具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。仅此声明,本发明在文中出现或即将出现的上、下、左、右、前、后、内、外等方位用词,仅以本发明的附图为基准,其并不是对本发明的具体限定。
本发明基于图像分析,以显色反应的检测技术为基础。因此,本发明所检测的无机氮的范围限于那些可使用显色反应进行检测的无机氮。
图1是基于图像分析的无机氮检测方法的总体流程图,包括:
S101、采用定性检测方法对白瓷板中的待测溶液进行显色处理以生成待测反应液,采用定性检测方法对白瓷板中的标准溶液进行显色处理以生成标准反应液。
显色处理是在无机氮待测浓度溶液及无机氮标准浓度溶液中加入显色剂,使得无机氮与显色剂反应生成显色的化合物,显色化合物的浓度与无机氮浓度成正比,而显色化合物的浓度反映在显色后反应液的颜色深浅上。因此,通过对显色处理后的反应液进行图像分析以检测待测无机氮溶液的浓度。
对不同的无机氮进行显色处理时需要配备不同的显色剂。在对某些无机氮,在进行显色处理时的同时需要加入掩蔽剂,排除某些化学成分,如金属离子的干扰,保证显色处理结果的准确性。以下列举了三种无机氮的显色处理方法:
氨氮显色处理方法:白色瓷板凹孔中分别加入50—250μL待测样品和氨氮标准溶液,然后向每个孔中加入0—50μL金属离子掩蔽剂和1—50μL氨氮显色剂,混匀后静置1—10分钟,在10—20分钟内观察或拍照。
硝酸盐氮显色处理方法:白色瓷板凹孔中分别加入1—50μL待测样品和硝酸盐氮标准溶液,然后向每个孔中加入1—50μL亚硝酸盐掩蔽剂,放置1—2分钟,再加入100—250μL硝酸盐氮显色剂,混匀后静置1—10分钟,在10—20分钟内观察或拍照。
亚硝酸盐氮显色处理方法:白色瓷板凹孔中分别加入50—200μL待测样品和亚硝酸盐氮标准溶液,然后向每个孔中加入50—150μL亚硝酸盐氮显色剂,混匀后静置1—5分钟,在10—20分钟内观察或拍照。
需要说明的是,上述标准溶液、显色剂及掩蔽剂的配方如下:
氨氮标准溶液:称取3.8190g氯化铵(优级纯,105℃干燥2h)溶于纯水,移入1000mL容量瓶,配制成CNH3-N=1000mg/L的标准储备液,使用前用水稀释0—100mg/L浓度梯度标准溶液。
硝酸盐氮标准溶液:称取7.218g经105℃-110℃干燥2h的硝酸钾溶于水,移入1000mL容量瓶,稀释至标线,配制成CNO3-N=1000mg/L的标准储备液,使用前用水稀释0—30mg/L浓度梯度标准溶液。
亚硝酸盐氮标准溶液:称取0.4926g 110℃-120℃干燥恒重的亚硝酸钠,溶于水,并定容1000mL,配制成CNO2-N=100mg/L的标准储备液,使用前用水稀释0—12mg/L浓度梯度标准溶液。
氨氮显色剂:7g碘化钾和10g碘化汞,溶于水中,然后再缓慢加入到50mL8mol/L的氧化钠溶液中,并纯水定容至100ml,避光保存。
金属离子掩蔽剂:50g酒石酸钾钠溶于100mL水中,加热沸煮去除氨,冷却后补水至100mL。
硝酸盐氮显色剂:0.5g二苯胺溶于100ml浓硫酸中,避光保存。
亚硝酸盐氮显色剂:4g对氨基苯磺酰胺和0.2g盐酸萘乙二胺溶于60mL2.5mol/L的磷酸溶液中,并定容100ml,避光保存。
亚硝酸盐掩蔽剂:0.17g氨基磺酸,加2mL水溶解,再加入10mL浓硫酸,使用前摇匀。
需要说明的是,常规二苯胺法检测硝酸盐需要在进行显色反应前,在样品中加入溶于水的氨基磺酸溶液去除亚硝酸盐干扰,再取去除亚硝酸盐干扰测样品至白瓷板,加入二苯胺试剂。这增加了对样品进行预处理的步骤。如果直接将预处理整合到检测的部分,即用常规的氨基磺酸水溶液在白瓷板上去除亚硝酸盐,会导致水分过多,使得显色较淡,并且色素容易沉淀导致结果不稳定。这里改用氨基磺酸的浓硫酸悬浊液可以达到去除亚硝酸盐,又不影响显色的作用。
S102、获取待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡图像及空白区域图像。
待测反应液图像及标准反应液图像均用于通过检测应液颜色的深浅,从而检测生成待测反应液的待测溶液的浓度。校正色卡图像及空白区域图像均用于对待测反应液图像及标准反应液图像进行校正处理,只是校正处理的内容不同。需要说明的是,空白区域是指白瓷板上除了凹孔以外的其他区域,对每个凹孔来说,其对应的空白区域就是其周边区域。如图2所示,对于凹孔A来说,其对应的空白区域就是区域B。
S103、读取待测反应液图像的RGB通道平均光密度数据以生成待测液RGB平均光密度数据,读取标准反应液图像的RGB通道平均光密度数据以生成标准液RGB平均光密度数据,读取校正色卡图像的RGB通道平均光密度数据以生成色卡RGB平均光密度数据,读取空白区域图像的RGB通道平均光密度数据以生成白区RGB平均光密度数据。
在读取上述图像的RGB三通道的平均光密度数据时,具体可以使用ImageJ软件来进行读取操作。
S104、根据色卡RGB平均光密度数据及白区RGB平均光密度数据,对待测液RGB平均光密度数据及标准液RGB平均光密度数据分别进行校正操作,以生成校正待测液RGB平均光密度数据及校正标准液RGB平均光密度数据。
移动电话、数码相机等图像采集设备采集的图像往往会根据内部拍照算法对原图像进行自动处理,如按照外部光线对图像进行补偿处理,使得采集图像的颜色与实际颜色有偏差。另外,现场快速检测的外部环境复杂,得到的也不是统一明暗背景的图像。因此,需要对对待测液RGB平均光密度数据及标准液RGB平均光密度数据分别进行校正处理,减少图像采集设备、外部环境对待测液RGB平均光密度数据及标准液RGB平均光密度数据的误差。
S105、从RGB三通道中选择一个或多个取样通道,根据取样通道、标准溶液浓度及校正标准液RGB平均光密度数据建立浓度函数,将校正待测液RGB平均光密度数据代入浓度函数计算待测溶液的浓度。
需要说明的是,浓度函数是平均光密度数据与无机氮浓度的关系曲线函数,标准溶液浓度是已知的,用户只要确定校正标准液RGB平均光密度数据,即可建立浓度函数。在建立浓度函数时,选择标准溶液浓度与平均光密度数据具有较好相关性的通道的数据建立函数。比如,在二苯胺试剂法测定硝酸盐氮的情况,以变化最灵敏的一个通道数据来建立函数,又比如,另一种是格里斯试剂法测亚硝酸盐氮或者纳氏试剂法氨氮的情况,用两个通道平均光密度数据,与标准溶液浓度建立浓度函数。
另外,即使是同一无机氮,如果使用不同的显色处理方式,也要对应使用不同的计算方式。比如,对硝酸盐用二苯胺试剂显色后呈蓝色,采用蓝色色卡,其补色红色通道变化最大,因此选用R通道数据。但是,如果采用金属还原的方法进行检测,硝酸盐被还原为亚硝酸盐再进行显色,显色后的颜色为紫色,与亚硝酸盐显色反应的显色相同,这时对硝酸盐浓度的计算方式就跟对亚硝酸盐浓度的计算方式相同。
因此,选择几个通道,选择哪一个通道需要综合考虑检测对象、显色处理效果、浓度函数在特定浓度范围内的相关性(敏感度)综合选择。同时,检测对象和显色处理的差异造成的影响最终反映在浓度函数在特定浓度范围内的相关性(敏感度)。因此,在选用取样通道时,最主要考虑的就是浓度函数在特定浓度范围内的相关性(敏感度)。
图3是步骤S102具体步骤的流程图,包括:
S201、选取校正色卡。
S202、对图像采集设备进行白平衡及亮度调节。
使用移动电话的摄像头进行拍摄,或使用相机进行拍摄时,需要进行白平衡调节,以免出现图片的黑白度失真的问题。另外,也要调节图像获取设备的亮度值,提高图像最浅色部分及最深色部分的辨析度。
S203、采用图像采集设备同时采集待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡图像及空白区域图像。
对待测反应液、标准反应液及校正色卡及白瓷板空白区域一起拍照,可以最大可能保证上述拍摄对象的光线环境是一致的,防止在分开拍照时光线等环境因素变化导致图像效果存在偏差。进行拍照时,在光线充足且均匀的地方,采用手机摄像头或者相机等图像采集设备进行拍照,拍照时镜头正对拍摄物,并避开影子和反射的亮光。
步骤S104包括对待测液RGB平均光密度数据及标准液RGB平均光密度数据进行校正色差操作,如图3所示,其具体步骤包括:
S301、计算校正色卡图像的标准RGB通道光密度数据,得到色卡RGB标准光密度数据,其计算公式为:
其中,Rd0,Bd0,Gd0分别是基准色块图像RGB三通道的标准光密度数据,R,B,G分别是基准色块RGB三通道的亮度值。
S302、根据色卡RGB平均光密度数据与色卡RGB标准光密度数据,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数。
色卡RGB标准光密度数据就是校正色卡图像真实的光密度数据值,通过拟合校正曲线函数,可以确定在当前环境下拍摄的校正色卡图像的平均光密度数据值与其标准值的关系曲线函数。
S303、将标准液RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正标准液RGB平均光密度数据。
S304、将待测液RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正待测液RGB平均光密度数据。
在建立了拟合校正曲线函数后,直接将标准液RGB平均光密度数据及待测液RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数即可计算出经色差校正的标准液RGB平均光密度数据及待测液RGB平均光密度数据。这里所谓的色差校正,就是对观测图像的RGB三通道平均光密度与其标准值的偏差进行校正。
步骤S104还包括对色差校正待测液RGB平均光密度数据及色差校正标准液RGB平均光密度数据进行校正明暗差异操作,如图5所示,其具体步骤包括:
S401、将白区RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正白区RGB平均光密度数据。
空白区域图像与待测反应液图像及标准反应液图像同处一张照片中,可用同一个拟合校正曲线函数进行色差校正操作。
S402、将色差校正标准液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正标准液RGB平均光密度数据。
S403、将色差校正待测液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正待测液RGB平均光密度数据。
除了“色差”,图像还可能存在“明暗差”,即因周边光线、阴影等造成的失真。“明暗差”在待测反应液图像、标准反应液图像及空白区域图像都存在。同时,空白区域图像在理想情况下,其RGB三通道的平均光密度数据均为零。对空白区域图像来说,其RGB三通道平均光密度数据如果为非零,则这些数据就是“明暗差”造成的数据。因此,将色差校正待测液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,就可以对色差校正待测液RGB平均光密度数据进行校正明暗差异操作。
需要说明的是,由于每个凹孔都有其对应的空白区域,“将色差校正待测液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据”实际是将凹孔中经色差校正的反应液(待测反应液或标准反应液)的平均光密度数据减去该凹孔对应的空白区域的色差校正白区RGB平均光密度数据。待测液RGB平均光密度数据经过色差校正及明暗差校正后得出校正待测液RGB平均光密度数据。同样地,将色差校正标准液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,就可以对色差校正标准液RGB平均光密度数据进行校正明暗差异操作。标准液RGB平均光密度数据经过色差校正及明暗差校正后得出校正标准液RGB平均光密度数据。
对部分无机氮进行检测时,在进行到步骤S105,需选取校正标准液RGB平均光密度数据的两个通道的平均光密度数据建立浓度函数的情形,比如,格里斯试剂法测亚硝酸盐氮或者纳氏试剂法氨氮时,需分别用两个通道数据来建立两个浓度函数。图6是针对选取校正标准液RGB平均光密度数据的两个通道的平均光密度数据建立浓度函数的情形下,步骤S105的具体步骤,包括:
S501、预设主浓度范围及副浓度范围,从RGB三通道中选取主通道及副通道。
主通道与副通道均是取样通道,“主”、“副”主要根据在不同浓度范围内平均光密度与浓度的相关性进行选择。主通道平均光密度数据与浓度建立的浓度函数在较大浓度范围下具有相关性。副通道平均光密度数据与浓度建立的浓度函数在低浓度范围下相关性更强。比如对检测氨氮时,G通道数据建立的浓度函数预测的浓度范围广,则把G通道作为主通道,B通道数据建立的浓度函数在低浓度范围下更灵敏,则把B通道作为副通道。又比如,检测亚硝酸盐氮时,B通道数据建立的浓度函数的预测浓度范围广,则把B通道作为主通道,G通道数据建立的浓度函数在低浓度范围下更灵敏,则把G通道作为副通道。
S502、从校正标准液RGB平均光密度数据中选取主通道的平均光密度数据以生成作为校正标准液主通道平均光密度数据,从校正待测液RGB平均光密度数据中选取主通道的平均光密度数据以生成校正待测液主通道平均光密度数据。
S503、从校正标准液RGB平均光密度数据中选取副通道的平均光密度数据以生成校正标准液副通道平均光密度数据,从校正待测液RGB平均光密度数据中选取副通道的平均光密度数据以生成校正待测液副通道平均光密度数据。
S504、在主浓度范围内,以校正标准液主通道平均光密度数据与标准溶液浓度建立主浓度函数CN=m1×Tm+n1。
其中CN为溶液浓度,Tm为校正标准液主通道平均光密度数据,m1及n1为常数。
