CN110269069A - 小茴香挥发油的新用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小茴香挥发油在农业上的新用途；即其在防治中药材或作物根腐病中的应用或在防治导致中药材或作物地上部发生病害的致病菌中的应用；实验结果表明：小茴香挥发油对引发三七根腐病发生的4种主要致病菌尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、腐霉和毁坏柱孢霉和导致三七地上部病害发生的2种致病菌胶孢炭疽菌、立枯丝核菌的菌丝生长有很强抑制作用，在浓度为50mg/mL时，其抑制率均在80％以上，其中对三七地上部病害致病菌抑制效果均达到了100％；MIC结果表明，小茴香挥发油对上述菌株有较好的抗真菌作用，通过对FIC值的分析，发现小茴香挥发油与恶霉灵联用对多种病原菌有加和效应和协同效应；此外，挥发油易挥发，且具有芳香辟秽的特点，因此以其开发的化肥或农药将具有安全、有效、低残留等优点。

Description

小茴香挥发油的新用途
技术领域
本发明涉及小茴香挥发油的用途，尤其涉及小茴香挥发油对中药材或作物根腐病及对中药材或作物地上部多种病害的防治作用，属于生物农药技术领域。
背景技术
化学药剂是对微生物有抑制作用的制剂，根据作用性质可将化学药剂分为杀菌剂和抑菌剂，杀菌剂是能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂，抑菌剂并不破坏细菌的原生质，而只是阻抑新细胞物质的合成，使细菌不能增殖；微生物种类、化学药剂处理微生物的时间长短、温度高低以及微生物所处环境等，都影响着化学药剂杀菌或抑菌的能力和效果；化学药剂的过量使用不仅在经济上造成浪费，还会造成药害，污染环境，杀伤天敌，对人体健康不利，有很多不良后果；
三七作为名贵栽培药用植物，随着社会需求量在不断增加，三七种植面积的迅速增加，其病害问题日益严重，已成为三七生产的主要障碍；目前，对三七病害的防治主要依赖各种化学药剂，化学农药虽有效，却大大增加了农民的投入成本，降低了药材品质，高残留的农药会造成严重的环境污染。
植物挥发油不仅用于传统医药、食品、烟草、酒精和烟草，还可用于植物保护(杀虫、抑菌、除草等)，这无疑为植物生态系统的利用开辟了一条新的途径；植物挥发油作为植物源农药应用于植物保护领域，与建议的无公害农药理念一致。从这个意义上说，植物挥发油也可以被归类为第三代农药。
小茴香为伞形科植物茴香Foeniculum vuLgare Mill.的干燥成熟果实；小茴香有散寒止痛，理气和胃的功效。
目前，未见与本发明技术方案相关的文献公开。
发明内容
本发明目的在于提供一种小茴香挥发油的新用途，即其在防治中药材或作物根腐病中的应用，所述根腐病的致病菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、腐霉(Pythium aphanidermatum)、毁坏柱孢霉(Cylindrocarpondestructans)等。
本发明小茴香挥发油还可应用在防治导致中药材或作物地上部发生病害的致病菌中；所述致病菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等。
本发明所述的小茴香挥发油的用途，是将小茴香挥发油用作制备防治中药材或作物根腐病或者防治引起中药材或作物地上部发生病害的致病菌的制剂，即以小茴香挥发油为活性成分，在制备防治致病菌制剂中的应用。
本发明所述防治致病菌制剂的成分(或有效成分)为小茴香挥发油，还可以加入一种或多种中药和作物病害防治制剂上可接受的辅料，或者与其他活性成分复配发挥协同抑菌作用。
小茴香挥发油可以通过现有技术设备制备成各种剂型的农药或各种形态的化肥。
