CN110331133A - 一种突触前膜分离方法 - Google Patents

一种突触前膜分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110331133A
CN110331133A CN201910528361.6A CN201910528361A CN110331133A CN 110331133 A CN110331133 A CN 110331133A CN 201910528361 A CN201910528361 A CN 201910528361A CN 110331133 A CN110331133 A CN 110331133A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
under
buffer
centrifuged
hepes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910528361.6A
Other languages
English (en)
Inventor
石天尧
冯书芳
周文霞
张永祥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Original Assignee
Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS filed Critical Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority to CN201910528361.6A priority Critical patent/CN110331133A/zh
Publication of CN110331133A publication Critical patent/CN110331133A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种突触前膜分离方法，该方法包括如下步骤：将离体脑组织置于蔗糖‑HEPES缓冲液中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到的沉淀P2用EDTA‑HEPES缓冲液重悬，于12000g下离心，得到的沉淀P3用Tritonx‑100‑NaCl‑HEPES缓冲液重悬，于12000g下离心，所得上清液再于50000g下离心，得到的沉淀P6用Tris‑HCl缓冲液重悬，于10000g下离心，得到主要是突触前膜成分的上清液S7。与现有技术相比，本发明的方法不需要制备密度梯度介质溶液，操作更为简单，对脑中小核团的样本组织同样适用。

Description

一种突触前膜分离方法
技术领域
本发明涉及一种突触前膜分离方法。
背景技术
神经突触由突触前膜、突触间隙与突触后膜三部分组成。突触的兴奋或抑制，不仅取决于神经递质的种类，更重要的还取决于突触膜上受体的类型。大脑中枢中的突触间隙距离是十分狭窄的(约20nm)。如果只是通过共聚焦显微镜或免疫电镜方式研究细胞膜表面蛋白，很有可能错误把它们定位在前后膜的任意一侧，造成实验偏差，并且很难定量。因此，将突触前后膜上受体分别分离出来进行细致研究显得十分必要。
过去大部分研究，都主要关注突触后膜上的受体。原因在于突触后膜蛋白与突触后致密物(postsynaptic densities,PSD)相互作用，影响其在膜上的定位与聚集，而分离突触后致密物的方法相对成熟且易于操作。但在已有突触后致密物分离方法中，突触前膜成分不是被丢失，就是和突触后膜附着在一起，使得突触前膜相关受体蛋白的研究远滞后于突触后膜。随着超高速密度梯度离心技术的出现，突触前膜受体分离方法也得以快速发展，突触前膜受体的功能研究也更加精确。
研究发现突触前膜相关受体在神经冲动或神经递质传递过程中起着四个主要功能：①突触前膜是组装和聚集突触囊泡的“码头”；②突触前膜上电压门控钙离子通道开放控制突触传递的开始；③突触前膜的细胞粘附分子精确控制着前后膜的精确对位关系；④突触前膜受体介导突触前的短时或长时程突触可塑性变化，发挥与突触后短时或长时程突触可塑性不一样的功能。由此可见，深入研究突触前膜相关受体蛋白的功能，很可能为神经系统相关疾病的研究提供更充足的实验依据和潜在药物靶点。
目前分离突触前膜受体所采用的超速密度梯度离心技术，是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降，在一定的离心力下把不同密度的物质分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该方法的优点是分离效果好，且适用范围广。但是也存在明显缺点：①高速离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。例如，在Berninghausen等(J Neurochem.2007 Dec；103(5):1855-63.)采用的方法中，利用两次高速离心和两次超速蔗糖密度梯度离心才将突触前膜成分分离出来。在申请人重复该方法分离突触前膜受体时又发现另一个缺点：需要足够多样本量。文献中要分离的是大鼠皮层组织样本，样本量充足。但在进行小鼠实验，同时研究脑中一些体积较小核团时，如杏仁核、腹侧被盖区、伏隔核等，很难满足分离方法要求的上样量，即使勉强达到上样量要求，在经过多次超速密度梯度离心后，样品难免会有较大损失。因此，想要从最后分离得到的突触前膜成分中检测出本身含量就比较低的目的蛋白可能会变得异常困难，实验的可重复性也会受到很大影响。
发明内容
基于现有超速密度梯度离心技术分离突触前膜时操作较为严格、不易掌握的现状，本发明的目的是提供一种易于操作的突触前膜分离方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种突触前膜分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体脑组织置于缓冲液A中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到沉淀P2；
(2)沉淀P2用缓冲液B重悬，于12000g下离心，得到沉淀P3；
(3)沉淀P3用缓冲液C重悬，于12000g下离心，所得上清液再于50000g下离心，得到沉淀P6；
(4)沉淀P6用缓冲液E重悬，于10000g下离心，得到主要是突触前膜成分的上清液S7；
其中，所述缓冲液A为pH＝7.4的蔗糖-HEPES缓冲液，蔗糖浓度为0.32M，HEPES浓度为10mM；
所述缓冲液B为pH＝7.4的EDTA-HEPES缓冲液，EDTA浓度为1mM，HEPES浓度为4mM；
所述缓冲液C为pH＝7.2的Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，NaCl浓度为100mM,Tritonx-100浓度为0.5vt％，HEPES浓度为20mM；
所述缓冲液E为25mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.6。
优选地，步骤(1)中，于1000g下离心10min，于12000g下离心20min；
步骤(2)中，于12000g下重复离心两次，每次20min；
步骤(3)中，于12000g下离心20min，于50000g下离心30min；
步骤(4)中，于10000g下离心15min；
上述各步骤的离心均在4℃下进行。
一种突触囊泡分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体脑组织置于缓冲液A中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到沉淀P2；
(2)沉淀P2用缓冲液B重悬，于12000g下离心，得到沉淀P3；
(3)沉淀P3用缓冲液C重悬，于12000g下离心，所得上清液再于50000g下离心，得到主要是突触囊泡成分的上清液S6；
其中，所述缓冲液A为pH＝7.4的蔗糖-HEPES缓冲液，蔗糖浓度为0.32M，HEPES浓度为10mM；
所述缓冲液B为pH＝7.4的EDTA-HEPES缓冲液，EDTA浓度为1mM，HEPES浓度为4mM；
所述缓冲液C为pH＝7.2的Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，NaCl浓度为100mM,Tritonx-100浓度为0.5vt％，HEPES浓度为20mM。
优选地，步骤(1)中，于1000g下离心10min，于12000g下离心20min；
步骤(2)中，于12000g下重复离心两次，每次20min；
步骤(3)中，于12000g下离心20min，于50000g下离心30min；
上述各步骤的离心均在4℃下进行
一种突触后膜分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体脑组织置于缓冲液A中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到沉淀P2；
(2)沉淀P2用缓冲液B重悬，于12000g下离心，得到沉淀P3；
(3)沉淀P3用缓冲液C重悬，于12000g下离心，得到沉淀P4；
(4)沉淀P4用缓冲液D重悬，于10000g下离心，得到主要是突触后膜成分的上清液S5；
其中，所述缓冲液A为pH＝7.4的蔗糖-HEPES缓冲液，蔗糖浓度为0.32M，HEPES浓度为10mM；
所述缓冲液B为pH＝7.4的EDTA-HEPES缓冲液，EDTA浓度为1mM，HEPES浓度为4mM；
所述缓冲液C为pH＝7.2的Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，NaCl浓度为100mM,Tritonx-100浓度为0.5vt％，HEPES浓度为20mM；
所述缓冲液D为pH＝7.5的二硫苏糖醇-SDS-脱氧胆酸-Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，HEPES浓度为20mM,NaCl浓度为0.15mM,Tritonx-100浓度为1vt％,脱氧胆酸浓度为1wt％，SDS浓度为1wt％，二硫苏糖醇浓度为1mM。
优选地，步骤(1)中，于1000g下离心10min，于12000g下离心20min；
步骤(2)中，于12000g下重复离心两次，每次20min；
步骤(3)中，于12000g下离心20min；
步骤(4)中，于10000g下离心15min；
上述各步骤的离心均在4℃下进行。
所述脑组织为大脑皮层、杏仁核、腹侧被盖区和/或伏隔核。
优选地，为防止蛋白降解，匀浆时可向上述缓冲液A中加入适量的蛋白酶抑制剂。
有益效果
与现有的突触前膜分离方法相比，本发明的方法具有以下优点：(1)不需要制备密度梯度介质溶液，使得操作更为简单，且能缩短高速离心所需的时间；(2)样品用量少：对脑中小核团的样本组织也可以分离出相关目的蛋白；(3)突触前后膜组分可以同时分别分离出来，可同时选取前后膜成分进行对照研究。
附图说明
图1为突触前膜受体分离流程示意图。post-SM:postsynaptic membrane(突触后膜)；pre-SM:presynaptic membrane(突触前膜)；SV:Synaptic vesicles(突触囊泡).
图2为小鼠皮层和杏仁核突触蛋白在不同部位的表达。Cor:Cortex；Amy:Amygdala.
图3为小鼠皮层和杏仁核突触前后膜NMDA受体亚型GluN2B和Kainate受体亚型GluK1蛋白含量的表达。
具体实施方式
以下结合优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。
HEPES:4-羟乙基哌嗪乙磺酸
EDTA:乙二胺四乙酸
SDS:十二烷基硫酸钠
DTT:二硫苏糖醇
Deoxycholic acid:脱氧胆酸
Tritonx-100:曲拉通x-100，聚乙二醇单辛基苯基醚
Tris:三羟甲基氨基甲烷
所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。超速离心机为日立Himac CP100WX型。
首先根据常规方法，将SPF级雄性C57BL/6J小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)断头后迅速取出大脑，在低温条件下(4℃人工脑脊液)去除软脑膜及血管组织，分别取出大脑皮层和杏仁核进行下列实施例的实验。
实施例1
①取上述大脑皮层50mg，加入缓冲液A 500μl匀浆。缓冲液A为：0.32M蔗糖缓冲液，pH7.4(配置100ml缓冲液A，需10.95g蔗糖，0.24g HEPES)。匀浆结束后，离心(1000g,10min,4℃)，得到沉淀P1和上清液S1。
②取上清液S1再次离心(12000g,20min,4℃)，得到沉淀P2和上清液S2。
③取沉淀P2用，加入200μl缓冲液B重悬。缓冲液B为：4mM HEPES缓冲液，pH7.4(配置100ml缓冲液B，需0.0953g HEPES，0.0292g EDTA)。离心(12000g,20min,4℃)，取上清液重复以上步骤，再次用200μl缓冲液B重悬，离心(12000g,20min,4℃)，得到沉淀P3(合并两次离心所得的沉淀)和上清液S3。
④取沉淀P3，加入120μl缓冲液C重悬，缓冲液C为：20mM HEPES,100mM NaCl,0.5％Tritonx-100，pH7.2(配置100ml缓冲液C，需0.4766g HEPES,0.5844g NaCl,0.5mlTritonx-100)。轻转(100g,15min,4℃)，再离心(12000g,20min,4℃)，得到沉淀P4和上清液S4。
⑤取沉淀P4，加入100μl缓冲液D重悬。缓冲液D为：20mM HEPES,0.15mM NaCl,1％Tritonx-100,1％Deoxycholic acid,1％SDS,1mM DTT，pH7.5(配置100ml缓冲液D，需0.4766g HEPES,0.0009g NaCl,1ml Tritonx-100,1g Deoxycholic acid,1g SDS,0.0154gDTT)。轻转(100g,1h,4℃)，离心(10000g,15min,4℃)，得到沉淀P5和上清液S5。S5放在-70℃冰箱冻存，留待检测。
⑥取上清液S4，高速离心(50000g,30min,4℃)，得到沉淀P6和上清液S6。S6放在-70℃冰箱冻存，留待检测。
⑦取沉淀P6，加入100μl缓冲液E重悬。缓冲液E为：25mM Tris-HCl(配置100ml缓冲液E，称0.3032g Tris,置于80ml蒸馏水中，用浓HCl调pH7.6,定容至100ml)。离心(10000g,15min,4℃)，得到沉淀P7和上清液S7。S7放在-70℃冰箱冻存，留待检测。
实施例2
①取上述杏仁核50mg，加入缓冲液A 500μl匀浆，同时加入40μl蛋白酶抑制剂储存液(按产品使用说明书用2ml 0.1M PBS溶解1片Roche cOmplete Tablets配置成25×蛋白酶抑制剂储存液)。缓冲液A为：0.32M蔗糖缓冲液，pH7.4(配置100ml缓冲液A，需10.95g蔗糖，0.24g HEPES)。匀浆结束后，离心(1000g,10min,4℃)，得到沉淀P1和上清液S1。
②取上清液S1再次离心(12000g,20min,4℃)，得到沉淀P2和上清液S2。
③取沉淀P2用，加入200μl缓冲液B重悬。缓冲液B为：4mM HEPES缓冲液，pH7.4(配置100ml缓冲液B，需0.0953g HEPES，0.0292g EDTA)。离心(12000g,20min,4℃)，取上清液重复以上步骤，再次用200μl缓冲液B重悬，离心(12000g,20min,4℃)，得到沉淀P3(合并两次离心所得的沉淀)和上清液S3。
④取沉淀P3，加入120μl缓冲液C重悬，缓冲液C为：20mM HEPES,100mM NaCl,0.5％Tritonx-100，pH7.2(配置100ml缓冲液C，需0.4766g HEPES,0.5844g NaCl,0.5mlTritonx-100)。轻转(100g,15min,4℃)，再离心(12000g,20min,4℃)，得到沉淀P4和上清液S4。
⑤取沉淀P4，加入100μl缓冲液D重悬。缓冲液D为：20mM HEPES,0.15mM NaCl,1％Tritonx-100,1％Deoxycholic acid,1％SDS,1mM DTT，pH7.5(配置100ml缓冲液D，需0.4766g HEPES,0.0009g NaCl,1ml Tritonx-100,1g Deoxycholic acid,1g SDS,0.0154gDTT)。轻转(100g,1h,4℃)，离心(10000g,15min,4℃)，得到沉淀P5和上清液S5。S5放在-70℃冰箱冻存，留待检测。
⑥取上清液S4，高速离心(50000g,30min,4℃)，得到沉淀P6和上清液S6。S6放在-70℃冰箱冻存，留待检测。
⑦取沉淀P6，加入100μl缓冲液E重悬。缓冲液E为：25mM Tris-HCl(配置100ml缓冲液E，称0.3032g Tris,置于80ml蒸馏水中，用浓HCl调pH7.6,定容至100ml)。离心(10000g,15min,4℃)，得到沉淀P7和上清液S7。S7放在-70℃冰箱冻存，留待检测。
上述实施例1、2分别所得的上清液S5、S6、S7的蛋白浓度定量采用BCA法测定，皮层组织样本(S5,S6,S7)的蛋白浓度分别为3616μg/ml,3396μg/ml,4901μg/ml，杏仁核组织样本(S5,S6,S7)的蛋白浓度分别为1859μg/ml,1451μg/ml,2717μg/ml。
上述上清液(S5、S6、S7)各取80μl加入20μl 5×蛋白上样缓冲液，沸煮5分钟，待冷却后采用免疫印迹法进行蛋白的测定，所需抗体如表1所示。分别用PSD-95作为突触前膜标记物，SNAP-25作为突触后膜标记物，Synaptophysin作为突触囊泡标记物，测定结果见图2。由测定结果可以看出，上清液S5主要是突触后膜成分，上清液S6主要是突触囊泡成分，上清液S7主要是突触前膜成分，证明了本发明方法能够有效地从大脑皮层及小核团的杏仁核等脑组织中分别分离出突触前膜、突触后膜和突触囊泡。
采用本发明方法分离后的突触前后膜，分别进行NMDA受体亚型GluN2B和Kainate受体亚型GluK1的含量测定，测定结果见图3。在皮层组织样本中，突触后膜GluN2B含量要显著高于突触前膜(p<0.05)，而GluK1则在突触前膜高表达(p<0.05)；在杏仁核组织样本中，突触后膜GluN2B含量也显著高于突触前膜(p<0.01)，但GluK1在突触前后膜表达没有显著差异。提示我们皮层突触前膜GluK1可能发挥重要调节作用。
表1蛋白免疫印迹法使用的一抗和二抗
抗体类型 种属 特异性 产品编号和公司 稀释比
一抗 鼠 β-actin sc1616,Santa Cruz 1:10000
一抗 兔 PSD-95 ab76115,abcam 1:2000
一抗 兔 SNAP-25 ab108990,abcam 1:1000
一抗 兔 Synaptophysin ab32127,abcam 1:10000
一抗 兔 GluN2B AB1557,Millipore 1:500
一抗 兔 GRIK1 ab67316,abcam 1:500
二抗 山羊 Anti-rabbit ZB-2301,中杉金桥 1:10000
二抗 山羊 Anti-mouse ZB-2305,中杉金桥 1:10000
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种突触前膜分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体脑组织置于缓冲液A中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到沉淀P2；
(2)沉淀P2用缓冲液B重悬，于12000g下离心，得到沉淀P3；
(3)沉淀P3用缓冲液C重悬，于12000g下离心，所得上清液再于50000g下离心，得到沉淀P6；
(4)沉淀P6用缓冲液E重悬，于10000g下离心，得到主要是突触前膜成分的上清液S7；
其中，所述缓冲液A为pH＝7.4的蔗糖-HEPES缓冲液，蔗糖浓度为0.32M，HEPES浓度为10mM；
所述缓冲液B为pH＝7.4的EDTA-HEPES缓冲液，EDTA浓度为1mM，HEPES浓度为4mM；
所述缓冲液C为pH＝7.2的Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，NaCl浓度为100mM,Tritonx-100浓度为0.5vt％，HEPES浓度为20mM；
所述缓冲液E为25mM Tris-HCl缓冲液，pH＝7.6。
2.根据权利要求1所述的突触前膜分离方法，其特征在于：
步骤(1)中，于1000g下离心10min，于12000g下离心20min；
步骤(2)中，于12000g下重复离心两次，每次20min；
步骤(3)中，于12000g下离心20min，于50000g下离心30min；
步骤(4)中，于10000g下离心15min；
上述各步骤的离心均在4℃下进行。
3.根据权利要求1所述的突触前膜分离方法，其特征在于：所述脑组织为大脑皮层、杏仁核、腹侧被盖区和/或伏隔核。
4.根据权利要求1所述的突触前膜分离方法，其特征在于：向缓冲液A中加入适量的蛋白酶抑制剂。
5.一种突触囊泡分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体脑组织置于缓冲液A中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到沉淀P2；
(2)沉淀P2用缓冲液B重悬，于12000g下离心，得到沉淀P3；
(3)沉淀P3用缓冲液C重悬，于12000g下离心，所得上清液再于50000g下离心，得到主要是突触囊泡成分的上清液S6；
其中，所述缓冲液A为pH＝7.4的蔗糖-HEPES缓冲液，蔗糖浓度为0.32M，HEPES浓度为10mM；
所述缓冲液B为pH＝7.4的EDTA-HEPES缓冲液，EDTA浓度为1mM，HEPES浓度为4mM；
所述缓冲液C为pH＝7.2的Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，NaCl浓度为100mM,Tritonx-100浓度为0.5vt％，HEPES浓度为20mM。
6.根据权利要求5所述的突触囊泡分离方法，其特征在于：
步骤(1)中，于1000g下离心10min，于12000g下离心20min；
步骤(2)中，于12000g下重复离心两次，每次20min；
步骤(3)中，于12000g下离心20min，于50000g下离心30min；
上述各步骤的离心均在4℃下进行，优选地，向缓冲液A中加入适量的蛋白酶抑制剂。
7.根据权利要求5所述的突触囊泡分离方法，其特征在于：所述脑组织为大脑皮层、杏仁核、腹侧被盖区和/或伏隔核。
8.一种突触后膜分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体脑组织置于缓冲液A中匀浆后，于1000g下离心，所得上清液再于12000g下离心，得到沉淀P2；
(2)沉淀P2用缓冲液B重悬，于12000g下离心，得到沉淀P3；
(3)沉淀P3用缓冲液C重悬，于12000g下离心，得到沉淀P4；
(4)沉淀P4用缓冲液D重悬，于10000g下离心，得到主要是突触后膜成分的上清液S5；
其中，所述缓冲液A为pH＝7.4的蔗糖-HEPES缓冲液，蔗糖浓度为0.32M，HEPES浓度为10mM；
所述缓冲液B为pH＝7.4的EDTA-HEPES缓冲液，EDTA浓度为1mM，HEPES浓度为4mM；
所述缓冲液C为pH＝7.2的Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，NaCl浓度为100mM,Tritonx-100浓度为0.5vt％，HEPES浓度为20mM；
所述缓冲液D为pH＝7.5的二硫苏糖醇-SDS-脱氧胆酸-Tritonx-100-NaCl-HEPES缓冲液，HEPES浓度为20mM,NaCl浓度为0.15mM,Tritonx-100浓度为1vt％,脱氧胆酸浓度为1wt％，SDS浓度为1wt％，二硫苏糖醇浓度为1mM。
9.根据权利要求8所述的突触后膜分离方法，其特征在于：
步骤(1)中，于1000g下离心10min，于12000g下离心20min；
步骤(2)中，于12000g下重复离心两次，每次20min；
步骤(3)中，于12000g下离心20min；
步骤(4)中，于10000g下离心15min；
上述各步骤的离心均在4℃下进行，优选地，向缓冲液A中加入适量的蛋白酶抑制剂。
10.根据权利要求8所述的突触后膜分离方法，其特征在于：所述脑组织为大脑皮层、杏仁核、腹侧被盖区和/或伏隔核。
CN201910528361.6A 2019-06-18 2019-06-18 一种突触前膜分离方法 Withdrawn CN110331133A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910528361.6A CN110331133A (zh) 2019-06-18 2019-06-18 一种突触前膜分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910528361.6A CN110331133A (zh) 2019-06-18 2019-06-18 一种突触前膜分离方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110331133A true CN110331133A (zh) 2019-10-15

Family

ID=68142768

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910528361.6A Withdrawn CN110331133A (zh) 2019-06-18 2019-06-18 一种突触前膜分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110331133A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118185873A (zh) * 2024-03-26 2024-06-14 大连理工大学 一种突触囊泡的提取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2959917A2 (en) * 2007-10-19 2015-12-30 The Regents of The University of California Compositions and methods for ameliorating cns inflammation, psychosis, delirium, ptsd or ptss
CN105641694A (zh) * 2008-12-19 2016-06-08 H.隆德贝克有限公司 用于治疗精神和行为障碍的对Vps10p-结构域受体家族的调节
CN109430166A (zh) * 2018-12-12 2019-03-08 徐州医科大学 一种学习记忆功能保护机制的研究方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2959917A2 (en) * 2007-10-19 2015-12-30 The Regents of The University of California Compositions and methods for ameliorating cns inflammation, psychosis, delirium, ptsd or ptss
CN105641694A (zh) * 2008-12-19 2016-06-08 H.隆德贝克有限公司 用于治疗精神和行为障碍的对Vps10p-结构域受体家族的调节
CN109430166A (zh) * 2018-12-12 2019-03-08 徐州医科大学 一种学习记忆功能保护机制的研究方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIDENORI ITO等: "Sept8 controls the binding of vesicle-associated membrane protein 2 to synaptophysin", 《JOURNAL OF NEUROCHEMISTRY》 *
TIAN-YAO SHI等: "Kainate receptor mediated presynaptic LTP in agranular insular cortex contributes to fear and anxiety in mice", 《NEUROPHARMACOLOGY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118185873A (zh) * 2024-03-26 2024-06-14 大连理工大学 一种突触囊泡的提取方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nishimura et al. Interaction of synaptic scaffolding molecule and β-catenin
Domin et al. The class II phosphoinositide 3-kinase PI3K-C2α is concentrated in the trans-Golgi network and present in clathrin-coated vesicles
Fukasawa et al. Slit diaphragms contain tight junction proteins
Lisé et al. Involvement of myosin Vb in glutamate receptor trafficking
De Camilli et al. Heterogeneous distribution of the cAMP receptor protein RII in the nervous system: evidence for its intracellular accumulation on microtubules, microtubule-organizing centers, and in the area of the Golgi complex.
Penmatsa et al. Compartmentalized cyclic adenosine 3′, 5′-monophosphate at the plasma membrane clusters PDE3A and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator into microdomains
Bukovsky et al. Placental expression of estrogen receptor beta and its hormone binding variant–comparison with estrogen receptor alpha and a role for estrogen receptors in asymmetric division and differentiation of estrogen-dependent cells
Xie et al. Potentiation of a sodium–calcium exchanger in the nuclear envelope by nuclear GM1 ganglioside
Cervio et al. Sera of patients with celiac disease and neurologic disorders evoke a mitochondrial-dependent apoptosis in vitro
Suckau et al. LPA1, LPA2, LPA4, and LPA6 receptor expression during mouse brain development
Inamura et al. Differential localization and regulation of stargazin-like protein, γ-8 and stargazin in the plasma membrane of hippocampal and cortical neurons
Khan et al. The role of Wnt/β-catenin pathway mediators in aortic valve stenosis
Fukaya et al. EFA 6A, a guanine nucleotide exchange factor for Arf6, interacts with sorting nexin‐1 and regulates neurite outgrowth
Mei et al. The role of galectin-3 in spermatozoa-zona pellucida binding and its association with fertilization in vitro
Stackpole et al. N-myristoylation regulates the axonal distribution of the Fragile X-related protein FXR2P
Kittur et al. The nucleolar channel system of human endometrium is related to endoplasmic reticulum and R-rings
Baxendale et al. Immunolocalization of multiple Gα subunits in mammalian spermatozoa and additional evidence for Gαs
CN110331133A (zh) 一种突触前膜分离方法
Aliagas et al. Changes in expression and activity levels of ecto‐5′‐nucleotidase/CD73 along the mouse female estrous cycle
Ibuchi et al. The Vps52 subunit of the GARP and EARP complexes is a novel Arf6-interacting protein that negatively regulates neurite outgrowth of hippocampal neurons
van der Goes et al. Determination of the sequential degradation of myelin proteins by macrophages
Xiang et al. Expression of endothelial nitric oxide synthase traffic inducer in the placentas of women with pre‐eclampsia
Guo et al. Developmental regulation of Na+/myo-inositol cotransporter gene expression
Chen et al. Role and mechanism of insulin‐like growth factor 2 on the proliferation of human trophoblasts in vitro
Pan et al. Identification of aquaporin-5 and lipid rafts in human resting saliva and their release into cevimeline-stimulated saliva

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20191015

WW01 Invention patent application withdrawn after publication