CN110305956A - 影响抑郁行为或抗抑郁行为的主效标记及其应用 - Google Patents

影响抑郁行为或抗抑郁行为的主效标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记，其位于人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列，为该序列从5′端到3′端方向的第1和8位之间的如SEQ ID NO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化；其可用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估。本发明还涉及一种含有鉴定该主效标记的引物的试剂盒，其可用于对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估。基于本发明所提供的主效标记，利用本发明所提供的试剂盒，能够简便、快速、准确地判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估，应用前景广阔。

Description

影响抑郁行为或抗抑郁行为的主效标记及其应用
技术领域
本发明属于抑郁症诊断生物标记技术领域，涉及一种影响抑郁行为或抗抑郁行为的主效标记及其应用。
背景技术
抑郁症又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性，有的甚至对临床上任何治疗策略都呈现疗效不好或无效，导致终身迁延不愈。给患者个人及家人带来巨大的痛苦，给家庭和社会带来沉重的经济负担。因此，对于抑郁症的诊断和预后评估极其重要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记。本发明的目标之二是提供用于鉴定上述主效标记的引物探针。本发明的目标之三是提供含有鉴定上述主效标记的引物探针的试剂套装或试剂盒。根据本发明所提供的主效标记，采用鉴定上述主效标记的引物探针的试剂套装或试剂盒，能够实现快速、简便、准确地对患者的抑郁症进行诊断、精准治疗和预后评估。
为此，本发明第一方面提供了一种影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记，所述主效标记位于人或动物的钟基因Per(Period)启动子区CRE序列，所述主效标记为人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列第1和8位之间的如SEQ ID NO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化。
根据本发明，所述SEQ ID NO-1为TGACGTCA。
在本发明的一些实施例中，所述钟基因Per启动子区包括钟基因Per1启动子区和/或Per2启动子区。
本发明第二方面提供了一种用于抑郁症诊断、精准治疗或预后评估的主效标记，其为如本发明第一方面所述的影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记。
本发明第三方面提供了一种用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂套装，其包含作为探针用于鉴定如本发明第一方面所述的主效标记或如本发明第二方面所述的主效标记的引物。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于鉴定位于患者的钟基因Per1启动子区CRE序列的主效标记的引物包括以下引物对中的一种或几种：
Per1-F1：5′-ACGTCACCTCCCTCTCTCGCC-3′；
Per1-R：5′-GAGGCGGAGAAGCAGGGTTCTA-3′；
Per1-F2：5′-CCTCCGCTTCCTCCCTCTCTC-3′；
Per1-R：5′-GAGGCGGAGAAGCAGGGTTCTA-3′；
在本发明的另一些具体优选的实施例中，用于鉴定位于患者的钟基因Per2启动子区CRE序列的主效标记的引物包括以下引物对中的一种或几种；
Per2-F：5′-AGAATCCAACCGAGTGAGAAACCG-3′；
Per2-R1：5′-ACGTCAATGGTGGCTGCATTGTT-3′；
Per2-F：5′-AGAATCCAACCGAGTGAGAAACCG-3′；
Per2-R2：5′-TCCTCACTTTCATATGGTGGCTGC-3′。
本发明第四方面提供了一种用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂盒，其包括含有如本发明第三方面所述的试剂套装中所述的引物中的一种或几种。
本发明第五方面提供了一种如本发明第三方面所述的试剂套装在制备用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂盒中的应用。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒包括含有如本发明第三方面所述的试剂套装中所述的引物中的一种或几种。
