CN110214009A - 双嘧达莫用于治疗slc29a2核-表达癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种药物组合物，其包含：(i)治疗有效量的致癌基因SLC29A2抑制剂；及(ii)药学上可接受的载体，其用于抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移，及/或延长癌症患者存活期。该致癌基因SLC29A2抑制剂可以是选自以下群组中的至少一者：双嘧达莫、地拉齐普、曲氟嗪、硝基苯甲基硫肌苷，及其衍生物。所使用的该组合物可进一步包含索拉非尼用于相同用途。

Description

双嘧达莫用于治疗SLC29A2核-表达癌症
技术领域
本发明大体上是关于抗癌疗法，更特别是关于SLC29A2核-表达癌细胞的治疗。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全世界第六大常见癌症及致死癌症第二位，且超过45％的患者被诊断为晚期HCC。此外，根据BCLC分期及治疗指南，索拉非尼(sorafenib)是用于晚期HCC的唯一疗法。然而，接受索拉非尼的患者亦有严重副作用，且总存活期仅延长3至6个月。因此，急需研发更有效且更具耐受性的治疗。
发明内容
在一个方面中，本发明关于一种药物组合物的用途，该药物组合物包含：(i)治疗有效量的双嘧达莫(dipyridamole)；及(ii)药学上可接受的载体，其用于制造抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
在一个实施方式中，在根据本发明用途之前，癌症患者经鉴别为双嘧达莫治疗的候选者，条件是自该患者取得的癌细胞群体与对照相比，显示具SLC29A2的核过度表达。在一个实施方式中，SLC29A2在癌细胞中的过度表达是以组织化学染色自癌症患者取得的肿瘤切片中的细胞核来检测。
在另一个方面中，本发明是关于双嘧达莫的用途及索拉非尼的用途，其用于制造抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
在另一个方面中，本发明是关于药物组合物的用途，该药物组合物包含：(i)治疗有效量的致癌基因SLC29A2抑制剂；及(ii)药学上可接受的载体，其用于制造抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
在本发明的一个实施方式中，致癌基因SLC29A2的抑制剂是选自以下群组中的至少一者：双嘧达莫、地拉齐普(dilazep)、曲氟嗪(draflazine)、硝基苯甲基硫肌苷(nitorbenzylthioinosine)，及其衍生物。
在本发明的另一个实施方式中，致癌基因SLC29A2的抑制剂选自以下群组：双嘧达莫、SLC29A2反义短小干扰RNA(siRNA)及抗SLC29A2短发夹RNA(shRNA)及抗SLC29A2中和抗体。
在本发明的另一个实施方式中，癌细胞是选自以下群组中的至少一者：肝癌细胞、乳癌细胞、头颈癌细胞及卵巢癌细胞。
在本发明的另一个实施方式中，癌细胞是肝癌细胞且含有显示对索拉非尼具治疗抗性的细胞群体。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的用途，该组合物进一步包含索拉非尼。
在本发明的另一个实施方式中，本发明的用途同时组合使用索拉非尼用于制造抑制癌症患者癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
或者，本发明关于一种药物组合物，其包含：(i)治疗有效量的双嘧达莫；及(ii)药学上可接受的载体，其用于抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移，及/或延长癌症患者存活期。
在一个实施方式中，根据本发明使用的药物组合物另外包含其他药物组合物，该其他药物组合物包含治疗有效量的索拉非尼及药学上可接受的载体，该其他药物组合物用于抑制癌症患者的癌细胞的增殖、发生及转移，及/或延长癌症患者存活期。
