CN110295220A - 一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，属于环境监测领域，其包括：红树林湿地现状调查；确定指示微生物；选定理想参照点；建立红树林沉积物样品采集方法，明确微生物分析方法，包括样品DNA提取方法、PCR扩增方法和克隆文库构建方法；选定指示微生物指标评价因子，以指示微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比作为评价因子；确定微生物指标评价因子的权重Wi；计算微生物指标评价因子的评价比值Ii；计算评价指标P，划分评价等级，根据评价等级对红树林湿地沉积物健康状况进行评估。本发明提供的红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，可准确有效地评估野外条件下红树林湿地沉积物的健康状况，适用范围广。
Description
技术领域
本发明涉及环境监测技术领域，具体涉及一种受重金属污染的红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法。
背景技术
红树林是常见于热带-亚热带低潮能海岸潮间带的木本植物群落，具有消浪护岸、净化水体、维护生物多样性的功能。红树林沉积物是富含有机质和营养元素的环境，使得红树林沉积物具有丰富的微生物群落。近年来，随着沿海城市化的快速发展，大量工业废水排入红树林生系统，对红树林沉积物健康产生严重的危害。工业废水中含有大量的重金属污染物，使得红树林沉积物中富集的重金属污染物对底栖生物或依靠沉积物生存的生物产生直接的毒害作用，所以红树林沉积物健康状况对红树林生态系统的稳定至关重要。对红树林沉积物健康状况的全面评估可为红树林湿地的保护和管理提供基础数据和指明保护方向。
在以往土壤重金属污染治理工作中，相关部门所采用的评价数据主要以土壤的重金属浓度测定为主。传统的重金属污染评价方法包括指数法和数学模型指数法，虽然能够在一定程度上满足评价的需求，但是由于实际污染情况中存在的复杂性和模糊性，单使用重金属浓度不能准确评估其生态风险。重金属进入生物体内的量会受到其形态和环境多种因素的影响，同时，不同的生物体对重金属也会有不同的响应，因此仅用重金属浓度来评价重金属的生物危害性是不准确的。在传统评价方法的基础上，有研究提出了生物评价法，使用蚯蚓作为指示性生物，其体内MT-2转录表达水平可以作为监测重金属的生物标志物，但生物评价法无法适用于红树林湿地健康状况的评价。
为有效提高土壤质量的监测和评价效果，将微生物学指标纳入土壤/沉积物质量的评价体系很有必要。土壤微生物是维持土壤质量的重要组成部分，它们对土壤中植物残体的降解、污染物的分解和土壤结构的形成过程起调节作用。土壤微生物群落能对基质的改变迅速做出响应，因此微生物学指标能敏感地反映土壤质量的变化。微生物指标的纳入，能够完善传统监测方法中由于存在的结果不准确、运算复杂和主观性强的问题，对土壤质量监测和评价具有重要作用。由于红树林生境的独特性以及污染情况的复杂性，现有的土壤评估方法很难准确的对其进行评估。采用微生物指标可以直接、准确、快速地对受工业废水中重金属污染的红树林沉积物健康状况进行评估。
发明内容
为了克服现有技术的不足之处，本发明目的在于提供一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，该方法可克服传统监测方法中由于存在的结果不准确、运算复杂和主观性强的问题，通过微生物群落的丰度、多样性和群落结构准确地评估红树林沉积物健康状况，为红树林的保护和管理提供基础数据支持和指明保护方向。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，所述方法包括：
步骤S101，红树林湿地现状调查，包括红树林湿地相关参数和污染物相关参数；具体的，所述的红树林湿地相关参数包括植物种类、气候条件、水淹环境和沉积物理化特征；污染物相关参数调查包括污染物来源、主要污染物类型，明确待测红树林的主要污染物为重金属。
步骤S102，确定指示微生物，查阅文献选出指示红树林沉积物重金属污染的微生物群落；具体的，基于文献调查，明确硫酸盐还原菌为红树林沉积物重金属污染的指示微生物，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，指示微生物的基因拷贝数和多样性指数应与重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著负相关；通过冗余分析，微生物群落结构应该与重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下有显著关系，即通过蒙特卡罗检验。
步骤S103，选定理想参照点，选定不受工业废水污染或最低限度受污染的红树林区域作为理想参照点；具体的，理想参考点的红树林应与待评价红树林位于同一区域，且植物种类、气候条件及水淹环境相同。
步骤S104，建立红树林沉积物样品采集方法，明确微生物分析方法，其包括样品DNA提取方法、PCR扩增方法和克隆文库构建方法；具体的，所述红树林沉积物样品采集方法包括统一取样深度、取样点位设置、样品取样量和样品前处理；所述样品DNA提取方法包括选用成熟的DNA提取；所述PCR扩增方法包括用成熟的引物对dsrB功能基因进行PCR扩增，选用成熟的纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；所述的克隆文库构建方法，选择克隆载体为Peasy-T1，转化所需的感受态细胞为Trans-T1，挑选阳性克隆子菌液进行一代测序技术测序，选取高质量的序列信息用于下游分析，所有的高质量序列在80％相似度水平上归类成OTU，OTU中具有最高丰度的序列选为该OTU的代表序列，基于OTU信息进行多样性和优势菌群分析；OTU即最小分类单元的缩写。
步骤S105，选定指示微生物指标评价因子，以指示微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比作为评价因子；具体的，指示微生物的基因拷贝数测定方法为实时定量PCR，步骤为：
荧光定量PCR使用的引物为正向引物DSRp2060F和反向引物DSR4R；荧光定量PCR反应在专用的PCR八连管中进行，所有样品做3个重复；反应体系为25μL∶12.5μL的qPCR预混液、1μL浓度为10μmol/L的正反引物、5μ L DNA模板、5.5μL无菌水；反应条件为：95℃预变性30s，再95℃变性5s，60℃退火/延伸15s，循环40次；荧光数据采集在延伸时进行。
标准曲线的绘制是利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，用Qubit3.0测定质粒浓度，计算质粒拷贝数将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线；根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，以基因拷贝数/克为单位，最后以基因拷贝数的对数值进行分析。
指示微生物的多样性指标选用Shannon多样性指数，步骤为：用Mothur软件基于OTU信息，计算出Shannon多样性指数；
指示微生物的优势菌群占比，具体包括：将代表序列信息在NCBI数据库中进行BLAST比对，选择相似度大于80％的序列；用MEGA软件，将代表序列和高相似度序列一起构建系统发育树，根据系统发育树计算各优势菌群的占比；基于文献调查，确定互营杆菌科是硫酸盐还原菌中对重金属浓度最敏感的菌群，其占比可作为后续计算指标，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，互营杆菌科的占比与主要重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著正相关，主要重金属包括铜、锌、镍和铬。
步骤S106，确定微生物指标评价因子的权重Wi；
步骤S107，计算微生物指标评价因子的评价比值Ii；
步骤S108，计算评价指标P，划分评价等级，根据评价等级对红树林湿地沉积物健康状况进行评估。
具体的，指示微生物的基因拷贝数测定方法为实时定量PCR，步骤为：
荧光定量PCR使用的引物为正向引物DSRp2060F和反向引物DSR4R；荧光定量PCR反应在专用的PCR八连管中进行，所有样品做3个重复；反应体系为25μL∶12.5μL的qPCR预混液、1μL浓度为10μmol/L的正反引物、5μL DNA模板、5.5μL无菌水；反应条件为：95℃预变性30s，再95℃变性5s，60℃退火/延伸15s，循环40次；荧光数据采集在延伸时进行。
标准曲线的绘制是利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，用Qubit3.0测定质粒浓度，计算质粒拷贝数将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线；根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，以基因拷贝数/克为单位，最后以基因拷贝数的对数值进行分析。
指示微生物的多样性指标选用Shannon多样性指数，步骤为：用Mothur软件基于OTU信息，计算出Shannon多样性指数；
指示微生物的优势菌群占比，具体包括：将代表序列信息在NCBI数据库中进行BLAST比对，选择相似度大于80％的序列；用MEGA软件，将代表序列和高相似度序列一起构建系统发育树，根据系统发育树计算各优势菌群的占比；基于文献调查，确定互营杆菌科是硫酸盐还原菌中对重金属浓度最敏感的菌群，其占比可作为后续计算指标，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，互营杆菌科的占比与主要重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著正相关，主要重金属包括铜、锌、镍和铬。
具体的，通过层次分析法确定微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比的权重Wi，具体方法如下：根据微生物基因拷贝数C1、多样性指数C2和优势菌群占比C3相对于沉积物健康状况评价的重要性构造判断矩阵：
得到特征向量为0.232、0.072和0.697；经检验，最大特征根为3.19，CI＝0.09符合要求，因此微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比的权重Wi为0.232、0.092和0.697。
具体的，所述的评价比值Ii根据以下公式计算得到：
其中，0表示待评估红树林的微生物指标测量数值，W表示理想参照点的微生物指标测定数值。
具体的，所述的评价指标P根据以下公式计算得到：
P＝-|Wa(Ia-1)|+Wd(Id-1)+Ws(Is-1)
其中，Wi表示评价因子的权重，Ii表示评价因子的评价比值，a表示基因拷贝数，d表示多样性指标，s表示优势菌群互营杆菌科的占比，
评价指标P针对评估红树林的沉积物健康状况进行评估进一步包括：
当P≤0时，红树林沉积物为健康；
当0＜P≤0.048时，红树林沉积物处于轻度污染；
当0.048＜P≤0.082时，红树林沉积物处于中度污染；
当P＞0.082时，红树林沉积物处于重度污染。
有益技术效果：本发明提供的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法与现有技术相比，将更全面评价沉积物健康状况，可以避免由于重金属种类和形态带来的局限性，评价结果更具准确性；进一步地，鉴于指示微生物对沉积物环境变化的敏感性，通过微生物指标直接及时反映沉积物健康状况。综上，该方法可为红树林的保护和管理提供有效数据支持和指明保护方向。
附图说明
以下参照附图对本发明实施例作进一步说明，其中：
图1是本发明一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法的流程图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明。
如图1所示，一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，所述方法包括以下具体步骤：
步骤S101，红树林湿地现状调查，包括红树林湿地相关参数和污染物相关参数；具体的，所述的红树林湿地相关参数包括植物种类、气候条件、水淹环境和沉积物理化特征；污染物相关参数调查包括污染物来源、主要污染物类型，明确待测红树林的主要污染物为重金属。
步骤S102，确定指示微生物，查阅文献选出指示红树林沉积物重金属污染的微生物群落；具体的，基于文献调查，明确硫酸盐还原菌为红树林沉积物重金属污染的指示微生物，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，指示微生物的基因拷贝数和多样性指数应与重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著负相关；通过冗余分析，微生物群落结构应该与重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下有显著关系，即通过蒙特卡罗检验。
步骤S103，选定理想参照点，选定不受工业废水污染或最低限度受污染的红树林区域作为理想参照点；具体的，理想参考点的红树林应与待评价红树林位于同一区域，且植物种类、气候条件及水淹环境相同。
步骤S104，建立红树林沉积物样品采集方法，明确微生物分析方法，其包括样品DNA提取方法、PCR扩增方法和克隆文库构建方法；具体的，所述红树林沉积物样品采集方法包括统一取样深度、取样点位设置、样品取样量和样品前处理；所述样品DNA提取方法包括选用成熟的DNA提取；所述PCR扩增方法包括用成熟的引物对dsrB功能基因进行PCR扩增，选用成熟的纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；所述的克隆文库构建方法，选择克隆载体为Peasy-T1，转化所需的感受态细胞为Trans-T1，挑选阳性克隆子菌液进行一代测序技术测序，选取高质量的序列信息用于下游分析，所有的高质量序列在80％相似度水平上归类成OTU，OTU中具有最高丰度的序列选为该OTU的代表序列，基于OTU信息进行多样性和优势菌群分析；OTU即最小分类单元的缩写。
步骤S105，选定指示微生物指标评价因子，以指示微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比作为评价因子；具体的，指示微生物的基因拷贝数测定方法为实时定量PCR，步骤为：
荧光定量PCR使用的引物为正向引物DSRp2060F和反向引物DSR4R；荧光定量PCR反应在专用的PCR八连管中进行，所有样品做3个重复；反应体系为25μL∶12.5μL的qPCR预混液、1μL浓度为10μ mol/L的正反引物、5μL DNA模板、5.5μL无菌水；反应条件为：95℃预变性30s，再95℃变性5s，60℃退火/延伸15s，循环40次；荧光数据采集在延伸时进行。
标准曲线的绘制是利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，用Qubit3.0测定质粒浓度，计算质粒拷贝数将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线；根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，以基因拷贝数/克为单位，最后以基因拷贝数的对数值进行分析。
指示微生物的多样性指标选用Shannon多样性指数，步骤为：用Mothur软件基于OTU信息，计算出Shannon多样性指数；
指示微生物的优势菌群占比，具体包括：将代表序列信息在NCBI数据库中进行BLAST比对，选择相似度大于80％的序列；用MEGA软件，将代表序列和高相似度序列一起构建系统发育树，根据系统发育树计算各优势菌群的占比；基于文献调查，确定互营杆菌科是硫酸盐还原菌中对重金属浓度最敏感的菌群，其占比可作为后续计算指标，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，互营杆菌科的占比与主要重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著正相关，主要重金属包括铜、锌、镍和铬。
步骤S106，确定微生物指标评价因子的权重Wi；具体的，通过层次分析法确定微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比的权重Wi，具体方法如下：根据微生物基因拷贝数C1、多样性指数C2和优势菌群占比C3相对于沉积物健康状况评价的重要性构造判断矩阵：
得到特征向量为0.232、0.072和0.697；经检验，最大特征根为3.19，CI＝0.09符合要求，因此微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比的权重Wi为0.232、0.092和0.697。
步骤S107，计算微生物指标评价因子的评价比值Ii；
步骤S108，计算评价指标P，划分评价等级，根据评价等级对红树林湿地沉积物健康状况进行评估。具体的，所述的评价比值Ii根据以下公式计算得到：
其中，0表示待评估红树林的微生物指标测量数值，W表示理想参照点的微生物指标测定数值。
具体的，所述的评价指标P根据以下公式计算得到：
P＝-|Wa(Ia-1)|+Wa(Id-1)+Ws(Is-1)
其中，Wi表示评价因子的权重，Ii表示评价因子的评价比值，a表示基因拷贝数，d表示多样性指标，s表示优势菌群互营杆菌科的占比，
评价指标P针对评估红树林的沉积物健康状况进行评估进一步包括：
当P≤0时，红树林沉积物为健康；
当0＜P≤0.048时，红树林沉积物处于轻度污染；
当0.048＜P≤0.082时，红树林沉积物处于中度污染；
当P＞0.082时，红树林沉积物处于重度污染。
具体实施例一：
本实施例中，选定西乡红树林和沙井红树林作为待评估区域来评价其沉积物的健康状况。
红树林湿地现状调查。西乡红树林(E113°50′36″，N22°35′33″)和沙井红树林(E113°45′56″，N22°43′37″)都位于广东省深圳市，平均气温22℃，平均降雨量为1927mm，平均湿度为79％，潮汐为不规则半日潮，平均潮差1.9m。西乡红树林种植的红树植物为秋茄，其沉积物表层沉积物(0-10cm)的氧还原电位是-91.0±20.0mV，有机质含量为43.00gkg-1，总氮含量为2.27g/kg，总磷含量为0.86g/kg，硫酸盐含量为1.80g/kg。沙井红树林种植的红树植物为秋茄，其沉积物表层沉积物(0-10cm)的氧还原电位是-139.0±22.0mV，有机质含量为23.40g/kg，总氮含量为2.12g/kg，总磷含量为0.32g/kg，硫酸盐含量为1.23g/kg。西乡红树林位于珠江口东岸，深受人类工业活动的影响，调查发现一条排污河穿过经林地直接排入珠江，西乡红树林沉积物中镉、铜、锌、镍和铬的含量分别为8.88、497.43、157.86、96.78和43.00g/kg；沙井红树林位于深圳市污染最严重的河流-茅洲河的河口附近，该地沿岸汇聚了电镀、电子加工、印染等企业排放的大量污染物，沙井红树林沉积物中镉、铜、锌、镍和铬的含量分别为8.32、1547.66、658.95、366.59和299.05g/kg。
选定理想参照点。福田红树林自然保护区(E114°01′08″，N22°31′47″)同样位于广东省深圳市，平均气温22℃，平均降雨量为1927mm，平均湿度为79％，；潮汐为不规则半日潮，平均潮差1.9m。自1980年，福田红树林被列为国家级自然保护区，受到工业废水轻微污染。福田红树林与待评估红树林都属于深圳滨海湿地，且生长着同样的红树植物-秋茄，因此可被确定为理想参照点。后续步骤中福田红树林沉积物中的微生物指标测定值为健康值。
建立红树林沉积物样品采集方法，明确微生物分析方法，其包括样品DNA提取方法、PCR扩增方法和克隆文库构建方法。样品采集方法具体为：取样深度为0-10cm；取样点位置为秋茄林地沉积物样品。样品取样量为30-40g。沉积物微生物DNA提取与测序：每份土壤样品取0.5g用于基因组的提取，提取试剂盒为DNA土壤试剂盒；采用引物DSRp2060F(5’-CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3’)和DSR4R(5’-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’)对硫酸盐还原菌的dsrB基因进行扩增；切割250bp的DNA电泳条带并用DNA纯化试剂盒进行纯化。对纯化后的DNA用大肠杆菌进行克隆，选择克隆载体为Peasy-T1，转化所需的感受态细胞为Trans-T1，挑选阳性克隆子菌液进行一代测序技术测序，选取高质量的序列信息用于下游分析。利用MEGA软件对测序获得的原始序列数据进行剪切。剪切后的序列按照80％相似度划分OTU，每个OTU中具有最高丰度的序列选为该OTU代表序列，基于OTU信息进行多样性和优势菌群分析。
测定指示微生物评价因子，具体如下：
微生物数量指标测定，用实时定量PCR方法分别测定待评价红树林和理想参照点的微生物数量。实时定量PCR结果：dsrB基因在福田、西乡和沙井红树林沉积物中的基因拷贝数的对数值分别为8.48、8.03和7.97。
微生物多样性指标测定，构建克隆文库，分别计算待评价红树林和理想参照点微生物的多样性指数。本实施例中，利用Mothur软件分析获得各样品中硫酸盐还原菌的Shannon多样性指数，Shannon多样性指数在福田、西乡和沙井红树林沉积物中分别为2.44、2.51和2.63。
测定红树林沉积物中指示微生物的优势菌群占比，构建系统发育树，计算优势菌群互营杆菌科的占比。本实施案例中，互营杆菌科在福田、西乡和沙井红树林沉积物中分别为18.5％、30.4％和31.4％。
按公式计算评价比值Ii，得到结果为：西乡红树林 沙井红树林：
按照公式P＝-|Wa(Ia-1)|+Wd(Id-1)+Ws(Is-1)计算评价指标P，得到结果为：P西乡＝0.078，沙井红树林P＝0.119。
根据评价指标P对红树林湿地沉积物健康状况进行评估：因为0.048＜P西乡≤0.082，所以西乡红树林为中度污染；P沙井＞0.082，所以沙井红树林为重度污染。该评价结果与土壤质量标准的评价结果有很好的一致性。
虽然通过实施例描绘了本发明，本领域普通技术人员知道，本发明有许多变形和变化而不脱离本发明的精神，希望所附的权利要求包括这些变形和变化而不脱离本发明的精神。
Claims (9)
1.一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，包括：
步骤S101，红树林湿地现状调查，包括红树林湿地相关参数和污染物相关参数；
步骤S102，确定指示微生物，查阅文献选出指示红树林沉积物重金属污染的微生物群落；
步骤S103，选定理想参照点，选定不受工业废水污染或最低限度受污染的红树林区域作为理想参照点；
步骤S104，建立红树林沉积物样品采集方法，明确微生物分析方法，其包括样品DNA提取方法、PCR扩增方法和克隆文库构建方法；
步骤S105，选定指示微生物指标评价因子，以指示微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比作为评价因子；
步骤S106，确定微生物指标评价因子的权重Wi；
步骤S107，计算微生物指标评价因子的评价比值Ii；
步骤S108，计算评价指标P，划分评价等级，根据评价等级对红树林湿地沉积物健康状况进行评估。
2.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，所述的红树林湿地相关参数包括植物种类、气候条件、水淹环境和沉积物理化特征；污染物相关参数调查包括污染物来源、主要污染物类型，明确待测红树林的主要污染物为重金属。
3.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，基于文献调查，明确硫酸盐还原菌为红树林沉积物重金属污染的指示微生物，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，指示微生物的基因拷贝数和多样性指数应与重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著负相关；通过冗余分析，微生物群落结构应该与重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下有显著关系，即通过蒙特卡罗检验。
