CN110295184A - 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用 - Google Patents

一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110295184A
CN110295184A CN201910744077.2A CN201910744077A CN110295184A CN 110295184 A CN110295184 A CN 110295184A CN 201910744077 A CN201910744077 A CN 201910744077A CN 110295184 A CN110295184 A CN 110295184A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
short hairs
hairs schizothoracin
seq
schizothoracin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910744077.2A
Other languages
English (en)
Inventor
王崇
梁银铨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Water Engineering Ecology Chinese Academy Of Sciences
Institute of Hydroecology MWR and CAS
Original Assignee
Institute Of Water Engineering Ecology Chinese Academy Of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute Of Water Engineering Ecology Chinese Academy Of Sciences filed Critical Institute Of Water Engineering Ecology Chinese Academy Of Sciences
Priority to CN201910744077.2A priority Critical patent/CN110295184A/zh
Publication of CN110295184A publication Critical patent/CN110295184A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
    • C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用。本发明从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行超氧化物歧化酶基因5'‑和3'‑序列的克隆，利用软件对克隆得到的中间序列、5'‑和3'‑序列进行拼接成为Cu/Zn‑SOD cDNA全长序列。该序列共801bp，包括完全开放阅读框465bp，5'‑UTR为60bp，3'‑UTR为276bp。本发明首次公开了短须裂腹鱼超氧化物歧化酶基因全序列及其全序列的克隆方法。同时，为深入研究短须裂腹鱼的超氧化物歧化酶的抗氧化分子机理提供理论依据。

Description

一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其 应用
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用。
背景技术
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,EC1.15.1.1)是广泛存在于生物体的重要抗氧化酶之一，能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应生成过氧化氢和水，平衡机体氧自由基水平，避免活性氧簇(ROS)的毒害作用，Cu/Zn-SOD是最早被发现的超氧化物歧化酶，约占SOD总量的90％，主要存在于真核细胞的细胞浆内。当水生动物受到胁迫时，其体内产生氧化应激，并诱导ROS水平明显增加，并进一步引起水生生物体内抗氧化酶的酶活力或基因表达的变化。SOD与其它抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、过氧化氢酶(CAT)在鱼体抗氧化过程中起重要作用，其基因表达水平或酶活力变化可反映机体的氧化损伤状况或受环境胁迫的状态。
短须裂腹鱼(Schizothorax wangchiachii)隶属于鲤形目、鲤科、裂腹鱼亚科、裂腹鱼属，主要分布于金沙江、乌江和雅砻江；因过度捕捞、环境污染、水电开发等原因，野生短须裂腹鱼资源越来越少。目前已经开展人工养殖，由于养殖过程中养殖密度过高、水质条件(氨氮等)不合理，营养素(蛋白质、脂肪、微量元素)的不足或过剩都会影响鱼类的生长和健康。
超氧化物歧化酶作为衡量鱼类氧化损伤状况或受环境胁迫的状态的指标，是研究短须裂腹鱼生长及抗氧化性能的一种最重要的蛋白酶。但是，目前还没有关于短须裂腹鱼的超氧化物歧化酶基因的结构和表达的报道，这极大地限制了对短须裂腹鱼抗氧化防御研究的发展。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用。
本发明是这样实现的，一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因，其序列见SEQID NO.11。
进一步，所述基因序列共801bp，包括完全开放阅读框465bp，5'端非编码区为60bp，3'端非编码区为276bp。
进一步，所述基因序列推导编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.12。
如上述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，包括以下步骤：
步骤1：提取总RNA并逆转录为cDNA；
步骤2：根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计引物，PCR克隆Cu/Zn-SOD基因中间片段；
步骤3：获取目标基因5’端序列；
步骤4：获取目标基因3’端序列；
步骤5：将步骤2、步骤3和步骤4获得的序列片段进行拼接，获得全长序列。
进一步，步骤2中根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计的引物序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
进一步，步骤3中涉及的引物序列见SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6。
进一步，步骤4中涉及的引物序列见SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9。
如上所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因在短须裂腹鱼超氧化物歧化酶相关研究中的应用。
如上所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法在短须裂腹鱼超氧化物歧化酶相关研究中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明从短须裂腹鱼的肝脏提取总RNA，反转录得到cDNA第一条链，采用RACE扩增法进行超氧化物歧化酶基因5'-和3'-序列的克隆，利用软件对克隆得到的Cu/Zn-SOD cDNA部分序列、5'-和3'-序列进行拼接成为Cu/Zn-SOD cDNA全长序列。该序列共801bp，包括完全开放阅读框(ORF)465bp，5'端非编码区(5'-UTR)为60bp，3'-UTR为276bp。其ORF编码154个氨基酸，分子量约为15.74kD，理论等电点为6.01。
本发明首次公开了短须裂腹鱼(Schizothorax wangchiachii)超氧化物歧化酶基因全序列及其全序列的克隆方法。且该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时的特点。同时，为深入研究短须裂腹鱼的超氧化物歧化酶的抗氧化分子机理提供理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例步骤2中PCR产物电泳图谱；
图2是本发明实施例步骤3中PCR产物电泳图谱；
图3是本发明实施例步骤4中PCR产物电泳图谱；
图4是短须裂腹鱼的Cu/Zn-SOD cDNA序列和推导的氨基酸序列；
图5是序列比对结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例
本发明公开了一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用，具体如下所示。
步骤1：cDNA的合成
1.1RNA提取方法
1)短须裂腹鱼经过MS-222麻醉后解剖，快速分离肝胰脏组织置于冻存管，于液氮中速冻后转移-80℃备用。从液氮中取出肝脏组织约80mg，置于预冷的研钵中，趁液氮尚未挥发光时，将组织磨成粉末，并迅速加1mL Trizol。匀浆后，Trizol/组织混合物室温放置5min，以便样本被Trizol充分裂解。
2)每1mL Trizol裂解的样本加入200μL氯仿(三氯甲烷)。
3)盖严管盖，上下剧烈摇晃15秒。
4)室温放置3min。
5)在4℃下12000g离心15min。
6)离心后，管中液体分层，转移最上层的无色液体(约总体积50％左右)至一个新的无RNA酶的EP管中(注意：千万不能吸到下层的液体及悬浮在中间的白色沉淀物。吸取的时候，将EP管倾斜成45°角)。
7)向新的上层液体中加500μL 100％异丙醇。
8)室温放置10min。
9)在4℃下12000g离心10min。
10)小心吸去上清，加入75％乙醇(75％乙醇要用DEPC水配置)。
11)下颠倒八次，7500g，4℃离心5min。
12)除去乙醇后，开盖室温放置5-10min，即得到纯化的RNA。
13)DEPC水溶解后，琼脂糖电泳检测分子的完整情况，分光光度法检测其浓度。
1.2RNA逆转录为cDNA
(使用Fermentas公司的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒)
1)在无RNA酶的PCR管中加入1μg的总RNA，和1μL的100μM的oligo(dT)引物，并用DEPC处理过的灭菌水加至体积12μL。
2)将上述混合液于65℃处理5分钟，然后在冰上立即冷却1分钟。
3)然后再在反应液中依次加入4μL 5X reaction buffer、1μL RiboLock RNaseInhibitor(20μ/μL)、2μL 10mM dNTP mix、1μL RevertAid M-MuLV ReverseTranscriptase(200μ/μL)。
4)将其轻轻混匀，并短暂离心。
5)在PCR仪上42℃孵育1个小时。
6)70℃孵育5分钟结束反应。
步骤2中间片段调取
1)根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计引物，并通过PCR克隆Cu/Zn-SOD基因中间片段。引物序列生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2)以步骤1中得到的cDNA为模板，以(SODF:AARGCHGTKTGYGTNCTDAARGG，见SEQ IDNO.1)和(SODR:GATGCCDATNACHCCRCARGCCA，见SEQ ID NO.2)为引物进行PCR反应，克隆Cu/Zn-SOD的部分序列。