本发明进一步是关于双嘧达莫及索拉非尼，其用于抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移，及/或延长癌症患者存活期。
本发明另外是关于一种药物组合物，其包含：(i)治疗有效量的致癌基因SLC29A2抑制剂；及(ii)药学上可接受的载体，其用于抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移，及/或延长癌症患者存活期。
本发明另外是关于一种抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的方法，该方法包括：向有此需要的癌症患者施用一种药物组合物，该药物组合物包含：(i)治疗有效量的双嘧达莫；及(ii)药学上可接受的载体。该方法可进一步包括向有此需要的癌症患者施用治疗有效量的索拉非尼。在一个实施方式中，向有此需要的癌症患者同时施用双嘧达莫及索拉非尼。
本发明另外是关于一种抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的方法，该方法包含：向有此需要的癌症患者施用一种药物组合物，该药物组合物包含：(i)治疗有效量的致癌基因SLC29A2的抑制剂；及(ii)药学上可接受的载体。
在一个实施方式中，在施用步骤之前另外包括：(a)检测获自癌症患者的癌细胞中SLC29A2的核表达且与对照对比；及(b)鉴别癌症患者为双嘧达莫治疗的候选者，条件是检测到癌症患者癌细胞群体与对照相比，具有SLC29A2的核过度表达。检测步骤可使用抗SLC29A2的抗体进行。抗体检测癌细胞中SLC29A2的核过度表达。检测步骤是以组织化学染色法对获自癌症患者的肿瘤切片中的细胞核进行染色。在一个实施方式中，该方法可进一步包括向有此需要的癌症患者施用治疗有效量的索拉非尼。在一个实施方式中，向癌症患者同时施用双嘧达莫及索拉非尼。在一个实施方式中，癌症患者具有带有展现致癌基因SLC29A2的核过度表达的癌细胞群体的肝癌细胞。
这些及其他方面将由以下优选实施方式的描述结合以下图式而变得显而易见，但可在不脱离本发明的新颖概念的精神及范围的情况下，在其中进行变化及修改。
附图说明本发明的一或多个实施方式，且与文字描述一起用以解释本发明的原理。在任何可能的情况下，在整个图式中使用相同参考编号来参照实施方式的相同或相似要素。
附图说明
图1A-I显示SLC29A2是一致癌基因。(A)与TCGA数据集中的正常肝比较，在四十二个肿瘤切片中显示较高的SLC29A2表达。(B、C)免疫组织化学染色显示SLC29A2的表达随癌症级别升高，且显示在淋巴结转移及远距转移中更高。(D)藉由阿尔玛蓝(Alamar blue)染剂测定细胞数量，且结果显示在HCC细胞株中异位表达的SLC29A2增进细胞增殖。结果经三重复试验且由平均值±SD表示。(E)SK-hep1细胞在软琼脂中的非锚定依赖性生长测定显示SLC29A2增加群落数量。本图展示为中心点的图像，与量化条形图，条形图表示六个孔的三个独立测定。(F)SLC29A2亦在HCC细胞株中增强跨室(transwell)迁移。本图展示为Boyden腔室的图像与条形图，条形图由平均值±SD表示。(G)上皮细胞-间充质细胞转换标记的蛋白印迹分析显示SLC29A2促进间质标记表达量且降低上皮标记表达量。(H)在SK-hep1细胞中SLC29A2的异位表达促使球体形成，条形图由平均值±SD表示，三重复试验。(I)在原位肝模型中SLC29A2增进肿瘤负荷。将模拟(mock)小鼠注射携有萤光素酶的SK-hep1细胞。将SLC29A2小鼠注射异位表达SLC29A2的SK-hep1细胞。图像表示藉由IVIS系统得到的各组中的一只小鼠随时间推移肿瘤的进展。
