CN110214176B

CN110214176B - 通过聚电解质多层膜涂覆多孔板的机器人方法

Info

Publication number: CN110214176B
Application number: CN201780077848.6A
Authority: CN
Inventors: 卡特琳·塞西尔·皮卡尔; 刘洁; 法比安·达隆诺; 保罗·马希约
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Polytechnique de Grenoble
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Polytechnique de Grenoble
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: EP3555259A1; CN110214176A; US11219901B2; EP3555259B1; US20200094246A1; US20220032289A1; JP2020503012A; WO2018109184A1; EP3336169A1

Abstract

本发明提供一种通过聚电解质多层膜涂覆多孔板的至少一个孔的底表面的机器人方法、根据该方法可获得的多孔板以及其用于细胞培养的用途。

Description

通过聚电解质多层膜涂覆多孔板的机器人方法

技术领域

本发明涉及一种通过聚电解质多层膜涂覆多孔板的机器人方法(roboticmethod)，该方法允许以高度可再现的和可靠的方式来制备膜并具有非常高的空间均匀性。

背景技术

聚电解质多层(PEM)的沉积已经成为一种非常容易处理和通用的工具。基于聚阳离子和聚阴离子的交替吸附，该技术允许构建具有可调性质的薄膜：通过调整几个参数，例如聚电解质的化学性质、pH和离子强度、浸渍和漂洗时间、薄膜的后处理，有可能获得几乎无限种类的架构。

近来，静电逐层(LbL)组装技术鉴于其多功能性，特别是大范围的构件和组装条件，以及提供局部小治疗剂和蛋白质(如生长因子)的可能性，已成为生物医学应用的一种非常有前景的工具。可用于表面改性的大量模板(形状、尺寸)、层材料(生物或合成)以及令人印象深刻的LbL组装技术组合都促成了该技术的广泛使用。

申请EP 1535952公开了一种用于制备交联聚电解质多层膜的方法，包括在偶联剂存在下构成多层膜的聚合物中存在的互补官能团：羧基和氨基的反应，由此形成酰胺键。

申请WO 2010/081884公开了一种用于涂覆表面的方法，包括以下步骤：(a)在表面上依次沉积至少一层交替吸附的聚电解质，以提供具有互补氨基和羧基反应性基团的涂覆表面，其中第一(或反过来第二)聚电解质是包含所述氨基的阳离子聚合物，第二(或反过来第一)聚电解质是包含所述羧基的阴离子聚合物，(b)在偶联剂存在下，使涂覆表面的所述互补反应性基团反应，以在所述互补反应性基团之间形成酰胺键，产生交联聚电解质多层膜，和(c)用含蛋白质溶液(优选用含有生长因子类型蛋白质的溶液)处理所述交联聚电解质多层膜，以在所述交联聚电解质多层上和内部掺入所述蛋白质。因此获得的膜含有蛋白质。在96孔板中构建膜，但是使用多通道移液管手动进行分配和吸取步骤。然而，该过程是依赖于用户的，因此不可重复、耗时且易受人为错误的影响。

已经开发了多种策略来使LbL薄膜沉积自动化。虽然最流行的技术是浸涂、喷涂和旋涂，但这些技术非常适用于大型基材，需要大量液体并且不能适应细胞培养板。

发明内容

最近，Jaklenec等人(ACS应用材料与界面(Appl Mater Interfaces)，2016,8(3)：2255-61)使用自动液体处理机器人，在大的pH范围内由合成聚合物(聚丙烯酸/聚烯丙胺盐酸盐，PAA/PAH)制备聚电解质薄膜并且含有越来越多的层数。为此，将聚电解质膜构建在粘合到硅晶片上的(无底)硅96孔板上，以便随后通过轮廓测定法进行分析并用于筛选细胞附着和扩散。然而，作者确定了几个遗留的技术问题：i)膜厚度的径向不均匀性，特别是咖啡环效应；ii)难以自动表征和分析膜。此外，既没有在细胞培养板中原位表征聚电解质膜，也没有证明生物活性分子可以加载到膜中并且具有有效的生物活性。

因此，在多孔板中开发用于制备膜的自动静电逐层组装技术仍然需要：

-以高度可再现的和可靠的方式，

-在每个孔内和不同孔之间具有非常高的空间均匀性，以优化细胞培养。

为此目的，本发明涉及通过聚电解质多层膜涂覆多孔板的至少一个孔的底表面的方法，所述方法包括n个连续序列，n为1至2000的整数，其中每个序列包含以下步骤：

a)在多孔板的至少一个孔的底表面上机器人沉积(robotic deposit)体积V_PE ¹的第一聚电解质PE¹溶液，其中第一聚电解质PE¹是包含氨基的阳离子聚合物，或是阴离子聚合物，然后，

b)机器人吸取(robotic aspiration)吸出体积V_aspPE ¹的所述PE¹溶液，其中吸出体积V_aspPE ¹高于或等于V_PE ¹，然后，

c)在所述底表面上机器人沉积体积V_PE ²的第二聚电解质PE²溶液，其中当PE¹是阴离子聚合物时，第二聚电解质PE²是包含氨基的阳离子聚合物，或当PE¹是包含氨基的阳离子聚合物时，PE²是阴离子聚合物，然后，

d)机器人吸取吸出体积V_aspPE ²的所述PE²溶液，其中吸出体积V_aspPE ²高于或等于V_PE ²。

机器人步骤通常利用自动液体处理机器进行，该自动液体处理机器设有移液臂作为机器人，例如具有TECAN Freedom100机器人。机器人臂的末端设有允许沉积和吸取溶液的尖端。液体处理臂将溶液移液到它们各自的储液器中并将它们分配到选定的孔中。吸取后，溶液被扔进垃圾桶。

步骤a)和c)是分配步骤。在步骤a)中，机器人从含有所述溶液的储液器中吸取第一聚电解质PE¹的溶液，并将所述溶液转移到多孔板的至少一个孔的底表面。在步骤c)中，机器人从含有所述溶液的储液器中吸取第二聚电解质PE²的溶液，并将所述溶液转移到多孔板的孔的底表面。优选地，为了实施步骤a)和c)，机器人臂的端部设有1mL移液管尖端。

步骤b)和d)是吸取步骤。在步骤b)和d)中，机器人从孔中吸取溶液并将其转移到垃圾箱。优选地，为了实施步骤b)和d)，机器人臂的端部设置有200μL移液管尖端。这些较小的尖端允许吸取步骤的更好的准确性，因此获得的膜具有更好的均匀性。

对于分配步骤a)和c)，典型的移液速度为400至800μL/s，对于吸取步骤b)和d)，典型的移液速度为30至150μL/s。

优选地，该方法的每个序列包括：

-在步骤a)和b)之间，进行孵育步骤a')，其中将第一聚电解质PE¹的溶液与底表面接触1至30分钟，优选5至15分钟，和

-在步骤c)和d)之间，进行孵育步骤c')，其中将第二聚电解质PE²的溶液与底表面接触1至30分钟，优选5至15分钟。

该方法包括步骤b)和d)机器人吸取吸出体积V_aspPE的PE溶液，其中吸出体积V_aspPE高于或等于V_PE，PE为PE¹(步骤b)或PE²(步骤d))。

在一个实施方式中，V_aspPE ¹＝V_PE ¹和V_aspPE ²＝V_PE ²。

在另一个实施方式中，V_aspPE ¹高于V_PE ¹并且V_aspPE ²高于V_PE ²。通常，V_aspPE ¹和V_aspPE ²分别高于1.01×V_aspPE ¹和1.01×V_aspPE ²，特别是高于1.02×V_aspPE ¹和1.02×V_aspPE ²，例如高于1.05×V_aspPE ¹和1.05×V_aspPE ²，最优选约1.10×V_aspPE ²。通常，V_aspPE ¹和V_aspPE ²分别低于1.50×V_aspPE ¹和1.50×V_aspPE ²。

这意味着与已沉积的溶液体积相比，机器人臂吸取额外的吸出体积。实际上，机器人吸取已经沉积的溶液和空气的混合物。

本发明基于以下发现：吸取高于或等于沉积的溶液体积的体积来产生具有高空间均匀性的膜，即不仅是每个单独的孔内沉积的膜的高空间均匀性，而且还是不同孔之间(在单个板内和在自动机器的独立运行中构建的不同板中)的膜沉积的高再现性。

使用配备多个通道的机器人臂可以实现逐层沉积方法的自动化并优化工作流程。并行处理为LbL膜的构建提供了几个关键优势：i)确保沉积的再现性，ii)增强细胞筛选测定的通量，iii)适用于任何类型的机器人臂，无论制造商如何。

鉴于在生物分子或细胞筛选生物技术和再生医学中的应用，在商业可获得的液体处理机器上实施根据本发明的方法无疑将扩大由良好控制的LbL涂层提供的可能性范围。

该方法涉及多孔板，例如6孔、12孔、，24孔、48孔或96孔板。鉴于细胞筛选测定，96孔板形式特别令人感兴趣，因为可以平行筛选多个条件并且每孔所需的细胞数量很少(通常5000个细胞/孔或更少)。