S505、在副浓度范围内,以校正标准液副通道平均光密度数据与标准溶液浓度建立副浓度函数CN=m2×TS+n2。
其中CN为溶液浓度,TS为校正标准液副通道平均光密度数据,m2及n2为常数。
S506、当校正待测液主通道平均光密度数据大于预设浓度的校正标准液主通道平均光密度数据时,
S507、将校正待测液主通道平均光密度数据代入主浓度函数计算待测溶液的浓度。
S508、当校正待测液主通道平均光密度数据小于预设浓度的校正标准液主通道平均光密度数据的预设倍数时,
S509、将校正待测液副通道平均光密度数据代入副浓度函数计算待测溶液的浓度。
预设浓度根据主浓度函数及副浓度函数的相关性进行预设。比如对亚硝酸盐氮检测的情形,如图7所示,B通道是主通道,G通道是副通道。根据G通道平均光密度数据建立的副浓度函数在较高浓度范围的相关性与其在低浓度范围的相关性相反,意味着在大浓度范围内,无法用副浓度函数进行预测,因为一个平均光密度数据可能有两个对应的浓度预测值。但是,根据B通道平均光密度数据建立的主浓度函数在较大浓度范围内仍呈现良好的相关性,可用来计算、预测待测溶液的浓度。
但是,在较低浓度范围下,主浓度函数的敏感度不大,平均光密度变化幅度远小于待测溶液的浓度变化幅度。这样,如果使用主浓度函数进行计算,就要在很小的平均光密度范围内对待测溶液浓度进行预测,误差很大。在较低浓度范围下,副浓度函数却展现了较好的敏感度,尤其是平均光密度数据的变化范围大于待测溶液浓度的范围,此时选用副浓度函数进行计算能更准确预测待测溶液浓度。
因此合理确定一个预设浓度,当校正待测液主通道平均光密度数据大于该预设浓度的校正标准液主通道平均光密度数据时,采用主浓度函数计算,可以保证预测值的唯一性。当校正待测液主通道平均光密度数据小于预设浓度的校正标准液主通道平均光密度数据的预设倍数时,采用副浓度函数计算,提高预测准确性。需要说明的是,设定预设倍数是为了修正校正标准液主通道平均光密度数据的测量误差。
S510、否则,采用主浓度函数及副浓度函数进行计算,对两个计算结果取平均值得出待测溶液的浓度。
其他情况下,采用两个函数分别进行计算,并取两个计算结果的平均值,可以将预测误差控制在较小的范围内。
其他情况下,两个函数都是可以用来预测待测溶液的浓度的,此时就要兼顾减少误差。由于低浓度范围下副浓度函数预测准确度更高,而高浓度范围下主浓度函数具有可预测性。因此,在其他情况下,可以分别采用两个函数进行计算,然后取平均值的方式提高待测溶液浓度预测的准确度。
进一步地,主浓度范围大于副浓度范围。
主浓度范围及副浓度范围实际是主浓度函数及副浓度函数的拟合曲线建立时的取样区间。由于副浓度函数只适用于低浓度范围,因此将副浓度范围设置小于主浓度范围,既能确保能在合适的取样区间建立副浓度函数的拟合曲线,也减少取样计算的工作量。
需要说明的是,并非对所有可进行显色反应检测的无机氮来说,都需要建立两个浓度函数,对部分无机氮进行检测时,可以只选取校正标准液RGB平均光密度数据的一个通道的平均光密度数据建立浓度函数的情形,比如,二苯胺试剂法测定硝酸盐氮的情况,只需以变化最灵敏的一个通道数据建立一个浓度函数。图8是针对选取校正标准液RGB平均光密度数据的一个通道的平均光密度数据建立浓度函数的情形下,步骤S105的具体步骤,包括:
S601、从RGB三通道中选取高相关通道。
高相关通道就是相关性最高的通道,即平均光密度数据变化幅度与浓度变化幅度都比较明显,不会出现平均光密度数据变化幅度明显而浓度变化很小的情况。选用相关性最高的通道的数据来建立浓度函数,能有效减少预测误差。
S602、从校正标准液RGB平均光密度数据中选取高相关通道的平均光密度数据作为校正标准液高相关通道平均光密度数据,从校正待测液RGB平均光密度数据中选取高相关通道的平均光密度数据作为校正待测液高相关通道平均光密度数据。
S603、以校正标准液高相关通道平均光密度数据与标准溶液浓度建立浓度函数CN=m3×Tc+n3。
其中CN为溶液浓度,Tc为校正标准液高相关通道平均光密度数据,m3及n3为常数。
S604、将校正待测液高相关通道平均光密度数据代入浓度函数计算待测溶液的浓度。
由于只建立一个浓度函数,故无需进行多次判断操作,简化了计算过程。
本发明基于图像分析的无机氮检测方法可以检测多种常见无机氮包括氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮。
氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮是实际生产中最常见的检测对象,实现对这三种无机氮的快速检测,将可以满足目前大多数对无机氮进行检测的需求。
校正色卡包括特定颜色色卡。在进行上述三种无机氮进行显色处理时,每种无机氮所显现的颜色各不相同。因此,特定颜色色卡的颜色类别及颜色深浅范围根据显色处理结果进行选择。具体来说,要选用与显色处理后的反应液最接近的颜色作为特定颜色色卡。特定颜色色卡中各个深浅色块应比较均匀地包括了较大范围的RGB值,保证拟合校正曲线函数可以覆盖所有情况。
对图像采集设备进行白平衡及亮度调节时,如果使用手动调节的方式,则校正色卡还包括灰色校正色卡、黑色校正色卡及白色校正色卡。这三个色卡都时纯色色卡,即只有一个深浅度的色块,没有不同深浅的色块。
使用灰色校正色卡、黑色校正色卡及白色校正色卡对图像采集设备进行白平衡及亮度调节的步骤包括:
使用灰色校正色卡对图像采集设备的采集参数进行白平衡调节,并使得空白区域图像亮度大于白色校正色卡,以及使得待测反应液图像及标准反应液图像的最低亮度值均高于黑色校正色卡。
现有技术多用灰色校正色卡进行白平衡调节。在进行调节时,将灰色校正色卡与待拍摄物体一起拍照,然后根据灰色校正色卡的灰度值调整图像参数,使得图像中的灰色校正色卡的灰度与其真是灰度值相同,这样对于图像中的其他的物件来说,也进行了白平衡调节,这样保持这一图像参数在相同的环境下进行拍摄即可。另外,使得空白区域图像亮度大于白色校正色卡,以及使得待测反应液图像或标准反应液图像的最低亮度值高于黑色校正色卡,能有效防止图像亮部过曝或者暗部欠曝,而导致颜色信息丢失,从而间接的提高了辨析度。
需要说明的是,所有校正色卡虽然均用于对图像进行校正,其中黑色校正色卡、白色校正色卡及灰色校正色卡只是单色色卡,没有深浅特点,其颜色数据是一个值,比如黑色校正色卡RGB值为(255,255,255),白色校正色卡RGB值为(0,0,0),灰色校正色卡RGB值为(128,128,128)。其他色卡则有深浅特点,其颜色数据是一个范围,比如黄色校正色卡HSV值分别为(15—60°,15—90%,35—75%),蓝色校正色卡HSV值分别为(222°,15%—90%,25%—60%),紫色校正色卡HSV值分别为(300—330°,15%—90%,25%—75%)。
下面以三个实施例对上述氨氮、硝酸盐氮及亚硝酸盐氮三种无机氮的检测过程进行说明。需要说明的是,第一实施例是针对使用纳氏试剂法检测氨氮的情形。第二实施例是针对使用二苯胺法检测硝酸盐氮情形。第三实施例是针对使用格里斯试剂法检测亚硝酸盐氮情形。另外,在三个实施例的附图中,白瓷板凹孔中的小圆圈用于表示反应液颜色的深浅,但仅是就直观而言,并非表示小圆圈数量排序就是实际的颜色深浅排序。校正色卡的色块中的线密度表示颜色深浅,线越多表示该色块的颜色越深。
第一实施例:对氨氮溶液浓度进行检测的全过程
对白瓷板凹孔中的待测溶液及氨氮标准溶液进行显色处理,获得待测反应液及标准反应液。
具体来说,准备12组样品分别为12瓶不同菌株培养24h的发酵液,通过白瓷板快速测定发酵液中氨氮浓度情况。取12孔白瓷板一块,依次加入150μL氨氮含量为0~98.3mg/L氨氮标准溶液和150μL待测样品。然后向每个孔中加入20μL金属离子掩蔽剂和30μL氨氮显色剂,混匀后静置5分钟。
使用灰色校正色卡对手机的采集参数进行白平衡调节,并使得空白区域图像亮度大于白色校正色卡,以及使得反应液图像的最低亮度值高于黑色校正色卡。
由于显色处理后的反应液是黄色,故选择黄色校正色卡作为氨氮浓度检测的校正色卡。
用手机对白瓷板凹孔内待测反应液、标准反应液、校正色卡及白瓷板空白区域一起拍照,获得待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡图像及空白区域图像。图像如图9所示,其中白瓷板100中101-112凹孔为标准反应液,对应校正色卡为校正色卡200;白瓷板300中301-312孔为待测反应液,对应校正色卡为校正色卡400。
采用imageJ分析读取待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡200图像、校正色卡400图像及空白区域图像的RGB三通道平均光密度数据。
计算校正色卡200图像及校正色卡400图像的标准光密度数据,得到校正色卡200的色卡RGB标准光密度数据及校正色卡400的色卡RGB标准光密度数据。其计算公式为:
其中,Rd0,Bd0,Gd0分别是基准色块图像RGB三通道的标准光密度数据,R,B,G分别是校正色卡图像的RGB三通道的亮度值。
