CN110257366B - 一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法 - Google Patents

一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法，包括以下步骤：生物炭制备，制备固化菌剂，生物炭盆栽防病实验。在本发明的盆栽实验中，添加最佳搭载生物炭菌剂的防治效果达79.55％，防治效果好，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。

Description

一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法
技术领域
本发明涉及一种烟草病害防治方法，尤其涉及一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌在烟草病害防治中的应用。
背景技术
烟草是一种重要的经济作物，烟草黑胫病是世界各烟草种植区的重要病害之一。目前对黑胫病的控制仍然以化学药剂为主，从而导致病原菌抗药性增强、环境污染及烟叶重金属含量超标等后果，影响防治效果、生态安全和人类健康。
烟草属于吸食性产品，随着人们对环境与健康的日益重视，减少农药使用，促进安全优质的烟叶生产，对改善农业生态环境具有重要意义。生物防治对环境友好，在某些情况下防治效果优于化学药剂，特别是在病害发病高峰期常伴随高温多雨，化学药剂难以发挥作用，因此，生物防菌剂的开发较为重要。
目前，枯草芽孢杆菌已经应用在烟草黑胫病防治中，但是单一的枯草芽孢杆菌的防治效果有待提高。
发明内容
本发明克服了现有技术的不足，提供一种防治效果较好的方法。
一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法，包括以下步骤：
S1生物炭制备：
取粉碎后的植物茎杆，在300℃-500℃条件下，反应5h，制备生物炭，粉碎研磨，过筛备用；
S2制备固化菌剂：
S201称取S1中制备的生物炭1g，放在50ml离心管种，加入菌悬液20ml，振荡吸附24h；
S202取出后，离心，弃上清液；
S203用0.85％的生理盐水洗涤S202中的下层离心固体，然后离心5min，重复洗涤2次，再离心后获得固定化菌剂；
S 3生物炭盆栽防病
S 301将酸化土与黑胫菌谷混合，添加S203中获得的固定化菌剂，设置对照组；
S302盆栽试验前，植盆栽试验第0、10、15、20d，测定土壤理化性质，理化性质指标包括：全氮含量、碳氮比、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量、pH、电导率；
S303接种后每第0、10、15、20d，以株为单位，调查黑胫病发病情况，计算病情指数和相对防治效果，其中，
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防治效果＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100；
S 304盆栽后第0、10、15、20d，取烟苗根际土，采用实时荧光定量PCR技术检测烟草黑胫病菌在烟草根际变化规律。
进一步包括，步骤S201中，振荡吸附的方法是将锥形瓶置于摇床中，振荡吸附的条件为：室温，振荡速度175r/min。
进一步包括，步骤S202中，离心条件为2500r/min离心10min。
进一步包括，步骤S 304中，根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18SrDNA基因序列设计荧光定量PCR特异引物SP：5'-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3'，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3'，扩增目的片段长度为172bp。
进一步包括，在步骤S1中，制备生物炭是，过60-100目筛。
本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明具备以下有益效果：
1.在本发明的盆栽实验中，添加最佳搭载生物炭菌剂的防治效果达79.55，防治效果好，在烟草黑胫病的生物防治方面具有潜在的应用价值，发展和应用前景良好。
2.生物防治对环境友好、不易产生抗药性、对人畜安全，为烟草绿色防控发展创造条件。
附图说明
图1是生物炭灰分含量柱状图；
图2是生物炭全氮含量柱状图；
图3是生物炭全碳含量柱状图；
图4是生物炭碳氮比柱状图；
图5是300℃制备的生物炭电镜结构图；
图6是400℃制备的生物炭电镜结构图；
图7是500℃制备的生物炭电镜结构图；
图8是不同温度下制备的生物炭吸附效果图；
图9是300℃制备的生物炭在电镜下的负载效果图；
图10是400℃制备的生物炭在电镜下的负载效果图；
图11是500℃制备的生物炭在电镜下的负载效果图；
图12是不同菌剂速效磷的效果柱状图；
图13是不同菌剂速效钾的效果柱状图；
图14是不同菌剂碱解氮的效果柱状图；
图15是不同菌剂全氮的效果柱状图；
图16是不同菌剂碳氮比的效果柱状图；
图17是荧光定量结果图；
图18是标准曲线图；
图19不同处理植株根际土烟草黑胫病目的基因片段拷贝柱状图。
具体实施方式
现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
实施例1
1.生物炭制备：
取粉碎后的植物茎杆，在300℃条件下，反应5h，制备生物炭，粉碎研磨，过60目筛备用，得到C300；
2.制备固化菌剂：
称取S1中制备的生物炭1g，放在50ml离心管种，加入菌悬液20ml，将锥形瓶置于摇床中，振荡吸附的条件为：室温，振荡速度175r/min，振荡吸附24h；取出后，离心(离心条件为2500r/min离心10min)，弃上清液；
用0.85％的生理盐水洗涤S202中的下层离心固体，然后离心5min，重复洗涤2次，再离心后获得固定化菌剂TB300；
3.生物炭盆栽防病
将酸化土与黑胫菌谷混合，添加S203中获得的固定化菌剂，设置对照组；
盆栽试验前，植盆栽试验第0、10、15、20d，测定土壤理化性质，理化性质指标包括：全氮含量、碳氮比、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量、pH、电导率；
接种后每第0、10、15、20d，以株为单位，调查黑胫病发病情况，计算病情指数和相对防治效果，其中，
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防治效果＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100；
盆栽后第0、10、15、20d，取烟苗根际土，采用实时荧光定量PCR技术检测烟草黑胫病菌在烟草根际变化规律。
根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18SrDNA基因序列设计荧光定量PCR特异引物SP：5'-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3'，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3'，扩增目的片段长度为172bp。
实施例2
1.生物炭制备：
取粉碎后的植物茎杆，在400℃条件下，反应5h，制备生物炭，粉碎研磨，过60目筛备用，得到C400；
2.制备固化菌剂：
称取S1中制备的生物炭1g，放在50ml离心管种，加入菌悬液20ml，将锥形瓶置于摇床中，振荡吸附的条件为：室温，振荡速度175r/min，振荡吸附24h；取出后，离心(离心条件为2500r/min离心10min)，弃上清液；
用0.85％的生理盐水洗涤S202中的下层离心固体，然后离心5min，重复洗涤2次，再离心后获得固定化菌剂TB400；
3.生物炭盆栽防病
将酸化土与黑胫菌谷混合，添加S203中获得的固定化菌剂，设置对照组；
盆栽试验前，植盆栽试验第0、10、15、20d，测定土壤理化性质，理化性质指标包括：全氮含量、碳氮比、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量、pH、电导率；
接种后每第0、10、15、20d，以株为单位，调查黑胫病发病情况，计算病情指数和相对防治效果，其中，
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防治效果＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100；
盆栽后第0、10、15、20d，取烟苗根际土，采用实时荧光定量PCR技术检测烟草黑胫病菌在烟草根际变化规律。
