延长，使存活指标不切实际时，DFS可为重要的指标。DFS一直以来是辅助疗法核准上市的主要基础。DFS可作为临床效益的替代指标或可提供临床效益的直接证据，此一判断系根据效果强度、风险-效益关系与疾病设定。

Child–Pugh评分系统又称为Child–Turcotte–Pugh评分系统或Child标准，用以评估慢性肝脏疾病的预后情形，主要用于肝硬化。此一评分系统可用于决定预后、所需的治疗强度以及肝脏移植的必要性。评分系统使用五个肝脏疾病的临床指标，每个指标得分介于1至3分，其中3分表示最严重的病状。

表A

肿瘤分级是根据样本肿瘤与来源组织的相似程度测量细胞退行性(分化的逆转)的评量系统。评分数值(以数字表示：G1至G4)随着细胞分化的缺乏而增加，反映出该肿瘤细胞与其来源正常组织的细胞间的差异程度。依据不同的机构与肿瘤类型，可有四级、三级或二级的分级方式。于本发明中，肝细胞癌病患系透过以下的四级分级方式而被分级：分化良好(G1)、中等分化(G2)、分化不良(G3)以及退行性(G4)肿瘤。

Kaplan-Meier(KM)存活曲线定义为在一特定时间长度下，当考虑许多小的时间间隔时的存活机率。估计Kaplan-Meier(KM)时，每个个体皆需要两部分的数据，一为最后观察时的“状态”(事件/设限)以及“时间”(达到事件或设限的时间)。如要进行比较，则个体分配在哪一“组”也需要知道。个体的“状态”只可以是事件或设限。举整体存活为例，当死亡被定义为“事件”，所有其他非死亡的状态则为“设限”。

在Kaplan-Meier存活曲线中，x-轴是“时间”，由零(当观察起始)到最后观察时点，y-轴则为个体存活的比例。在零时点，个体100％存活而没有事件，每个垂直下降则代表一个事件。于本发明中，主要疗效指标为无疾病存活期，且事件代表肿瘤复发或病患死亡。对于一个组以上的研究来说，两曲线分离程度越大，说明两组间的治疗结果差异越大。

PI-88(muparfostat)为提供肝细胞癌病患在切除手术后的一种新颖辅助治疗药物。在第二期临床试验中，PI-88耐受性佳，于每日160毫克的剂量下安全性良好，且被证实能延长肝脏切除后的肝细胞癌病患的复发时间，尤其在肝炎病毒引起的肝细胞癌病患。因此，第三期的多中心随机对照临床试验(RCT)进一步调查muparfostat(PI-88)作为一类肝素酶抑制剂，其对于乙型肝炎或丙型肝炎引起的肝细胞癌病患于手术切除肝脏后的肿瘤复发或死亡的疗效。

缩写：HCC，肝细胞癌；DFS，无疾病存活期；ITT，意向分析；PP，符合方案分析；AE，不良事件；HBV，乙型肝炎病毒；HCV，丙型肝炎病毒；RCT，随机对照试验；HIT，肝素引起的血小板低下；OS，整体存活；SD，标准偏差；HR，风险比；SAE，严重不良事件；ICI，免疫检查点抑制剂。

以下根据本发明实施例所提出的例示性器具、装置、方法及其相关结果并非意图用以限制本发明的范围。应注意名称或副标题可能使用于范例中以方便阅读，不应被认为其限制了本发明的范围。此外，一些理论在此被提出，然而不论其是否正确，只要本发明在不考虑任何特定理论或行动计划下被实施，该等理论皆不应限制本发明的范围。

材料与方法

制备PI-88(muparfostat)及包含其中的硫化磷酸甘露聚糖成份的方法已被美国专利公开号20140135282以及P.N.Handley等人所揭示(2017年)。P.N.Handley等人发表于糖类研究446-447第68至75页的“对酵母菌Pichia(Hansenula)holstii NRRL Y2448磷酸甘露聚糖的寡糖磷酸盐级分的新结构洞悉”一文中，揭示了PI-88的硫化磷酸甘露聚糖成份的以下化学结构通式：