根据校正色卡200的色卡RGB平均光密度数据与校正色卡200的色卡RGB标准光密度数据,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数,通过最小二乘法建立校正色卡200的拟合校正曲线函数,将标准液RGB平均光密度数据代入校正色卡200的拟合校正曲线函数,计算出色差校正标准液RGB平均光密度数据。
同理,根据校正色卡400的色卡RGB平均光密度数据与校正色卡400的色卡RGB标准光密度数据,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数,通过最小二乘法建立校正色卡400的拟合校正曲线函数,将待测液RGB平均光密度数据代入校正色卡400的拟合校正曲线函数,计算出色差校正待测液RGB平均光密度数据。
将白区RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正白区RGB平均光密度数据。
将色差校正标准液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正标准液RGB平均光密度数据。
将色差校正待测液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正待测液RGB平均光密度数据。
由白瓷板100采集的标准溶液平均光密度数据表见表1。
表1
选取G通道为主通道,选取B通道为副通道。
对0—100mg/L的校正标准液RGB平均光密度数据,选取其中的G通道平均光密度数据以生成校正标准液G平均光密度数据。
以校正标准液G平均光密度数据与氨氮标准溶液浓度建立主氨氮浓度函数CNH3-N=182.69×Gd-5.4496。
对0—29.5mg/L的校正标准液RGB平均光密度数据,选取其中的B通道平均光密度数据以生成校正标准液B平均光密度数据。
以校正标准液B平均光密度数据与标准溶液浓度建立副氨氮浓度函数CNH3-N=47.489×Bd-10.499。
当校正待测液G平均光密度数据大于CNH3-N=29.5mg/L标准溶液B通道校正平均光密度值(即0.1597)时,采用主氨氮浓度函数CNH3-N=182.69×Gd-5.4496计算待测溶液浓度。
当校正待测液G平均光密度数据小于CNH3-N=29.5mg/L校正标准液G平均光密度数据的0.9倍(即0.1597×0.9=0.1437)时,采用副氨氮浓度函数CNH3-N=47.489×Bd-10.499计算待测溶液的浓度。
否则,采用主氨氮浓度函数及副氨氮浓度函数进行计算,对两个计算结果取平均值得出待测溶液的浓度。
图10是主氨氮浓度函数及副氨氮浓度函数的曲线示意图,可以看出该方法在氨氮浓度为0~98.3mg/L范围均有较好的线性关系。
测定结果如表2,发酵液含有大量菌体,在未经离心或者絮凝情况下测定结果与标准的纳氏试剂比色法测定结果相近,通过本发明方法可以快速方便的监测发酵过程中氨氮变化。
样品编号 |
本发明方法 |
纳氏试剂比色法 |
样品1 |
5.6mg/L |
5.5mg/L |
样品2 |
32.2mg/L |
36.8mg/L |
样品3 |
9.2mg/L |
8.5mg/L |
样品4 |
37.0mg/L |
39.8mg/L |
样品5 |
10.6mg/L |
10.7mg/L |
样品6 |
17.2mg/L |
15.8mg/L |
样品7 |
11.7mg/L |
10.2mg/L |
样品8 |
2.6mg/L |
2.1mg/L |
样品9 |
32.7mg/L |
35.7mg/L |
样品10 |
3.3mg/L |
3.8mg/L |
样品11 |
1.1mg/L |
1.0mg/L |
样品12 |
3.9mg/L |
3.8mg/L |
表2
第二实施例:对硝酸盐氮溶液浓度进行检测的全过程
对白瓷板凹孔中的待测溶液及硝酸盐氮标准溶液进行显色处理,获得待测反应液及标准反应液。
具体来说,准备以下样品:样品1为亚硝酸钠溶液(亚硝酸盐氮含量为25mg/L),样品2为含硝酸盐污水,样品3为含硝酸盐污水中加入亚硝酸钠(亚硝酸盐氮含量为25mg/L)。取12孔白瓷板一块,依次加入50μL硝酸盐氮含量为0~29.94mg/L硝酸盐氮标准溶液和50μL硝酸盐氮待测样品。然后向每个孔中加入50μL亚硝酸盐掩蔽剂,放置1分钟,再加入200μL硝酸盐氮显色剂,混匀后静置5分钟。
使用灰色校正色卡对手机的采集参数进行白平衡调节,并使得空白区域图像亮度大于白色校正色卡,以及使得反应液图像的最低亮度值高于黑色校正色卡。
由于显色处理后的反应液是蓝色,故选择蓝色校正色卡作为硝酸盐氮浓度检测的校正色卡。
用手机对白瓷板凹孔内待测反应液、标准反应液、校正色卡及白瓷板空白区域一起拍照,获得待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡图像及空白区域图像。如图11,其中白瓷板500的凹孔501-507分别为硝酸盐氮标准溶液,凹孔508-510分别为检测样品1-3。白瓷板500对应的校正色卡为校正色卡600。
采用imageJ分析读取待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡600图像及空白区域图像的RGB三通道平均光密度数据。
计算校正色卡600图像的标准光密度数据,得到校正色卡600图像的色卡RGB标准光密度数据。其计算公式为:
其中,Rd0,Bd0,Gd0分别是基准色块图像RGB三通道的标准光密度数据,R,B,G分别是校正色卡图像的RGB三通道的亮度值。
根据校正色卡600图像的色卡RGB平均光密度数据与校正色卡600图像的色卡RGB标准光密度数据,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数,拟合校正曲线函数图如图12所示。将标准液RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正标准液RGB平均光密度数据。
将白区RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正白区RGB平均光密度数据。
将色差校正标准液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正标准液RGB平均光密度数据。
选取R通道为高相关通道。
对校正标准液RGB平均光密度数据,选取其中的R通道平均光密度数据以生成校正标准液R平均光密度数据。
以校正标准液R平均光密度数据与标准溶液浓度建立硝酸盐氮浓度函数CNO3-N=28.869×Rd-1.6627。结果如图13,经校正后的硝酸盐氮浓度函数有更好的拟合度,在0~30mg/L范围内,校正标准液R平均光密度数据与硝酸盐氮浓度呈线性关系。
对校正待测液RGB平均光密度数据,选取其中的R通道平均光密度数据以生成校正待测液R平均光密度数据。
将校正待测液R平均光密度数据代入硝酸盐氮浓度函数计算待测溶液浓度。测定结果如表3,样品未经离心或者絮凝去除悬浮物即可检测,测定结果与麝香草酚比色法测定结果相近,亚硝酸盐氮浓度为25mg/L的干扰对检测结果没有明显影响。
样品编号 |
图像分析法 |
麝香草酚比色法 |
样品1 |
0.4mg/L |
0.2mg/L |
样品2 |
15.9mg/L |
15.5mg/L |
样品3 |
14.4mg/L |
15.0mg/L |
表3
第三实施例:对亚硝酸盐氮溶液浓度进行检测的全过程
对白瓷板凹孔中的待测溶液及亚硝酸盐氮标准溶液进行显色处理,获得待测反应液及标准反应液。
具体来说,准备以下样品:样品1-6为6个富集硝化细菌的水样,通过检测亚硝酸盐生成量反映硝化细菌富集情况。取12孔白瓷板一块,依次加入150μL亚硝酸盐氮含量为0~12.05mg/L亚硝酸盐氮标准溶液和150μL待测样品。然后向每个孔中加入100μL亚硝酸盐氮显色剂,混匀后静置5分钟。
使用灰色校正色卡对手机的采集参数进行白平衡调节,并使得空白区域图像亮度大于白色校正色卡,以及使得反应液图像的最低亮度值高于黑色校正色卡。
由于显色处理后的反应液的颜色是紫色,故选择紫色校正色卡作为亚硝酸盐氮检测的校正色卡。
用手机对白瓷板凹孔内待测反应液、标准反应液、校正色卡800、校正色卡1000及空白区域一起拍照,获得待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡800图像、校正色卡1000图像及空白区域图像。拍照结果如图14,其中白瓷板700中凹孔701-712为亚硝酸盐氮标准溶液,对应校正色卡为校正色卡800。白瓷板900中凹孔901为蒸馏水作为空白对照,即对蒸馏水进行显色处理生成的待测反应液。凹孔902-907分别为待测溶液样品1~6。白瓷板900图像对应的校正色卡为校正色卡1000。
采用imageJ分析读取待测反应液图像、标准反应液图像、校正色卡800图像、校正色卡1000图像及空白区域图像的RGB三通道平均光密度数据。
计算校正色卡800图像及校正色卡1000图像的标准光密度数据,得到校正色卡800的色卡RGB标准光密度数据及校正色卡1000的色卡RGB标准光密度数据,其计算公式为:
其中,Rd0,Bd0,Gd0分别是基准色块图像RGB三通道的标准光密度数据,R,B,G分别是校正色卡图像的RGB三通道的亮度值。
根据校正色卡800的色卡RGB平均光密度数据与校正色卡800的色卡RGB标准光密度数据,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数,通过最小二乘法建立校正色卡800的拟合校正曲线函数,将标准液RGB平均光密度数据代入校正色卡800的拟合校正曲线函数,计算出色差校正标准液RGB平均光密度数据。
同理,根据校正色卡1000的色卡RGB平均光密度数据与校正色卡1000的色卡RGB标准光密度数据,通过最小二乘法建立拟合校正曲线函数,通过最小二乘法建立校正色卡1000的拟合校正曲线函数,将待测液RGB平均光密度数据代入校正色卡1000的拟合校正曲线函数,计算出色差校正待测液RGB平均光密度数据。
将白区RGB平均光密度数据代入拟合校正曲线函数,计算出色差校正白区RGB平均光密度数据。
将色差校正标准液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正标准液RGB平均光密度数据。
将色差校正待测液RGB平均光密度数据减去色差校正白区RGB平均光密度数据,计算出校正待测液RGB平均光密度数据。
由白瓷板700采集的标准溶液平均光密度数据表见表4。
表4
选取B通道为主通道,选取G通道为副通道。
对亚硝酸盐氮浓度为0—12mg/L的校正标准液RGB平均光密度数据,选取其中的B通道平均光密度数据以生成校正标准液B平均光密度数据。
以校正标准液B平均光密度数据与亚硝酸盐氮浓度建立主亚硝酸盐氮浓度函数CNO2-N=19.695×Bd+0.2072。
对亚硝酸盐氮浓度为0—2.0mg/L的校正标准液RGB平均光密度数据,选取其中的G通道平均光密度数据以生成校正标准液G平均光密度数据。
以校正标准液G平均光密度数据与亚硝酸盐氮浓度建立副亚硝酸盐氮浓度函数CNO2-N=2.2881×Gd+0.0322。
图15是主亚硝酸盐氮浓度函数及副亚硝酸盐氮浓度函数的曲线图,可以看出该方法在亚硝酸盐氮浓度为0.12~12.05mg/L范围均有较好的线性关系,与常规重氮偶合比色法相比有更广的检测范围。图16是重氮偶合比色法的吸光度-待测溶液浓度曲线图。由于使用重氮偶合比色法进行检测时,测量仪器对溶液浓度的灵敏度过高,导致预测的浓度范围很小,如图16的例子只为0.06—0.6mg/L。本发明对亚硝酸盐氮浓度进行检测时,在低浓度范围内,比如0.12—0.6mg/L,使用副浓度函数预测浓度的准确度与重氮偶合比色法大致相同,同时,对于较大浓度范围,比如0.6—12.05mg,则使用主浓度函数计算,大大扩展了检测范围。
当校正待测液G平均光密度数据大于CNO2-N=2.01mg/L标准溶液B通道校正平均光密度值(即0.0653)时,采用主亚硝酸盐氮浓度函数CNO2-N=19.695×Bd+0.2072方程计算待测液亚硝酸盐氮浓度。
当校正待测液G平均光密度数据小于CNO2-N=2.01mg/L校正标准液G平均光密度数据的0.9倍(即0.0653×0.9=0.0588)时,采用副亚硝酸盐氮浓度函数CNO2-N=2.2881×Gd+0.0322计算待测溶液浓度。
否则,采用第一亚硝酸盐氮浓度函数及第二亚硝酸盐氮浓度函数计算,再取平均值作为待测溶液浓度。
测定结果如表5,样品未经离心或者絮凝去除悬浮物即可检测,测定结果与重氮偶合比色法测定结果相近。
样品编号 |
图像分析法 |
重氮偶合比色法 |
空白对照 |
0.03mg/L |
-0.01mg/L |
样品1 |
2.10mg/L |
2.15mg/L |
样品2 |
1.98mg/L |
2.08mg/L |
样品3 |
7.02mg/L |
6.78mg/L |
样品4 |
0.06mg/L |
0.06mg/L |
样品5 |
0.15mg/L |
0.16mg/L |
样品6 |
7.22mg/L |
6.90mg/L |
表5
上述3个实施例表明本发明所用方法不需要复杂的预处理操作,拍照即可批量采集各反应液数据。检测范围也比常规比色法更广,相当于简化了稀释到合适浓度的步骤。检测结果与常规比色法相近。因此本发明所用三种无机氮检测方法兼具了便捷,准确的特点。
上述3个实施例中图像和数据在电脑上分析计算,分析计算过程都是程序化的流程,如由此进一步开发移动终端软件,可以实现在手机等图像采集设备上直接读数。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。