3)1.PCR体系(50μL)：15μL PCR-Grade Water，25.0μL 2X Ex taq Buffer(takara)，1.0μL dNTP Mix(10mM)，1.0μL Ex taq(takara)，5μL cDNA，1.5μL primer F(10X)，1.5μL primer R(10X)。
4)PCR扩增条件均为：94℃变性4min后，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃10min。PCR电泳结果见图1，其中Marker:DL2000。
5)PCR产物经1.2％琼脂糖电泳检测后，回收目的片段，纯化后克隆至载体pMD18-T，转化感受态细胞E.coli Top10，方法参照《草鱼铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA的克隆与组织表达》一文，2014年，郑青梅等。所筛选的阳性克隆经检测后由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果如下：
>WH061500174(L-SODFR)L-SODRzidai_Pw_F03，见SEQ ID NO.3。
TGTTCTTAAAGGCACCGGGGAAGTGACCGGCACTGTTCATTTCGAGCAAGAGAATGACGGGTCTCCAGTGAAGCTCTCAGGTGATATCACTGGCCTTACTCCAGGAAAGCATGGTTTCCATGTCCATGCTTTTGGAGACAACACAAACGGCTGCATCAGTGCAGGTCCGCACTTCAACCCTCACGATAAAACTCATGGTGGACCAACTGATAGTGTCAGACACGTCGGAGACCTTGGTAACGTGATAGCTGGTGACAATGGTGTTGCAAAAATTGACATTGTGGATGCAATGGTGACCCTGTCAGGGGAACACTCCGTCATTGGGAGGACCATGGTGATCCATGAGAAAGGGGATGACTTGGGTAAAGGAGGCAATGACGAAAGTCTA
步骤3获取目标基因的5’端序列
采用Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNAEnds,Version 2.0试剂盒获得该基因的5’端序列，具体如下：
3.1设计引物：
A203-1(GSP1):GCATGGACATGGAAAC，见SEQ ID NO.4；
A203-2(GSP2):GCTTTCCTGGAGTAAGGCC，见SEQ ID NO.5；
A203-3(GSP3):CACTGGAGACCCGTCATTC，见SEQ ID NO.6。
3.2按照步骤1中的1.1部分提取总RNA。使用SUPERSCRIPT II RT酶和引物GSP-1对总RNA进行目的基因第一链cDNA的合成。使用RNase Mix对合成的cDNA进行去RNA处理，具体如下：
1)在0.5mL离心管中加入以反应液：
2)将混合物在70℃下孵育10分钟使RNA变性。在冰上冷却1分钟。通过简单离心收集试管内容物，按如下顺序添加：
反应液1和2总体积24μL。
3)轻轻拌匀，用短时间离心收集反应。42℃孵育1分钟；
4)加入1μL of SUPERSCRIPT II RT，混合后42℃孵育50分钟；
5)70℃孵育15分钟；
6)反应在37℃离心10至20秒；
7)加1μL RNase混合完全后，37℃孵化为30分钟；
8)通过简单的离心收集反应，并置于冰上。
3.3使用DNA纯化试剂盒：GLASSMAX DNA isolation spin cartridges对经RNAase处理过的cDNA进行纯化。
3.4使用TdT酶和dCTP对纯化后的cDNA进行末端加上多聚C
1)在每根试管中加入以下成分，轻轻混合。
2)在94℃下孵育2-3分钟，在冰上冷却1分钟。通过简单的离心收集试管内的物质并置于冰上。
3)加入1μL TdT，混合后37℃孵育10分钟。
4)在65℃下加热10分钟。收集反应物置于冰上。
3.5使用引物GSP-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物AAP对已经加dC尾的cDNA进行PCR第一轮扩增
1)在0.5ml离心管中加入以反应液，置于冰上。
2)加入0.5μL Taq DNA聚合酶(5units/μL)后混匀。
3)直接将冰管转移到热循环器中，预平衡至初始变性温度(94℃)。
4)PCR反应程序为：94℃变性2min，1个循环；94℃变性2min；55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃10min，1个循环，4℃保存。
3.6使用引物GSP-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物AUAP进行巢式PCR第二轮扩增。
1)将第一轮的PCR反应产物稀释100倍，把下面的反应液加入到0.5ml离心管中，
2)加入0.5μL Taq DNA聚合酶(5units/μL)后混匀。
3)PCR反应程序为：94℃变性2min，1个循环；94℃变性2min；55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃10min，1个循环，4℃保存。
3.7将第二轮PCR产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，电泳结果见图2，其中Marker:DL2000。
3.8目标片段纯化后的PCR产物与pMD18T进行连接，转化感受态细胞E.coliTop10，对阳性克隆进行测序。测序结果如下：
>G09_AF06250194.A203-3-10.M13R，见SEQ ID NO.7。