图2A-I显示SLC29A2的致癌作用是STAT3依赖性的。(A)藉由蛋白激酶数组(protein kinase array)的筛检显示SLC29A2促使STAT3磷酸化。(B)SLC29A2及磷酸化-STAT3在HCC患者组织中的表达呈正相关。n＝234。(C)在HCC细胞株中表达SLC29A2促使STAT3磷酸化及上游激酶(Jak2及Tyk2)活化。(D)STAT3D的结构性示意图，STAT3D在DNA结合域中是显性负性的。(E)引入STAT3D可减少SLC29A2诱导的STAT3磷酸化。(F、G、H、I)抑制STAT3传信传导逆转SLC29A2驱动的致癌表型，包括增殖(F)、迁移(G)、非锚定依赖性生长能力(H)及球体形成(I)。
图3A-F显示SLC29A2的异常核表达促进致癌作用。(A)HCC组织的免疫组织化学染色显示与相邻正常组织相比在原发性肿瘤中SLC29A2及磷酸化STAT3的核表达异常。(B)SLC29A2的异位表达增强在核中的异常表达。α-微管蛋白、泛钙粘蛋白及SP1表示亚细胞部分的标记。(C)SK-hep1细胞的免疫荧光染色显示藉由显性负性Ran-GTP酶(Ran-Q69L)抑制核孔而减少SLC29A2的核转运。条形图表示在Ran-WT及Ran-Q69L组中SLC29A2的分布，n＝300。(D、E)核转运的抑制减少SLC92A2介导的致瘤表型，包括增殖(D)及迁移(E)。(F)亚细胞分划(fractionation)接着免疫沉淀显示SLC29A2在细胞核中与STAT3相互作用。
图4A-E显示SLC29A2的糖基化修饰导致膜锚定及核转运。(A)蛋白印迹法显示SLC29A2的糖基化突变体(N48D及N57D)的异位表达。(B)免疫荧光共焦显微试验显示SLC29A2的糖基化修饰对核转运及p-Stat3活化至关重要。(C、D)功能性测定显示糖基化修饰对SLC29A2-介导的增殖(C)及跨室迁移(D)至关重要。(E)突变的糖基化位点亦逆转SLC29A2驱动的上皮细胞-间充质细胞转换表型。
图5A-E显示在异常表达细胞中双嘧达莫的治疗降低SLC29A2-驱动的致癌表型。(A)携有扩增SLC29A2的HCC细胞株相比于非扩增细胞对双嘧达莫敏感。使用阿尔玛蓝(ALAMAR )染剂进行细胞存活率测定，Y轴表示细胞对双嘧达莫的IC50。(B)相比于对照细胞，表达SLC29A2的SK-hep1细胞对双嘧达莫敏感。(C)双嘧达莫减少表达SLC29A2的细胞的跨室迁移。(D)双嘧达莫抑制SLC29A2诱导的Stat3磷酸化及周期蛋白D1下调。(E)共焦显微试验显示双嘧达莫减少SLC29A2的核转运。左图表示在细胞核中SLC29A2表达的百分比。
图6A-E显示双嘧达莫与索拉非尼的组合可增进活体外及活体内抑制作用。(A)双嘧达莫与索拉非尼的组合治疗增进细胞存活率的降低，表达SLC29A2的细胞尤其如此。(B)双嘧达莫与索拉非尼的组合进一步降低SLC29A2诱导的Stat3磷酸化。(C)活体内治疗的实验设计流程图。(D)治疗后6周藉由IVIS系统测量肿瘤负荷。(E)相比于单一治疗及媒剂试验，组合治疗增强小鼠总存活期。
图7显示所提出的研究模式。
图8是显示SLC29A2在不同癌细胞株中扩增的表列。
图9A-F显示在肿瘤小鼠模型中SLC29A2表达的影响。(A、B)在肝原位肿瘤模型中SLC29A2的异位表达促使肿瘤进展。(C)SLC29A2减少小鼠存活期。(D、E、F)在原发性肝(E)及转移性肺(F)中SLC29A2的异位表达增加结节。
图10A-J显示双嘧达莫对表达SLC29A2的癌细胞的影响。(A、B、C、D)双嘧达莫与索拉非尼的组合进一步降低HCC细胞株的细胞存活率，在SLC29A2高度表达的细胞中尤其如此(B、D)。(E)在SLC29A2表达的肝原位模型中双嘧达莫治疗降低肿瘤进展。双嘧达莫与索拉非尼的组合可进一步降低肿瘤进展。(F)双嘧达莫与索拉非尼的组合进一步增加小鼠存活期。(G、H、I)在原发性肝(H)及转移性肺(I)中双嘧达莫的治疗降低结节。双嘧达莫与索拉非尼的组合可进一步降低在肝(H)及肺(I)中结节。在双嘧达莫及/或索拉非尼治疗下对小鼠没有显著体重变化及毒性(J)。
具体实施方式
本发明更特定描述于以下实施方式中，该等实施例仅为说明性的，因为其中的许多修改及变化对熟习此项技术者而言为显而易见。现详细描述本发明的各种实施方式。参看图式，在整个图式中相同编号指示相同组分。除非上下文另外明确规定，否则如在本描述中且在随后的整个权利要求书中所使用，“一”及“该”的含义包括复数指示物。另外，除非上下文另外明确规定，否则如在本描述中且在随后的整个权利要求书中所使用，“在……中(in)”的含义包括“在……中(in)”及“在……上(on)”。而且，为方便读者，说明书中可使用标题或副标题，其不会对本发明的范围造成影响。另外，本说明书中所用的一些术语更具体地定义于下文。
定义
本说明书中所使用的术语在本发明的上下文中及在使用各术语的特定上下文，在所属技术领域中具有其特定含义。这些用于描述发明内容的术语将在下文中或本说明书中其他地方论述，以提供实施者关于本发明的描述的进一步引导。为方便起见，某些术语可能会被特别标示，使用例如斜体字及/或引号。这些特别标示并不影响这些术语的范围及含义；无论是否有特定标示，在同一上下文中术语的范围及含义相同。应了解，同一事物可以用超过一种方式表达。因此，替代用语和同义词可以用于本文中论述的任一种或多种术语，无论术语在本文中是否详细阐述或论述，均不被赋予任何特别不同的意义。在本文中亦提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的说明并不排除使用其他同义词的表述。在本说明书中的任何地方的实例，包含本文中论述的任何术语仅为例示性的，且绝不限制本发明或任何例示术语的范围及含义。同样，本发明不局限于本说明书中所给的各种实施方式。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语与本发明所属领域的一般技术者通常所知的具有相同含义。如有冲突，以本文献(包括定义)为准。
如本文中所使用，“大约(around)”、“约(about)”或“大致(approximately)”应通常意谓在既定值或范围的20％内、优选10％内且更优选5％内。在本文中给出的数量为近似值，意谓即使未明确地陈述亦可推断为具有术语“大约”、“约”或“大致”之意。
如本文中所使用，“对照”应通常意谓正常对应细胞。
术语“癌症引发细胞”、“肿瘤引发细胞”、“癌症引发细胞”可互换。
术语“治疗(treating/treatment)”是指向患有癌症或具有此类疾病的症状或有患此类疾病的倾向性的有此需要的个体施用有效量的化合物，用以治愈、减轻、缓解、医治、改善或预防疾病、其症状或疑似倾向。此类个体可藉由健康照护专业人士根据来自任何适合诊断方法的结果来鉴别。
“有效量”是指对所治疗个体赋予治疗效果所需的活性化合物的量。如熟习此项技术者所认识到的，有效剂量将视施用途径、赋形剂使用及与其他治疗性治疗共同使用的可能性而不同。
由美国卫生与人群服务部食品及药物管理局(U.S.Department of Health andHuman Services Food and Drug Administration)发表的“估算成人健康志愿者治疗临床试验中的安全起始剂量的工业和审查员指南(Guidance for Industry and ReviewersEstimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics inAdult Healthy Volunteers)”揭示“治疗有效量”可由下式藉由计算得到：
HED＝动物剂量(mg/kg)×(动物重量(kg)/人类重量(kg))0.33。
实施例
在不意图限制本发明的范围的情况下，以下提供根据本发明的具体实施方式的例示性仪器、设备、方法及其相关结果。应注意，为读者方便起见，实方式中可使用标题或副标题，其决不应限制本发明的范围。此外，本文中提出且揭示了某些理论；然而，无论其正确与否，其决不应限制本发明的范围，只要根据本发明实施该发明即可，不需考虑任何特定理论或操作流程。
材料及方法
患者组织样品及免疫组织化学染色
人类活癌症组织数组购自SuperBio Chips(#CSA3)及BioMax(#LV208及#LV2081)。将组织数组在用于脱蜡及抗原恢复的Dewax及HIER缓冲液H(#TA-100-DHBH，Thermo)中在95℃下孵育15分钟。随后将切片用3％过氧化氢孵育以去除内源性过氧化酶活性。再用10％山羊血清阻断之后，在阻断溶液中在将切片与对SLC29A2具特异性的一级抗体(1:1000稀释，#ab48595，abcam)及对磷酸化-STAT3具特异性的一级抗体(1:1000稀释，#9145，CellSignaling Technology)一起在4℃下孵育过夜。应用双链HRP系统(#k4065，Dako)结合一级抗体且根据使用操作说明书显色。切片随后用苏木精复染色。由病理学家使用四阶层评级系统(阴性：0，弱阳性：+1，中度阳性：+2，及强阳性：+3)及各切片中染色的百分比来评估SLC29A2及磷酸化-STAT3的表达。SLC29A2的核表达评分超过+2表示过度表达。
细胞株
将HCC细胞株(Sk-hep1及Mahlavu)保持在具有10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、1％L-谷氨酰胺及1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的达尔伯克氏改良的伊格氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中。所有细胞皆测试霉浆菌(mycoplasma)污染。
质粒及转染
pcDNA3.0/HA-SLC29A2根据Chen等人(2010)(Hepatology,52(5),1690-1701)文献产生。为稳定表达SLC29A2或STAT3D，根据使用操作说明书藉由JetPrime转染剂(Polyplus)用质粒转染HCC细胞株，且在G418(SK-hep1：800μg/mL，Mahlavu：500μg/mL)存在下进一步加以筛选。
免疫沉淀法及免疫印迹法
用含有蛋白酶抑制剂混合物(#04693132001，Roche)及磷酸酶抑制剂(#54625，Millipore)的RIPA缓冲液溶解细胞，且将等量溶胞物(20μg/色带)装载在SDS-PAGE上且印迹在PVDF膜上。藉由使用针对以下的一级抗体进行蛋白印迹法：SLC29A2(#ab48595，abcam)或HA-标签(#MMS-101R，Covance)、磷酸化-STAT3(#9145，Cell Signaling Technology)、STAT3(#9139，Cell Signaling Technology)、蜗牛蛋白(snail)(#3879，Cell SignalingTechnology)、蛞蝓蛋白(slug)(#9585，Cell Signaling Technology)、扭转蛋白(twist)(#46702，Cell Signaling Technology)、E-钙粘蛋白(#3195，Cell Signaling Technology)、γ-连环蛋白(#2309，Cell Signaling Technology)、N-钙粘蛋白(#13116，Cell SignalingTechnology)、波形蛋白(vimentin)(#5741，Cell Signaling Technology)、α-SMA(#sc-53142，Santa Cruz)、GAPDH(#GTX100118，GeneTex)、存活蛋白(survivin)(#2808，CellSignaling Technology)、周期蛋白D1(#2978，Cell Signaling Technology)、p-Jak2(#3771，Cell Signaling Technology)、Jak(#3230，Cell Signaling Technology)、p-Tyk2(#9321，Cell Signaling Technology)、Tyk2(#9312，Cell Signaling Technology)、Flag-标签(F1804，Sigma-Aldrich)、α-微管蛋白(sc-8035，Santa Cruz))、泛钙粘蛋白(#4068，CellSignaling Technology)、SP1(sc-420，Santa Cruz)及β-肌动蛋白(#MAB1501，Millipore)。