根据本发明的一些实施例方式，所述应用包括：利用试剂盒中的引物探针来鉴定患者的钟基因Per启动子区CRE序列从5′端到3′端方向的第1和8位之间是否存在如SEQ IDNO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化，并籍此判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估。
在本发明的一些实施例中，所述SEQ ID NO：1为TGACGTCA。
在本发明的一些实施例中，所述钟基因Per启动子区包括钟基因Per1启动子区和/或Per2启动子区。
根据本发明的一些具体实施方式，所述应用包括：
步骤A，采集外周静脉血，提取总DNA；
步骤B，以步骤A中提取的DNA为模板，采用如本发明第三方面所述的试剂套装或如本发明第五方面所述的试剂盒中所含的引物为扩增引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤C，鉴定PCR扩增产物中CRE序列的完整性及表观遗传修饰变化；
步骤D，基于步骤C的鉴定结果，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估；
在本发明的一些具体实施例中，在步骤D中，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应的基准包括：
(1)钟基因Per1启动子区CRE序列的全部缺失或部分缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，引起轻-中度抑郁症；
(2)钟基因Per2启动子区CRE序列的全部缺失或部分缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，引起中度以上的抑郁症发作；
(3)没有钟基因Per启动子区CRE序列的上述变化，患有抑郁的个体对临床上抗抑郁策略呈现的反应比较好；
(4)具有上述钟基因Per启动子区CRE序列变化的抑郁症患者，呈现对目前临床上的抗抑郁策略反应不好，甚至无反应；优选考虑对其进行生物节律系统的调节治疗。
本发明所提供的影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记位于患者的钟基因Per启动子区CRE序列，其可以用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估。含有鉴定该主效标记的引物的试剂盒能够用于对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估。基于本发明所提供的标记，利用本发明所提供的试剂盒，能够简便、准确地判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估，应用前景广阔。
附图说明
下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：
图1示出糖水偏爱试验所呈现的钟基因Per1/Per2启动子区的CRE序列点突变对大鼠抑郁样行为及CCPA抗抑郁样作用的影响。
图1中，A为动物实验流程图；B为给予CCPA之前的糖水偏爱测试结果；C1为给予CCPA后12h时的糖水偏爱测试结果；C2为给予CCPA后24h时的糖水偏爱测试结果；C3为给予CCPA后36h时的糖水偏爱测试结果；CCPA是被验证为具有快速抗抑郁样作用的腺苷A1受体激动剂2-氯-N6-环戊基腺苷。
图2示出强迫游泳试验所呈现的钟基因Per1/Per2启动子区的CRE序列点突变对大鼠抑郁样行为及CCPA抗抑郁样作用的影响。
图2中，A为动物实验流程图；D为给予CCPA之前的强迫游泳测试结果；E1为给予CCPA后12h时的强迫游泳测试结果；E2为给予CCPA后24h时的强迫游泳测试结果；E3为给予CCPA后36h时的强迫游泳测试结果；CCPA是被验证为具有快速抗抑郁样作用的腺苷A1受体激动剂2-氯-N6-环戊基腺苷。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。
除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
I.术语
本发明中所述用语“抑郁症”又称抑郁障碍，以显著而持久的心境低落为主要临床特征，是心境障碍的主要类型。临床可见心境低落与其处境不相称，情绪的消沉可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，自卑抑郁，甚至悲观厌世，可有自杀企图或行为；甚至发生木僵；部分病例有明显的焦虑和运动性激越；严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。每次发作持续至少2周以上、长者甚或数年，多数病例有反复发作的倾向，每次发作大多数可以缓解，部分可有残留症状或转为慢性。
本发明中所述抑郁症包括一般意义上的抑郁症和由心理、社会因素引发的抑郁症，或由其它任何躯体因素所诱发的抑郁症，可以由脑外伤、心脑血管疾病、癌症或癌症治疗中使用干扰素等药物诱发、生活或社会节律紊乱引发、慢性睡眠障碍引发、也可以是慢性疼痛、糖尿病等慢性躯体疾病引发，等等。
目前，因为对抑郁症严重程度的划分仅是依据主观量表评定，并没有客观的实验室检测指标作为客观划分依据，这里所描述的“轻、中度抑郁症”和“中度以上的抑郁症”的临床表现，是依据临床主观量表评定划分给出的多数患者临床表现的描述。例如，“轻、中度抑郁症”对工作和生活有一定的影响，但还能进行基本正常的生活、勉强完成日常工作任务；又例如，“中度以上的抑郁症”患者，学习、生活和工作都会受到很大的影响，社会功能部分或全部受损，基本上不能进行正常的生活和工作。
本发明中所述用语“预后评估”是指根据经验预测的疾病发展情况。预后评估分为自然预后评估和干预预后评估。疾病预后评估是评估者根据对某种疾病的了解，包括其临床表现、化验室结果及影像学结果、病因、病理、病情发展规律等，以及根据治疗时机和方法结合治疗操作中所发现的新情况，对疾病的近期和远期疗效、转归恢复或进展的程度所做出的评估。干预预后评估则是医生根据临床症状或影像、化验等途径获取患者病情信息，掌握病因、病理和病情程度等，尤其是要根据治疗时机和方法结合治疗操作中所发现的新情况，结合当前临床医学干预水平、临床经验来预测判断疾病的近期和远期疗效、转归恢复或进展的程度，后续所需要的治疗时间和程序。包括康复，干预治疗后遗留的症状、体征和并发症等其它异常的发生或消失及死亡。
所述“预后评估”也包括提供时间线索，如预测某段时间内发生某种疾病的可能性。
本发明所述用语“试剂套装”是指抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估所必须使用的全部试剂或药剂的组合。
本发明所述用语“试剂盒”是指装有用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估所必须使用的全部试剂或药剂的盒子或容器。
II.实施方案
既往研究报道，p-CREB能与钟基因Per1、Per2启动子区CRE序列结合，启动相应基因的转录和表达。为验证p-CREB与钟基因Per结合，及钟基因Per1、Per2启动子区CRE序列在抑郁行为的发生和抗抑郁行为中的关键作用，本发明人采用CRISPR-Cas9技术对SD大鼠钟基因Per1、Per2启动子区CRE序列(TGACGTCA)进行点突变敲除，并发现大鼠的钟基因Per启动子区CRE序列上第1和8位之间的如SEQ ID NO：1所示序列(TGACGTCA)的全长或部分碱基的缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，在抑郁和抗抑郁行为中起到了决定性的作用。而钟基因Per启动子区CRE序列在人和大鼠中是高度保守的，本发明正是基于上述发现完成的。
因此，本发明第一方面所涉及的主效标记为影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记，其位于人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列，所述主效标记为人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列第1和8位之间的如SEQ ID NO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化。
本发明中，所述SEQ ID NO：1为TGACGTCA。实际上，该序列即为钟基因Per启动子区CRE序列。因此，本发明所述主效标记可以理解为人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化。
本发明中，所述表观遗传修饰的变化包括对DNA甲基化修饰、乙酰基化修饰和硫酰基化修饰中的一种或几种。
本发明中，所述钟基因Per启动子区包括钟基因Per1启动子区和/或Per2启动子区。
研究表明，大鼠的神经系统与人类相似，因此，大鼠广泛用于高级神经活动的研究，如奖励和惩罚实验、学习记忆、神经内科各种疾病(包括缺血性脑卒中、出血性脑卒中、帕金森氏病等)、精神科各种疾病(包括抑郁症症、精神分裂症、自闭症、痴呆症、精神发育迟滞等)的研究。基于此，本发明人建立了抑郁相关基因的大鼠基因敲除或表观遗传修饰的变化模型，用于研究人和大鼠的抑郁/抗抑郁行为。
本发明人研究发现，人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列(TGACGTCA)的全长或部分碱基的缺失突变，使得人或动物易于呈现出抑郁行为；而人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列(TGACGTCA)的完整可以使得人或动物不易呈现抑郁行为，且呈现出对各种抗抑郁策略均具有较好的反应。因此，本发明中所述影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记，也可以理解为抑郁症相关主效标记。
在本发明的一些实施例中，大鼠的钟基因Per1的ID为：RefGene数据集_NM_001034125 rang＝chr10：55682124-55695958，而钟基因Per1启动子区CRE序列位于钟基因Per1的第1705-1712位。
在本发明的另一些实施例中，大鼠的钟基因Per2的ID为：RefGene数据集NM_031678 rang＝chr9：98557038-98599823，而钟基因Per2启动子区CRE序列位于钟基因Per2的第799-806位。
在本发明第二方面，提供了一种用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的主效标记，其为如本发明第一方面所述的影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记。这可以理解为，上述主效标记影响患者的抑郁行为/抗抑郁行为，因此，可以通过鉴定上述主效标记的存在来评价患者的抑郁行为/抗抑郁行为，并籍此对患者进行抑郁症诊断、精准治疗或预后评估。
本领域技术人员应该了解的是，本发明中所述用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的主效标记，是指该主效标记可用于实现抑郁症诊断、精准治疗和预后评估中一种或几种目标，这几种目标或处置彼此并不矛盾，既可以独立实施，也可以联合或彼此相结合实施，其可以被认为是抑郁症处理相关主效标记。
本发明中所述患者包括人或动物，所述动物包括各种科学研究用动物，优选为大鼠。
本发明第三方面提供了一种用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂套装，其包含作为探针用于鉴定如本发明第一方面所述的主效标记或如本发明第二方面所述的主效标记的引物。
在本发明的一些具体优选的实施例中，用于鉴定位于患者的钟基因Per1启动子区CRE序列的主效标记的引物包括表1所示的引物对中的一种或几种。
表1
在本发明的另一些具体优选的实施例中，用于鉴定位于患者的钟基因Per2启动子区CRE序列的主效标记的引物包括表2所示的引物对的一种或几种。
表2
上述表1和表2中的引物名称中符号“-”之前的字母和数字代表该引物是针对钟基因Per1或Per2启动子区的CRE序列的主效标记，符号“-”之后的字母“F”代表上游引物，“R”代表下游引物，数字“1”或“2”分别代表第1或第2上游引物或下游引物。
上述表1和表2中所述“PCR扩增片段大小”也称为“PCR扩增产物大小”，是指该PCR扩增产物的理论长度，亦即其所对应的钟基因Per启动子区CRE序列的野生型或杂合子或纯合子的检测序列长度。
采用上述表1的任意一个引物对，可以用于鉴定钟基因Per1启动子区CRE序列为野生型或杂合子；采用上述表2中的任意一个引物对可以用于鉴定钟基因Per2启动子区CRE序列为纯合子或杂合子；采用上述表1中的二个引物对或表2中的二个引物对可以用于鉴定钟基因Per启动子区CRE序列为野生型或杂合子或纯合子。采用上述表1或表2中的任意一个引物对均可以用于鉴定钟基因Per启动子区CRE序列的如ID NO：1所示序列(TGACGTCA)的全长的缺失/插入突变，从而对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估。
本领域技术人员应该了解的是，上述采用表1或表2中的引物鉴定钟基因Per启动子区CRE序列仅为本发明中的一些较佳的实施例，本发明中所述用于鉴定钟基因Per启动子区CRE序列的如ID NO：1所示序列(TGACGTCA)的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化的引物并不限于表1和表2中所列引物对，其他的能够鉴定钟基因Per启动子区CRE序列的如ID NO：1所示序列(TGACGTCA)的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化的引物也均可以用于本发明。
本领域技术人员还应该了解的是，本发明中所述用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂套装，是指该试剂套装可用于实现抑郁症诊断、精准治疗和预后评估中一种或几种目标，这几种目标或处置彼此并不矛盾，既可以独立实施，也可以联合或彼此相结合实施，其可以被认为是抑郁症处理相关试剂套装。
在本发明第四方面，提供了一种用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂盒，其包括含有如本发明第三方面所述的试剂套装中所述的引物中的一种或几种。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述包括含有如本发明第三方面所述的试剂套装中所述的引物中的至少二种的混合液。
本领域技术人员应该了解的是，本发明中所述用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂盒，是指该试剂套装可用于实现抑郁症诊断、精准治疗和预后评估中一种或几种目标，这几种目标或处置彼此并不矛盾，既可以独立实施，也可以联合或彼此相结合实施，其可以被认为是抑郁症处理相关试剂盒。
在本发明第五方面，提供了一种如本发明第三方面所述的试剂套装在制备用于抑郁症诊断、或精准治疗、或预后评估的试剂盒中的应用，其中：所述试剂盒包括含有如本发明第三方面所述的试剂套装中所述的引物中的一种或几种。优选地，所述包括含有如本发明第三方面所述的试剂套装中所述的引物中的至少二种的混合液。
根据本发明，所述应用包括：利用试剂盒中的引物探针来鉴定患者的钟基因Per启动子区CRE序列从5′端到3′端方向的第1和8位之间是否存在如SEQ ID NO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化，并籍此判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估。其中，所述SEQ ID NO：1为TGACGTCA。所述钟基因Per启动子区包括钟基因Per1启动子区和/或Per2启动子区。
在本发明的一些实施方式中，所述应用包括：
步骤A，采集外周静脉血，提取总DNA；
步骤B，以步骤A中提取的DNA为模板，采用如本发明第三方面所述的试剂套装或如本发明第五方面所述的试剂盒中所含的引物为扩增引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤C，鉴定PCR扩增产物中CRE序列的完整性及表观遗传修饰变化；
步骤D，基于步骤C的鉴定结果，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估；
在步骤D中，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应的基准包括：
(1)钟基因Per1启动子区CRE序列的全部缺失或部分缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，引起轻-中度抑郁症；
(2)钟基因Per2启动子区CRE序列的全部缺失或部分缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，引起中度以上的抑郁症发作；
(3)没有钟基因Per启动子区CRE序列的上述变化，患有抑郁的个体对临床上抗抑郁策略呈现的反应比较好；
(4)具有上述钟基因Per启动子区CRE序列变化的抑郁症患者，呈现对目前临床上的抗抑郁策略反应不好，甚至无反应；优选考虑对其进行生物节律系统的调节治疗。
在本发明的一些具体优选的实施例中，所述应用包括：
步骤S1，采集外周静脉血，提取总DNA；
步骤S2，以步骤S1中提取的DNA为模板，采用如表1所示的一种或二种引物对和/或如表2所示的一种或二种引物对为扩增引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤S3，鉴定PCR扩增产物中CRE序列的完整性及表观遗传修饰变化；
步骤S4，基于步骤S3的鉴定结果，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估；
在步骤S4中，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应的基准包括：
(1)钟基因Per1启动子区CRE序列的全部缺失，引起轻-中度抑郁症；
(2)钟基因Per2启动子区CRE序列的全部缺失，引起中度以上的抑郁症发作；
(3)没有钟基因Per启动子区CRE序列的上述变化，患有抑郁的个体对临床上抗抑郁策略呈现的反应比较好；
(4)具有上述钟基因Per启动子区CRE序列变化的抑郁症患者，呈现对目前临床上的抗抑郁策略反应不好，甚至无反应；优选考虑对其进行生物节律系统的调节治疗。
上述判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应的基准为本发明人经过大量试验研究确定，经反复验证，其能够较为准确、快速地判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，为进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估提供了可靠依据。
III.实施例
以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。
以下实施例中的定量试验，均设置多次重复实验，所有结果以平均值±标准误(Mean±S.E.M)表示。数据分析对于仅有基因干预的数据采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，对于既有基因干预又有抗抑郁干预的数据，采用双因素方差分析(Two-WayANOVA)；post hoc分析视数据特征分别采用Dunnett和Turkey或Mann Whitney检验完成。以p＜0.05作为差异显著性标准。
野生型实验动物：雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重260-280g)：北京维通利华实验动物技术有限公司。钟基因Per1、Per2启动子区CRE序列(TGACGTCA)点突变敲除的大鼠为本实验室繁殖生产的F2代纯合子。
实施例1：
采用CRISPR-Cas9技术对SD大鼠钟基因Per1、Per2启动子区CRE序列(TGACGTCA)进行点突变敲除。实验流程分别见图1.A和图2.A。实验分组：WT对照组、钟基因Per1 CRE序列点突变纯合子组和钟基因Per2 CRE序列点突变纯合子组。在给予CCPA或溶媒(2％DMSO和生理盐水混合溶液)前，对三组大鼠进行糖水偏爱测试和强迫游泳测试；在给予CCPA或溶媒后12小时、24小时、36小时再分别进行糖水偏爱测试和强迫游泳测试，结果如图1和图2所示。
图1中的结果显示：
三组大鼠在成年后进行糖水偏爱测试。野生型大鼠(WT)和钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠糖水偏爱测试(图1.B)，单因素方差分析显示启动子区CRE序列敲除因素在糖水偏爱测试中有主效应(F2，59＝5.918，P＝0.0045)，进一步Dunnett′s posthoc test检验显示钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠糖水消耗比值显著低于野生型大鼠(P＜0.05，图1.B)。野生型大鼠和钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠在给予CCPA或溶媒后12小时、24小时、36小时糖水偏爱测试(图1.C1-C3)。双因素方差分析显示，启动子区CRE序列敲除因素在糖水偏爱实验中有主效应(给予CCPA后12小时测试，F2，64＝8.659，P＝0.0005；给予CCPA后24小时测试，F2，64＝4.854，P＝0.0109；给予CCPA后36小时测试，F2，64＝6.811，P＝0.0021)。在糖水偏爱测试中，给予CCPA后并未显示出逆转钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠抑郁样行为的作用。
图2中的结果显示：
三组大鼠在成年后进行强迫游泳测试。野生型大鼠(WT)和钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠强迫游泳测试(图2.D)，单因素方差分析表明，CRE序列敲除因素在强迫游泳测试中有主效应(F2，53＝3.180，P＝0.0496)，进一步Dunnett′s post hoc test检验显示与野生型大鼠相比，钟基因Per2启动子区CRE序列点突变大鼠在强迫游泳测试中不动时间显著增加(P＜0.05)，而钟基因Per1启动子区CRE序列点突变大鼠在强迫游泳测试中不动时间差异无统计学意义(P＞0.05)。野生型大鼠和钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠给予CCPA或溶媒后12小时、24小时、36小时强迫游泳测试(图2.E1-E3)，双因素方差分析显示，CRE敲除因素对强迫游泳测试的不动时间有主效应(给予CCPA后12小时测试，F2，64＝4.437，P＝0.0157；给予CCPA后24小时测试，F2，64＝1.389，P＞0.05；给予CCPA后36小时测试，F2，62＝5.827，P＝0.0048)。进一步Mann Whitney检验表明野生型大鼠在给予CCPA后36小时，在强迫游泳测试中不动时间显著降低(P＜0.05)。在强迫游泳测试中，给予CCPA后也并未显示出逆转钟基因Per1/Per2启动子区CRE序列点突变大鼠抑郁样行为的作用。
以上结果表明，钟基因Per1启动子区CRE序列点突变纯合子组和钟基因Per2启动子区CRE序列点突变纯合子组均发生了抑郁样行为(P＜0.01图1.B；P＜0.05，图1.D)，然而在给予CCPA后这两组大鼠均未能逆转抑郁样行为(P＞0.05，图1.C1-3、E1-E3)，说明钟基因Per1和Per2启动子区CRE序列在CCPA快速抗抑郁样行为中具有重要的作用。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
例如，该专利可以扩展到所有临床上所述的抑郁状态，及所有的抗抑郁药物，如五羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)、五羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRIs)、单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)、三环类抗抑郁剂(TCAs)、去甲肾上腺素-多巴胺再摄取抑制剂(NDRIs)、去甲肾上腺素和特异性5-HT能调节剂、5-HT调节剂、新研发上市的氯胺酮及其衍生物和代谢产物、尚在研究的其它快速抗抑郁剂(东莨胆碱等)等；物理抗抑郁治疗策略，如电休克(包括改良电休克)治疗、直流电刺激治疗、交流电刺激治疗、经颅磁刺激治疗、迷走神经刺激治疗、深部脑刺激治疗、睡眠剥夺治疗、光治疗等。
序列表
<110> 北京大学，中国科学院大学
<120> 影响抑郁行为或抗抑郁行为的主效标记及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> （钟基因Per启动子区CRE序列）
<400> 1
tgacgtca 8
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> （引物Per1-F1）
<400> 2
acgtcacctc cctctctcgc c 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> （引物Per1-R）
<400> 3
gaggcggaga agcagggttc ta 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> （引物Per1-F2）
<400> 4
cctccgcttc ctccctctct c 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> （引物Per2-F）
<400> 5
agaatccaac cgagtgagaa accg 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> （引物Per2-R1）
<400> 6
acgtcaatgg tggctgcatt gtt 23
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> （引物Per2-R2）
<400> 7
tcctcacttt catatggtgg ctgc 24

Claims (10)

1.一种影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记，所述主效标记位于人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列，所述主效标记为人或动物的钟基因Per启动子区CRE序列从5′端到3′端方向的第1和8位之间的如SEQ ID NO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化。
2.根据权利要求1所述的主效标记，其特征在于，所述SEQ ID NO：1为TGACGTCA。
3.根据权利要求1或2所述的主效标记，其特征在于，所述钟基因Per启动子区包括钟基因Per1启动子区和/或Per2启动子区。
4.一种用于抑郁症诊断、或者精准治疗、或者预后评估的主效标记，其为如权利要求1-3中任意一项所述的影响抑郁行为/抗抑郁行为的主效标记。
5.一种用于抑郁症诊断、或者精准治疗、或者预后评估的试剂套装，其包含作为探针用于鉴定如权利要求1-3中任意一项所述的主效标记或如权利要求4所述的主效标记的引物；优选地，用于鉴定位于患者的钟基因Per1启动子区CRE序列的主效标记的引物包括以下引物对中的一种或几种：
Per1-F1：5′-ACGTCACCTCCCTCTCTCGCC-3′；
Per1-R：5′-GAGGCGGAGAAGCAGGGTTCTA-3′；
Per1-F2：5′-CCTCCGCTTCCTCCCTCTCTC-3′；
Per1-R：5′-GAGGCGGAGAAGCAGGGTTCTA-3′；
和/或，用于鉴定位于患者的钟基因Per2启动子区CRE序列的主效标记的引物包括以下引物对中的一种或几种；
Per2-F：5′-AGAATCCAACCGAGTGAGAAACCG-3′；
Per2-R1：5′-ACGTCAATGGTGGCTGCATTGTT-3′；
Per2-F：5′-AGAATCCAACCGAGTGAGAAACCG-3′；
Per2-R2：5′-TCCTCACTTTCATATGGTGGCTGC-3′。
6.一种用于抑郁症诊断、或者精准治疗、或者预后评估的试剂盒，其包括含有如权利要求5所述的试剂套装中所述的引物中的一种或几种。
7.一种如权利要求5所述的试剂套装在制备用于抑郁症诊断、或者精准治疗、或者预后评估的试剂盒中的应用；优选地，所述试剂盒包括含有如权利要求5所述的试剂套装中所述的引物中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用试剂盒中的引物探针来鉴定患者的钟基因Per启动子区CRE序列从5′端到3′端方向的第1和8位之间是否存在如SEQ ID NO：1所示序列的全长或部分碱基的缺失/插入突变和/或表观遗传修饰的变化，并籍此判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述SEQ ID NO：1为TGACGTCA；和/或，所述钟基因Per启动子区包括钟基因Per1启动子区和/或Per2启动子区。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括：
步骤A，采集外周静脉血，提取总DNA；
步骤B，以步骤A中提取的DNA为模板，采用权利要求5所述的试剂套装或权利要求6所述的试剂盒中所含的引物为扩增引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；
步骤C，鉴定PCR扩增产物中CRE序列的完整性及表观遗传修饰变化；
步骤D，基于步骤C的鉴定结果，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应，并进一步对抑郁患者进行诊断、或精准治疗、或预后评估；
优选地，在步骤D中，判断患者的抑郁行为的严重程度及对抗抑郁策略的反应的基准包括：
(1)钟基因Per1启动子区CRE序列的全部缺失或部分缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，引起轻-中度抑郁症；
(2)钟基因Per2启动子区CRE序列的全部缺失或部分缺失/插入突变或表观遗传修饰的变化，引起程度为中度以上的抑郁症发作；
(3)没有钟基因Per启动子区CRE序列的上述变化，患有抑郁的个体对临床上抗抑郁策略呈现的反应比较好；
(4)具有上述钟基因Per启动子区CRE序列变化的抑郁症患者，呈现对目前临床上的抗抑郁策略反应不好，甚至无反应；优选考虑对其进行生物节律系统的调节治疗。
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