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGCGTGGCTACGCCTGTTTCTTATAGAGTGTCGTCCAGCAGTGCAGCCAGTCGCGCGGTGCTGGGTCATATACTCGGGGGCGGTGCAGGGGGGTCGTGGATTGGTCTAGAGGCGTTTTCCCGTTGCATGCCTAGTGAAAACACTATCCGTTTCTTTCACTCTCAGTCACTTTACAGTTTGCATAATCCAAAAGCAGCATGGTGAAGAAGGCCGTTTGTGTACTTAAAGGCACCGGGGAAGTGACCGGCACTGTTCATTTCGAGCAAGAGAATGA CGGGTCTCCAGTG
步骤4cDNA 3'RACE端序列扩增
采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒克隆短须裂腹鱼Cu/Zn-SOD的基因的3'RACE，具体如下：
4.1设计引物序列：
3’791-1：CGTCGGAGACCTTGGTAACGTGATAGCT，见SEQ ID NO.8；
3’791-2：GTCAGGGGAACACTCCGTCATTGGG，见SEQ ID NO.9。
4.2使用逆转录酶试剂盒SMARTScribeTMReverse Transcriptase和引物3’CDSprimer A(5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGACTAC(T)30V N–3')对总RNA进行逆转录合成cDNA。
步骤：
1)提取总RNA，方法同步骤3。
2)在0.5ml的离心管中加入下面的反应液，混匀后离心。
3)在反应液中继续加入下面的成分。
4)混合均匀，瞬时离心。
5)72℃孵育3min，然后42℃冷却2min，最后14000rpm离心10min。
6)室温下，混匀下面的试剂：
7)将步骤3和6的反应液混匀，离心。
8)42℃孵育90min。
9)70℃加热10min终止反应。
4.3使用引物3’791-1和UPM(5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'；5'-:CTAATACGACTCACTATAGGGCAAFCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3')，以上面合成的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，操作同步骤3。
4.4将第一轮PCR扩增产物稀释50倍，然后用引物3’791-2和UPM进行第二轮PCR扩增，操作同步骤3。
4.5将第二轮PCR产物进行电泳，并对目的条带进行切胶回收纯化。电泳结果见图3，其中Marker:DL2000。
4.6纯化后的PCR产物送至上海生工直接测序
>WH062400553(3#791-2-34)M13-_J_H06，见SEQ ID NO.10
GTCAGGGGAACACTCCGTCATTGGGAGGACCATGGTGATCCATGAGAAAGGGGATGACTTGGGTAAAGGAGGCAATGACGAAAGTCTTAAAACTGGCAACGCTGGAGGTCGTCTGGCCTGTGGTGTCATAGGCATCACTCAGTGAAGTCCAGCTCTAATCAAAGACTTAGCTTTGAAATAATTGTGACCAATGTGGATCCCCCTTCTGTAAGCACTTAGCCCACTGAGGATTATGATCACTATTTTTGCAAGTTAATGTTTAAGGAATTGTACTTTAGCTATGTAAAGCCGTTTTTCCGCACACGTCTATGTGGGCACTATCTACCTTCTTACAGCTACAAAGTGATGTTTGTTTCCTCTGATCTCTGCTTTATTCAATAAAGATTGAGCAGACTTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
步骤5全长拼接及ORF预测
利用软件对所克隆的短须裂腹鱼Cu/Zn-SOD cDNA部分序列、3'RACE和5'RACE序列进行分析并拼接成为Cu/Zn-SOD cDNA全长序列，如下：
全序列，见SEQ ID NO.11
AAACACTATCCGTTTCTTTCACTCTCAGTCACTTTACAGTTTGCATAATCCAAAAGCAGCATGGTGAAGAAGGCCGTTTGTGTACTTAAAGGCACCGGGGAAGTGACCGGCACTGTTCATTTCGAGCAAGAGAATGACGGGTCTCCAGTGAAGCTCTCAGGTGATATCACTGGCCTTACTCCAGGAAAGCATGGTTTCCATGTCCATGCTTTTGGAGACAACACAAACGGCTGCATCAGTGCAGGTCCGCACTTCAACCCTCACGATAAAACTCATGGTGGACCAACTGATAGTGTCAGACACGTCGGAGACCTTGGTAACGTGATAGCTGGTGACAATGGTGTTGCAAAAATTGACATTGTGGATGCAATGGTGACCCTGTCAGGGGAACACTCCGTCATTGGGAGGACCATGGTGATCCATGAGAAAGGGGATGACTTGGGTAAAGGAGGCAATGACGAAAGTCTTAAAACTGGCAACGCTGGAGGTCGTCTGGCCTGTGGTGTCATAGGCATCACTCAGTGAAGTCCAGCTCTAATCAAAGACTTAGCTTTGAAATAATTGTGACCAATGTGGATCCCCCTTCTGTAAGCACTTAGCCCACTGAGGATTATGATCACTATTTTTGCAAGTTAATGTTTAAGGAATTGTACTTTAGCTATGTAAAGCCGTTTTTCCGCACACGTCTATGTGGGCACTATCTACCTTCTTACAGCTACAAAGTGATGTTTGTTTCCTCTGATCTCTGCTTTATTCAATAAAGATTGAGCAGACTTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
以该cDNA序列再次设计特异引物进行PCR检测，进一步测序检验。短须裂腹鱼的Cu/Zn-SOD cDNA序列和推导的氨基酸序列见图4，其中，方框表示起始密码子和终止密码子，双层方框表示金属结合位点，三层方框表示半胱氨酸；一条下划线表示保守标签序列，双层下划线表示终止信号，三层下划线表示polyA尾巴。推导的氨基酸序列详见SEQ IDNO.12(MVKKAVCVLKGTGEVTGTVHFEQENDGSPVKLSGDITGLTPGKHGFHVHAFGDNTNGCISAGPHFNPHDKTHGGPTDSVRHVGDLGNVIAGDNGVAKIDIVDAMVTLSGEHSVIGRTMVIHEKGDDLGKGGNDESLKTGNAGGRLACGVIGITQ)。
将获得短须裂腹鱼Cu/Zn-SOD全长cDNA序列与NCBI上核酸数据库及蛋白数据库进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，分析相似性及保守结构域；采用软件Vector NTI Suite 6分析Cu/Zn-SOD理论分子量、等电点。该序列共801bp，包括完全开放阅读框(ORF)465bp，5'端非编码区(5'-UTR)为60bp，3'-UTR为276bp。其ORF编码154个氨基酸，分子量约为15.74kD，理论等电点为6.01。通过序列比对，表明短须裂腹鱼的Cu/Zn-SOD的cDNA推测氨基酸序列与多种动物的超氧化物歧化酶基因一致性很高，一致性在62％-95％。序列比对结果见图5，其中，clustal比对完全保守的残基用星号(*)表示，高度保守的残基用(：)表示，替带保守的残基用(.)表示。浅灰色方框表示sod酶蛋白家族保守标签序列，阴影表示金属结合位点，深黑色方框表示半胱氨酸位点。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 水利部中国科学院水工程生态研究所
<120> 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(SODF)
<400> 1
aargchgtkt gygtnctdaa rgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(SODR)
<400> 2
gatgccdatn achccrcarg cca 23
<210> 3
<211> 388
<212> DNA
<213> 中间序列(WH061500174L-SODFRL-SODRzidai_Pw_F03)
<400> 3
tgttcttaaa ggcaccgggg aagtgaccgg cactgttcat ttcgagcaag agaatgacgg 60
gtctccagtg aagctctcag gtgatatcac tggccttact ccaggaaagc atggtttcca 120
tgtccatgct tttggagaca acacaaacgg ctgcatcagt gcaggtccgc acttcaaccc 180
tcacgataaa actcatggtg gaccaactga tagtgtcaga cacgtcggag accttggtaa 240
cgtgatagct ggtgacaatg gtgttgcaaa aattgacatt gtggatgcaa tggtgaccct 300
gtcaggggaa cactccgtca ttgggaggac catggtgatc catgagaaag gggatgactt 360
gggtaaagga ggcaatgacg aaagtcta 388
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(GSP1)
<400> 4
gcatggacat ggaaac 16
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(GSP2)
<400> 5
gctttcctgg agtaaggcc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(GSP3)
<400> 6
cactggagac ccgtcattc 19
<210> 7
<211> 313
<212> DNA
<213> 5' 端序列(G09_AF06250194.A203-3-10.M13R)
<400> 7
ggccacgcgt cgactagtac ggggggggcg tggctacgcc tgtttcttat agagtgtcgt 60
ccagcagtgc agccagtcgc gcggtgctgg gtcatatact cgggggcggt gcaggggggt 120
cgtggattgg tctagaggcg ttttcccgtt gcatgcctag tgaaaacact atccgtttct 180
ttcactctca gtcactttac agtttgcata atccaaaagc agcatggtga agaaggccgt 240
ttgtgtactt aaaggcaccg gggaagtgac cggcactgtt catttcgagc aagagaatga 300
cgggtctcca gtg 313
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(3’791-1)
<400> 8
cgtcggagac cttggtaacg tgatagct 28
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(3’791-2)
<400> 9
gtcaggggaa cactccgtca ttggg 25
<210> 10
<211> 421
<212> DNA
<213> 3' 端序列(WH0624005533#791-2-34M13-_J_H06)
<400> 10
gtcaggggaa cactccgtca ttgggaggac catggtgatc catgagaaag gggatgactt 60
gggtaaagga ggcaatgacg aaagtcttaa aactggcaac gctggaggtc gtctggcctg 120