根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18SrDNA基因序列设计荧光定量PCR特异引物SP：5'-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3'，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3'，扩增目的片段长度为172bp。
实施例3
1.生物炭制备：
取粉碎后的植物茎杆，在500℃条件下，反应5h，制备生物炭，粉碎研磨，过60目筛备用，得到C500；
2.制备固化菌剂：
称取S1中制备的生物炭1g，放在50ml离心管种，加入菌悬液20ml，将锥形瓶置于摇床中，振荡吸附的条件为：室温，振荡速度175r/min，振荡吸附24h；取出后，离心(离心条件为2500r/min离心10min)，弃上清液；
用0.85％的生理盐水洗涤S202中的下层离心固体，然后离心5min，重复洗涤2次，再离心后获得固定化菌剂TB500；
3.生物炭盆栽防病
将酸化土与黑胫菌谷混合，添加S203中获得的固定化菌剂，设置对照组；
盆栽试验前，植盆栽试验第0、10、15、20d，测定土壤理化性质，理化性质指标包括：全氮含量、碳氮比、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量、pH、电导率；
接种后每第0、10、15、20d，以株为单位，调查黑胫病发病情况，计算病情指数和相对防治效果，其中，
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防治效果＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100；
盆栽后第0、10、15、20d，取烟苗根际土，采用实时荧光定量PCR技术检测烟草黑胫病菌在烟草根际变化规律。
根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18SrDNA基因序列设计荧光定量PCR特异引物SP：5'-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3'，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3'，扩增目的片段长度为172bp。
性能测试
1、生物炭理化性质测定：(1)使用元素分析仪测定生物炭全氮、全碳、C/N比；(2)采用碱解扩散法测定碱解氮含量；(3)采用Na HCO3浸提-钼锑抗显色法测定速效磷含量；(4)采用NH4OAc浸提-火焰光度计法测定速效钾含量；(5)按土水比1∶5(m∶V)浸提、采用雷磁PHS-3Cp H计测定土壤pH值。所有测定均设置三个重复。
2、生物炭灰分测定：将坩锅置于马弗炉中在750℃下干烧4h后取出，置于干燥器中备用。取C300、C400、C500生物炭各1g(称准至0.0001g)置于干烧后的坩锅中，每种炭设置4个重复，称量坩锅与生物炭总重并记录编号。将盛有生物炭的坩锅置于马弗炉中，在750℃下反应4h后，再次称量坩锅与生物炭总重，其与反应前总重的差值即为生物炭灰分质量。
生物炭的理化性质如表1中所示。
表1生物炭理化性质表
Figure BDA0002119716690000071
如图1-7所示，在300℃下制备的生物炭的理化性质较好，并且在电镜下的吸附结构均匀，其吸附效果最好。
3.生物炭对Tbp55菌株的吸附效果测定
生物炭固定化微生物的生物量测定采用微生物量碳法(TOC)测定。其结果如表2和图8中所示。
表2生物炭对Tbp55菌株的吸附效果表
菌剂 TOC
TB300 355.41±23.47a
TB400 128.84±15.00c
TB500 231.61±12.40b
其中，在图9-11中显示，在电镜下TB300的吸附效果最好，即实施例1中制备的生物炭的吸附性能最好。
4、盆栽实验性能测试
将酸化土与黑胫菌谷混合(1kg:2g)，分别添加最佳搭载生物炭菌剂(TB300),300℃、400℃、500℃条件下制备生物炭(C300、C400、C500)，20g/kg，共6个处理：
T1：酸化土+黑胫菌谷+TB300菌剂
T2：酸化土+黑胫菌谷+C300生物炭
T3：酸化土+黑胫菌谷+C400生物炭
T4：酸化土+黑胫菌谷+C500生物炭
T5：Tpb55发酵液50倍液，50毫升/株，15株750ml.
CK：酸化土+黑胫菌谷
每个处理5棵苗，重复3次，共6*3*5＝90棵烟苗；酸化土1kg/盆。
5、盆栽土壤理化性质检测：
依照以下指标测定土壤理化性质(盆栽试验前，植盆栽试验第0、10、15、20d)：
(1)通过元素分析仪测定土壤全氮含量、C/N比；
(2)采用碱解扩散法测定碱解氮含量；
(3)采用Na HCO3浸提-钼锑抗显色法测定速效磷含量；
(4)采用NH4OAc浸提-火焰光度计法测定速效钾含量；
(5)按土水比1∶5(m∶V)浸提、采用雷磁PHS-3C pH计测定土壤pH值；
(6)通过电导率仪测定土壤电导率。
土壤理化性质如表3和图12-16中所示。
表3
Figure BDA0002119716690000091
5、病情指数和相对防治效果：
接种后每第0、10、15、20天，在晴天中午以后以株为单位对各处理黑胫病发病情况进行调查，计算病情指数。
按标准方法对烟草黑胫病分级，其标准为：
0级：全株无病。
1级：茎部病斑大小不超过茎围的三分之一，个别叶片萎蔫。
3级：茎部病斑大小不超过茎围的二分之一，或者半数以下的叶片轻度凋萎，或者少数下部的叶片出现病斑。
5级：茎部病斑大小超过茎围的二分之一，或者半数以上的叶片轻度凋萎。
7级：茎部病斑环绕茎围，或者半数以上的叶片凋萎。
9级：病株的叶片全部凋萎或者枯死。
计算公式：
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防治效果＝(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100。
本发明的防治效果如表4中所示，防治效果高达79.55，防治效果较好。
表4
处理 病情指数 防治效果(％)
CK 54.32 -
Tbp55菌液 34.57 36.36
TB复合菌剂 11.11 79.55
C300 41.98 22.72
C400 44.44 18.19
C500 48.81 10.14
6、根际病原菌动态检测：
盆栽后第0、10、15、20d取烟苗根际土，采用实时荧光定量PCR技术检测烟草黑胫病菌在烟草根际变化规律。
根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18SrDNA基因序列设计荧光定量PCR特异引物SP：5'-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3'，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3'，扩增目的片段长度为172bp，引物由擎科合成。
荧光定量图如图17-19所示。并且，植株根际土烟草黑胫病DNA目的片段质量如表5所示。
表5植株根际土烟草黑胫病DNA目的片段质量表
处理 DNA质量
CK 553883.29±25853.43a
Tbp55菌液 13402.34±549.59d
TB复合菌剂 8206.41±380.05d
C300 121338.02±5743.29c
C400 243794.45±20348.81b
C500 239496.52±16064.94b
以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。

Claims (4)

1.一种基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1 生物炭制备：
取粉碎后的植物茎杆，在300℃-500℃条件下，反应5h，制备生物炭，粉碎研磨，过筛备用；
将制备的生物炭进行理化性质、灰分测定，选择理化性质较好的生物炭条件如下：在300℃条件下，反应5h，制备生物炭，粉碎研磨，过60目筛备用；
S2 制备固化菌剂：
S201 称取S1中制备的生物炭1g，放在50ml离心管种，加入枯草芽孢杆菌悬液20ml，振荡吸附24h；
S202 取出后，离心，弃上清液；
S203 用0.85%的生理盐水洗涤S202中的下层离心固体，然后离心5min，重复洗涤2次，再离心后获得固定化菌剂；
选择吸附性较好的固定化菌剂；
S 3 生物炭盆栽防病
S 301 将酸化土与黑胫菌谷混合，添加S203中获得的固定化菌剂，设置对照组；
S302盆栽试验前，植盆栽试验第0、10、15和/20天，测定土壤理化性质，理化性质指标包括：全氮含量、碳氮比、碱解氮含量、速效磷含量、速效钾含量、pH和/电导率；
S303接种后每第0、10、15和20 天，以株为单位，调查黑胫病发病情况，计算病情指数和相对防治效果，其中，
病情指数=∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100
相对防治效果=(对照病情指数—处理病情指数)/对照病情指数×100；
S 304 盆栽后第0、10、15和20天，取烟苗根际土，采用实时荧光定量PCR技术检测烟草黑胫病菌在烟草根际变化规律。
2.根据权利要求1所述的基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法，其特征在于，步骤S201中，振荡吸附的方法是将锥形瓶置于摇床中，振荡吸附的条件为：室温，振荡速度175r/min。
3.根据权利要求1所述的基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法，其特征在于，步骤S202中，离心条件为2500r/min离心10min。
4.根据权利要求1所述的基于生物炭的枯草芽孢杆菌对烟草病害的防治方法，其特征在于，步骤S 304中，根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18SrDNA 基因序列设计荧光定量PCR特异引物SP：5'-TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3'，AP：5’-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3'，扩增目的片段长度为172bp。
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