4.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，理想参考点的红树林应与待评价红树林位于同一区域，且植物种类、气候条件及水淹环境相同。
5.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，所述红树林沉积物样品采集方法包括统一取样深度、取样点位设置、样品取样量和样品前处理；所述样品DNA提取方法包括选用成熟的DNA提取；所述PCR扩增方法包括用成熟的引物对dsrB功能基因进行PCR扩增，选用成熟的纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；所述的克隆文库构建方法，选择克隆载体为Peasy-T1，转化所需的感受态细胞为Trans-T1，挑选阳性克隆子菌液进行一代测序技术测序，选取高质量的序列信息用于下游分析，所有的高质量序列在80％相似度水平上归类成OTU，OTU中具有最高丰度的序列选为该OTU的代表序列，基于OTU信息进行多样性和优势菌群分析。
6.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，指示微生物的基因拷贝数测定方法为实时定量PCR，步骤为：
荧光定量PCR使用的引物为正向引物DSRp2060F和反向引物DSR4R；荧光定量PCR反应在专用的PCR八连管中进行，所有样品做3个重复；反应体系为25μL∶12.5μL的qPCR预混液、1μL浓度为10μmol/L的正反引物、5μL DNA模板、5.5μL无菌水；反应条件为：95℃预变性30s，再95℃变性5s，60℃退火/延伸15s，循环40次；荧光数据采集在延伸时进行；
标准曲线的绘制是利用含有qPCR目的片段的质粒为标准基因，用Qubit3.0测定质粒浓度，计算质粒拷贝数将质粒DNA进行10倍梯度系列稀释制作标准样品和待测样品一起扩增，得出标准曲线；根据所得标准曲线计算出样品中的基因拷贝数，以基因拷贝数/克为单位，最后以基因拷贝数的对数值进行分析；
指示微生物的多样性指标选用Shannon多样性指数，步骤为：用Mothur软件基于OTU信息，计算出Shannon多样性指数；
指示微生物的优势菌群占比，具体包括：将代表序列信息在NCBI数据库中进行BLAST比对，选择相似度大于80％的序列；用MEGA软件，将代表序列和高相似度序列一起构建系统发育树，根据系统发育树计算各优势菌群的占比；基于文献调查，确定互营杆菌科是硫酸盐还原菌中对重金属浓度最敏感的菌群，其占比可作为后续计算指标，具体判断标准如下：通过Spearman相关分析，互营杆菌科的占比与主要重金属浓度在显著性水平P＜0.05的条件下成显著正相关，主要重金属包括铜、锌、镍和铬。
7.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，通过层次分析法确定微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比的权重Wi，具体方法如下：根据微生物基因拷贝数C1、多样性指数C2和优势菌群占比C3相对于沉积物健康状况评价的重要性构造判断矩阵：
得到特征向量为0.232、0.072和0.697；经检验，最大特征根为3.19，一致性指数CI＝0.09符合要求，因此微生物基因拷贝数、多样性指数和优势菌群占比的权重Wi为0.232、0.092和0.697。
8.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，所述的评价比值Ii根据以下公式计算得到：
其中，O表示待评估红树林的微生物指标测量数值，W表示理想参照点的微生物指标测定数值。
9.根据权利要求1所述的一种红树林湿地沉积物健康状况的微生物指标评估方法，其特征在于，所述的评价指标P根据以下公式计算得到：
P＝-|Wa(Ia-1)|+Wd(Id-1)+Ws(Is-1)
其中，Wi表示评价因子的权重，Ii表示评价因子的评价比值，a表示基因拷贝数，d表示多样性指标，s表示优势菌群互营杆菌科的占比，
评价指标P针对评估红树林的沉积物健康状况进行评估进一步包括：
当P≤0时，红树林沉积物为健康；
当0＜P≤0.048时，红树林沉积物处于轻度污染；
当0.048＜P≤0.082时，红树林沉积物处于中度污染；
当P＞0.082时，红树林沉积物处于重度污染。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20191001 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |