CN110305854A - 一种携带荧光素酶的重组h3n2亚型流感病毒、构建方法及应用 - Google Patents

一种携带荧光素酶的重组h3n2亚型流感病毒、构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒、构建方法及应用。该重组流感病毒该重组流感病毒包括如下第一组基因和第二组基因；第一组基因由HA基因和NA基因组成；第二组基因由核蛋白NP基因、聚合酶PB1基因、聚合酶PB2基因、聚合酶PA、基质蛋白M基因和非结构蛋白NS基因组成；第一组基因来源于H3N2亚型流感病毒；第二组基因中的至少一个基因来源于H1N1亚型流感病毒；第二组基因中的任一基因与荧光素酶报告基因融合以表达荧光素酶。所得重组流感病毒具有优异的稳定性和复制能力，方便检测，用于抗病毒药物、抗体或者新型疫苗的诊断和评估具有重要的科研价值。

Description

一种携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒、构建方法及 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒、构建方法及应用。
背景技术
流感病毒属于正粘病毒科，是一种负链RNA病毒，病毒基因组为单股8节段负链RNA。流感病毒最大的特点是容易变异，以逃避人体的免疫力，这也是流感不断发生、流行而难以根除的原因。甲型流感病毒感染是全球流感发病及死亡的主要原因。
病毒基因组编码7种内部蛋白，分别是核蛋白NP、三种聚合酶PB1、PB2和PA，两种基质蛋白M1和M2，非结构蛋白NS1，两种外膜蛋白血凝素HA和神经氨酸酶NA。甲型流感病毒根据其表面(HA和NA)结构及其基因特性的不同又可分为许多亚型，至今甲型流感病毒已发现的血凝素HA有18个亚型(H1-H18),神经氨酸酶(HA)有11个亚型(N1-11)。H3N2亚型流感病毒自1968年引起流感大流行以来一直是人群中存在的主要A型流感病毒亚型，并通过抗原漂移和抗原转换逃避宿主的免疫识别，不断引起新的流行；此外，H3N2亚型流感病毒变异中会发生重配，有可能使病毒的复制受到限制，这样在现有抗病毒药物研发筛选中，会存在干扰，难以筛选高效、稳定且不易产生耐药性的抗流感药物或疫苗。本发明通过构建稳定的重组H3N2亚型流感病毒，以荧光素酶表达为检测指标，能够灵敏、高效的进行抗流感病毒药物的筛选，将为流感病毒疫苗和抗病毒药物研发、评价等应用研究提供基础。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒、构建方法及应用，目的在于成功构建一种可以报告基因Gluc的复制能力强的重组流感H3N2亚型病毒，用于抗病毒药物、抗体或者新型疫苗的诊断或评估。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒，该重组流感病毒包括如下第一组基因和第二组基因；
所述第一组基因由HA基因和NA基因组成；所述第二组基因由核蛋白NP基因、聚合酶PB1基因、聚合酶PB2基因、聚合酶PA、基质蛋白M基因和非结构蛋白NS基因组成；
所述第一组基因来源于H3N2亚型流感病毒；
所述第二组基因中的至少一个基因来源于H1N1亚型流感病毒；
所述第二组基因中的任一基因与荧光素酶报告基因融合以表达荧光素酶。
所述第二组基因中的所有基因都来源于H1N1亚型流感病毒。
所述荧光素酶报告基因与第二组基因中的非结构蛋白NS基因融合以表达荧光素酶。
所述荧光素酶报告基因融合在非结构蛋白NS基因的3’端。
所述H1N1亚型流感病毒为A/Puerto Rico/8/34(PR8)流感病毒株；所述H3N2亚型流感病毒为A/New York/196/2003(NY)病毒株。
一种构建上述重组H3N2亚型流感病毒的方法，包括：
1)质粒材料制备
将相应的基因重组到表达质粒上，得到相应的重组表达质粒；
2)病毒拯救
a、取上述重组表达质粒加入到新鲜的Opti-MEM；
b、转染；
c、共转染至293T/MDCK细胞中，一段时间后从上清液中收集病毒，即得。
步骤1)所述表达质粒选自pDZ或pHW2000；优选的，所述表达质粒为pDZ。
步骤2)中共转染至293T/MDCK细胞中，24-96小时后从上清液中收集病毒。
步骤2)中共转染至293T/MDCK细胞中，48小时后从上清液中收集病毒。
步骤2)a中各重组表达质粒按0.5μg的量加入到新鲜的Opti-MEM。
所述的重组H3N2亚型流感病毒在抗流感抗体或疫苗筛选或评估中的应用。
本发明的有益效果:
本发明构建的重组H3N2亚型流感病毒，将荧光素酶报告基因插入到PR8病毒株的NS基因节段，获得了PR8-Gluc重组流感病毒，然后与NY(H3N2)亚型流感病毒进行基因重配，即通过将NY(H3N2)上除HA、NA之外的其他基因重配为PR8-Gluc重组流感病毒上相应基因片段，在报告基因稳定表达的基础上，构建的H3N2重组流感病毒复制能力强、稳定、易于检测，采用其进行抗流感病毒药物筛选，具有灵敏度高的显著优势，检测时间短，相比现有传统检测方法大大节约了时间。
本发明的病毒构建方法，应用于其他亚型流感病毒，如H7N9、H5N1等的报告病毒构建，也具有指导意义，对相应抗病毒药物、抗体或者新型疫苗的诊断和评估具有重要的科研价值。
附图说明
图1为本发明携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒的构建示意图；
图2为本发明携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒在MDCK细胞中进行连续传代稳定性评价图；
图3a为本发明携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒传代后细胞病变效应评价图；
图3b为A/NY-r19感染MDCK细胞60小时后的CPE；
图3c为未感染病毒的正常MDCK细胞的CPE；
图4a为携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒及其母株NY、A/NY-r19的生长曲线；
图4b为荧光素酶随着病毒扩增的表达情况；
图4c显示荧光素酶表达水平与病毒滴度具有很高的相关性；
图4d为荧光素酶表达水平与初始感染剂量及扩增时间的关系比较；
图5a为MDCK细胞分别在TBHQ存在的情况下以0.1MOI感染NY-r19-Gluc病毒抑制趋势；
图5b为阿比朵尔存在的情况下以0.1MOI感染NY-r19-Gluc病毒抑制趋势；
图6为对照一的重组报告病毒中带NS-Gluc基因片段的质粒构建方法图；
图7为对照一的重组报告病毒NS-Gluc连续传代稳定性评价图；
图8为对照二的重组报告病毒A/NY-r18-Gluc的构建策略；
图9为对照二的重组报告病毒A/NY-r18-Gluc连续传代稳定性评价图；
图10a对照二的重组报告病毒A/NY-r18-Gluc连续传代细胞病变效应评价图；
图10b为A/NY感染MDCK细胞60小时后的CPE；
图10c为未感染病毒的正常MDCK细胞的CPE。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本发明进行详细阐述。
实施例1:携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒的构建
1、选用流感病毒H1N1的PR8病毒株，将PR8的NS节段与荧光素酶报告基因融合Gluc，荧光素酶报告基因融合在NS基因的3’端，得到携带荧光素酶的重组流感病毒PR8-Gluc，同时选择一种亲本株流感病毒A/New York/196/2003(NY)；
2、将流感病毒NY上除HA、NA两个基因片段以外的6个基因片段：核蛋白NP、聚合酶PB1、PB2、PA、基质蛋白M和非结构蛋白NS，全部替换为PR8-Gluc病毒中的6个对应片段，具体的：
将上述基因片段重组到表达质粒pDZ中，制备以下8种重组表达质粒：pDZ-PR8/PB2、pDZ-PR8/PB1、pDZ-PR8/PA、pDZ-PR8/NP、PDZ-PR8/M、pDZ-PR8/NS-Gluc、pDZ-NY/HA、pDZ-NY/NA；
将上述8个重组表达质粒各0.5μg加入到新鲜的Opti-MEM；借助Lipofectamine2000(Invitrogen)完成转染；共转染至293T/MDCK细胞中，48小时后从上清液中收集病毒，构建得表达甲型流感H3N2亚型流感病毒特异性的重组报告病毒。
如图1所示，为本发明重组报告病毒的构建示意图，在包含了PR8的6个基因片段的病毒骨架中加入来自H3N2病毒株A/New York/196/2003的HA和NA两个基因片段后组合而成的6：2重配病毒。
实施例2:Gluc基因在重组报告病毒中的稳定性评价
对实施例1构建得到的重组H3N2亚型流感病毒的稳定性进行评价：
如图2所示，重组报告病毒NY-r19-Gluc在MDCK细胞中进行连续传代，并用收获病毒(第1代至第8代)以0.01MOI的感染剂量感染MDCK细胞，在感染后的第60小时进行荧光素酶测定，测定结果显示该重组报告病毒连续8代复制稳定，其荧光素酶检测结果显示器具有优异的稳定性。具体操作为：
(1)重组报告病毒于MDCK细胞中连续传代(8代)；
(2)将收集到的上述病毒用0.01moI同期感染MDCK细胞；
(3)观察细胞病变效应(CPE)，并与感染后60小时收集50μl病毒上清液；
(4)利用BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit按照使用说明书对50μl病毒上清液进行高斯荧光素酶检测。