可以在多孔板的所有孔上实施该方法，或仅在其中一些孔上实施(优选至少在两个孔上)。

在第一序列的步骤a)中选择用于沉积的孔是多孔板的孔，其上形成多层膜。通常，该方法的所有步骤都在相同的孔上进行，m是用于实施该方法所选择的孔的数量。因此，m是从1(实施方式，其中该方法仅在一个孔中实施)至多孔板的孔数(例如96孔板的96)的整数，优选从2至多孔板的孔的数量。实际上，为了构建多层膜的层对，步骤b)、c)和d)的沉积或吸取在与第一序列的步骤a)中沉积第一聚电解质PE¹溶液的底表面上的孔相同的孔上进行。类似地，所有序列的所有步骤涉及与在第一序列的步骤a)中选择的孔相同的孔。自动化处理机器人的软件允许定义孔的数量m和必须沉积逐层膜的特定位置。

板的所有孔具有高度H。孔的底部可具有各种形式，U形、V形或平面圆形。孔优选地具有平坦的底部，通常是具有直径d的圆形底表面。

该方法的每个序列允许沉积多层膜的一对层。在该方法结束时获得的多层膜包含n层对。

通过该方法制备的聚电解质多层膜中的层数“n”可以在很宽的范围内变化并且取决于所需的厚度。优选地，n是2至2000的整数，特别是5至2000，优选5至1000，更优选5至100。当需要厚的聚电解质膜时，n可以在15至1000之间变化，优选20至500(特别是20至60)。

每层对包括聚电解质PE¹层和相反电荷的聚电解质PE²层。薄膜结构经过精确设计，可控制在范围为1至50000nm，最好为100nm至30μm内的1nm的精度。膜的厚度通常可以在1nm至50000nm之间变化，优选为500nm至20μm，更优选为1至10μm。当膜的厚度大于300nm时，膜被认为是厚膜。

该方法包括顺序沉积第一聚电解质PE¹，然后是第二聚电解质PE²，其中一种是包含氨基的阳离子聚合物，另一种是阴离子聚合物。

在本发明中，术语“阴离子聚合物”涉及包含至少一个易带负电荷基团的聚合物。阴离子聚合物优选包含羧酸、磷酸根、硫酸根和/或磺酸根。羧基可以以酸、酰卤(优选酰氯)、酸酐或活化酯的形式存在，例如N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯或N-对硝基苯基酯。阴离子基团与所用聚合物共价键合。

该方法中可以使用任何阴离子聚合物，包括但不限于聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(谷氨酸)、聚尿酸(藻酸、半乳糖醛酸、葡糖醛酸...)、糖胺聚糖(透明质酸或其盐(如钠)-也称为透明质酸-、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素)、聚(天冬氨酸)和聚苯乙烯磺酸盐(PSS)、聚氨基酸(D和/或L型)的任意组合及其混合物。

术语“阳离子聚合物”涉及包含至少一个易带正电荷基团的聚合物。

在本发明的意义上，氨基可以以羟胺、酰肼和胺官能团的形式存在。氨基与所用聚合物共价键合。

任何包含氨基的阳离子聚合物均可用于该方法，包括但不限于聚(赖氨酸)例如聚(D-、L-赖氨酸)、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(烯丙胺)、聚(乙烯)亚胺、壳聚糖、聚精氨酸如聚(L-精氨酸)、聚(鸟氨酸)、聚组氨酸如聚(D、L-组氨酸)、聚(甘露糖胺)、聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和更一般的聚氨基酸(D和/或L形式)的任意组合，及其混合物。

优选地，包含氨基的阳离子聚合物是聚(L-赖氨酸)(或PLL)、聚丙烯胺盐酸盐(PAH)或壳聚糖(CHI)和/或包含氨基的阴离子聚合物是透明质酸或其盐，例如透明质酸钠(通常也称为HA)、肝素(HEP)、聚苯乙烯磺酸盐(PSS)、聚(L-谷氨酸)(PGA)或其混合物。

聚电解质多层膜更优选为(PLL/HA)膜、(PSS/PAH)膜、(PLL/PGA)或(CHI/PGA)膜。

上述聚合物的分子量可在很宽的范围内变化。更优选地，分子量在0.5kDa至20,000kDa的范围内，甚至更优选地，分子量在5至2,000kDa的范围内。

通常，相同的聚电解质PE¹和PE²用于所有序列。

通常，第一聚电解质PE¹的相同溶液用于每个序列的所有步骤a)，并且第二聚电解质PE²的相同溶液用于每个序列的所有步骤c)。

通常，V_PE ¹对于所有序列是相同的，V_aspPE ¹对于所有序列是相同的，V_PE ²对于所有序列是相同的，并且V_aspPE ²对于所有序列是相同的。

通常，该方法包括在每个聚电解质沉积步骤之后的至少一个漂洗步骤。因此，该方法通常包括：

-在每个序列的步骤b)和c)之间，进行漂洗步骤，其包括以下子步骤：

b2)在所述底表面上机器人沉积体积V_rinsePE ¹的漂洗溶液，然后，

b3)机器人吸取吸出体积V_asprinsePE ¹的所述漂洗溶液，其中吸出体积V_asprinsePE ¹高于或等于V_rinsePE ¹，

其中可以重复漂洗步骤；以及

-在每个序列的步骤d)之后，进行漂洗步骤，其包括以下子步骤：

d2)在所述底表面上机器人沉积体积V_rinsePE ²的漂洗溶液，然后，

d3)机器人吸取吸出体积V_asprinsePE ²的所述漂洗溶液，其中吸出体积V_asprinsePE ²高于或等于V_rinsePE ²，

其中可以重复漂洗步骤。

在步骤b2)和d2)，机器人从含有所述溶液的储液器中吸取漂洗溶液，并将所述溶液转移到多孔板的孔的底表面。优选地，为了实施步骤b2)和d2)，机器人臂的端部设有1mL移液管尖端。

在步骤b3)和d3)，机器人从孔中吸取溶液并将其转移到垃圾箱。优选地，为了实施步骤b3)和d3)，机器人臂的端部设有200μL移液管尖端。

通常，当V_aspPE ¹＝V_PE ¹和V_aspPE ²＝V_PE ²时，则V_asprinsePE ¹＝V_rinsePE ¹和V_asprinsePE ²＝V_rinsePE ²。同样，通常，当V_aspPE ¹高于V_PE ¹且V_aspPE ²高于V_PE ²时，则V_asprinsePE ¹高于V_rinsePE ¹，V_asprinsePE ²高于V_rinsePE ²。通常，所有这些都使用相同的额外体积百分比。换句话说，通常，V_aspPE ¹＝β×V_PE ¹，V_aspPE ²＝β×V_PE ²，V_asprinsePE ¹＝β×V_rinsePE ¹和V_asprinsePE ²＝β×V_rinsePE ²，其中β是从1.00(即没有吸取额外体积)到1.30的数字。

优选地，当该方法包括这些漂洗步骤时，其每个序列还包括：

-在步骤b2)和b3)之间，进行孵育步骤b2')，其中将漂洗溶液与底表面接触0.2至10分钟，优选1至5分钟，和

-在步骤d2)和d3)之间，进行孵育步骤d2')，其中将漂洗溶液与底表面接触0.2至10分钟，优选1至5分钟。

通常，对于所有序列，相同的漂洗溶液用于所有步骤b2')，并且对于所有序列，相同的漂洗溶液用于所有步骤d2')。

如果可能，步骤b2)中使用的漂洗溶液与步骤d2)中使用的漂洗溶液相同，因为这有利于该方法。通常，当对于步骤b2)和d2)使用相同的漂洗溶液时，该方法包括三种溶液：第一聚电解质PE¹溶液、第二聚电解质PE²溶液和用于步骤b2)和d2)的漂洗溶液。

如果在步骤b2)和d2)需要不同的漂洗溶液，则该方法通常涉及四种溶液：第一聚电解质PE¹溶液、第二聚电解质PE²溶液和用于步骤b2)的漂洗溶液以及用于步骤d2)的漂洗溶液。

用于聚电解质溶液和漂洗溶液的合适溶剂是：水，盐(例如NaCl、KCl、MnCl₂、(NH₄)₂SO₄)的水溶液，任何类型的生理缓冲液(Hepes、磷酸盐缓冲液、培养基如最低必需培养基、Mes-Tris、Mes、Tris、缓冲剂)和水混溶性非离子溶剂，如C1-C4链烷醇、C3-C6-酮(包括环己酮)、四氢呋喃、二恶烷、二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇和低聚物乙二醇和丙二醇及其醚和开链和环状酰胺，如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮等。极性水不混溶的溶剂，如氯仿或二氯甲烷，其可以含有一部分上述有机溶剂，只要它们可与它们混溶，将仅在特殊情况下才考虑。优选使用水或溶剂混合物，其一种组分是水。如果所实施的聚电解质的溶解度允许，则仅使用水作为溶剂，因为这简化了该方法。

为了改善所形成的膜的进一步空间均匀性，已经开发了两种不同的实施方式并在下文中描述：

在下文称为“湿表面”的第一实施方式中，首先将体积V_wet的第一聚电解质PE¹溶液(即，在膜的累积之前，在上述序列之前)添加到每个孔中，通常为了形成恢复底表面的液体层。

在该第一实施方式中，在上述方法中，在第一序列的步骤a)之前，对在其上进行步骤a)的至少一个孔被填充体积V_wet的第一聚电解质PE¹溶液，其中以mL表示的体积V_wet为从