试验设计及参与者

此第三期跨国(台湾、韩国、中国及香港)、多中心、双盲、安慰剂控制的PI-88作为肝炎病毒引起的肝细胞癌于手术切除肝脏后的辅助治疗随机对照试验系于2011年九月开始执行，试验于ClinicalTrials.gov登记(代号NCT01402908)。试验设计招募约500名参与者，以观察218件肿瘤复发或任何原因引起的肝细胞癌相关死亡事件。无疾病存活期的中位数在安慰剂组与PI-88组的假定值分别为12个月及18个月。接受安慰剂或PI-88组的基线事件率分别为0.693和0.462。相对危险比是0.667而设限比是60％，并有85％的检力与0.05的型一错误。

在131名病患产生肿瘤复发或因任何原因死亡后进行了期中分析。在期中分析中采用了具有Lan-DeMets alpha-消费函数的群组顺序设计，为了评估PI-88对主要指标的影响，期中分析双侧alpha水平设定为0.01806，而最终分析设定为0.04148。

所有病患都提供了书面、已签署并有日期的受试者同意书以参与此试验。参与单位的人体试验委员会在随机对照试验开始前通过试验计划书及相关修订。受试者纳入条件如下：(1)经组织学检查证实为肝细胞癌病患，并曾在随机分派前4至6周内接受过根治性切除手术(根治性切除手术定义为术后组织学具有明确的肿瘤边缘(大于或等于0.1公分)，而且经胸部、腹部计算机断层扫描和腹部核磁共振扫描的追踪结果确认未见肿瘤；证明有淋巴结转移残留的病患不应该参加；(2)乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染者；(3)年龄在18岁以上；(4)ECOG(东部肿瘤协作组)指数在0至1；(5)Child Pugh分级在8以下；及(6)适当的骨髓及肝功能。受试者排除条件如下：(1)最近肝肿瘤切除的病理确认为单一肿瘤且直径小于2公分；(2)有免疫性血小板减少症、其他血小板异常、其他遗传性或后天凝血疾病的病史，或实验室检查结果显示有抗肝素抗体，或之前任何抗肝素抗体检查结果为阳性；(3)有任何肝细胞癌转移、曾经或同时罹患其他恶性疾病的证据；(4)具临床意义的非恶性疾病；(5)过去的肝细胞癌治疗史包括：随机分派前曾接受过化学疗法、放射线疗法、分子标靶药物(例如抗血管新生抗体或激酶抑制剂)、疫苗、肝动脉栓塞治疗(TAE)、肝动脉栓塞化学治疗(TACE)、肝脏移植，或最近一次肝脏切除前的切除手术；及(6)曾有发炎性肠病、任何异常出血倾向、或因开放伤口或已安排接受手术并有出血性危险者。

随机分派

签署受试者同意书后，根据招募标准确认病患的就医纪录及目前病况以查核每位病患的资格。符合条件的病患依据肿瘤大小(小于5公分对5公分以上)及血管侵犯(无对有)与否进行分层，然后透过中央互动网络回复系统以1:1的比率随机分派至接受PI-88(160毫克/天)或安慰剂(Cenduit交互式响应技术；Cenduit，达勒姆，北卡罗来纳，美国)。

研究材料

PI-88以无菌冻干粉末的形式填装于玻璃瓶中(Par制药，罗切斯特，密歇根，美国)并提供给药品部门，再配制后为160毫克。安慰剂以无菌冻干粉末的形式填装于玻璃瓶中，该玻璃瓶的规格与外观与试验药物使用者完全相同，安慰剂的主要成份为无菌冻干粉末的乳糖。PI-88与安慰剂的粉末及溶液的外观完全相同，以确保治疗的盲性。

流程

PI-88或安慰剂系以单一皮下注射每周连续四天每天给予，每四周中有三周给药(四周为一个周期)，每一治疗周的注射日相同。受试者接受1至8天的初期训练后自行于家中施打药物。受试者接受至多52周的治疗，并后续追踪至96周。

若病患的血小板数量低于每公升50×109(即小于50,000/立方毫米)，或于第一次访视时有疑似或不明原因的下降致低于基础值50％，立即中止用药，且立即将最近一次取得的血液样本送至中央检验室进行抗肝素抗体的检测。若抗肝素抗体的检测结果呈阳性，则受试者将被要求永久中止治疗。当抗肝素抗体检测结果显示有高度可能性发生肝素引起的血小板低下(HIT)时，负责医师会接到警示。临床试验第一次访视代表治疗开始，而在治疗开始前的第一次访视所搜集的数据代表基础值数据。

结果评估

此随机对照试验的主要疗效指标为无疾病存活期，定义为从随机分派至肿瘤复发或任何原因的死亡的期间。次要疗效指标为肿瘤复发时间、肿瘤复发率以及整体存活(OS)。肿瘤复发的诊断是根据每三个月进行的计算机断层扫描监测的放射学算法，该放射学算法着重显示计算机断层扫描或磁振造影扫描呈现的“典型血管形态”，此形态由动脉期高血管性及早期或晚期的门脉/静脉期“快速洗脱(washout)”组成，且可透过三相界面螺旋计算机断层扫描或钆增强磁振造影扫描进行确认。计算机断层/磁振造影扫描系以中央机构根据放射学算法进行独立评估以判断肿瘤的复发，若于诊断演算过程的任何时点有难以确定的发现，则进行肝脏切片以确认肿瘤是否复发。

中央及在地医学影像评估

所有计算机断层扫描及相关影像被传送至一独立中央计算机断层判读服务机构进行回溯性评估与中央检阅，此外亦同时于试验地点进行判读。无疾病存活期系根据中央及在地影像判读数据进行计算，以中央判读结果为主要判定结果，在地判读结果则供确认之用。

统计分析

数据是使用R 3.3.2软件来分析(R统计计算基金会，维也纳，奥地利)。连续变量的分布特征以平均值±标准偏差来表示，类别变量以频率和百分比(％)来表示，以Kaplan-Meier方法来估计无疾病存活期的存活曲线。比较PI-88组和安慰剂组在基线的人口统计学和临床特征。PI-88及安慰剂的安全性数据在所有随机分派且至少接受过一剂指定药物的病患中被检视。疗效分析依主要指标(无疾病存活期)与次要指标(复发时间与整体存活)而执行，意向分析及符合方案分析两者皆执行。

A.意向分析

根据肿瘤大小(小于5公分对5公分以上)和血管侵犯(无对有)分层的双样本对数秩检验来比较PI-88组和安慰剂组间无疾病存活期的存活曲线。验证PI-88组与安慰剂组间所需的比例风险假设。

B.符合方案(PP)分析

经随机分派的病患中，依方案接受至少80％所需给药方案，且治疗后12周内未复发或死亡、未违反任何进入研究的资格标准、未接受任何排除的并用治疗且在试验期间未解盲者纳入符合方案分析。由于在试验期间病患使用抗乙型肝炎病毒药物、抗丙型肝炎病毒药物与PI-88的状况可能会随时间改变，因此回归分析使用时间相依共变量拟合Cox比例风险模型(称之为“Cox’s模型”)来估计PI-88、抗乙型肝炎病毒药物、抗丙型肝炎病毒药物和其他预测因子对于无疾病存活期的调整效果。

定义了以下两种类型的四个时间相依共变量，用于拟合Cox的无疾病存活(DFS)模型：(1)自随机分派后用药第一天至每一DFS独特事件时间的累积用药天数，但不考虑在“潜伏期”或“培养期”(预先设定的每一DFS特殊事件时间前28天的延迟时间)内的药物使用。此类药物包括：(a)七种抗乙型肝炎病毒(HBV)药物的任一种(阿德福韦(adefovir)、阿德福韦酯(adefovirdipivoxil)、恩替卡韦(entecavir)、拉米夫定(lamivudine)、替比夫定(telbivudine)、泰诺福韦(tenofovir)及替诺福韦(tenofovirdisoproxil fumarate))；(b)五种抗丙型肝炎病毒(HCV)药物的任一种(利巴韦林(ribavirin)、派罗欣聚乙二醇干扰素(peginterferon)、派罗欣聚乙二醇干扰素α-2A(peginterferon alfa-2A)、派罗欣聚乙二醇干扰素α-2B(peginterferon alfa-2B)及聚乙二醇干扰素α-2A(pegylatedinterferon alfa-2A))；及(c)PI-88。(2)从PI-88使用的最后一天开始累计到每一DFS独特事件的时间所经过的天数来验证PI-88的“迟发效应”或“延迟效应”。技术上，使用“计数处理方式输入”将原始宽版PP数据重建为DFS的长版PP数据。在每个DFS的有序事件时间，我们计算了长版PP数据中所有处于风险中的患者的上述四个时间相依共变量的值。然后，我们将所有由长版PP数据所衍生的相关固定的及时间相依的共变量来拟合Cox的DFS模型。

为确保分析结果有令人满意的质量，我们在回归分析中使用了(1)变项选择，(2)适配性(GOF)评估和(3)回归诊断和补救的模型拟合技术。应用逐步变量选择程序(前向和后向步骤的迭代)来获得最终Cox模型的最适候选。所有单变项显著和不显著但相关的共变项(表2)及其一些交互项被添加到变项表中以供选择。进入的显著标准(SLE)和留存的显著标准(SLS)保守地设定在0.15。然后，借助实质性知识，最终候选最适Cox模型是通过一次一个地丢弃具有大于0.05的p值的共变量手动来确定，直到所有回归系数显著不同于0为止。单变量分析与多变量分析结果间的任何差异，很可能是由于单变量分析中未被控制变项的混杂效应或多变量分析中中间变项的掩蔽效应。

检查适配性、协和值、和调整后一般化的R2来评估拟合Cox模型的适配性。Cox模型的协和值(介于0到1之间的值)等同于逻辑回归模型的c统计量；因此，其值大于或等于0.7表明为可接受的判别力值。然而，由Nagelkerke(1991)提出的调整后一般化的R2(0≤R2≤1)值对Cox模型而言通常较低；根据我们的经验，调整后一般化的R2大于或等于0.15表明为Cox模型的适配性。

简单和多元泛加成模型(GAMs)用来拟合绘制GAM图，检测连续共变量的非线性效应，然后在逐步变量选择过程中确定用于离散连续共变量的适当切点(如有必要)。在计算上，VGAM套装的vgam函数(带有平滑参数的默认值)可以用来拟合R中GAM的连续、二元、和计数效应。由于GAM最初是为平滑连续共变量的一般化线性效应而开发的模型(GLMs)，我们将DFS的二元效应(即1＝复发或死亡对0＝设限)的GAM与长版PP数据拟合，并使用绘图函数绘制连续共变量的平滑效应(称为“GAM图”)进行视觉检查。此外，我们在存活套装的coxph函数内指定了平滑选项pspline(使用p-spline基础的平滑线)，来平滑连续共变量对简单和多个Cox模型DFS的影响，并使用termplot函数来绘制R中的连续共变量的平滑效应(称为“p-spline曲线”)进行视觉检查(Moore,2016,pp.84-85)。具体而言，我们分别在三个次族群患者中进行GAM和p-spline平滑分析，即(1)大血管侵犯型患者、(2)微小血管侵犯型患者、(3)无血管侵犯型患者，检测在这些次族群中连续共变量(例如，最大肿瘤的大小)的异质非线性效应。最后，应用残差分析回归诊断，影响案例检测和多重共线性评估的统计工具来发现任何模型或数据问题。在连续共变量方差膨胀因子(VIF)值大于或等于10或在类别共变量VIF值大于或等于2.5表明拟合Cox模型中一些共变量间存在多重共线性问题。

抗乙型肝炎病毒药物系选自由阿德福韦(Adefovir)、阿德福韦酯(Adefovirdipivoxil)、恩替卡韦(Entecavir)、拉米夫定(Lamivudine)、替比夫定(Telbivudine)、泰诺福韦(Tenofovir)及替诺福韦(Tenofovirdisoproxil fumarate)所组成的群。

抗丙型肝炎病毒药物系选自由利巴韦林(Ribavirin)、派罗欣聚乙二醇干扰素(Peginterferon)、派罗欣聚乙二醇干扰素α-2A(Peginterferon alfa-2A)、派罗欣聚乙二醇干扰素α-2B(Peginterferon alfa-2B)及聚乙二醇干扰素α-2A(Pegylated interferonalfa-2A)、帕利瑞韦(Paritaprevir)、西米普韦(Simepravir)、格佐普韦(Grazoprevir)、Ladispavir、奥比他韦(Ombitasvir)、Elbasavir、索非布韦(Sofosbuvir)、来迪派韦(Edipasvir)、Viekira Pak、利托那韦(Ritonavir)及达卡他韦(Daclatasvir)所组成的群。

结果

筛选727位肝炎病毒引起的术后肝细胞癌病患，其中520位接受随机分派。此一多国第三期随机对照试验由来自台湾、南韩、香港及中国的肝细胞癌专业内、外科医师共138位研究主持人共同执行。此随机对照试验因2014年7月27日排定的期中分析达到负面停止界线而于2015年1月提前中止，然而，所有PI-88组或安慰剂组的受试病患于当时已接受最多12个月的治疗，因此，供安全性评估及意向疗效分析的病患人数仍然分别达到原订目标的518及519人(图1)。

疗效分析

A.意向分析

共159件经中央影像判读确认的事件用于进行意向分析疗效评估，其中分别有85件属PI-88组，74件属安慰剂组。如表1(图6-1至图6-3)所列，意向分析(n＝519)中治疗组与安慰剂组间的基线人口统计学和临床特征已经过平衡。PI-88组与安慰剂组间的无疾病存活期生存曲线经比较后无统计上的显著性(p值等于0.12)。Cox对ITT事件评估的比例风险分析结果显示，PI-88与安慰剂组之间的DFS期没有显著差异(估计风险比[HR]：1.26，95％信赖区间[CI]：0.92-1.72，图2A)。基于各研究中心的影像评估有类似的Kaplan-Meier DFS曲线，显示在图2B。

在此试验中，复发时间与无疾病存活期相同，因为没有病患在无先前肿瘤复发的情况下死亡。考虑整体存活期，七个死亡案例被报导，包括PI-88组三个及安慰剂组四个。整体存活期中位数在两治疗组中揭未达到，未观察到PI-88对于整体存活期之显著治疗效果。

B.符合方案分析

共有426名患者有资格进行PP分析。表2(图7-1至图7-3)中列出的治疗组的单变量分析结果证实了接受安慰剂(n＝229，53.76％)和接受PI-88(n＝197，46.24％)的患者之间基线人口统计学和临床特征在PP数据(n＝426)中的可比性。两组的Kaplan-Meier存活曲线估计绘制如图3A。血管侵犯次族群的单变量分析结果显示，大血管侵犯型患者(n＝26,6.10％)、微小血管侵犯型患者(n＝175,41.08％)和无血管侵犯型患者(n＝225,52.82％)在许多基线人口统计学和临床特征方面，其在PP数据(n＝426)中具不可比较性。

如表3(图8)所示，通过拟合Cox's DFS的模型进行多变量分析，其中调整人口学特征、临床HCC特征、时变抗HBV药物使用、时变抗HCV药物使用、和时变PI-88等的效应，在DFS上进行了仔细检查。调整拟合的Cox's DFS模型中其他共变量的效应后，在微小血管侵犯次族群接受PI-88的最后一个周期结束后累计时间大于16周的患者，其复发或死亡风险比接受安慰剂的患者降低87.22％(HR＝0.1278，95％信赖区间：0.0168-0.9727，p值等于0.0470)。

图4A描绘了肿瘤复发或死亡时间大于24周的微小血管侵犯型病患经过肿瘤数目、病理分化、Child–Pugh分数、大血管侵犯、肿瘤大小、及随机分派后使用抗HBV或抗HCV药物调整后的DFS曲线。状态事件定义为肿瘤复发或任何原因导致的死亡；时间的定义为从随机分派到试验期间肿瘤复发或任何原因导致的死亡，以周为单位；组别为PI-88组或安慰剂组。一年的治疗完成后，PI-88发挥了抗肿瘤复发的显著保护效果(HR等于0.2068，p值等于0.0404)。图4B显示无血管侵犯型病患接受PI-88治疗的类似Kaplan–Meier曲线。在图4C中，将图4A及图4B在相同的X轴与Y轴尺度上重迭以便于比较。

图5显示在试验药物使用52周后，muparfostat(PI-88)在微小血管侵犯型病患的次族群中具有强大的保护效果。X轴的单位为时间(周)，X轴上的数字代表“从微小血管侵犯型病患接受muparfostat的最后一个周期结束后的累积时间(周)”。Y轴上的P为肿瘤复发或死亡的概率，而Logit(P)等于log[P/(1-P)]。观测次数为16536次，是采用计数处理方式从原始PP数据中重建。对微小血管侵犯型病患而言，在接受muparfostat治疗的最后一个周期结束16.461周后，肿瘤复发或死亡的概率低于未有肿瘤复发或死亡的概率，换言之，肿瘤复发或死亡的概率对未有肿瘤复发或死亡的概率其比例随时间而下降(自muparfostat治疗的最后一个周期结束起的累积周数)。

安全性数据

共计518位病患接受至少一剂PI-88(n＝258)或安慰剂(n＝260)治疗，在试验结束时，346位病患完成最后一周期的治疗(即周期13)。安慰剂组(187/260，71.9％)较PI-88组(159/258，61.6％)有较多的病患完成13个周期的研究治疗，安慰剂组的平均治疗期间(42.16周)显著高于PI-88组(38.57周，p值等于0.0210)。治疗顺服性(大于等于80％)在安慰剂组为96.2％(250/260)，在PI-88组为88.8％(229/258)。

如表4(图9-1至图9-2)，PI-88组中152位(占58.9％)病患及安慰剂组中51位(占19.6％)病患通报至少一项不良事件(AE)，其被认定为与研究治疗相关。根据系统器官分类，发生率最高的治疗相关不良事件大部份系有关于一般不适及投药部位状况(PI-88：31.4％，安慰剂：4.6％)，且皆属于轻度或中度严重性。整体发生率最高的治疗相关不良事件为落发，被通报发生于52位PI-88组病患(占22.5％)及4位安慰剂组病患(占1.5％)，其次为小血板数下降，被通报发生于36位PI-88组病患(占14.0％)及10位安慰剂组病患(占3.8％)，以及注射部位血肿，被通报发生于33位PI-88组病患(占12.8％)及7位安慰剂组病患(占2.7％)。

于研究治疗期间，两研究组别皆无病患发生致命的不良事件，然而有七位病患于追踪访视期间死亡，其中三位病患为PI-88治疗组，四位病患为安慰剂组。七位病患的死亡原因经确认与肿瘤复发有关而非研究治疗。

计30位(占11.6％)病患通报了34件治疗突发严重不良事件(SAEs)，但仅有两件可能与药物有关。其中15位(占5.8％)发生治疗紧急严重不良事件的病患来自安慰剂组，且与较早的试验相比，本次研究未有新观察到的安全性讯号被提出。PI-88治疗组有两位病患发生治疗相关的严重不良事件，一位病患有第三级急性心肌梗塞，另一位有第三级构音不良，两者皆被认为可能与研究药物有关。

接受PI-88治疗的病患(13/258，5.0％)与安慰剂治疗病患(7/260，2.7％)相较有较高比例发生第三级或第四级不良反应，例如血小板数量下降。有五例肝素引起的血小板低下的临床疑似案例，仅有一例被认为类似肝素引起的血小板低下，但未最后确诊。

总结来说，此试验研究了PI-88作为肝细胞癌治疗性切除后的辅助治疗的临床疗效，且评估此一治疗方法是否能够降低术后肿瘤复发。意向分析相关的Kaplan–Meier分析结果显示安慰剂组与PI-88组间的无疾病存活期不论在独立(中央)或非独立(在地)评估中，皆无显著差异。本研究未能达到疗效指标可能归因于以下原因。首先，相关假设是由先前第二期肝细胞癌试验得来，由于样本数少，其仅提供了有限的病患筛选及临床疗效线索。在此情况下，许多临床负面因素，例如大血管侵犯、高肿瘤负荷(例如复数肿瘤、肿瘤大小超过10公分，以及退行性肿瘤分化)未能于试验中被排除或控制。因此，试验中招募的非特定病患严重稀释了PI-88对研究族群的潜在有益效果。其次，肝细胞癌微环境的复杂性，包括癌细胞分化、不同疾病期别以及各种异质性的肝细胞癌化，可能在研究族群中造成不同效果。第三，伴随使用抗病毒核苷类似物可能掩盖了PI-88的疗效。

当研究药物使用52周时，PI-88在微小血管侵犯型病患的次族群中具有强大的保护效果(图5)。此一发现意味着PI-88透过调控肿瘤微环境至一稳定状态而提供临床效益，且若药物使用一段长时间，肝内肿瘤复发能够被显著降低。

作为肝细胞癌于手术切除后的标准治疗，可检测到HBV病毒量的病患在本研究中被鼓励使用抗HBV药物。图10显示在药物服用60周后，抗HBV药物在无血管侵犯型患病的次族群中具延迟保护效果。X轴的单位为时间(周)，X轴上的数字代表“随机分派后到每个事件发生前所使用抗-HBV药物治疗累积的周数减去28天”，其被定义为自随机分派后第一天起到DFS的每个独特事件时间，服药所累积的天数，但忽略预先指定的28天药物使用滞后时间，作为每个DFS独特事件时间之前抗HBV药物的“迟发期”或“育成期”。至于Y轴，P为肿瘤复发或死亡的概率，并且Logit(P)等于log[P/(1-P)]。观测次数为16536次，是采用计数处理方式从原始PP数据中重建。

对于无血管侵犯型患者，随机分派后到每个事件发生前所使用抗-HBV药物治疗累积的周数减去28天，在61.22周后，其肿瘤复发或死亡的概率低于未有肿瘤复发或死亡的概率。换言之，肿瘤复发或死亡的概率对未有肿瘤复发或死亡的概率其比例随时间而下降(随机分派后到每个事件发生前抗HBV药物治疗累积的周数减去28天)

如表3(图8)所示，抗HBV药物在长时间使用下(例如超过60周)具有抑制肿瘤复发的保护效果；然而，抗HBV药物主要在无血管侵犯型病患中发挥效果。研究显示抗HBV治疗，特别是核苷类似物，能够降低HBV引起的肝细胞癌病患于根治性治疗后肿瘤复发的风险。不过此研究结果显示这样的保护效果仅作用于无血管侵犯的特定病患次族群中，且抗HBV药物的保护力低于PI-88的保护力。

在本发明中，使用具有时间相依共变量(即Cox模型)的Cox比例风险模型来进一步研究治疗对于微小血管侵犯型患者的影响，结果显示PI-88在治疗过程的晚期开始发挥保护效果。图4A描绘了在接受治疗超过52周的微小血管侵犯型病患次族群中，PI-88具有正面保护效果(HR等于0.2068)。根据图3C至D及图4B，PI-88组在75周后几乎没有复发个案，此结果强烈证实了PI-88具有已知类肝素酶抑制剂及抗血管新生效果以外的，未确定的生化或免疫作用模式。PI-88在肿瘤微环境中发挥不可预期的调控效果，可能在多种癌症治疗上与免疫检查点抑制剂(ICI)协同扮演增强效果的角色。因此，PI-88与免疫检查点抑制剂(ICI)的合并疗法可能在癌症治疗方面具有相当潜力。

在本试验中，多数(超过37％)肿瘤复发系发生于手术后6个月内，24周内的早期复发可能肇因于手术切除后的残余微转移或卫星式转移，若早期复发与其他控制共变量被刻意地从分析中排除，其余病患的Kaplan–Meier存活曲线将变得更有利于PI-88组(图4A)。PI-88的作用机制为一细胞抑制剂而非细胞毒性剂，因此对于那些本已存在于肝脏内的小癌细胞病灶，若其在手术后残留于肝组织内，且无法透过影像发现或以生化检验侦测到，期待PI-88能够一致地消灭它们并不合理。这些微小的肝细胞癌残余可能在手术后快速转变为继发性成长的病灶，因为局部肝脏切除手术本身即可能在加速肝细胞癌的癌化过程中扮演重要角色。无法在术后抑制肝脏内残留的癌症病灶生长可能是PI-88无法在此研究中证实对DFS具有效益的原因之一。然而，令人鼓舞的是在本试验中发现整体1年、2年及3年无疾病存活率分别为73％、66％与58％，与至目前为止多数其它肝细胞癌的统合分析所报导的存活结果具有可比较性。

在本发明中，大部份复发系发生于手术后早期，由于这样的结果对于DFS分析具有重大影响，其对于任何欲证实一辅助治疗对于肝细胞癌病患术后疗效的临床研究，明显地制造了一个具有风险的困难。虽然带有根治性目的的HCC手术目标在于完全清除肝脏内的所有癌症病灶，但仅能够切除技术上及放射学上能够被侦测到、且技术上适合的癌症病灶，看不见或侦测不到的癌细胞微群聚则可能已经散布到接受切除的主要肿瘤以外。

本发明的主要发现如下，第一，微环境调控剂，如PI-88，可能仅对于极小的术后残余肿瘤有作用，因此审慎的病患筛选以更好地符合此标准是关键的。第二，可能有必要对复发作更加精准的分类，以便区分根治性手术后由残余癌细胞病灶而来的继发性复发，以及手术时尚未存在但由原发性肿瘤的其他位置独立产生的复发(新生)。第三，由于早期复发可能与手术结果较有关连，而非药物效果本身，因此必须有合理的计划来排除术后早期复发的案例(例如6个月内的复发)。

总结上述，虽然无疾病存活期在全体PI-88治疗组中并未改善，但PI-88能够显著延长切除样本的组织学具微小血管侵犯的病患次族群(占治疗族群约40％)的无疾病存活期。在此病患次族群中，若使用PI-88一长时期(例如大于52周)，则对肿瘤复发的保护效果将变得显著。另一方面，切除样本的组织学不具血管侵犯的病患次族群(占治疗族群超过50％)，其无疾病存活期在投予抗HBV药物一段时间(例如大于60周)后可被延长。然而，对于切除样本的组织学具大血管侵犯的病患次族群(占治疗族群不到10％)而言，PI-88或抗HBV药物皆不能显著延长其无疾病存活期。综上所述，本发明显示了确认肝细胞癌病患的血管侵犯类型不仅在预后判断方面具有意义，对于如何选择有效的药物以延长病患于肝脏切除后的预期寿命亦至关重要。

此外，随着近期对于在肿瘤微环境调控上扮演角色的类肝素酶及其他生长因子的知识增加，本发明亦指出PI-88在未来的肝细胞癌试验中作为单一疗法或与其他抗癌药物合并使用的潜力。

本发明前述实施例的描述仅为呈现与说明的目的，而非意图穷尽或限制本发明于所揭露的特定态样。按照上述教示所为的修改或变化都是可能的。

实施例的替代方案在不脱本发明的精神与范围下，对于所属领域的技术人员而言是明确的。因此，本发明的范围系由所附申请专利范围而定义，而非前述说明与实施例。部份参考文献，可能包括专利、专利申请与各种公开文献，于本发明中被引述与讨论。所有于本说明书中被引述与讨论的参考文献全体皆引用作为本说明书的揭示内容，如同其被单独地引用时具有相同程度的完整性。

Claims (15)

1.一种治疗有效量的muparfostat在制备供一肝脏切除后的一微小血管侵犯型肝细胞癌(HCC)患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其系与一治疗有效量的一免疫检查点抑制剂在制备供一微小血管侵犯型肝细胞癌患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途合并使用。

3.如权利要求1所述的用途，其系与一治疗有效量的一附加抗癌剂在制备供一微小血管侵犯型肝细胞癌患者用于减低肝内肿瘤复发及延长无疾病存活期的一药物的用途合并使用。

4.如权利要求1所述的用途，其中该治疗有效量的muparfostat系该药物的唯一抗癌剂。

5.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者于该肝脏切除前具有不超过一个肿瘤。

6.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者的术后Child-Pugh总评分低于8分。

7.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者于该肝脏切除前的肝肿瘤大小不超过10公分。

8.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者于该肝脏切除前根据四级制肿瘤分级系具有一分化良好、中等分化或分化不良肿瘤。

9.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者具有乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝细胞癌或丙型肝炎病毒(HCV)引起的肝细胞癌。

10.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者对于抗乙型肝炎病毒药物的治疗无效。

11.如权利要求1所述的用途，其中该药物的给药方案为每周至少连续四天，每四周中有三周给药。

12.如权利要求1所述的用途，其中该药物的给药方案为至少52周。

13.如权利要求1所述的用途，其中该微小血管侵犯型肝细胞癌患者系于该肝脏切除后至少5.2周接受该药物。

14.一种治疗有效量的muparfostat在制备治疗一肝细胞癌患者于肝脏切除后的药物的用途，其中该肝细胞癌(HCC)患者具有以下特征：

(a)一微小血管侵犯的征状；及

(b)至少一种以下特征：

(i)于肝脏切除前具有不超过单一个肿瘤；

(ii)术后Child-Pugh总评分低于8分；

(iii)于该肝脏切除前的肝肿瘤大小不超过10公分；及

(iv)于该肝脏切除前根据四级制肿瘤分级系具有一分化良好、中等分化或分化不良肿瘤。

15.一种治疗有效量的muparfostat在制备治疗一微小血管侵犯型肝细胞癌(HCC)患者于肝脏切除后的一药物的用途，其中该药物排除用于治疗无血管侵犯型肝细胞癌患者及大血管侵犯型肝细胞癌患者。