本发明中小茴香挥发油是通过常规水蒸气蒸馏法提取，无水硫酸钠干燥挥发油而制得，该制备方法简单，所需试剂成本低，有利于大量生产。
小茴香挥发油可通过抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长来降低植物发病率和病情指数；还可以通过和化学农药协同增效，达到减少化学农药施用的目的。
小茴香挥发油作为一种天然的杀菌活性物质，在使用后其活性消失或被微生物分解，对环境无污染，对人畜安全；由于小茴香挥发油是植物源提取物，其有效成分复杂多样，对病原菌为多成分多靶点的作用机制，使得靶标生物不易产生对某种或某几种成分产生抗药性，从而获得持久的防治效果。与化学合成农药相比，小茴香挥发油的有效成分易挥发、易降解，抑菌而不杀菌，因此不易对其它的有益微生物造成危害，能改善土壤微生态结构，促进植物与微生物协同进化，保护生态环境，提高中药材或作物的品质。
配制50mg/mL的小茴香挥发油溶液，溶剂为含有体积浓度1％的DMSO和体积浓度0.1％的吐温80的水溶液，测试小茴香挥发油对三七根腐病发生的4种主要致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、腐霉(Pythiumaphanidermatum)和毁坏柱孢霉(Cylindrocarpon destructans)的作用，以及导致三七地上部病害发生的2种致病菌胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝生长的作用；结果显示小茴香挥发油对6种病原菌具有广谱的抑菌作用且抑菌率高，抑制率均在80％以上，其中对三七地上部病害致病菌抑制效果均达到了100％；对孢子萌发和菌丝生长有抑制作用，将小茴香挥发油与化学农药恶霉灵进行复配，发现其对多个菌株的抑菌效果均具有协同和加和作用；EC50实验结果显示0.821mg/mL的小茴香挥发油能有效抑制半数尖孢镰刀菌丝生长；活体试验结果显示小茴香挥发油能有效抑制三七植株上的尖孢镰刀菌的生长。
本发明小茴香挥发油具有制备方法简单、使用方便、投入低、效率高、易挥发、低毒、低残留的特点；在国家大力发展有机农业的大背景下，小茴香发油是比较理想的克服三七病害的化学药剂替代品，对农业的可持续发展具有重要意义，在农业生产中有较广阔的应用前景。
附图说明
图1是小茴香挥发油对尖孢镰刀菌(1)、腐皮镰刀菌(2)、毁坏柱孢霉(3)、腐霉(4)、胶孢炭疽菌(5)、立枯丝核菌(6)的菌落生长的抑制结果；
图2是小茴香挥发油对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、毁坏柱孢霉、腐霉、立枯丝核菌、胶孢炭疽菌菌落生长的抑菌率结果；图中不同字母表示同一处理对不同菌株抑制率有显著性差异p<0.05；
图3为小茴香挥发油活体试验中三七幼苗长势图，其中a为小茴香挥发油处理组；b为阳性对照组；c为阴性对照。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：小茴香挥发油的制备
(1)在1000g小茴香中添加其质量7倍的水，浸泡2h，采用加热蒸馏的方式，利用水蒸气提取小茴香中的挥发油，提取时间为8h，冷凝收集溜出液；
(2)提取出来的溜出液用无水硫酸钠干燥，除去所含水份，即为小茴香挥发油，放进棕色样品瓶里，密封，-20℃保存待用。
实施例2：致病菌的活化
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL；
(2)将分离自三七根部和地上部的致病菌进行纯化鉴定，鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、腐霉(Pythiumaphanidermatum)、毁坏柱孢霉(Cylindrocarpon destructans)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，将上述菌种接种在PDA培养基上进行活化，接种3～4次后，取生长旺盛的菌株备用。
实施例3：GC-MS测定小茴香挥发油的化学组分
(1)GC条件：仪器型号：Agilengt Technologies 7890B-5977B；色谱柱：HP-5MS30m×250μm×0.25μm；
(2)EI源电离源温度：230℃；四级杆温度：150℃；扫描范围：30～500m/z；进样口温度：285℃；分流比10:1；进样量：1μl；电子能量：70eV；柱温箱升温程序：50℃保持4min，5℃/min升温至120℃，1℃/min升温至180℃，10℃/min升温至280℃保持16min；其中RI值根据正构烷烃连续碳(C9-C25)的保留时间计算得到，将化合物的保留时间和质谱与NIST17.L数据库进行数据比对，确定最终化合物，检测结果见下表；
实施例4：测定小茴香挥发油对实施例2中6种致病菌菌丝生长的影响
(1)无菌操作条件下，在每个培养皿中倒入15mL PDA培养基，待冷却凝固后，取实施例2中在PDA培养基上培养7d的致病菌，用直径5mm的打孔器沿菌落边缘打取菌块，接种于培养基中央；
(2)将4个无菌牛津杯距离真菌块25mm处等距离放置；
(3)将实施例1干燥后的小茴香挥发油用含有体积浓度1％的DMSO和体积浓度0.1％的吐温80的水溶液溶解，制得浓度为50mg/mL小茴香挥发油液体；
(4)在每个牛津杯中加入200μL步骤(3)的50mg/mL小茴香挥发油液体(事先用0.22μm有机系滤头过滤除菌)，于微生物培养箱中28℃恒温培养，以不加小茴香挥发油的含有体积浓度1％的DMSO和体积浓度0.1％的吐温80的水溶液和恶霉灵为对照，每个处理设5个重复；
(5)培养箱中培养7d后，采用“十字交叉法”测量菌落直径。
结果见图1、2，从图1中可以看出小茴香挥发油对这6种病原菌具有广谱的抑菌作用且抑菌率高，与阴性对照组相比，加入挥发油的实验组菌落直径更小，部分菌株在挥发油处理后甚至不出现菌丝生长；从抑菌率柱状图上看(图2)，对于三七的6种致病菌，小茴香挥发油对其都有强烈的抑制作用，其中对三七地上部病害致病菌抑制效果均达到了100％。
实施例5：小茴香挥发油MIC测定
(1)将实施例1干燥后的小茴香挥发油用含有体积浓度2％的DMSO和体积浓度1％的吐温80的水溶液溶解，用二倍稀释法配置浓度范围为18.75-0.038mg/mL的多个浓度梯度液体，阳性药恶霉灵、单体化合物茴香脑、草蒿脑用同样方法配置成浓度范围为18.75-0.038mg/mL的溶液；
(2)取实施例2中生长7d的病原菌，用20mL 1/4 PDA液体培养基(不添加琼脂，马铃薯和葡萄糖的量为常规培养基的1/4)冲洗培养基，然后制成孢子浓度为1×104个/mL的孢子悬浮液；
(3)在96孔板中加入0.22μm微孔滤膜过滤除菌的50μL小茴香挥发油和150μL步骤(2)中制成的孢子悬浮液；
(4)空白对照是50μL含有体积浓度2％DMSO和体积浓度1％吐温80的水溶液以及150μL1/4PDA液体培养基；阳性对照为50μL含有体积浓度2％DMSO和体积浓度1％吐温80的水溶液以及150μL步骤(2)中的孢子悬浮液；
(5)96孔板28℃恒温培养36h，然后检查孔内真菌生长情况；在595nm处用酶标仪(Thermo 1510)测量每个孔的吸光度，结果见下表；
不同字母表示同一行中不同菌株的最小抑菌浓度具有显著性差异p<0.05。
实施例6：小茴香挥发油与恶霉灵联合作用测定
(1)依据实施例5得到的小茴香挥发油和恶霉灵的MIC，配置成最高浓度为8倍MIC，然后采用二倍稀释法配置8个稀释梯度；
(2)将不同浓度的小茴香挥发油(25μL)和不同浓度的恶霉灵(25μL)组合添加在96孔板内，然后每个孔中加入实施例5步骤(2)中制成的孢子悬浮液(150μL)；