V_wet ^min＝0.5×π(d/2)²

到

V_wet ^max＝(2/3)×π(d/2)²×H，

其中：

-d是孔的直径，以mm表示，

-H是孔的高度，以mm表示。

体积V_wet取决于多孔板的孔的直径(d)和高度(H)。

体积V_wet高于或等于V_wet ^min＝0.5×π(d/2)²，其对应于允许液体高度为0.5mm的体积，这被认为是最低液体高度。

体积V_wet小于或等于V_wet ^max＝(2/3)×π(d/2)²×H，其对应于允许液体高度为孔高度(2/3)的体积。优选地，体积V_wet小于或等于(1/2)×π(d/2)²×H，或甚至小于或等于(1/3)×π(d/2)²×H。

如下表1提供了多孔板的常用高度和直径以及相应的V_wet ^min和V_wet ^max的实例。

表1：多孔板的常用H和d以及相应的V_wet ^min和V_wet ^max

孔的数量	96孔	48孔	24孔	12孔	6孔
						高度H(mm)	11.20	16.84	17.80	18.00	17.67
直径d(mm)	6.40	11.00	15.60	22.10	34.80
						总体积/孔(μL)	360.00	1600.00	3400.00	6900.00	16800.00
V_wet ^min(μL)	16.1	47.5	95.5	191.7	475.4
						V_wet ^max(μL)	240.0	1066.7	2266.7	4600.0	11200.0

优选地，体积V_wet是多孔板的最小推荐工作体积，即在多孔板的数据表上推荐的最小工作体积。

两种替代方案可以获得填充有体积V_wet的第一聚电解质PE¹溶液的孔。

根据一个替代方案，在第一序列的步骤a)之前，该方法包括在将要在第一序列的步骤a)中进行沉积的每个孔的底表面上机器人沉积体积V_wet的第一聚电解质PE¹溶液的步骤a0)。

这种替代方案很有意思，因为只需要一个额外的步骤。

根据第二替代方案，在第一序列的步骤a)之前，该方法包括以下步骤：

a1)在将要在第一序列的步骤a)中进行沉积的每个孔的底表面上机器人沉积体积V_a1)的第一聚电解质PE¹溶液，其中V_a1)高于V_wet，然后

a2)机器人吸取吸出体积V_a2)的所述第一聚电解质PE¹的所述溶液，其中所述吸出体积V_a2)为：V_a2)＝V_a1)-V_wet。

因此，该第二替代方案在执行n个序列之前需要两个额外的步骤。然而，它是有趣的，因为它允许溶液在底表面上均匀分布。因此，当体积V_wet接近V_wet ^min时，该替代方案是有趣的，因为低体积的溶液更难以分布在底表面的整个表面上。

通常，为了确保吸出体积V_a2)等于V_a1)减去V_wet，用于吸取溶液的机器人尖端的末端浸入溶液中。于是，没有空气被吸取，并且进入机器人的吸出体积是V_a2)。

在该第一实施方式中，特别优选的是V_aspPE ¹＝V_PE ¹和V_aspPE ²＝V_PE ²。在这种情况下，在每个孔内留下恒定体积的溶液(即V_wet)，这确保表面始终保持被液体覆盖。通过这样做，避免了在聚电解质膜上方的湿/干状态的局部差异，并且获得了更均匀的膜。此外，由于在形成薄膜的每个孔内部存在永久性液膜，因此不需要优化机器人臂的尖端与底表面之间的距离。

通常，在该方法的该第一实施方式中，每个漂洗步骤重复三次(即，该方法的每个序列按顺序包括步骤a)、b)、b2)、b3)、b2)、b3)、b2)、b3)、b2)、b3)、c)、d)、d2)、d3)、d2)、d3)、d2)、d3)、d2)和d3))。由于恒定体积的溶液(即V_wet)留在每个孔内，因此需要许多漂洗步骤以进行有效的漂洗。

在下文称为“倾斜”的第二实施方式中，将板倾斜(图1)，以便在沉积和吸取步骤期间改善液体均匀性。

在该第二实施方式中，对于根据该第二实施方式的方法的每个序列，在步骤a)、b)、c)、d)，并且如果存在这些步骤，在步骤b2)、b3)、d2)和d3)，底表面相对于水平面以倾斜角α倾斜5°至40°，优选10°至30°，更优选约20°。优选地，角度α对于所有步骤a)、b)、c)、d)是相同的，并且如果存在这些步骤，则对于步骤b2)、b3)、d2)和d3)也是相同的。这种倾斜有助于在吸取步骤中从孔中除去所有液体。

通常，为了使底表面倾斜，板支架以倾斜角α倾斜(图1)。

优选地，在上面定义的孵育步骤期间，底表面在水平平面内(即底表面不倾斜)。因此，优选地，对于每个序列，当每个序列包含如上定义的步骤a')和c')和/或包含如上定义的步骤b2')和d2')时，则对于每个序列，在步骤a')和c')和/或在步骤b2')和d2')，底表面在水平面内。这也有助于获得均匀的膜，因为液体均匀地分布在孔的底表面。

通常，多孔板倾斜以实施步骤a)，然后移回水平面以实施步骤a')，然后倾斜以实施步骤b)和b2)，然后移回水平面以实施步骤b2')，然后倾斜以实施步骤b3)和c)，然后移回水平面以实施步骤c')，然后倾斜以实施步骤d)和d2)，然后移回水平面以实施步骤d2')，然后倾斜以实施步骤d3)(图1)。

通常，在该方法的第二实施方式中，每个漂洗步骤重复一次(即，该方法的每个序列按顺序包括步骤a)、b)、b2)、b3)、b2)、b3)、c)、d)、d2)、d3)、d2)和d3))。通常，多孔板倾斜以实施步骤a)，然后移回水平面以实施步骤a')，然后倾斜以实施步骤b)和b2)，然后移回水平面以实施步骤b2')，然后倾斜以实施步骤b3)和b2)，然后移回水平面以实施步骤b2')，然后倾斜以实施步骤b3)和c)，然后移回水平面以实施步骤c')，然后倾斜以实施步骤d)和d2)，然后移回水平面以实施步骤d2')，然后倾斜以实施步骤d3)和d2)，然后移回水平面以实施步骤d2')，然后倾斜以实施步骤d3)。

在该方法的第二实施方式中，V_aspPE ¹可以等于V_PE ¹，V_aspPE ²可以等于V_PE ²。然而，在这种情况下，当机器人臂的末端与底表面之间的距离小于0.3mm时，获得了更好的均匀性。此外，发明人发现很难除去最初沉积的所有体积的聚电解质溶液，并且剩余的溶液导致不均匀性。

为了避免这种困难并进一步改善膜的均匀性，通过倾斜优化每个孔中的体积的吸取优选地与吸取额外的体积相结合，这使得能够通过几乎吸取多余的量来有效地从孔中吸取所有液体。因此，吸出体积V_aspPE ¹优选高于V_PE ¹，特别是1.05V_PE ¹至1.20V_PE ¹，吸出体积V_aspPE ²优选高于V_PE ²，特别是1.05V_PE ²至1.20V_PE ²。在这种情况下，不需要优化机器人臂的末端与底表面之间的距离。

在该第二实施方式中，在第一序列的步骤a)之前，将要进行步骤a)的至少一个孔优选为不含聚电解质溶液(或更一般地，不含任何溶液，即空的)。因此，情况不同于执行该方法的第一实施方式时的情况，并且其中，在第一序列的步骤a)之前，将要执行步骤a)的至少一个孔包括第二聚电解质PE²。

所获得的聚电解质多层膜的这种高空间均匀性使得能够在优化的条件下进行细胞培养测定。对于生物医学应用而言特别重要的是控制可影响生物活性的表面的均匀性。这些膜可含有生物活性分子并触发受控的细胞粘附和分化。

此外，直接在多孔细胞培养板的底部构建膜是特别令人感兴趣的，因为这使得能够组合原位膜表征方法和高通量细胞测定。

值得注意的是，吸光度、荧光或甚至发光测量可以在使用酶标仪的常规中进行。

此外，如果仔细选择培养板，也可以同时进行各种分辨率的光学成像，条件是板的底部是光学透明的并且足够薄以与高分辨率物镜(x63或更高)兼容。96孔板格式似乎特别适用于含有昂贵分子(如药物、多肽或生长因子)的表面涂层的高通量筛选，因为它可以使用少量生物活性分子、少量细胞，并执行生物分子和细胞的原位成像。96孔板格式也是特别有利的，因为它可以与高通量光学和光谱分析相结合。值得注意的是，可以使用荧光/吸光度酶标仪来分析具有薄底部(约180μm)的96孔板，以及在高分辨率(63X物镜或更高)的荧光显微镜下成像。

膜的生物活性可以通过插入与聚电解质相关的肽或通过蛋白质的包埋来实现它们的功能化。

因此，该方法可以在n个序列之后包括在所述底表面上机器人沉积体积V_PE ³的第三聚电解质PE³溶液的步骤e')，其中：

-聚电解质PE³与至少一种肽连接，和

-当PE²是阴离子聚合物时，第三聚电解质PE³是包含氨基的阳离子聚合物，或者当PE²是包含氨基的阳离子聚合物时，PE³是阴离子聚合物。

优选地，肽是RGD。最优选地，聚电解质PE³是PGA-RGD。

此外，在阴离子聚合物包含羧基的实施方式中，该方法可以在n个序列之后包括以下步骤：

e)在偶联剂存在下使所述氨基和羧基反应，以形成酰胺键并使聚电解质多层膜交联，然后

f)用含蛋白质的溶液，优选用含有生长因子类型蛋白质的溶液处理所述交联的聚电解质多层膜，以便在所述交联的聚电解质多层膜上和内部掺入所述蛋白质。

偶联剂能够在聚电解质多层的羧基和氨基之间形成酰胺键(或其衍生物)。偶联剂可以充当催化剂，其可以在之后除去，或作为反应物，其在形成的酰胺键之间产生间隔物(或连接)。例如，偶联剂是碳二亚胺化合物，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)，任选地在N-羟基琥珀酰亚胺化合物存在下，例如N-羟基磺基琥珀酰亚胺，更优选N-羟基磺基琥珀酰亚胺对硝基苯酚或二甲基氨基吡啶。

步骤e)优选在水溶性溶液中进行，更优选在水溶液中进行，例如在无盐溶液中或在含有盐(例如KCl、NaCl)的水溶液中，或任何种类的缓冲液(诸如Mes、Tris、Hepes或磷酸盐缓冲液)中。步骤e)优选在4至6的pH范围内进行。

还可以通过改变溶液中偶联剂的浓度来控制交联度。

步骤f)优选在2至9，更优选2至5.5的pH下进行。

含蛋白质的溶液优选是缓冲液，例如Mes缓冲液，优选具有低离子强度的溶液，更优选不含任何盐的缓冲液，例如HCl(例如1mM的HCl)。

在可以使用的生长因子蛋白质中，尤其可以引用对治疗应用和/或细胞生物学应用有用的蛋白质。可以掺入根据本发明的膜中的生长因子的例子是所有骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、所有成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子5和9(GDF5、GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞瘤衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)和其他神经营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)、脑源性神经元生长因子(BDNF)。

在生长因子蛋白中，转化生长因子(TGF)家族是一种选择，因为该家族起着重要的作用，例如在通过调节骨祖细胞和成骨细胞的增殖和分化来形成骨中。骨形态发生蛋白2(BMP-2)是TGF家族的成员，特别刺激成肌细胞向成骨细胞谱系的分化；当与生物材料如聚合物结合递送时，其重组人形式rhBMP-2更有效。

步骤f)中使用的蛋白质可以是生长因子型蛋白质，优选转化生长因子。更具体地，生长因子是骨形态发生蛋白2(BMP2)或骨形态发生蛋白7(BMP-7)、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，或嵌合体1或嵌合体2。生长因子可以通过包括生物或化学方法的各种方法制备。重组形式是特定的实施方式。化学方法通常采用自动肽合成仪。例如，野生型SDF-1可以通过梅里菲尔德(Merrifield)固相法在全自动肽合成仪上使用芴基甲氧基羰基(Fmoc)化学合成。

在步骤e)和f)之间或在步骤f)之后，该方法可包括干燥聚电解质多层膜的步骤g)。该步骤有利于存储多孔板并运输它。聚电解质多层膜可以在使用前有利地再水合。

根据第二个目的，本发明涉及根据上述方法可获得的多孔板。该多孔板包括至少一个孔，其底表面涂覆有聚电解质多层膜。

该多孔板的特征在于所述聚电解质多层膜具有高空间均匀性。可以容易地评估该空间均匀性，例如通过以下实施例中定义的程序和参数(特别是SD和CV)。

在步骤f)结束时获得的负载蛋白质的交联聚电解质多层膜在与各种细胞类型(例如成肌细胞和成骨细胞前体)接触时特别有用，细胞可以以非常有效的方式粘附、增殖和任选地分化。有利地，在所获得的聚电解质多层膜上的细胞粘附和扩散是均匀的。细胞均匀地分布在孔的整个表面上，并且仅观察到一群扩散良好的细胞。相反，当聚电解质多层膜是异质时，细胞粘附和扩散根据孔内的空间位置而不同：通常，在孔的中心处细胞很多并且很好地扩散，但是较少的细胞和较少扩散的细胞朝向孔的边界。因此，异质膜导致同一孔内的几个不同的细胞群，并导致细胞粘附和扩散的空间异质性。因此，通过根据本发明的方法获得的均质聚电解质多层膜对于细胞培养是有意义的。因此，根据第三个目的，本发明涉及多孔板用于细胞培养的用途。

以下附图和实施例说明了本发明，但不应视为限制本申请的范围。

附图说明

图1：多孔细胞培养板中高通量的逐层沉积示意图。操作倾斜实施例时的工艺原理。在所有四个主要沉积和漂洗步骤中的所有沉积和吸取步骤期间板倾斜：聚阳离子及其漂洗，聚阴离子和其漂洗。

图2：多孔板的图示和(X,Y,Z)坐标的定义，每个孔中心的(X,Y)坐标对于商业上可获得的细胞培养板是已知的；Z0是分配溶液期间尖端的初始位置，需要由用户定义。

图3：选择4极位置(N,W,E,S)和中心位置(C)的定义，以评估每个孔内的膜厚度均匀性。使用共聚焦显微镜软件、使用定制的宏使每个孔中5个位置中的每个位置的成像过程自动化。

图4：通过高分辨率成像获得的荧光强度与距孔的底表面的距离Z之间的函数关系。使用Image J、使用定制的宏测量膜厚度h＝Z2-Z1。

图5：在使用多通道移液管(对比例)的手工膜的情况下，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的膜厚度。对每个位置分别绘制hN、hW、hC、hE和hS的平均值+标准偏差(平均值±SD)(m＝48个孔)。

图6：在使用多通道移液管(对比例)的手工膜的情况下，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的CV(％)。

图7：在使用多通道移液管(对比例)的手工膜的情况下，m个独立孔上的每孔平均厚度(hWELL)的箱形图。

图8：在使用多通道移液管(对比例)的手工膜的情况下，hWELL(其中m＝48个孔)的CV。

对于图5至图8，汇集数据用于两个独立实验，每个实验的每个多孔板具有24个孔(总共m＝48个孔)。

图9：在机器人制造的膜的情况下，对于实施例1的条件NT_0％，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的膜厚度(μm)±SD。

图10：在机器人制造的膜的情况下，对于实施例1的条件NT_0％，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的CV(％)。

图11：在机器人制造的膜的情况下，对于实施例1的NT_10％的条件，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的膜厚度(μm)±SD。

图12：在机器人制造的膜的情况下，对于实施例1的NT_10％的条件，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的CV(％)。

图13：在机器人制造的膜的情况下，对于实施例1的条件T_0％，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的膜厚度(μm)±SD。

图14：在机器人制造的薄膜的情况下，对于实施例1的条件T_0％，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的CV(％)。

图15：在机器人制造的膜的情况下，对于实施例1的条件T_10％，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的膜厚度(μm)±SD。

图16：在机器人制造的薄膜的情况下，对于实施例1的条件T_10％，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的CV(％)。

图17：在用于实施例1的条件表面湿润的机器人制成的膜的情况下，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的膜厚度(μm)±SD。

图18：在用于实施例1的条件表面湿润的机器人制造的膜的情况下，在每个孔的不同极位置(N,W,C,E,S)处测量的CV(％)。

对于图9至18，数据是来自两个独立实验的每个条件总共9个孔的平均值±SD和CV。

图19：使用机器人臂在96孔板中制备的(PLL/HA)12膜的每孔平均厚度(hWELL)。对于每个单独的微孔，计算每孔的平均厚度，作为5个位置的平均值。对于5个实验条件中的每一个，将所有平均厚度测量值绘制成箱形图。数据来自：来自33个微孔(来自3个独立实验)的NT条件；用于T条件的81个孔(来自4个独立实验)和用于表面湿润条件的12个孔(实施例1)。数据表示：数据表示为箱形图，分别显示第一个四分位数、中位数、第三个四分位数，极限为10％和90％，极值分别为5％和95％。

图20：使用对应于图19中所示的每孔平均厚度的机器人臂在96孔板中制备的(PLL/HA)12膜的CV(实施例1)。

图21至25：对于每个实验条件(图21：NT_0％，图22：NT_10％，图23：T_0％，图24：T_10％，图25：表面湿润)，示出了每个孔中的所有像素荧光强度(使用共焦显微镜的平铺扫描选项获得)的3个代表性曲线(连续、虚线和黑色虚线)(实施例1)。表2中给出了其高度的标准偏差。

图26至29：4个实验位置中每个位置的五极位置(N,W,C,E,S)的尖端末端与底表面之间的不同距离(Z-步长)处的厚度测量值(图26：NT_0％，图27：NT_10％，图28：T_0％，图29：T_10％)。尖端的末端位于微孔板底部上方4个不同的高度，从Z0＝+0.1到+1mm，步长为+0.3mm。(例如孔底上方的+0.1；+0.4；+0.7和+1mm(每个条件n＝6孔)。每个箱形图表示在每个孔内5个位置的6个独立孔上的总共30个厚度测量值。

图30：作为BMP-2初始加载浓度的函数的三个实验条件下C2C12细胞覆盖的表面积的百分比(由微孔的平铺扫描图像计算)。数据是至少10个孔的平均值±SD(实施例3)

图31：作为BMP-2初始加载浓度的函数的四种实验条件下的细胞ALP活性(a.u.)(实施例3)。基质结合BMP-2对C2C12细胞的生物活性。使用机器人臂构建的(PLL/HA)膜(用EDC30)交联，后加载5、10、25和50μg/mL的BMP-2，评估它们的生物活性。在生长培养基中以5000个细胞/孔铺板的C2C12细胞在培养3天后进行ALP染色。(实施例3)

图32：作为BMP-7初始加载浓度的函数的T_10％条件下干细胞的ALP活性(a.u.)。基质结合BMP-7对D1干细胞的生物活性。将基质结合的BMP-7加载到交联的(PLL/HA)12膜(用EDC10交联)上，其使用机器人臂在T_10％条件下制备。将D1鼠间充质干细胞接种在每个微孔中，并在GM中培养长达2天，然后再在DM中转换7天。通过酶测定法定量ALP活性。与不存在BMP-7的膜相比，测试了从2.5至50μg/mL的4种增加的BMP-7负载浓度。将第3天的ALP表达作为聚电解质膜中BMP-7负载剂量的函数。数据是每个实验条件下三个独立孔的平均值±SD。

图33：作为n(层对数)的函数的(PSS/PAH)聚电解质膜的膜厚度。使用具有条件T_10％的机器人臂使用PDMS微孔在硅基板上沉积含有增加数量的10至40层对的(PSS/PAH)膜。在膜沉积后，移除PDMS孔并通过AFM探测样品。在刮擦薄膜后测量薄膜厚度。数据是25次测量的平均值±SD(每个样品5次独立测量，每个实验条件5个样品)。数据的线性拟合(Y＝6,34X-7,11，R＝0,974)证实了这些薄膜的线性增长。

图34：通过使用扫描仪的视觉观察评估基质结合的BMP对BMP响应性骨骼肌成肌细胞(C2C12细胞)的生物活性。通过染色强度对每个单孔在高通量下观察在载有BMP的膜(交联至EDC70)上培养3天的C2C12成肌细胞的ALP活性。研究了5种不同的BMP(BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9和BV265)和4种不同的BMP负载量(溶液中的初始BMP浓度为2.5至20μg/mL)。

图35：基质结合的BMP对BMP反应性骨骼肌成肌细胞(C2C12细胞)的生物活性。测量ALP活性(a.u.)作为仿生膜中加载阶段期间溶液中BMP初始浓度的函数。将基质结合的BMP加载到交联的(PLL/HA)12膜(用EDC70交联)上，其使用机器人臂在T_10％条件下制备。将C2C12成肌细胞接种在每个微孔中并在GM中培养3天。定量测量ALP活性，并使用TecanInfinite1000酶标仪在多重读数模式下测量在570nm处的吸光度(每个单个微孔中76个不同位置的平均值)。对于每种BMP(BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9和BV265)，与不存在BMP的膜相比，测试了从2.5至20μg/mL的4种增加的BMP负载浓度。将第3天的ALP表达绘制为溶液中初始BMP浓度的函数。数据是每个实验条件下两个独立孔的平均值±SD。

图36：涂有由5层对制成的PGA/PLL膜的单个微孔(直径6.4mm)的平铺扫描成像。通过使用PLL-FITC使膜可视化。

图37：在无血清培养基中培养1小时后，粘附在PGA-肽末端仿生膜上的C2C12成肌细胞(每mm2)的数量。研究了4种不同的膜交联条件(CL0、CL5、CL10、CL30)，并研究了四种不同的PGA/PGA-RGD肽(无肽、比率2/1、比率1/2和仅PGA-肽)。对于每个实验条件，数据是三个独立孔的平均值±SD。

图38：成肌细胞扩散区域的定量(与图XY相同的实验条件)。细胞扩散区域使用定制的宏自动定量，使用Image J ton计算细胞覆盖的细胞面积并推导出平均细胞扩散区域。

具体实施方式

实施例

聚电解质

不同类型的聚电解质用于膜构建：聚(L-赖氨酸)氢溴酸盐(PLL，Sigma，Aldrich，St Quentin Fallavier，法国)，聚(烯丙胺盐酸盐)，壳聚糖(CHI，FMC生物聚合物)和聚(乙烯亚胺)(PEI，Sigma，Aldrich，法国)作为聚阳离子；透明质酸(HA，Lifecore Biomedical，USA)，聚苯乙烯磺酸盐(PSS)和聚(L-谷氨酸)(PGA，均来自Sigma Aldrich，法国)作为聚阴离子。如Picart等，高级功能材料(Adv.Funct.Mat)2005：15,83-94中描述的将PGA移植到含有RGD的肽上。

选择了四种不同的聚阳离子/聚阴离子对：

-(PLL/HA)膜是指数增长膜的模型系统。对于由12层对制成的膜，厚度应为约1.5至2μm，即接近共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测的分辨率极限。

-(PSS/PAH)膜是已知的另一种模型系统，其与沉积层的数量线性增长。

-选择(CHI/PGA)膜作为第三聚电解质薄膜，以显示机器人与其他聚电解质的潜力。

-选择(PLL/PGA)膜作为第四聚电解质薄膜，以显示机器人沉积其他聚阴离子的潜力，并对使用机器人和具有最终层的膜制备的膜进行细胞粘附和扩散的高通量筛选PGA和PGA-RGD的混合物。

膜构建缓冲液

对于(PLL/HA)膜构建，将PLL(0.5mg/mL)、HA(1mg/mL)和PEI(2mg/mL)溶解在HEPES-NaCl缓冲液(20mM Hepes，pH 7.4，0.15M NaCl)中。为了改善膜对基材的吸附，沉积第一层PEI，然后沉积HA层。然后，开始使用漂洗步骤插入聚阳离子(PLL)和聚阴离子(HA)的循环沉积方法，直到达到所需的层数。在膜构建期间，所有漂洗步骤均在pH6.5、0.15M NaCl中进行。

对于(PLL/PGA)膜构建，PLL和PGA以1mg/mL溶解在Hepes-NaCl缓冲液中。

对于(PSS/PAH)膜构建，将PAH和PSS以5mg/mL溶解在Tris-NaCl缓冲液(pH7.4，含有X 0.15M NaCl^-)中。

对于CHI/PGA膜构建，将CHI和PGA溶解在pH 5的含有0.15M NaCl的0.1M乙酸钠缓冲液中。为了成像，除了在pH 6.0下进行2小时反应之外，根据制造商的方案用Alexa Fluor568(英杰公司，胺反应探针)荧光标记CHI。使用Sephadex-25尺寸排阻柱(PD-10，AmershamBioscience，瑞典)进行产物纯化和未结合染料的去除。使用具有10x物镜的Zeiss LSM 700共聚焦显微镜在空气中对由12层对制成的膜成像。

对比例：使用多通道移液管手动沉积膜

使用多通道微量移液管(Eppendorfpro300，德国，通常具有8个尖端的通道)在96孔细胞培养板中手动构建LbL膜。将聚电解质分配到每个孔中并孵育8分钟。聚阳离子和聚阴离子分配中插入2个2分钟的漂洗步骤。通过将板平铺而小心地分配液体。通过颠倒翻转板将它扔掉。使用8臂多通道移液管将由12对层制成的(PLL/HA)膜手动沉积在24个孔中。PLL-FITC用于染色膜。

首先，这个过程很繁琐，需要实验者高度关注几个小时。此外，由于薄膜沉积所需的总时间可能非常长，因此耗费时间：它与沉积的层对数n成比例。例如，手工制备由24对层组成的膜需要长达两天的工作时间。

此外，手工聚合电解质膜沉积在单个孔内显示出高度异质，如在不同极位置的膜厚度分析中可以观察到(图5至8)。不同极位置的变异系数在每个特定位置的变化在10％至23％之间，并且每个孔的平均厚度在独立孔之间变化大约20％(对于汇集在一起的两个独立实验)。不希望受理论束缚，发明人认为这些空间异质性可能源自毛细管效应，已知毛细管效应在这种长度尺度下是重要的。

实施例1：使用液体处理机自动化的(PLL/HA)膜构建

在同一板中进行大量原位物理化学表征和生物学研究：i)LbL沉积(实施例1)，ii)原位LbL膜均匀性的表征(实施例1)，iii)生物活性蛋白质的加载及其表征(实施例3)，iv)评估载有蛋白质的LbL膜在微孔板中原位培养的细胞培养物的生物活性：使用光学显微镜和光谱法以高通量量化短期粘附和ALP活性(实施例3)。

使用液体处理机自动化的膜构建

将LbL膜直接沉积在96孔细胞培养板(Reference 655986，葛莱娜第一生化，德国)中，用于随后通过共聚焦显微镜和使用荧光/吸光度酶标仪在原位(在液体或空气中)表征。开发了一种方案，使用自动液体处理机(TECAN Freedom)在多孔板中以高通量沉积逐层膜(图1)。

使用该设备的膜构建由聚阳离子和聚阴离子分配的序列组成，其中插入了漂洗步骤。原理在于使用液体处理移液臂。该液体处理臂将液体吸移到各自的储液器中，并将它们分配到多孔板的选定孔中(图2)。将含有聚电解质和漂洗溶液的槽放置在工作台上。使用了三个槽：一个用于聚阳离子、一个用于聚阴离子、一个用于漂洗溶液(如果两种漂洗溶液将是不同的)和垃圾桶。将多孔培养板放置在工作台上。

我们创建了一个在分配和吸取步骤中倾斜板的选项(图1)，使用市售的倾斜板托架：多孔板可以倾斜角度α由用户定义，通常可以在5至20度之间变化，在下面的实施例中是20度。此条件将在下文中命名为“倾斜”(T)，而对于工作台上板的标准位置(α＝0度)命名为“非倾斜”(NT)。

首先，使用机器人软件来定制宏，我们定义了孔的数量和我们希望逐层沉积膜的特定位置。

序列，即一对层，由以下步骤组成：

-液体处理臂从槽中吸取聚电解质，并使用尖端将其分配到选定的孔中(通常为50μL)(图2)，此步骤称为“分配”，

-聚电解质溶液的孵育时间为6分钟，

-将每个孔中的液体吸回并分配到垃圾桶中。在此步骤中，可以添加额外的吸出体积。

在下面的示例中，定义的体积是额外的吸出体积，定义为相对于最初沉积在该特定孔中的体积的过量体积的a％(0、5、10、15或20％，分别对应于1.00×V_aspPE，1.05×V_aspPE，1.15×V_aspPE和1.20×V_aspPE，如上所定义(PE为PE¹或PE²))；例如：如果额外的吸出固定为10％，对于50μL的初始分配体积，机器人将吸回55μL。

-按照相同的步骤进行2次漂洗步骤，不同之处在于随后从漂洗槽中吸取液体(漂洗体积为80μL)。

-液体臂从槽中吸取带相反电荷的聚电解质(通常为50μL)并将其分配到选定的孔中，

-带相反电荷的聚电解质的孵育时间为6分钟。

-将每个孔中的聚电解质吸回并分配到垃圾桶中。

-按照相同的程序进行相反电荷的聚电解质(通常为80μL)的x漂洗步骤(通常为2)，不同之处在于随后从漂洗槽中吸取液体(漂洗体积为80μL)。

为了在移液中获得更高的精确度，可以使用最合适的移液尖端(例如200μL)来实现分配。可以用1mL尖端进行吸取。

将该序列重复n次以构建由n层对构成的逐层膜。

实验条件

我们比较了五个实验条件：

通过控制微孔板的倾斜(非倾斜或相对于水平面倾斜角α为20°的倾斜状态，分别为“NT”或“T”)和额外的吸出体积(固定为0％或10％)，以下总共有四个条件，命名为：

NT_0％；NT_10％；T_0％；T_10％。

第5个和最后一个条件是非倾斜/0％额外吸取(即(V_aspPE ¹＝V_PE ¹和V_aspPE ²＝V_PE ²))，但在构建方法期间具有不变的过量体积(即V^wet)。我们在下文中将其命名为“表面湿润”状态。

对于这种情况，在实验的最初阶段将一定体积的PE¹聚电解质溶液分配到每个孔内(对于96孔板的孔，该体积设定为30μL)。这允许将恒定体积的溶液留在每个孔内，以确保表面始终保持被液体覆盖。通过这样做，我们的目的是避免聚电解质膜上方液体膜高度的局部差异。

移液速度

移液速度可由使用者在机器人臂的工作范围内控制。对于分配步骤，典型的移液速度设定为400-800μL/s，对于吸取步骤，设定为30-150μL/s。

孔内薄膜均匀性的特征(平铺扫描和横断面)

如果其中一个膜组件用荧光染料标记，则可以使用共焦显微镜(Zeiss LSM 700，LePeck，法国)的平铺扫描选项和10X物镜对给定孔内的整体膜均匀性进行成像。此选项可以通过获取图像子集自动扫描孔。

薄膜厚度“h”

我们使用PLL-FITC(PLL/HA)膜和(CHI-FITC)(CHI/PGA)膜来观察膜。事实上，对于指数增长的膜，已知最后一层能够在整个膜内扩散。因此，通过测量荧光带的厚度可以容易地测量膜厚度。

为了在高空间分辨率下评估每个孔内的膜均匀性，我们测量了每个孔内的五个不同位置(北、西、中、东和南，分别为N、W、C、E、S，图3)的膜厚度。根据用户的评估，该中心大约是孔的中心。其他两极分别位于距离中心+2mm的X和Y方向。为了测量这些位置的膜厚度(位置总数等于孔总数×5)，我们使用63x油物镜和配有Zen软件(蔡司)的定制宏来自动采集横截面，间隔为0.36μm。然后，使用Image J(NIH.Bethesda)上的定制宏从荧光强度分布图中自动推导出每个厚度(图4)。典型的荧光强度分布在噪声水平(接近0)处开始，随着焦平面深入到膜中而增加到峰值，然后返回到噪声水平。简而言之，首先确定最大强度(F_MAX)。我们应用阈值系数C使得I＝CxF_MAX。然后我们推导出Z位置(Z1，Z2)，在该位置处该线截取荧光强度分布。可以容易地推导出膜厚度h：h＝Z2-Z1(以μm计)。值得注意的是，通过比较手动测量的膜厚度，通过原子力显微镜和同一图像上的宏来验证该宏。

在每个孔内的不同位置N、W、C、E、S测定膜厚度，并测定相应的厚度hN、hW、hC、hE和hS。

每孔平均厚度“hWELL”

每孔hWELL的平均厚度计算为极位置(N,W,E,S)和中心(C)的所有5个厚度测量值之和除以5。因此，使用下式计算：

m个独立孔“hMEAN”的平均厚度

hMEAN计算如下：

m个独立孔的每孔平均厚度(hWELL)的标准偏差“SD”

SD计算如下：

平均厚度的变化系数“CV”

通过以下公式计算5个位置的每一个或每个孔的平均厚度的变异系数(CV)：

/>

CV可以独立于其绝对厚度值来比较样品。

用于非原位表征的在硅晶片上的PDMS微孔中的膜沉积

使用红外光谱、轮廓测定和AFM显微镜进行的非原位表征需要在硅晶片(直径2英寸，道康宁，美国)上构建膜。

我们设计了一种定制的硅基板，其中聚二甲基硅氧烷(PDMS，Sylgard 184试剂盒，道康宁)的孔尺寸与96孔板相似。将PDMS与固化剂(10：1)混合10分钟，并置于干燥器中20分钟以除去气泡。然后，将其引入模具中，在20分钟内再次脱气，并在65℃的烘箱中放置至少4小时，然后小心地从模具中取出并切成矩形块。制作与96孔板中相同直径和位置的圆孔。硅和PDMS基材均经过UV处理(PSD-UV臭氧清洁系统，Novascan Technologies)10分钟，以增加它们之间的粘合强度。此后，使处理过的面接触，压制粘附并在100℃的烘箱中引入1小时30分以胶合在一起。然后使用如上所述的机器人臂沉积(PSS/PAH)和(PLL/HA)聚电解质膜。

对于非原位膜表征，必须进行额外的干燥步骤。

对于(PLL/HA)膜，将储存在Hepes-Nacl缓冲液中的交联膜用MilliQ水漂洗，然后干燥。

对于(PSS/PAH)膜，简单地用MilliQ水漂洗膜，然后干燥。将膜干燥在培养箱中于37℃下进行2小时。在该过程结束时，移除PDMS模具并将膜保持在4℃。在每次FTIR和轮廓测定分析之前，将膜置于37℃的培养箱中1小时，以消除任何可能的湿度变化影响。AFM还表征了干膜。

使用红外光谱、轮廓测定和原子力显微镜进行非原位分析

FTIR分析

使用Vertex 70分光光度计(Bruker Optics Gmbh，Ettlingen，德国)以透射模式使用灵敏的MCT(Mercury-Cadmium-Telluride)检测器进行实验。在膜分析之前，使用透射附件在样品室中引入裸硅基板之后获得背景信号。将构建在硅基板上的干膜置于样品架中，并通过对256个干涉图求和来获得它们的光谱。使用OPUS软件v6.5(Bruker，德国)进行光谱分析，去除H₂O和CO₂贡献并手动校正基线，始终在每个光谱中选择相同的参考点。对于每种条件，最终光谱是相同样品(但来自不同孔)的3种不同光谱的平均值。

轮廓

使用表面光度仪(Dektak XT，Bruker公司，美国)进行在硅基板上构建的膜的厚度测量。对每个条件的五个样品(对应于同时构建的5个不同的孔)进行刮擦以产生物理步骤，并使用(v 5.4，Bruker公司，美国)获得每个样品的三次测量。用直径为12.5μm的触针和设定为1mg的力进行长度为1000μm的30s的扫描。因此，每种条件的膜厚度是15次测量的平均值。

AFM

通过使用硅悬臂(OMCL-AC240TS，奥林巴斯)的具有NanoScope IIIa控制器的DI3100AFM(Veeco)以轻敲模式获得沉积在硅上的聚电解质膜的AFM图像。将膜涂覆的基材在水中洗涤并在观察之前风干。基材形貌用512×512像素以1Hz的频率成像。

倾斜(“T”)/非倾斜(“NT”)、额外吸取和“表面湿润”条件对单孔和孔间膜均匀性的影响

在5极位置评估每个孔内的膜均匀性(图9至18)。结果提供在下面的表2和表3中。

表2：针对5种不同实验条件研究的所有参数测量的实验值。

参数	NT_0％	NT_10％	T_0％	T_10％	SW
						5个位置的CV的平均值±SD	19.3±9.8	20.6±5.4	7.1±3.9	5.1±0.5	6.6±1.6
(hWELL)的CV(％)	18.3	20.3	14	6.8	5.3
						整体膜均匀性(平铺扫描)	0.742	1.004	0.172	0.177	0.494
BMP50的细胞扩散(mm²)		1200±486		1828±697	1620±512
						BMP50的总表面覆盖率(％)		7.6±0.3		25.6±3.9	13.0±1.6
ALP生物活性	85	83	84	83	84

为了便于比较五个条件，基于实验值，对每个标准进行评分，得分越高，则参数越好。然后计算总平均分数。

表3：针对5种不同实验条件研究的所有参数的得分。

参数	NT_0％	NT_10％	T_0％	T_10％	SW
						5个位置的CV的平均值±SD	2	2	4	5	5
(hWELL)的CV(％)	2	2	3	5	5
						整体膜均匀性(平铺扫描)	2	1	5	5	3.5
BMP50的细胞扩散(mm²)		1.5		5	4
						BMP50的总表面覆盖率(％)		1.5		5	3.5
ALP生物活性	5	5	5	5	5
						总分	2.8	2.2	4.25	5	4.3

表3的排名给出了三个第一最佳条件：T_10％>SW>T_0％。NT_0％和NT_10％非常接近，但远低于其他。

因此，从绝对厚度测量值(图9、11、13、15和17)以及每个极点(图10、12、14、16和18)的CV看来：

-“表面湿润”状态(上面描述的第一实施方式)，和

-倾斜的条件(上述第二实施方式)，

-无需额外吸取(V_aspPE ¹＝V_PE ¹和V_aspPE ²＝V_PE ²)，

-或额外吸取10％(V_aspPE ¹＝1.10V_PE ¹和V_aspPE ²＝1.10V_PE ²)，

会产生更均匀的膜。

此外，对于倾斜实验，特别是倾斜和10％额外吸取的条件，以及对于表面湿润条件，每孔的平均厚度(图19)变化的比较小。

对于“非倾斜”(NT)条件，CV值(图20)系统地高于15％，对于T_0％条件，CV值为10％至15％，对于T_10％和对于表面湿润，CV值小于8％。

使用PLL-FITC以可视化膜的孔的整体视图和共焦显微镜软件的平铺扫描选项来提供关于每个孔中的整体膜均匀性的补充信息。荧光强度的三个代表性直方图绘制在图21至25中。所获得的图像以及直方图清楚地显示，相比于“非倾斜”(NT)条件，荧光分布在T_0％(图23)和T_10％(图24)和在表面湿润条件下(图25)条件下更均匀。

移液尖端的定位对膜厚度的影响

在实验开始之前，用户需要在(X,Y,Z)中定义参考位置，以便定义分配和吸取步骤的初始坐标。(X,Y)坐标的定义很简单，因为知道96孔板的孔中心的坐标。

遵循以下程序以在孔中溶液分配期间以及从孔中吸取期间控制板底附近的尖端的Z位置。在实验开始之前，将尖端定位在靠近板底的位置。首先将尖端设置成与微孔板接触，直到微孔板完全没有移动。然后，将尖端在Z中升高一步(使用的机器人为100μm)。该位置设定为参考Z位置Z0。

因此，我们研究了尖端的Z定位是否以及如何影响膜厚度测量。为此，在四个不同的Z位置处构建膜，从参考位置Z0(即，在板底上方0.1mm)逐渐增加0.3mm(图26至29)。

对于NT条件和T_0％，膜厚度的分散随Z增加而增加，但是对于T_10％条件，这些值几乎与Z无关。因此，后一种情况对于用户来说似乎更灵活，用户在Z0的优化中不需要高度精确。

关于“表面湿润”状态，由于在每个孔内部存在永久液膜，因此在实验之前不需要精确调节移液管尖端的初始Z位置Z0。

实施例2：使用液体处理机自动化的(PSS/PAH)或(CHI/PGA)膜构建

自动沉积方法也适用于其他类型的聚电解质膜。我们选择了聚电解质系统，即(PSS/PAH)薄膜，已知其线性生长并被认为是“模型系统”。如所预期的，发现它们的干燥厚度随着沉积层对的数量(图33)线性增长，直至由40对层制成的膜时的约250nm。

我们还检查了另一种由(CHI/PGA)制成的聚电解质体系，即聚电解质膜可以有效地沉积在孔的底部。由共聚焦显微镜成像测量的(CHI/PGA)12膜的厚度为2.26±0.14μm。

实施例3：装载在(PLL/HA)膜中的生物活性蛋白质

评估在实施例1和2中制备的聚电解质膜中后载的蛋白质的均匀性。

膜交联和(PLL/HA)膜中生物活性蛋白的加载

如先前在Crouzier T等，Small 2009，5：598-608中所描述的，将生物活性蛋白加载到(PLL/HA)膜中。

首先使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(EDC，终浓度为10、30或70mg/mL)和N-氢硫代琥珀酰亚胺钠盐(酰亚胺，终浓度为11mg/mL)作为催化剂，在pH 5.5的0.15MNaCl溶液中化学交联膜。将膜在4℃孵育过夜，然后彻底洗涤HEPES-NaCl缓冲液。

使用多通道移液管在酸性pH下将(PLL/HA)聚电解质膜手动加载骨形态发生蛋白(BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-9或两种BMP嵌合体，即嵌合体1和嵌合体2)作为生物活性蛋白，如先前在Crouzier T等人，Small 2009，5：598-608中所描述的。

细胞培养和细胞对生物活性聚电解质膜的反应

我们使用BMP-2应答细胞、C2C12骨骼成肌细胞(<25代，获自美国典型培养物保藏中心，ATCC)以评估聚电解质膜的生物活性。如前所述(Crouzier T等，Small 2009，5：598-608)在组织培养培养皿中，在1：1杜尔贝科改良鹰培养基(DMEM)中培养细胞：Ham's F12培养基(Gibco，英杰公司，法国))在37℃、5％CO₂培养箱中补充10％胎牛血清(FBS，PAA实验室，法国)和100U/mL青霉素G和100μg/mL链霉素(Gibco，英杰公司，法国)。然后，在每个孔中接种15000个细胞/cm²的培养基。在粘附4小时和24小时后，获得相差图像，并且还将样品固定在4％多聚甲醛(Sigma Aldrich，圣昆廷法拉维耶，法国)中。使用DAPI(生命技术公司和使用罗丹明鬼笔环肽(Sigma Aldrich)的肌动蛋白细胞骨架)对细胞核染色。

D1鼠间充质干细胞(D1)培养

D1细胞培养首先在生长培养基(89％aMEM(sigmaM4526)、含有1％抗生素的10％FBS(青霉素链霉素混合物，15140122英杰公司)中进行2天，然后在分化培养基中培养7天(生长培养基补充50μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸盐和倍半水合镁盐水合物(Sigma A8960)和10mMβ-甘油磷酸二钠盐五水合物(Sigma 50020)。在每个孔中接种9375个细胞。细胞培养停止后，通过酶测定评估ALP活性。

人骨膜来源的干细胞(hPDSC)培养

在250μM抗坏血酸2磷酸盐存在下，在10％FBS存在下，将人骨膜来源的干细胞(10至14之间的传代)在DMEM/高葡萄糖中培养。在200～μL培养基中以5000个细胞/cm²(每孔约1700个细胞)的密度接种它们。每2-3天更换培养基，并进行细胞培养2周。

碱性磷酸酶(ALP)生物活性

培养一定天数后(C2C12为3天，D1细胞为3天，hPDSC为14天)，除去生长培养基，用4％多聚甲醛固定细胞。根据制造商的说明书，在0.01％(w/v)萘酚AS-MX溶液(SigmaAldrich)中对它们进行ALP活性快速蓝色RR盐染色。

ALP酶活性

除去培养基，用PBS洗涤细胞，并在500mL 0.1％Triton-X100的PBS溶液中超声处理5秒进行裂解。然后使用标准方案定量这些裂解物的ALP活性，并将其标准化为相应的总蛋白质含量，其通过使用二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(Interchim，France)来测定。

分析聚电解质膜中负载的生物活性蛋白质的均匀性

为了评估(PLL/HA)膜中BMP-2负载的均匀性，使用用羧基荧光素(BMP-2CF)标记的BMP-2(总BMP-2浓度的5％)，并在彻底漂洗膜之后，在Hepes-NaCl缓冲液中进行孔的平铺扫描，以仅获得基质结合的BMP-2。

使用BMP响应细胞评估BMP蛋白的生物活性。

首先，我们选择使用EDC终浓度为30mg/mL的交联膜(即，标注为EDC30)，因为已知这些膜对细胞粘附性差，除非它们以基质结合的方式呈现BMP-2。膜越不均匀，预期细胞对基质结合的BMP的响应差异越大。

由于EDC30膜上的基质结合的BMP-2显著增加细胞粘附和扩散，我们首先在24小时评估细胞粘附(图30)。

对于这些实验，选择NT_10％和T_10％的两个“极端条件”和表面湿润条件。

细胞看起来是圆形的并且在NT_10％条件下粘附性差，而在T_10％条件下它们是更多数量的并且也更多地扩散。

对于早期骨标记物(即碱性磷酸酶)的表达，可以通过染色快速评估BMP-2的生物活性(图31)。所有条件都导致BMP-2剂量依赖性和显著的ALP表达，如在细胞染色和相应的定量后可见到的。

