CN110283908A - 一种结直肠癌辅助诊断snp标志物及其应用 - Google Patents

一种结直肠癌辅助诊断snp标志物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物及其应用，该标志物为rs8100241。本发明通过针对rs8100241位点进行巧妙的引物和探针设计，能够依靠荧光定量PCR，即可对正常人群进行ANKLE1基因变异的检测，从而鉴别直肠癌的高危人群，辅助直肠癌患者的诊断。该技术方法设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估直肠癌的患病风险提供了帮助，有助于临床上对该类人群进行直肠癌筛查和早期干预。

Description

一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物及其应用
技术领域
本发明涉及于基因工程及肿瘤医学领域，具体涉及一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物及其应用。
背景技术
结直肠癌是严重威胁我国人民健康的常见恶性肿瘤，其发病率位列我国恶性肿瘤第五位，且随着我国生活水平的提高，结直肠癌的发病率呈现不断上升的趋势。目前，针对结直肠癌最有效的筛查方法是结肠镜检查。但是，这种方法也有检出率不高、患者接受度不高等问题。如能更为精准的针对结直肠癌的高危个体开展筛查和早期诊断，则可以使得患者的接受度更高，且为国家节省大量的医疗支出。
RNA的N6-Methyladenosine修饰(简称m6A修饰)是一种近年来广泛关注的转录后调控方式，可以影响基因的RNA和蛋白表达水平。在蛋白编码基因的RNA上，广泛存在m6A位点。RNA甲基化酶可以在“阅读”分子的引领下，作用于这些位点上，通过“写入”或“擦除”甲基化，实现对RNA翻译的精细调控。已有多个研究证实，这种转录后调控过程与肿瘤的发生发展过程密切相关。因此，m6A修饰可以作为一种新型分子标记，辅助肿瘤的诊断。由于m6A修饰发生在RNA水平上，因此其对应的编码区DNA如果含有遗传变异，则会显著影响基因m6A修饰的修饰过程，从而影响肿瘤的发生和易感性。
我们前期的研究表明，在ANKLE1基因编码区存在一个遗传变异rs8100241，可以通过影响ANKLE1的m6A修饰影响结直肠癌的易感性。相比于正常个体，携带rs8100241风险基因型的个体，结直肠癌的发病风险显著升高，可被认为是结直肠癌的高危人群。因此，对ANKLE1基因m6A修饰相关SNP的检测，可以辅助结直肠癌的早期诊断，早期发现结直肠癌患者。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物及其应用。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物，该标志物为rs8100241的组合。
上述的结直肠癌辅助诊断SNP标志物的特异性扩增引物，所述rs8100241的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
上述的结直肠癌辅助诊断SNP标志物的特异性探针，所述rs8100241的探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
上述SNP标志物在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs8100241。
所述试剂盒还包括上述SNP标志物的特异性扩增引物和上述SNP标志物的特异性探针。
本发明的有益效果为：从分子生物学及基因诊断水平上，提供了筛选结直肠癌高危人群的技术方法。此方法基于我们前期的研究显示，rs8100241位点与中国人群的结直肠癌易感性相关。通过针对rs8100241位点进行巧妙的引物和探针设计，能够依靠荧光定量PCR，即可对正常人群进行rs8100241变异的检测，从而鉴别结直肠癌的高危人群，辅助结直肠癌患者的诊断。该技术方法设计巧妙、简易可行、结果准确可靠，可在各级医院进行推广，对于评估结直肠癌的患病风险提供了帮助，有助于临床上对该类人群进行结直肠癌筛查和早期干预。
附图说明
图1为基于ANKLE1的结直肠癌风险预测模型AUC曲线。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物，该标志物为rs8100241的组合。
上述的结直肠癌辅助诊断SNP标志物的特异性扩增引物，所述rs8100241的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
上述的结直肠癌辅助诊断SNP标志物的特异性探针，所述rs8100241的探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
上述SNP标志物在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs8100241。
所述试剂盒还包括上述SNP标志物的特异性扩增引物和上述SNP标志物的特异性探针。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的受试者血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(2)基因型检测：选择结直肠癌病例和健康对照，在ANKLE1的m6A修饰相关位点上找到与中国人群结直肠癌发病相关的SNP标志物(3)对筛选出的阳性关联标志物，在独立的样本中进行验证，以判断其关联的稳定性。(4)结直肠癌辅助诊断试剂盒的研制：根据结直肠癌病例和健康对照中基因型分布频率有显著差异的遗传标志物开发辅助诊断试剂盒。
具体来说本发明的研究的实验方法主要包括以下内容：
我们对募集到的具有完整病历资料及分型明确的3580例结直肠癌患者和3864例无肿瘤病史的正常对照人群进行了基因分型。结直肠癌患者和正常对照均为中国大陆汉族。患者经组织病理学确诊，无年龄限制；正常对照无肿瘤病史，经体检无肿瘤体征。收集了研究对象的性别、年龄等信息。研究对象的基本情况请见表1。每个研究对象均知情同意参加本研究并捐献2ml外周静脉血，用于分离制备淋巴细胞基因组DNA。
表1.研究中采用的结直肠癌患者及正常对照人群的基本资料
我们运用非条件logistic回归加性模型(additive model)计算ANKLE1基因的m6A修饰SNP位点rs8100241与结直肠癌易感性的关联，并校正性别、年龄。研究结果表明，在校正了性别、年龄后，携带rs8100241保护基因型的个体，结直肠癌的患病风险较正常人减少11％(OR＝0.89,95％CI:0.83–0.96,P＝0.0018)。
我们进一步用这个SNP位点建立了结直肠癌的风险预测模型。我们构建了一个公式，综合考虑SNP的三种基因型和性别、年龄、吸烟及饮酒情况。其中，对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”；对于性别，男性为“1”，女性为“0”；对于年龄，大于或等于60岁为“1”,小于60岁为“0”。分析时以多因素logistic回归系数β为权重，得到基于rs8100241分型危险评分的公式如下：
危险评分＝(-0.1215×性别的评分)+(-0.6414×年龄的评分)+(-0.1126×rs8100241分型的评分)。
通过绘制AUC曲线，可得该模型曲线下面积为0.601，临界值为-0.028，具体见图1。
实验方法：
1.外周血DNA提取：
我们用常规酚-氯仿法提取DNA，具体步骤如下：
1)取约3ml抗凝血，室温下5,000×g离心15min，弃去上层，留约0.3ml血细胞。加入0.5ml新鲜配制的终浓度为20μg/ml RNA酶的抽提缓冲液，混匀后37℃孵育1h。
2)加入终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，混匀后37℃孵育过夜。
3)每管加入Tris缓冲液平衡的酚(pH＝7.0)0.7ml，充分混匀，室温下8,000×g离心15min。
4)将上层液体转移到另一1.5ml离心管中，加入等体积酚–氯仿(1:1)0.7ml，充分混匀15min；室温8,000×g离心15min。
5)将上层液体转移到另一干净1.5ml离心管中，加入10％体积的10M乙酸铵溶液，加入2倍体积预冷的无水乙醇，–20℃静置2h以沉淀DNA。
6)沉淀出的DNA用75％乙醇洗涤，12,000×g离心15min后弃上层液体；再用75％乙醇洗涤，12,000×g离心15min后弃上层液体。
7)将管倒立在吸水纸上，待乙醇挥发干净后，每管加适当TE缓冲液，4℃放置一周后保存于–20℃备用。
2.基因分型
采用的分型平台为TaqMan基因分型技术(ABI 7900HT Real Time PCR system,Applied Biosystems)，5μl PCR反应体系如表2所示：
表2
反应条件为：95℃预变性10min，然后95℃15sec和60℃1min共40个循环。
反应所用的引物和探针如下：
rs8100241引物：
正向引物：ACTCTGACCGCGGTGTTT(SEQ ID NO：1)
反向引物：GCCGTCCTCTAGCACCAAAT(SEQ ID NO：2)
rs8100241探针：
正向探针：FAM-CTGCGGCGCGGAC-MGB(SEQ ID NO：3)
反向探针：HEX-CTGCGGCACGGAC-MGB(SEQ ID NO：4)
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学
<120> 一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actctgaccg cggtgttt 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccgtcctct agcaccaaat 20
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcggcgcg gac 13
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcggcacg gac 13

Claims (6)

1.一种结直肠癌辅助诊断SNP标志物，其特征在于，该标志物为rs8100241。
2.根据权利要求1所述的结直肠癌辅助诊断SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于，所述rs8100241的特异性扩增引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
3.根据权利要求1所述的结直肠癌辅助诊断SNP标志物的特异性探针，其特征在于，所述rs8100241的探针序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
4.权利要求1所述SNP标志物在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用。
5.一种结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs8100241。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求2所述SNP标志物的特异性扩增引物和权利要求3所述SNP标志物的特异性探针。
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