(3)150μL实施例5步骤(2)中制成的孢子悬浮液与50μL含有体积浓度2％的DMSO和体积浓度1％的吐温80的水溶液为阳性对照；
(4)96孔板在28℃恒温保存36h，在595nm处用酶标仪(Thermo 1510)比色，检测真菌生长情况；
(5)联合用药的MIC测定：以无真菌孔生长对应的药物浓度作为小茴香挥发油与恶霉灵联用的MIC；
(6)FIC计算：挥发油的FIC＝挥发油与恶霉灵联用的MIC/挥发油的MIC，恶霉灵的FIC＝挥发油与恶霉灵联用的MIC/恶霉灵的MIC；
(7)FICI＝挥发油的FIC+恶霉灵的FIC，其中FICI≤0.5为协同作用，0.5<FICI≤1为加和作用，1<FICI≤4为无关作用，FICI>4为拮抗作用；FIC≤0.5，协同作用；0.5<FICI≤1，加和；1<FICI≤4，无关；FICI>4，拮抗作用；结果见下表；
出于减少化学农药使用的绿色环保理念以及资源节约的目的，开展棋盘实验让挥发油与恶霉灵互配；挥发油与恶霉灵联合使用效果见上表所示，对于受试菌F.oxysporum、P.aphanidermatum、C.Gloeosporioides，挥发油与恶霉灵联合使用均能产生协同效果；而对于所有受试菌，挥发油与恶霉灵联合使用均不产生拮抗作用，说明在实际生产中，挥发油可以与恶霉灵按适当的浓度配比，增强抑菌活性，并且能减少化学农药的使用。
实施例7：小茴香挥发油对尖孢镰刀菌的EC50实验
EC50是评价真菌对抗菌剂敏感性的一个重要指标；由于尖孢镰刀菌是引起三七根腐病的元凶之一，并且它对小茴香挥发油比较敏感，故本实验选用尖孢镰刀菌作为试验菌，实验步骤如下：
(1)配制PDA培养基，分装成99mL每份，密封，高温高压灭菌20min；
(2)待PDA冷却至50℃-55℃时，采用无菌操作，往每份PDA培养基中分别加入不同浓度的小茴香挥发油1mL，充分摇匀，得到终浓度为2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC的PDA溶液；
(3)在培养皿中加入15mL上述PDA溶液，重复添加三次，待PDA溶液冷却凝固后，往中央接入直径为5mm的菌饼，置于真菌培养箱培养7天，测量菌落直径并计算抑制率，结果见下表；
实验结果显示：小茴香挥发油的EC50为0.821mg/mL；阳性对照恶霉灵的EC50为0.021mg/mL；以上结表明，在本实验体系中，0.821mg/mL的小茴香挥发油能有效抑制半数尖孢镰刀菌丝生长。
实施例8：小茴香挥发油的活体试验
(1)在由蛭石和石英砂(体积比为2:1)组成的无菌培养基质中加入小茴香挥发油，得到含有挥发油的培养基质(0.55mg/g)，自封袋密封保存；
(2)将含有挥发油的培养基质熏蒸5天后，按每盆250克的量装盆；
(3)用1×107个孢子/mL的尖孢镰刀菌孢子悬液浸泡三七幼苗3小时后，每盆栽种10株，共4盆，作为小茴香挥发油处理组，阴性对照组为浸泡无菌水，以不经挥发油处理的蛭石和石英砂(体积比为2:1)组成的无菌培养基质种植孢子悬液浸泡的三七幼苗作为阳性对照组；每组5个重复；
(5)培养15天后，当阳性对照组幼苗出现明显的病害症状时，对每个组三七植株的根系、茎秆、叶片的鲜重和干重以及株高进行测量，并计算各组的发病率及病情指数，结果见下表及图3；

Claims (3)

1.小茴香挥发油在防治中药材或作物根腐病中的应用。
2.小茴香挥发油在防治导致中药材或作物地上部发生病害的致病菌中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：致病菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
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