tggtgtcata ggcatcactc agtgaagtcc agctctaatc aaagacttag ctttgaaata 180
attgtgacca atgtggatcc cccttctgta agcacttagc ccactgagga ttatgatcac 240
tatttttgca agttaatgtt taaggaattg tactttagct atgtaaagcc gtttttccgc 300
acacgtctat gtgggcacta tctaccttct tacagctaca aagtgatgtt tgtttcctct 360
gatctctgct ttattcaata aagattgagc agacttcgag aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 420
a 421
<210> 11
<211> 801
<212> DNA
<213> 全序列(Cu/Zn - SOD cDNA)
<400> 11
aaacactatc cgtttctttc actctcagtc actttacagt ttgcataatc caaaagcagc 60
atggtgaaga aggccgtttg tgtacttaaa ggcaccgggg aagtgaccgg cactgttcat 120
ttcgagcaag agaatgacgg gtctccagtg aagctctcag gtgatatcac tggccttact 180
ccaggaaagc atggtttcca tgtccatgct tttggagaca acacaaacgg ctgcatcagt 240
gcaggtccgc acttcaaccc tcacgataaa actcatggtg gaccaactga tagtgtcaga 300
cacgtcggag accttggtaa cgtgatagct ggtgacaatg gtgttgcaaa aattgacatt 360
gtggatgcaa tggtgaccct gtcaggggaa cactccgtca ttgggaggac catggtgatc 420
catgagaaag gggatgactt gggtaaagga ggcaatgacg aaagtcttaa aactggcaac 480
gctggaggtc gtctggcctg tggtgtcata ggcatcactc agtgaagtcc agctctaatc 540
aaagacttag ctttgaaata attgtgacca atgtggatcc cccttctgta agcacttagc 600
ccactgagga ttatgatcac tatttttgca agttaatgtt taaggaattg tactttagct 660
atgtaaagcc gtttttccgc acacgtctat gtgggcacta tctaccttct tacagctaca 720
aagtgatgtt tgtttcctct gatctctgct ttattcaata aagattgagc agacttcgag 780
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 801
<210> 12
<211> 154
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Cu/Zn - SOD cDNA)
<400> 12
Met Val Lys Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Thr Gly Glu Val Thr
1 5 10 15
Gly Thr Val His Phe Glu Gln Glu Asn Asp Gly Ser Pro Val Lys Leu
20 25 30
Ser Gly Asp Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly Lys His Gly Phe His Val
35 40 45
His Ala Phe Gly Asp Asn Thr Asn Gly Cys Ile Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro His Asp Lys Thr His Gly Gly Pro Thr Asp Ser Val Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Ile Ala Gly Asp Asn Gly Val Ala
85 90 95
Lys Ile Asp Ile Val Asp Ala Met Val Thr Leu Ser Gly Glu His Ser
100 105 110
Val Ile Gly Arg Thr Met Val Ile His Glu Lys Gly Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Asp Glu Ser Leu Lys Thr Gly Asn Ala Gly Gly Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Thr Gln
145 150

Claims (9)

1.一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因，其序列见SEQ ID NO.11。
2.根据权利要求1所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因，其特征在于，所述基因序列共801bp，包括完全开放阅读框465bp，5'端非编码区为60bp，3'端非编码区为276bp。
3.根据权利要求1所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因，其特征在于，所述基因序列推导编码的氨基酸序列见SEQ ID NO.12。
4.如权利要求1-3任一所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：提取总RNA并逆转录为cDNA；
步骤2：根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计引物，PCR克隆Cu/Zn-SOD基因中间片段；
步骤3：获取目标基因5’端序列；
步骤4：获取目标基因3’端序列；
步骤5：将步骤2、步骤3和步骤4获得的序列片段进行拼接，获得全长序列。
5.根据权利要求4所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，其特征在于：步骤2中根据已知的多种动物Cu/Zn-SOD基因的保守区序列设计的引物序列见SEQID NO.1和SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求4所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，其特征在于：步骤3中涉及的引物序列见SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6。
7.根据权利要求4所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法，其特征在于：步骤4中涉及的引物序列见SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9。
8.如权利要求1-3任一所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因在短须裂腹鱼超氧化物歧化酶相关研究中的应用。
9.如权利要求4-7任一所述的一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆方法在短须裂腹鱼超氧化物歧化酶相关研究中的应用。
CN201910744077.2A 2019-08-13 2019-08-13 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用 Pending CN110295184A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910744077.2A CN110295184A (zh) 2019-08-13 2019-08-13 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910744077.2A CN110295184A (zh) 2019-08-13 2019-08-13 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110295184A true CN110295184A (zh) 2019-10-01

Family

ID=68032929

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910744077.2A Pending CN110295184A (zh) 2019-08-13 2019-08-13 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110295184A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105409845A (zh) * 2015-12-01 2016-03-23 中国科学院昆明动物研究所 一种短须裂腹鱼人工繁殖方法
CN108300724A (zh) * 2018-01-22 2018-07-20 厦门市产品质量监督检验院 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶ecCu/ZnSOD基因及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105409845A (zh) * 2015-12-01 2016-03-23 中国科学院昆明动物研究所 一种短须裂腹鱼人工繁殖方法
CN108300724A (zh) * 2018-01-22 2018-07-20 厦门市产品质量监督检验院 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶ecCu/ZnSOD基因及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAIBO YU ET AL.: "Antioxidant defenses of Onychostoma macrolepis in response to thermal stress: Insight from mRNA expression and activity of superoxide dismutase and catalase", 《FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY》 *
郑清梅等: "草鱼铜锌超氧化物歧化酶全长cDNA的克隆与组织表达", 《基因组学与应用生物学》 *
黄俊: "短须裂腹鱼仔稚鱼个体发育和摄食生态学研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kwon et al. Cloning of brain aromatase gene and expression of brain and ovarian aromatase genes during sexual differentiation in genetic male and female Nile tilapia Oreochromis niloticus