高通量筛选干细胞粘附和命运

我们选择了T_10％条件，以进一步证明基质结合蛋白的多功能性，以高通量筛选干细胞上的细胞过程。

我们首先测试了基质结合的BMP-7是否对鼠D1干细胞具有生物活性(图32)。为此，将细胞在生物活性聚电解质膜上培养长达9天。我们发现细胞选择性地粘附在基质结合的BMP-7上，并且可以生长至少9天。值得注意的是，细胞在没有基质结合的BMP-7的情况下分离并在其存在下形成结节。它们的ALP表达直接取决于基质结合的BMP-7的量并且以指数方式增长至平稳值(拟合在图32的图中)。

我们进一步测试了基质结合的BMP对小鼠C2C12骨骼肌成肌细胞是否具有生物活性(图34和35)。

为此，我们首先验证了这些BMP可以有效地加载到仿生膜中(表4)。

表4：(PLL/HA)膜中加载的BMP的比例和数量。

	纳入％	数量(/cm²)	SD
				BMP-9	86％	2325	65
BV-265	61％	1850	56
				BMP-2	60％	1650	115
BMP-4	65％	1810	15
				BMP-7	38％	1100	84

将细胞在生物活性聚电解质膜(5种不同的BMP蛋白和4种不同的BMP负载浓度)上培养3天。我们发现细胞选择性地粘附在基质结合的BMP上并在此时间段内生长。使用两种不同的方法以高通量评估它们的ALP表达：首先，使用扫描仪观察ALP染色，并拍摄整个微孔板的图像，显示每个孔中的ALP表达(图34)。其次，使用Tecan Infinite 1000酶标仪在高通量下定量ALP染色，通过使用多读取每孔模式定量570nm处的吸光度(在每个单独的微孔中测量76个不同位置，并得到这76个位置的平均值)。该定量使得能够将ALP绘制为溶液中BMP的初始浓度的函数(图35)，其清楚地显示剂量依赖性ALP响应：ALP强度取决于BMP的类型(按照顺序BMP-9>BV265>BMP-2>BMP-4>BMP-7)和BMP剂量(随着BMP浓度增加，ALP表达增加)。对于BMP-2、BMP-9、BV265、BMP-4，还给出了相应的指数拟合平稳值(连续线和虚线)，同时对于BMP-7拟合是线性的(连续线)。

实施例4：使用液体处理机自动化的(PLL/PGA)膜构建和细胞粘附和扩散的高通量筛选

自动沉积方法也应用于另一种类型的聚电解质膜，即我们先前研究用于细胞粘附的(PGA/PLL)膜(Picart等，高级功能材料2005)。

在本研究中，我们使用仅使用T_10％条件制作的膜。

(PGA/PLL)膜由5层对(例如(PGA/PLL)5膜)制成，并且是天然的(例如未交联的，CL0)或不同程度的交联(EDC 5、EDC 10、EDC 30，在下文中称为CL5、CL10、CL30)。因此，总共有4种不同的膜条件。最后使用液体处理机用Hepes-NaCl缓冲液漂洗它们。在这些膜的顶部，沉积最后一层。它由固定比例的PGA和PGA-RGD肽(接枝到PGA的含RGD的肽)的混合物构成。用于沉积最终层的PGA/PGA-RGD比率是变化的，以便研究最终层的4种不同条件：P0(3/0)，P1(2/1)，P2(1/2)，P3：(0/3)。将C2C12成肌细胞C2C12以3500细胞/孔(约10500个细胞/cm²)的密度接种在96孔微量培养板中。

我们首先验证了使用显微镜的平铺扫描选项观察到的每个孔内的仿生膜是均匀的(图36，显示了直径约6mm的整个孔)。

接下来，在无血清培养基中的不同仿生膜上进行细胞培养1H后，对细胞粘附和扩散进行定量。为此，将它们的细胞核(用Hoechst染色)和细胞骨架(用罗丹明鬼笔环肽染色)染色。使用自动Zeiss荧光显微镜在两个通道中以20X物镜以高通量自动获取图像。对于未交联膜(CL 0)和低程度交联的膜(CL5)，粘附细胞的数量随着RGD-肽浓度的增加而增加，但对于更多CL膜(CL10和CL30)而言是与肽无关的(图37)。关于细胞扩散区域(图38)，可见明显的肽依赖性细胞扩散区域，当肽的量增加时，成肌细胞扩散增强。因此，我们可以得出结论，含有肽接枝层的(PGA/PLL)仿生膜可以高通量进行细胞粘附和扩散。

Claims

1.通过聚电解质多层膜涂覆多孔板的至少一个孔的底表面的方法，所述方法包括n个连续序列，n为1至2000的整数，其中每个序列包含以下步骤：

a)在多孔板的至少一个孔的底表面上机器人沉积体积V_PE ¹的第一聚电解质PE¹溶液，其中第一聚电解质PE¹是包含氨基的阳离子聚合物，或者，是阴离子聚合物，然后，

b)机器人吸取吸出体积V_aspPE ¹的已经沉积的所述PE¹溶液与空气的混合物，其中吸出体积V_aspPE ¹高于或等于V_PE ¹，然后，

c)在所述底表面上机器人沉积体积V_PE ²的第二聚电解质PE²溶液，其中当PE¹是阴离子聚合物时，第二聚电解质PE²是包含氨基的阳离子聚合物，或者，当PE¹是包含氨基的阳离子聚合物时，PE²是阴离子聚合物，然后，

d)机器人吸取吸出体积V_aspPE ²的已经沉积的所述PE²溶液与空气的混合物，其中吸出体积V_aspPE ²高于或等于V_PE ²，

其中，对于每个序列，在步骤a)、b)、c)、d)中，底表面相对于水平面以倾斜角α倾斜5°至40°。

2.根据权利要求1所述的方法，其中每个序列包括：

-在步骤a)和b)之间，进行孵育步骤a')，其中将第一聚电解质PE¹的溶液与底表面接触1至30分钟，和

-在步骤c)和d)之间，进行孵育步骤c')，其中将第二聚电解质PE²的溶液与底表面接触1至30分钟。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中每个序列包括：

-在步骤b)和c)之间，进行漂洗步骤，其包括以下子步骤：

其中可以重复漂洗步骤，和

-在步骤d)之后，进行漂洗步骤，其包括以下子步骤：

其中可以重复漂洗步骤。

4.根据权利要求3所述的方法，其中每个序列包括：

-在步骤b2)和b3)之间，进行孵育步骤b2')，其中将漂洗溶液与底表面接触0.2至10分钟，和

-在步骤d2)和d3)之间，进行孵育步骤d2')，其中将漂洗溶液与底表面接触0.2至10分钟。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在第一序列的步骤a)之前，所述至少一个孔被填充体积V_wet的第一聚电解质PE¹溶液，其中，以mL表示的体积V_wet为从

V_wet ^min＝0.5×π(d/2)²

到

V_wet ^max＝(2/3)×π(d/2)²×H，

其中：

-d是孔的直径，以mm表示，

-H是孔的高度，以mm表示。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在每个序列中，V_aspPE ¹＝V_PE ¹和V_aspPE ²＝V_PE ²。

7.根据权利要求5所述的方法，在第一序列的步骤a)之前，包括在将要在第一序列的步骤a)中进行沉积的每个孔的底表面上机器人沉积体积V_wet的第一聚电解质PE¹溶液的步骤a0)。

8.根据权利要求5所述的方法，在第一序列的步骤a)之前，包括以下步骤：

a1)在将要在第一序列的步骤a)进行沉积的每个孔的底表面上机器人沉积体积V_a1)的第一聚电解质PE¹溶液，其中V_a1)高于V_wet，然后，

a2)机器人吸取吸出体积V_a2)的所述第一聚电解质PE¹溶液，其中所述吸出体积V_a2)为：

V_a2)＝V_a1)-V_wet。

9.根据权利要求4所述的方法，其中，对于每个序列，在步骤b2)、b3)、d2)和d3)中，底表面相对于水平面以倾斜角α倾斜5°至40°。

10.根据权利要求4所述的方法，其中，每个序列包括如权利要求2所定义的步骤a')和c')和/或包括如权利要求4所定义的步骤b2')和d2')，并且其中，对于每个序列，在步骤a')和c')和/或在步骤b2')和d2')中，底表面在水平面内。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在每个序列中，吸出体积V_aspPE ¹为1.05V_PE ¹至1.20V_PE ¹，吸出体积V_aspPE ²为1.05V_PE ²至1.20V_PE ²。

12.根据权利要求1所述的方法，其中阴离子聚合物包含羧基，所述方法在n个序列之后包含以下步骤：

e)在偶联剂存在下使所述氨基和羧基反应，以形成酰胺键并使聚电解质多层膜交联，然后，

f)用含蛋白质的溶液处理交联的聚电解质多层膜，以便在所述交联的聚电解质多层膜上和内部掺入所述蛋白质。

13.根据权利要求12所述的方法，在步骤e)和f)之间或在步骤f)之后，包括干燥聚电解质多层膜的步骤g)。

14.根据权利要求1所述的方法，包括在所述n个序列之后，在所述底表面上机器人沉积体积V_PE ³的第三聚电解质PE³溶液的步骤e')，其中：

-聚电解质PE³与至少一种肽连接，和

-当PE²是阴离子聚合物时，第三聚电解质PE³是包含氨基的阳离子聚合物，或者，当PE²是包含氨基的阳离子聚合物时，PE³是阴离子聚合物。