如图3所示，图3a为本发明携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒传代后细胞病变效应评价图；图3b为A/NY-r19感染MDCK细胞60小时后的CPE；图3c为未感染病毒的正常MDCK细胞的CPE。分别用NY-r19-Gluc和NY-r19以1个moL对MDCK细胞进行感染，60小时后观察到的细胞病变效应反应，在经历8次传代后，NY-r19-Gluc感染的MDCK细胞CPE无明显变化，稳定性优异。
实施例3:构建得到的重组H3N2亚型流感病毒的体外多周期复制分析
(1)铺细胞于24孔板中并用指定病毒进行感染；
(2)37℃孵育1小时，冲洗细胞，并加入含有2μg/mL TPCK-胰蛋白酶的新鲜Opti-MEM；
(3)在换液后的第0、12、24、36、48、60、72、84、96、108小时各取等分上清液；
(4)分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到MDCK细胞上来测定TCID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期进行高斯荧光素酶检测。
如图4所示，图4a为重组报告病毒及其母株NY、A/NY-r19的生长曲线。图4b为荧光素酶随着病毒扩增的表达情况。图4c显示荧光素酶表达水平与病毒滴度具有很高的相关性。图4d为荧光素酶表达水平与初始感染剂量及扩增时间的关系比较。
实施例4构建得到的重组H3N2亚型流感病毒在抗流感病毒药物筛选方面的应用
(1)用0.1moL重组报告病毒与指定剂量的阳性药物共孵育生长于24孔板中的MDCK细胞；
(2)37℃孵育1小时，冲洗细胞，并加入含有2μg/mL TPCK-胰蛋白酶的新鲜Opti-MEM；
(3)再加入不同剂量的阳性药物；
(4)感染72小时后，各孔分别取出50μl上清液进行高斯荧光素酶检测。
如图5所示，MDCK细胞分别在图5aTBHQ和图5b阿比朵尔存在的情况下以0.1moI感染NY-r19-Gluc病毒。作为对照，同时进行PR8-Gluc感染。用Gluc检查法监测病毒感染情况，并用GraphPad Prism 5分析其抑制作用。
由图5可以看出，本发明的重组H3N2亚型流感病毒作为筛选工具能够更加灵敏、快速的进行抗流感病毒药物的筛选，节约时间，可用于高通量筛选。
实施例6携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒的构建方法比较
对比一：对H3N2(NY)病毒进行改造，进行NY-NS-Gluc重组病毒的构建
该对比例一是在H3N2(NY)病毒的NS基因上插入荧光素酶报告基因进行表达；具体操作如下：
1、选用流感病毒NY病毒株，将NY的NS节段与荧光素酶报告基因融合，得到携带荧光素酶的重组流感病毒NY-Gluc；
2、重组表达质粒pDZ-NY/NS-Gluc的构建方法如图6所示，将NY的NS-Gluc基因重组到表达质粒上得到重组表达质粒pDZ-NY/NS-Gluc；同时，将NY上其余基因片段重组到表达质粒上，制备其余7种重组表达质粒：pDZ-NY/PB2、pDZ-NY/PB1、pDZ-NY/PA、pDZ-NY/NP、PDZ-NY/M、pDZ-NY/HA、pDZ-NY/NA；
将上述8个重组表达质粒各0.5μg加入到新鲜的Opti-MEM；借助Lipofectamine2000(Invitrogen)完成转染；共转染至293T/MDCK细胞中，48小时后从上清液中收集病毒，构建得表达甲型流感H3N2亚型流感病毒特异性的重组报告病毒。
如图6所示，为本实施例的Gluc基因与NY的NS区段融合产生报告基因流感A亚型H3N2病毒示意图。在甲型流感NY(H3N2)病毒的基因组中加入Gluc报告基因。报告病毒A/NY-Gluc通过引入PTV-1 2A蛋白自剪切位点从单个mRNA表达NS1-Gluc和NEP蛋白；此外，通过引入沉默突变破坏RNA剪接供体/受体(SD/SA)位点。
前述实施例1的荧光素酶报告基因构建方法同该对比一图6，区别在于NS序列不同。
采用前述实施例2的方法进行Gluc基因在本实施例重组报告病毒中的稳定性评价。如图7所示，用WT NY或NY-Gluc在MDCK细胞中以0.01moI连续传代实验感染(第0代至第2代)，并分别在感染后60小时，进行荧光素酶测定。结果表明，上述方法构建的携带Gluc报告基因的H3N2重组流感病毒在传代过程中信号迅速丢失，具有不稳定性遗传特点。
对比二：NY-r18-Gluc重组病毒构建
该对比例二是在H1N1病毒的NS基因上插入荧光素酶基因，然后，将H3N2
(NY)中的NS基因对应H1N1病毒重组的NS基因进行重配。
1、选用流感病毒H1N1的PR8病毒株，在PR8的NS节段插入Gluc报告基因，得到携带荧光素酶报告基因的重组流感病毒PR8-Gluc；
2、在包含了7个基因片段的流感病毒H3N2(NY)上引入PR8-NS-Gluc重组报告病毒中的NS-Gluc进行重配，具体的：
选择H1N1(PR8)的NS-Gluc基因、H3N2(NY)的PB2、PB1、PA、NP、M、HA、NA基因，重组到表达质粒pDZ中，制备以下8种重组表达质粒：pDZ-NY/PB2、pDZ-NY/PB1、pDZ-NY/PA、pDZ-NY/NP、PDZ-NY/M、pDZ-PR8/NS-Gluc、pDZ-NY/HA、pDZ-NY/NA；
将上述8个重组表达质粒各0.5μg加入到新鲜的Opti-MEM；借助Lipofectamine2000(Invitrogen)完成转染；共转染至293T/MDCK细胞中，48小时后从上清液中收集病毒，构建得表达荧光素酶的重组甲型流感H3N2亚型报告病毒。
如图8所示，为本实施例重组报告病毒的构建策略。在包含了NY的7个基因片段的病毒骨架中加入来自PR8-Gluc重组报告病毒中的NS-Gluc一个基因片段后得到重配病毒。
采用前述实施例2的方法进行Gluc基因在本实施例重组报告病毒中的稳定性评价。如图9所示，用A/NY-r18-Gluc重组病毒在MDCK细胞中以0.01moI连续传代实验感染(第0代至第5代)。并分别在感染后60小时，进行荧光素酶测定。结果表明，与NY-Gluc病毒不同，NY-r18-Gluc病毒可以高水平表达Gluc蛋白，并且在连续传代病毒后未观察到Gluc表达的明显降低，表明报告基因Gluc基因在功能上得以维持。
如图10所示，分别用NY病毒和NY-r18-Gluc病毒(p1-p4)感染MDCK细胞，MOI为1。感染60小时后观察细胞病变效应。A/NY-r18-Gluc病毒在经历4次传代后，NY-r18-Gluc感染的MDCK细胞呈现出的CPE发生了明显的变化-细胞呈纤维状，并形成了多核合胞体结构；CPE现象改变，表明病毒存在基因组不稳定的缺陷。
上述具体实施方式不能作为对本发明保护范围的限制，对于本技术领域的技术人员来说，对本发明实施方式所做出的任何替代改进或变换均落在本发明的保护范围内。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。

Claims (10)

1.一种携带荧光素酶的重组H3N2亚型流感病毒，其特征在于，该重组流感病毒包括如下第一组基因和第二组基因；
所述第一组基因由HA基因和NA基因组成；所述第二组基因由核蛋白NP基因、聚合酶PB1基因、聚合酶PB2基因、聚合酶PA、基质蛋白M基因和非结构蛋白NS基因组成；
所述第一组基因来源于H3N2亚型流感病毒；
所述第二组基因中的至少一个基因来源于H1N1亚型流感病毒；
所述第二组基因中的任一基因与荧光素酶报告基因融合以表达荧光素酶。
2.根据权利要求1所述的重组H3N2亚型流感病毒，其特征在于，所述第二组基因中的所有基因都来源于H1N1亚型流感病毒。
3.根据权利要求1或2所述的重组H3N2亚型流感病毒，其特征在于，所述荧光素酶报告基因与第二组基因中的非结构蛋白NS基因融合以表达荧光素酶。
4.根据权利要求3所述的重组H3N2亚型流感病毒，其特征在于，所述荧光素酶报告基因融合在非结构蛋白NS基因的3’端。
5.根据权利要求1-4任一所述的重组H3N2亚型流感病毒，其特征在于，所述H1N1亚型流感病毒为A/Puerto Rico/8/34(PR8)流感病毒株；所述H3N2亚型流感病毒为A/New York/196/2003(H3N2)病毒株。
6.一种构建权利要求1-5任一所述重组H3N2亚型流感病毒的方法，其特征在于，包括：
1)质粒材料制备
将相应的基因重组到表达质粒上，得到相应的重组表达质粒；
2)病毒拯救
a、取上述重组表达质粒加入到新鲜的Opti-MEM；
b、转染；
c、共转染至293T/MDCK细胞中，一段时间后从上清液中收集病毒，即得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)所述表达质粒选自pDZ或pHW2000；优选的，所述表达质粒为pDZ。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中共转染至293T/MDCK细胞中，24-96小时后从上清液中收集病毒。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤2)a中各重组表达质粒按0.5μg的量加入到新鲜的Opti-MEM。
10.权利要求1-5任一所述的重组H3N2亚型流感病毒在抗流感抗体或疫苗筛选或评估中的应用。
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