Fan et al. Cloning of an antifreeze protein gene from carrot and its influence on cold tolerance in transgenic tobacco plants
Fujimori et al. Expression of cyclooxygenase-2 and prostaglandin receptor EP4b mRNA in the ovary of the medaka fish, Oryzias latipes: possible involvement in ovulation
Li et al. Molecular cloning and characterization of a calreticulin cDNA from the pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus
Lee et al. Molecular cloning and chromosomal localization of a prophenoloxidase cDNA from the malaria vector Anopheles gambiae
Yang et al. Identification of a germ cell marker gene, the dead end homologue, in Chinese sturgeon Acipenser sinensis
Yan et al. Identification and characterization of a glyoxalase I gene in a rapeseed cultivar with seed thermotolerance
Fujita et al. Molecular cloning of lysozyme-encoding cDNAs expressed in the salivary gland of a wood-feeding termite, Reticulitermes speratus
Saito et al. Cloning and characterization of amphibian cold inducible RNA-binding protein
Mohanta et al. Molecular cloning, characterization and functional assessment of the myosin light polypeptide chain 2 (mylz2) promoter of farmed carp, Labeo rohita
Xing et al. Identification of a novel gene SRG4 expressed at specific stages of mouse spermatogenesis
Dong et al. Expression analysis and characterization of zglp1 in the Chinese tongue sole (Cynoglossus semilaevis)
CN110295184A (zh) 一种短须裂腹鱼铜锌超氧化物歧化酶基因、克隆方法及其应用
CN110511938A (zh) 一种短须裂腹鱼热应激蛋白hsp70基因、检测方法及其应用
CN109868277A (zh) 曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能
Serikawa et al. Aaknox1, a kn1-like homeobox gene in Acetabularia acetabulum, undergoes developmentally regulated subcellular localization
CN108610402A (zh) 花生膜联蛋白基因AhANN6在提高植物及微生物抗高温和抗氧化胁迫中的应用
Kinoshita et al. A novel heat stress‐responsive gene in the marine diatom Chaetoceros compressum encoding two types of transcripts, a trypsin‐like protease and its related protein, by alternative RNA splicing
CN108300724B (zh) 一种黄姑鱼超氧化物歧化酶ecCu/ZnSOD基因及其应用
Ichida et al. Characterization of a vasa homolog in Mekong giant catfish (Pangasianodon gigas): Potential use as a germ cell marker
Choi et al. The heat shock protein 70a from'Pyropia seriata'increases heat tolerance in'Chlamydomonas'
CN108192878B (zh) 松墨天牛内源漆酶蛋白Ma-Lac1、编码基因及其应用
Pang et al. Cloning, characterization and expression of tyrosinase-like gene in amphioxus Branchiostoma japonicum
CN108676801A (zh) 一种斜带石斑鱼的卵母细胞标记基因slbp2的cDNA及其应用
Li et al. Molecular cloning of the heat shock protein 20 gene from Paphia textile and its expression in response to heat shock

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination