CN110373320A - 细胞分离器及其分离方法 - Google Patents

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程鹏
张敏超
陈忠垒
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Suzhou Skyline Innovation Nanotechnology Co Ltd
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    • C12N5/00Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Abstract

本发明公开了一种细胞分离器及其分离方法,所述分离器包括分离器主体和与其相连通的多个分离通道,所述分离器主体用于盛放细胞混合液,所述细胞混合液中的不同细胞分别与不同介电常数的分离物特异结合,所述分离器主体通过控制器施加直流或交流电压,使不同的细胞进入不同的分离通道分离开来;所述分离方法,包括以下步骤:将不同的细胞分别与不同的分离物特异结合,得到结合有不同分离物的细胞混合液;再将所述的结合有不同分离物的细胞混合液置入分离器主体中,再通过控制器对所述分离器主体施加电压,使细胞混合液中结合有不同介电常数或不同正负电荷密度的分离物的细胞在下流过程中分开,分开的细胞再下流进入不同的分离通道。

Description

细胞分离器及其分离方法
技术领域
本发明涉及一种细胞分离器及其分离方法,属于生物技术领域。
背景技术
目前细胞分选的流程均是首先将纳米磁珠生物特异性连接在细胞上,然后将能增强磁场分布的分选柱置于永磁体磁铁的磁场中,在细胞溶液通过分离柱的时候将有纳米磁珠连接的细胞吸附在柱子上,之后将不需要的细胞洗掉分离,最后再将分离柱从磁场上移走,用分散液将吸附在分离柱上的细胞重新分散。
由于单一永磁体的磁场强度固定,无法调制,而磁铁数量增多后磁场分布复杂,难以使用,且磁珠生产工艺复杂,成本高,价格昂贵,所以上述这种细胞分选的方式每次只能分选一种细胞且自动化难度较大,通量较低,细胞分选柱难以循环利用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞分离器及其分离方法,从而能够快速分选出多种细胞,并且这种分选方式可以不间断分选大量溶液,大大提高了通量。
为达到上述目的,本发明提供如下技术方案:
一方面,本发明提供一种细胞分离器,包括分离器主体和与其连接的多个分离通道,所述分离器主体用于盛放细胞混合液,所述细胞混合液中的不同的细胞分别与不同介电常数的分离物特异结合,所述分离器主体通过控制器施加直流或交流电压形成直流或交变电场,使不同的细胞在下流的过程中进入不同的分离通道分离开来。
进一步地,所述分离物为纳米颗粒或生物分子。
进一步地,所述细胞分离器还包括第一连接部,所述第一连接部的一端与所述分离器主体相连通,所述第一连接部的另一端与所述多个分离通道相连通,通过第一连接部的设置,更有利于细胞混合液的分离。
进一步地,所述第一连接部与多个分离通道相连通的一端的宽度,大于所述第一连接部与分离器主体相连通的另一端的宽度,通过该设计,不但能够使细胞混合液更充分分离,而且有助于延长其液体的流程,使其分离更为充分。
进一步地,所述分离通道包括第二连接部和细胞流出部,所述第二连接部的一端与所述第一连接部相连通,另一端与所述细胞流出部相连通。
进一步地,所述第二连接部与第一连接部相连通的一端的宽度,大于所述第二连接部与细胞流出部相连通的另一端的宽度,通过将分离通道设计成倒锥形,在充分分离细胞的同时,能够将分离的细胞进一步收集。
进一步地,所述分离器主体的两侧分别加载有正、负电极,所述正、负电极分别通过导线与所述控制器连接。
另一方面,本发明还提供一种上述的细胞分离器的细胞分离方法,包括以下步骤:
1)将不同的细胞分别与不同的分离物特异结合,得到结合有不同分离物的细胞混合液;
2)再将所述的结合有不同分离物的细胞混合液置入分离器主体中,再通过控制器对所述分离器主体施加电压,使细胞混合液中结合有不同介电常数或不同正负电荷密度的分离物的细胞在下流的过程中分开,分开的细胞再逐渐下流进入不同的分离通道。
进一步地,当所述控制器施加直流电压时,带有高密度正电荷的分离物连接的细胞会向负极方向移动最远,带有低密度正电荷的分离物连接的细胞会向负极移动,但比高密度正电荷的移动距离短,带有高密度负电荷的分离物连接的细胞会向正极方向移动最远,带有低密度负电荷的分离物连接的细胞会向正极移动,但比高密度负电荷的移动距离短,不同正负电荷密度分离物连接的细胞在垂直于溶液流动方向分别向正负极方向移动不同距离,最终流入不同的分离通道。
进一步地,所述分离物为纳米颗粒或生物分子。
进一步地,所述直流电压的范围为正负100V。
进一步地,当所述控制器施加交流电压时,不同介电常数或导电性分离物连接的细胞会在交变电场中被分离物不同的介电泳作用力中向正负极流动不同的距离,改变电压以及频率均可改变介电泳力的大小,所以改变电压或频率可以改变在等同时间内不同介电常数或导电率分离物连接的不同细胞游动的距离的差别从而精确的最终让不同细胞流到不同的分离通道中,最终分离开来。
进一步地,当所述控制器施加交流电压时,所述分离物质为纳米颗粒。
进一步地,所述电压的范围为正负100V,频率为1Hz~1MHz。
本发明的有益效果在于:通过将不同介电常数的纳米颗粒或生物分子特异性吸附在细胞上,由于生物分子或纳米颗粒有不同的高频电场极化效应或不同的正负电荷强弱差别,可以在交流电场或直流电场中产生不同的响应,将电场响应极大不同的颗粒或分子特异性连接在细胞上,之后将连有这些纳米颗粒或分子的细胞置于交流或直流电场中,应用电泳或介电泳原理,通过调节电场以及纳米颗粒或分子对电场的不同响应来分离纯化细胞。
不同极性的纳米颗粒的合成方式多样,且可以使用生物相容性好的纳米颗粒,降低对传统方法中纳米磁珠的依赖,且不需要生产复杂的细胞分选柱,总体上降低了成本。这种基于调节电场的细胞分选技术并没有使细胞物理吸附在分选柱上,而且可以使用生物分子连接细胞,来达成改变极性或电荷的结果,降低了对细胞的物理破坏,对之后使用细胞的实验有很大的帮助,电场调节方式简单易操作,分选设备可循环利用,可通过带有不同极性的分子或纳米颗粒快速分选出多种细胞。这种分选方式可以不间断分选大量溶液,大大提高了通量。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明的细胞分离器的结构示意图;
其中:
1.分离器主体,2.分离通道,201.第二连接部,202.细胞流出部,3.细胞混合液,4.控制器,5.导线,6.电极,7.第一连接部。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
如图1所示,本发明的细胞分离器,包括分离器主体1和与其连接的多个分离通道2,分离器主体1用于盛放细胞混合液3,细胞混合液3中的不同细胞分别与不同介电常数的分离物特异结合,分离器主体1通过控制器4施加直流或交流电压形成直流或交流电场,使不同的细胞在下流的过程中进入不同的分离通道2分离开来。具体实施时,分离物可为纳米颗粒或生物分子,分离器主体1的两侧分别加载有正、负电极6,正、负电极6分别通过导线5与控制器4连接,分离通道2为四个。
在上述实施例中,细胞分离器还包括第一连接部7,第一连接部7的一端与分离器主体1相连通,第一连接部7的另一端与所述多个分离通道2相连通,通过第一连接部7的设置,更有利于细胞混合液的分离。具体实施时,第一连接部7与多个分离通道2相连通的一端的宽度,大于第一连接部7与分离器主体2相连通的另一端的宽度,通过该设计,不但能够使细胞混合液更充分分离,而且有助于延长其液体的流程,使其分离更为充分。
在上述实施例中,分离通道2包括第二连接部201和细胞流出部202,第二连接部201的一端与第一连接部7相连通,另一端与细胞流出部202相连通。具体实施时,第二连接部202与第一连接部7相连通的一端的宽度,大于第二连接部7与细胞流出部202相连通的另一端的宽度,通过将分离通道2设计成倒锥形,在充分分离细胞的同时,能够将分离的细胞进一步收集。
在上述实施例中,当控制器4施加直流电压时,带有高密度正电荷的分离物连接的细胞会向负极方向移动最远,带有低密度正电荷的分离物连接的细胞会向负极移动,但比高密度正电荷的移动距离短,带有高密度负电荷的分离物连接的细胞会向正极方向移动最远,带有低密度负电荷的分离物连接的细胞会向正极移动,但比高密度负电荷的移动距离短,不同正负电荷密度分离物连接的细胞在垂直于溶液流动方向分别向正负极方向移动不同距离,最终流入不同的分离通道2。具体实施时,当控制器4施加直流电压时,分离物为纳米颗粒或生物分子,直流电压的范围为正负100V。
在上述实施例中,当控制器4施加交流电压时,不同介电常数或导电性分离物连接的细胞会在交变电场中被分离物不同的介电泳作用力中向正负极流动不同的距离,改变电压以及频率均可改变介电泳力的大小,所以改变电压或频率可以改变在等同时间内不同介电常数或导电率分离物连接的不同细胞游动的距离的差别从而精确的最终让不同细胞流到不同的分离通道2中,最终分离开来。具体实施时,当控制器4施加交流电压时,分离物质为纳米颗粒,电压的范围为正负100V,频率为1Hz~1MHz。
实施例1
对于直流电场,可应用电泳原理。首先合成带不同正负电荷强度且生物相容性高的金属或高分子纳米颗粒,在本实施例中,采用聚乙二醇和聚甲基丙烯酸或聚乙烯亚胺的共聚物,通过调整两种高分子的比例最终合成四种直径50纳米高分子纳米颗粒,Zeta电势分别为+10、+40、-10、-40mV。两种高分子颗粒均可通过羧基氨基偶联反应连接特异性抗体,例如CD4,CD8a,CD49b,Gr-1,再通过连有特异性抗体的纳米颗粒连接在表面有这四个受体的在细胞表面,通过控制浓度比例控制每个细胞偶联纳米颗粒的数量最终控制细胞与纳米颗粒偶联后系统性的表面电荷量。
将连有纳米颗粒的细胞混合溶液通入细胞分离器主体1中,在与细胞流动方向相垂直的方向持续施加直流电压20V,或以正弦波或其他波形施加正负10V的直流电压。流动的细胞由于表面所带电荷不同,带正电荷的细胞向负极方向移动,带负电荷的细胞向正极移动,尤其在正弦波等波形的驱动下,细胞分离越来越远,但由于交换了电极方向,细胞在流道中的位置离初始位置之间的距离并不会太远,相对较对称。通过这种方式,细胞在流动到流道底部时,分别流入独立的流道2,最终在独立流道2出口分别收集四种细胞。
实施例2
对于交流电场,可应用介电泳原理。首先合成带不同介电常数且生物相容性高的金属或高分子纳米颗粒,在本实施例中,采用聚乙二醇和聚苯胺的共聚物,通过调整两种高分子的比例最终合成四种直径50纳米高分子纳米颗粒。聚苯胺累的导电性高分子可以大幅提高高分子纳米颗粒在高频电场中的响应速度,尤其在相对频率较低时,导电性在介电常数中其主导地位,微小调整聚苯胺的含量可以在0.1-10MHz频率电场范围内使得高分子纳米颗粒表现出很大的差异。高分子颗粒均可通过羧基氨基偶联反应连接特异性抗体,例如CD4,CD8a,CD49b,Gr-1,再通过连有特异性抗体的纳米颗粒连接在表面有这四个受体的在细胞表面,最终通过控制浓度比例控制每个细胞偶联纳米颗粒的数量来控制细胞与纳米颗粒偶联后系统性的介电常数。
将连有纳米颗粒的细胞混合溶液通入细胞分离器主体1中,在与细胞流动方向相垂直的方向以不对称电极形状持续施加交流电压20V,电压频率为1MHz或以正弦波等波形方式使频率从10kHz-1MHz变化,使得细胞分开距离较大。流动的细胞由于有效介电常数不同,会使得细胞在非匀强场中朝电场线密度更高或更低的区域移动,尤其在正弦波等波形频率变化的驱动下,细胞分离越来越远,但由于改变了频率范围,细胞移动方向反向变化细胞在流道中的位置离初始位置之间的距离不会太远,相对较对称,通过这种方式,细胞在流动到流道底部时,分别流入独立的流道2,最终在独立流道2出口分别收集四种细胞。
此外,通过实验测定上述实施例1和2所分离的细胞的回收率,结果表明,本发明的对细胞进行分离的方法,相比现有技术中的细胞分离方法,其细胞的回收率有明显提高,并且由于同时可以分离多个细胞,分离通量高,此外,本发明的分离方法并没有使细胞物理吸附在分选柱上,而且可以使用生物分子连接细胞,来达成改变极性或电荷的结果,降低了对细胞的物理破坏,对之后使用细胞的实验有很大的帮助。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (14)

1.一种细胞分离器,其特征在于,包括分离器主体和与其相连通的多个分离通道,所述分离器主体用于盛放细胞混合液,所述细胞混合液中的不同细胞分别与不同介电常数或不同正负电荷密度的分离物特异结合,所述分离器主体通过控制器施加直流或交流电压形成直流或交变电场,使不同的细胞进入不同的分离通道分离开来。
2.根据权利要求1所述的细胞分离器,其特征在于,所述分离物为纳米颗粒或生物分子。
3.根据权利要求2所述的细胞分离器,其特征在于,所述细胞分离器还包括第一连接部,所述第一连接部的一端与所述分离器主体相连通,所述第一连接部的另一端与所述多个分离通道相连通。
4.根据权利要求3所述的细胞分离器,其特征在于,所述第一连接部与多个分离通道相连通的一端的宽度,大于所述第一连接部与分离器主体相连通的另一端的宽度。
5.根据权利要求4所述的细胞分离器,其特征在于,所述分离通道包括第二连接部和细胞流出部,所述第二连接部的一端与所述第一连接部相连通,另一端与所述细胞流出部相连通。
6.根据权利要求5所述的细胞分离器,其特征在于,所述第二连接部与第一连接部相连通的一端的宽度,大于所述第二连接部与细胞流出部相连通的另一端的宽度。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞分离器,其特征在于,所述分离器主体的两侧分别加载有正、负电极,所述正、负电极分别通过导线与所述控制器连接。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞分离器的细胞分离方法,包括以下步骤:
1)将不同的细胞分别与不同的分离物特异结合,得到结合有不同分离物的细胞混合液;
2)再将所述的结合有不同分离物的细胞混合液置入分离器主体中,再通过控制器对所述分离器主体施加电压,使细胞混合液中结合有不同介电常数或不同正负电荷密度的分离物的细胞在下流的过程中分开,分开的细胞再下流进入不同的分离通道。
9.根据权利要求8所述的细胞分离器的细胞分离方法,其特征在于,当所述控制器施加直流电压时,带有高密度正电荷的分离物连接的细胞会向负极方向移动最远,带有低密度正电荷的分离物连接的细胞会向负极移动,但比高密度正电荷的移动距离短,带有高密度负电荷的分离物连接的细胞会向正极方向移动最远,带有低密度负电荷的分离物连接的细胞会向正极移动,但比高密度负电荷的移动距离短,不同正负电荷密度分离物连接的细胞在垂直于溶液流动方向分别向正负极方向移动不同距离,最终流入不同的分离通道。
10.根据权利要求9所述的细胞分离器的细胞分离方法,其特征在于,所述分离物为纳米颗粒或生物分子。
11.根据权利要求9所述的细胞分离器的细胞分离方法,其特征在于,所述直流电压的范围为正负100V。
12.根据权利要求8所述的细胞分离器的细胞分离方法,其特征在于,当所述控制器施加交流电压时,不同介电常数或导电性分离物连接的细胞会在交变电场中被分离物不同的介电泳作用力中向正负极流动不同的距离,改变电压以及频率均可改变介电泳力的大小,所以改变电压或频率可以改变在等同时间内不同介电常数或导电率分离物连接的不同细胞游动的距离的差别从而精确的最终让不同细胞流到不同的分离通道中,最终分离开来。
13.根据权利要求12所述的细胞分离器的细胞分离方法,其特征在于,当所述控制器施加交流电压时,所述分离物质为纳米颗粒。
14.根据权利要求12所述的细胞分离器的细胞分离方法,其特征在于,所述电压的范围为正负100V,频率为1Hz~1MHz。
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Effective date of registration: 20200915

Address after: Room d707, building D, Suzhou Institute of nanotechnology and nanobionics, Chinese Academy of Sciences, No.398 Ruoshui Road, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province, 215000 (room d707)

Applicant after: Caike (Suzhou) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 215123 7th floor, building D, No. 398, Ruoshui Road, Suzhou Industrial Park, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: SUZHOU TIANJI INNOVATION NANO TECHNOLOGY Co.,Ltd.