CN110327490B - 一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架及其制备方法，所述多维复合支架为采用低温多喷头3D打印技术一体成型的多维空间几何结构，所述多维复合支架至少包含PLGA/TCP/Mg/CGF的化学组成，所述CGF(细胞生长因子)为多种，且分布在所述多维复合支架中，所述多维复合支架在降解过程中梯度释放各种所述CGF。该支架实现多种细胞生长因子成分的时空分布及梯度释放控制，在植入人体之后由于该支架中复合不同浓度不同梯度的生长因子，从而使支架在降解过程中梯度释放各种细胞生长因子，匹配和加速体内骨缺损修复重建的生理过程，决临床上骨缺损修复的瓶颈问题。

Description

一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及脊柱融合内固定领域，具体涉及一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架及其制备方法。
背景技术
高能量创伤、骨肿瘤、骨髓炎常导致大段骨缺损，治疗十分困难，植骨所需的骨移植材料来源有限、并发症多，体外组织工程技术临床疗效仍欠佳。而骨延长骨搬运技术存在治疗时间长、费用高、钉道松动、感染等风险。原位组织诱导再生技术为近年研究热点。
骨缺损愈合过程中需要一系列的细胞生长因子(cell growth factor,CGF)进行调控，主要包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、转化生长因子-β(transforminggrowthfactorβ，TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrowth factor，PDGF)、表皮生长因子(epidermic growth factor，EGF)等。在骨缺损修复重建的不同阶段需要不同的生长因子，也有些生长因子是重叠出现的。骨修复的早期主要为支架的快速血管化，VEGF是主要的生长因子，中期伴随着血管长入支架，血管周围游走的间充质细胞或骨髓基质干细胞开始诱导转化为软骨细胞和骨细胞，BMP-2在这一时期是主要的生长因子。TGF-β具有促进细胞增殖、调节细胞分化、促进细胞外基质合成作用，TGF-β1和TGF-β2都可促进骨膜间充质细胞的增殖和分化、诱导间充质细胞转变为软骨细胞，同时促进成软骨细胞的增殖和细胞外基质如胶原、透明质酸和蛋白聚糖的合成，在整个修复重建过程中特别是骨愈合的中晚期起着重要作用。
传统的原位组织诱导性生物材料存在以下问题：力学强度不足、单一网孔结构、无多维空间构象、生物活性分子释放不可控、形态大小与体内骨缺损无法匹配，无法实现符合体内生理修复过程需要的材料的梯度降解及生长因子的梯度释放等问题。因此，设计一种与体内骨缺损修复重建生理过程相匹配的、能够梯度降解及梯度释放生长因子的原位组织诱导性生物材料是解决临床上大段骨缺损修复的关键所在。
3D打印新技术的出现，为解决上述难题提供了可能。通过计算机辅助设计可以实现材料的多维空间结构，同时利用低温3D打印技术可以直接在支架中加入各种生长因子，应用多喷头3D打印技术实现支架内层、中层、外层各种复合材料的梯度打印及各种生长因子的梯度分布，匹配或加速体内骨缺损修复重建的生理过程，有望解决临床上骨缺损修复的瓶颈问题。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提出一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架，所述多维复合支架为采用低温多喷头3D打印技术一体成型的多维空间几何结构，所述多维复合支架至少包含PLGA/TCP/Mg/CGF的化学组成，所述CGF(细胞生长因子)为多种，且分布在所述多维复合支架中，所述多维复合支架在降解过程中梯度释放各种所述CGF(细胞生长因子)。
进一步地，所述CGF(细胞生长因子)包含血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)中的一种或几种。
进一步地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)中的一种或几种。
进一步地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)中的一种或几种。
进一步地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)中的一种或几种。
进一步优选地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)中的一种或几种。
进一步地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)中的一种或两种。
进一步地，所述多维复合支架的PLGA/TCP/Mg组份之间至少有两种以上不同的混合比例可供选用。
本发明的第二个方面是提供一种如上述所述方法制备的一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)首先配制PLGA高分子含TCP及镁粉基本溶液(PLGA/TCP/Mg)：10-14wt％的PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液，将3-6wt％镁粉(镁粉颗粒大小为50微米)及TCP混入所述PLGA高分子溶液中，PLGA与TCP的质量比为4:1，经搅拌及剧烈震动后充分分散镁粉及TCP颗粒；
(2)在步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制A溶液为：rhBMP-2+PLGA/TCP/Mg基本溶液，rhBMP-2浓度为10ng/ml；
(3)在步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制B溶液为：TGF-β+PLGA/TCP/Mg基本溶液，TGF-β浓度为10ng/ml；
(4)把步骤(1)制备的基本溶液放入多喷头打印机的C喷头对应的物料罐中，把步骤(2)制备的A溶液放入多喷头打印机的A喷头对应的物料罐中，把步骤(3)制备的B溶液放入多喷头打印机的B喷头对应的物料罐中；
(5)通过多喷头技术结合低温3D打印技术打印圆柱体形，长度约为20mm双层多孔支架，该支架中最外围圆柱体为步骤(1)制备的PLGA/TCP/Mg基本溶液，中间层打印步骤(2)制备的A溶液，最里层打印步骤(3)制备的B溶液；
(6)低温调节下打印后，经真空冷冻干燥去除支架内有机溶剂后得到多维复合支架，该多维复合支架表面具有微孔洞结构，随后将支架浸泡在10ng/mlVEGF溶液中，物理吸附VEGF；
(7)将所述步骤(6)中得到的成型块直接冷冻干燥48小时及得到多生长因子可梯度释放的多维复合支架。
进一步地，步骤(1)中PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液的浓度为11-13wt％，镁粉浓度为4-6wt％。
进一步优选地，步骤(1)中PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液的浓度为12wt％，镁粉浓度为5wt％。
进一步地，步骤(7)制得的所述多维复合支架的孔隙率>80％、孔径300-500微米、孔连通率100％。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
(1)本发明人前期创新设计的PLGA/TCP/Mg复合材料，具有良好的生物相容性和促成骨活性，可促进间充质细胞骨向分化，本发明在前期的基础上设计具备促进和加速大段骨缺损的修复能力的含多种生长因子并可梯度释放的新型支架；
(2)本发明拟对该支架材料进行多维空间构象优化打印设计，实现材料的降解性能与力学强度的平衡，同时3D低温打印复合不同浓度的生长因子，体内外实验检测该多维复合支架的理化性能、生物学性能及成骨能力，分析支架梯度降解、生长因子梯度释放动态曲线，找出最佳多维空间构象与梯度，使该材料具备与体内骨缺损生理修复过程相匹配的梯度降解、梯度释放及促骨诱导骨再生性能(4D打印)，为解决临床大段骨缺损修复的难题奠定基础；
(3)通过对新型材料多维空间结构的3D打印参数的精细调控，实现CGF在PLGA/TCP/Mg多维复合支架中的多维度梯度分布及有序时空差异性梯度释放，实现PLGA/TCP/Mg支架梯度降解与生物分子的有序释放；
(4)支架的制备利用多喷头结合低温3D打印技术，在PLGA/TCP/Mg/支架中复合不同浓度不同梯度的生长因子，从而使PLGA/TCP/Mg/CGF支架在降解过程中梯度释放各种细胞生长因子，匹配和加速体内骨缺损修复重建的生理过程，决临床上骨缺损修复的瓶颈问题。
附图说明
图1为本发明一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架的结构示意图；
图2为本发明一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架在扫描电镜图像(X35)下的空隙图；
图3为本发明一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架在扫描电镜图像(X100)下的空隙图；
图4为山羊胫骨中段大段骨缺损模型的示意图；
图5为本发明一种多维复合支架联合钢板植入图4所示缺损模型修复胫骨中段骨缺损的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架，如图1所示，所述多维复合支架为采用低温多喷头3D打印技术一体成型的多维空间几何结构，该多维复合支架至少包含PLGA/TCP/Mg/CGF的化学组成、多维空间几何结构的多参数可精细调控，所述多维复合支架至少包含PLGA/TCP/Mg/CGF的化学组成，所述CGF(细胞生长因子)为多种，包括血管内皮生长因子VEGF、骨形态发生蛋白BMP、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子IGF、成纤维细胞生长因子FGF、血小板衍生生长因子PDGF、表皮生长因子EGF中的一种或几种。
在微观上，如图2和图3所示，图2为支架在扫描电镜图像(X35)下的空隙图，图3为支架在扫描电镜图像(X100)下的空隙图，该多维复合支架利用多喷头结合低温3D打印技术，在PLGA/TCP/Mg/支架中复合不同浓度不同梯度的生长因子，从而使PLGA/TCP/Mg/CGF支架在降解过程中梯度释放各种细胞生长因子，匹配和加速体内骨缺损修复重建的生理过程，决临床上骨缺损修复的瓶颈问题。
具体地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)中的一种或几种。较为优选地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)中的一种或几种。进一步较为优选地，所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子(IGF)中的一种或几种。更为优选所述CGF(细胞生长因子)包含骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)中的一种或两种。
所述多维复合支架的PLGA/TCP/Mg组份之间至少有两种以上不同的混合比例可供选用，如在12wt％的PLGA、4wt％的TCP、4wt％的Mg组成的混合比例与12wt％的PLGA、5wt％的TCP、5wt％的Mg组成的混合比例之间选用。优选地，多维复合支架PLGA/TCP/Mg组份中至少有三种不同的混合比例可供选用，如在12wt％的PLGA、4wt％的TCP、4wt％的Mg组成的混合比例；12wt％的PLGA、5wt％的TCP、5wt％的Mg组成的混合比例与13wt％的PLGA、5wt％的TCP、5wt％的Mg之间选用。
本发明还提供一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架的制备方法，该多维复合支架在制备过程中利用低温多喷头3D打印技术，涉及PLGA/TCP/Mg/CGF复合材料多维生物活性支架3D打印制备方法及其理化性能精细调控参数，这些参数包括支架微小单元构象、支架孔径、孔隙率、连通率、材料组成、力学强度、降解性能及其生物活性等。在该多喷头结合低温3D打印技术中3D打印喷头至少有2个以上，更优选地，3D打印喷头至少有3个。
具体地，该多生长因子可梯度释放的多维复合支架的制备方法，以下步骤：
(1)首先配制PLGA高分子含TCP及镁粉基本溶液(PLGA/TCP/Mg)：10-14wt％的PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液，将3-6wt％镁粉(镁粉颗粒大小为50微米)及TCP混入所述PLGA高分子溶液中，PLGA与TCP的质量比为4:1，经搅拌及剧烈震动后充分分散镁粉及TCP颗粒；
(2)在步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制A溶液为：rhBMP-2+PLGA/TCP/Mg基本溶液，rhBMP-2浓度为10ng/ml；
(3)在步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制B溶液为：TGF-β+PLGA/TCP/Mg基本溶液，TGF-β浓度为10ng/ml；
(4)把步骤(1)制备的基本溶液放入多喷头打印机的C喷头对应的物料罐中，把步骤(2)制备的A溶液放入多喷头打印机的A喷头对应的物料罐中，把步骤(3)制备的B溶液放入多喷头打印机的B喷头对应的物料罐中；
(5)通过多喷头技术结合低温3D打印技术打印圆柱体形，长度约为20mm双层多孔支架，该支架中最外围圆柱体为步骤(1)制备的PLGA/TCP/Mg基本溶液，中间层打印步骤(2)制备的A溶液，最里层打印步骤(3)制备的B溶液；
(6)低温调节下打印后，经真空冷冻干燥去除支架内有机溶剂后得到多维复合支架，该多维复合支架表面具有微孔洞结构，随后将支架浸泡在10ng/mlVEGF溶液中，物理吸附VEGF；
(7)将所述步骤(6)中得到的成型块直接冷冻干燥48小时及得到多生长因子可梯度释放的多维复合支架。
在该多生长因子可梯度释放的多维复合支架的制备方法中，PLGA/TCP/Mg/CGF复合支架的化学组成、多维空间几何结构的多参数精细调控和对该支架材料进行多维空间构象优化打印设计，实现材料的降解性能与力学强度的平衡，调整多维复合支架的主要参数，使支架孔径模拟天然松质骨从几百微米至几微米的微孔及其分布状态、力学强度与天然骨接近、降解性能与骨生长速度相匹配。
采用本发明方法制备的多生长因子可梯度释放的多维复合支架，通过多喷头技术结合低温快速成型时的关键参数调控，改变CGF在PLGA/TCP/Mg多维复合支架内的含量，实现CGF在多维复合支架中的梯度分布，制备孔隙率>80％、孔径300-500微米、孔连通率100％的PLGA/TCP/Mg/CGF多维复合支架，并使用Micro-CT，扫描电镜，力学测试仪等检测多维复合支架本身的材料学特性和力学特性。
本发明制备方法通过对新型材料多维空间结构的3D打印参数的精细调控，实现CGF在PLGA/TCP/Mg多维复合支架中的多维度梯度分布及有序时空差异性梯度释放，实现PLGA/TCP/Mg支架梯度降解与生物分子的有序释放。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
以下实施例中所用各试剂均直接购于市场，例如：PLGA高分子购自山东省医疗器械研究所，TCP购自北京现代东方精细化学制品有限公司，rhBMP-2、TGF-β和VEGF购自艾博抗(上海)贸易有限公司。
实施例1
一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架，具体采用以下方法制备：
(1)首先配制PLGA高分子含TCP及镁粉基本溶液(PLGA/TCP/Mg)：12wt％的PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液，将4wt％镁粉(镁粉颗粒大小为50微米)及TCP混入所述PLGA高分子溶液中，PLGA与TCP的质量比为4:1，经搅拌及剧烈震动后充分分散镁粉及TCP颗粒；
(2)在所述步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制A溶液为：rhBMP-2+PLGA/TCP/Mg基本溶液，rhBMP-2浓度为10ng/ml；
(3)在所述步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制B溶液为：TGF-β+PLGA/TCP/Mg基本溶液，TGF-β浓度为10ng/ml；
(4)把所述步骤(1)制备的基本溶液放入多喷头打印机的C喷头对应的物料罐中，把所述步骤(2)制备的A溶液放入多喷头打印机的A喷头对应的物料罐中，把所述步骤(3)制备的B溶液放入多喷头打印机的B喷头对应的物料罐中；
(5)通过多喷头技术结合低温3D打印技术打印圆柱体形，长度约为20mm双层多孔支架，该支架中最外围圆柱体为所述步骤(1)制备的PLGA/TCP/Mg基本溶液，中间层打印所述步骤(2)制备的A溶液，最里层打印所述步骤(3)制备的B溶液；
(6)低温调节下打印后，经真空冷冻干燥去除支架内有机溶剂后得到支架，该支架表面具有微孔洞结构，随后将支架浸泡在10ng/ml VEGF溶液中，物理吸附VEGF；
(7)将所述步骤(6)中得到的成型块直接冷冻干燥48小时及得到多生长因子可梯度释放的多维复合支架，其结构如附图1所示。
实施例2
一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架采用以下方法制备：
(1)首先配制PLGA高分子含TCP及镁粉基本溶液(PLGA/TCP/Mg)：14wt％的PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液，将5wt％镁粉(镁粉颗粒大小为50微米)及TCP混入所述PLGA高分子溶液中，PLGA与TCP的质量比为4:1，经搅拌及剧烈震动后充分分散镁粉及TCP颗粒；
(2)在所述步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制A溶液为：rhBMP-2+PLGA/TCP/Mg基本溶液，rhBMP-2浓度为10ng/ml；
(3)在所述步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制B溶液为：TGF-β+PLGA/TCP/Mg基本溶液，TGF-β浓度为10ng/ml；
(4)把所述步骤(1)制备的基本溶液放入多喷头打印机的C喷头对应的物料罐中，把所述步骤(2)制备的A溶液放入多喷头打印机的A喷头对应的物料罐中，把所述步骤(3)制备的B溶液放入多喷头打印机的B喷头对应的物料罐中；
(5)通过多喷头技术结合低温3D打印技术打印圆柱体形，长度约为20mm双层多孔支架，该支架中最外围圆柱体为所述步骤(1)制备的PLGA/TCP/Mg基本溶液，中间层打印所述步骤(2)制备的A溶液，最里层打印所述步骤(3)制备的B溶液；
(6)低温调节下打印后，经真空冷冻干燥去除支架内有机溶剂后得到支架，该支架表面具有微孔洞结构，随后将支架浸泡在10ng/ml VEGF溶液中，物理吸附VEGF；
(7)将所述步骤(6)中得到的成型块直接冷冻干燥48小时及得到多生长因子可梯度释放的多维复合支架，其结构如附图1所示。
验证试验
以如图4所示的山羊胫骨中段大段骨缺损模型为动物实验模型。
将本发明所制备的如图1所示的多维复合支架，植入如图4所述的山羊胫骨中段大段骨缺损模型内，植入后的结构图如图5所示，该多维复合支架联合钢板内固定修复胫骨中段骨缺损。通过该动物实验验证可知，在降解过程中，该多维复合支架中各生物分子能有序释放，匹配和加速体内骨缺损修复重建的生理过程，且各生物分子随降解时间的关系曲线规律稳定，决临了床上骨缺损修复的缺陷。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (3)

1.一种多生长因子可梯度释放的多维复合支架，其特征在于，所述多维复合支架为采用低温多喷头3D打印技术一体成型的多维空间几何结构，所述多维复合支架包含PLGA/TCP/Mg/CGF的化学组成，所述CGF为多种，且分布在所述多维复合支架中，所述多维复合支架在降解过程中梯度释放各种所述CGF；所述CGF含血管内皮生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白(BMP)和转化生长因子-β(TGF-β)；
所述多维复合支架的制备方法包括如下步骤：
(1)首先配制PLGA高分子含TCP及镁粉基本溶液(PLGA/TCP/Mg)：10-14wt％的PLGA高分子1，4-二氧杂环乙烷溶液，将3-6wt％镁粉及TCP混入所述PLGA高分子溶液中，PLGA与TCP的质量比为4∶1，经搅拌及剧烈震动后充分分散镁粉及TCP颗粒；所述镁粉的颗粒大小为50微米；
(2)在步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制A溶液为：rhBMP-2+PLGA/TCP/Mg基本溶液，rhBMP-2浓度为10ng/ml；
(3)在步骤(1)制备的溶液中添加生物活性分子，配制B溶液为：TGF-β+PLGA/TCP/Mg基本溶液，TGF-β浓度为10ng/ml；
(4)把步骤(1)制备的基本溶液放入多喷头打印机的C喷头对应的物料罐中，把步骤(2)制备的A溶液放入多喷头打印机的A喷头对应的物料罐中，把步骤(3)制备的B溶液放入多喷头打印机的B喷头对应的物料罐中；
(5)通过多喷头技术结合低温3D打印技术打印圆柱体形，长度约为20mm双层多孔支架，该支架中最外围圆柱体为步骤(1)制备的PLGA/TCP/Mg基本溶液，中间层打印步骤(2)制备的A溶液，最里层打印步骤(3)制备的B溶液；
(6)低温调节下打印后，经真空冷冻干燥去除支架内有机溶剂后得到多维复合支架，该多维复合支架表面具有微孔洞结构，随后将支架浸泡在10ng/ml VEGF溶液中，物理吸附VEGF；
(7)将所述步骤(6)中得到的成型块直接冷冻干燥48小时即 得到多生长因子可梯度释放的多维复合支架。
2.根据权利要求1所述的多生长因子可梯度释放的多维复合支架，其特征在于，所述多维复合支架的PLGA/TCP/Mg组份之间至少有两种以上不同的混合比例可供选用。
3.根据权利要求1所述多生长因子可梯度释放的多维复合支架的制备方法，其特征在于，步骤(7)制得的所述多维复合支架的孔隙率＞80％、孔径300-500微米、孔连通率100％。
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