对于免疫沉淀法，将指定抗体首先与结合蛋白A/G的磁体珠粒(蛋白A：#28-9513-78，蛋白G：#28-9513-79，GE healthcare)在4℃下孵育1小时，且随后将使等量细胞溶胞物与结合抗体的珠粒在4℃下反应过夜。将沉降珠粒(pull-down beads)洗涤、洗提，且随后以蛋白印迹法进行蛋白质检测。
软琼脂非锚定依赖性(soft agar anchorage-independent)测定
在6孔盘中铺设含有完全培养基及0.5％琼脂糖的基底层(2mL/孔)，且在基底层上涂覆含有完全培养基、0.3％琼脂糖及总共1×104个细胞的顶层(2mL/孔)。向各孔添加完全培养基(2mL)且每3天替换。在孵育3周之后，用0.3％结晶紫溶液将群落染色，并且以ImageJ软件计数。
细胞增殖及细胞存活率测定
藉由ALARMA试剂(DAL1100，ThermoFisher)根据制造商的操作说明书检测细胞增殖及细胞存活率。对于细胞增殖测定，在96孔盘中接种总共1.25×103个细胞。指定孵育时间之后，用10％ALARMA替换培养基，在37℃下孵育1小时。在560nm下激发ALAMAR荧光且在590nm下测量。
迁移测定
在含有无血清培养基的8微米Boyden室插入式培养皿(#MCEP24H48，Millipore)的上部腔室中接种总共1×104个细胞。随后将插入式培养皿挂在含有完全培养基的24孔盘上。16小时之后，抹除非迁移细胞且将迁移细胞用甲醇固定且用刘氏(Liu's)染色剂染色。利用ImageJ软件计算迁移细胞数量。
球体形成测定
在含有DMEM/F12培养基、EGF(20ng/mL)、bFGF(20ng/mL)、B27及胰岛素(4μg/mL)的超低粘附性6孔盘(#3471，Corning)中接种总共1×104个细胞。球体每5至8天继代一次直至其达到100μm的直径，且在其继代之前于相位差显微镜下计数。
细胞分划
根据制造商的操作说明书收集细胞且使用细胞分划试剂盒(#78840，ThermoScientific)分划细胞为细胞溶质、膜及核部分。将相同量的细胞溶质、膜及核部分用于免疫沉淀法及免疫印迹法。α-微管蛋白、泛钙粘蛋白及SP1充当对照，用于细胞分划及免疫印迹负载。
共焦显微试验分析
细胞于载玻片上生长。用冰冷PBS洗涤之后，以甲醇固定细胞，以5％BSA阻断细胞，且细胞与一级抗体在4℃下一起孵育过夜。用PBS润洗载片，且与结合Alexa488或Alexa594的二级抗体孵育。随后用PBS润洗载片，用DAPI染色，及用Dako荧光封固剂(mountingmedium)(#S3025，Dako)封固。藉由具有63X/1.4物镜的Zeiss LSM 700激光扫描显微镜获得经免疫染色的细胞。使用ZEN、AxioVision及ImageJ软件分析图像。
定向诱变
使用QuikChange II定向诱变试剂盒(#200523，Agilent)，按照使用操作说明书藉由定向诱变产生SLC29A2-N48D及SLC29A2-N57D。引物如下：SLC29A2-N48D：CCGGGGCCGGCGACAGCACAGCC(SEQ ID NO:1；正向)，GGCTGTGCTGTCGCCGGCCCCGG(SEQ ID NO:2；反向)，及SLC29A2-N57D：GATCCTGAGCACCGACCACACGGGTCC(SEQ ID NO:3；正向)，GGACCCGTGTGGTCGGTGCTCAGGATC(SEQ ID NO:4；反向)。序列是藉由DNA测序来确认。
小鼠原位模型
所有动物程序均在台湾中央研究院动物实验管理机构的批准下进行。将携有萤光素酶的SK-hep1细胞(每只小鼠1×106个细胞)与基质胶(#354262，BD)混合，注射至6至8周龄的雄性裸鼠的肝中。在注射4周之后，将小鼠用异氟醚麻醉且腹膜内(i.p.)注射50μL D-萤光素(#XR-1001，Xenogen)，接着使用IVIS图像系统检测萤光素酶活性。将萤光素酶活性阳性小鼠随机分组，且一天一次经由胃管灌食媒剂、索拉非尼、双嘧达莫或组合治疗药剂(索拉非尼：10mg/kg/天，双嘧达莫：25mg/kg/天，以4倍浓度溶解于KolliphorEL/乙醇，50％:50％中)。每两周以IVIS图像系统检测萤光素酶活性，且使用IVIS操作软件分析图像。
在肿瘤注射之后48周或在肿瘤超量生长之前牺牲小鼠。收集肿瘤样品且用4％多聚甲醛固定。
生物信息学分析
自基因表达汇编(Gene Expression Omnibus)收集GSE14520-GPL3921，且在此数据集中有214名成对的HCC患者。自TCGA收集46名成对的HCC患者的3级RNAseq资料。所有这些数据均藉由史都登氏(student's)t检验分析。
统计分析
除有指示的情况外，各样品均以三重复试验进行分析。对于活体外分析，重复各实验至少三次。所有误差杠均表示标准偏差。应用史都登氏t检验来比较两组独立样品。藉由皮尔森(Pearson)相关性分析相关性。P值<0.05视为统计显著。
结果
SLC29A2在不同癌症类型中扩增且高度表达。
在HCC组织及细胞株中发现SLC29A2扩增。在此，我们藉由计算机仿真研究突显出SLC29A2在不同癌症类型中的重要性。藉由使用cBioportal数据库，我们发现SLC29A2亦在其他类型的癌症中扩增，包括乳癌、胰脏癌、头颈癌及卵巢癌。藉由内部分析方法或cBioportal数据库分析CCLE数据集显示，SLC29A2在不同细胞株中扩增(图8，表1)。使用FireBrowse数据库，SLC29A2在不同癌症组织中的表达高于TCGA数据集中的其正常组织。这些结果显示，不仅在HCC中且在其他癌症类型中皆有SLC29A2的扩增及异常表达。
SLC29A2是HCC中的致癌基因。
当我们将HCC作为模型来研究SLC29A2的致癌特性时，我们首先计算机仿真研究SLC29A2在HCC样品中的表达。结果显示，相比于TCGA数据集中的正常组织，在HCC肿瘤中SLC29A2具有较高的表达(图1A)。免疫组织化学染色亦显示，在肿瘤进展期间SLC29A2的表达增加(图1B及1C上图)。相比于原发性肿瘤，SLC29A2在淋巴结转移性及远距转移性组织中的表达增加(图1C，下图)。为研究在HCC中SLC29A2是否是致癌基因，我们在HCC细胞株中异位表达SLC29A2。功能性研究显示，在HCC细胞株SK-hep1及Mahlavu中SLC29A2促进增殖(图1D)、非锚定依赖性生长(anchorage-independent growth，AIG)能力(图1E)及跨室迁移(图1F)。分析几个标记的表达指示SLC29A2促使上皮细胞-间充质细胞转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)表型(图1G)。SLC29A2亦在HCC中促进癌症所引发的细胞特性(图1H)。我们在裸鼠中实施原位肿瘤小鼠模型，且结果亦显示SLC29A2促使肿瘤进展及活体内转移(图1I)。在肝原位肿瘤模型中，SLC29A2的异位表达促使肿瘤进展(图9A-B)。SLC29A2减少小鼠存活期(图9C)。图9D-F显示，SLC29A2的异位表达增加在原发性肝(9E)及转移性肺(9F)中的结节。由这些结果及先前研究，我们发现在异种移植模型中SLC29A2是不可或缺且足以导致肿瘤的(包括增殖、AIG、迁移及肿瘤进展)。
SLC29A2的致癌特性是通过Stat3活化。
为研究SLC29A2诱导的致癌作用的基本机制，我们实施蛋白激酶数组来探讨可能涉及的路径。结果显示，SLC29A2在HCC细胞株中的表达增加Stat3磷酸化(图2A)。免疫组织化学染色亦显示，SLC29A2的表达与HCC组织样品中的磷酸化Stat3呈正相关(图2B)。在HCC细胞株中SLC29A2的异位表达亦显示Stat3磷酸化及上游活化因子Jak2及Tyk2增加(图2C)。一下游信号因子存活蛋白被活化，但另一因子周期蛋白D1出乎意料地下调(图2C)。为阐明Stat的重要性，我们利用在DNA结合域中突变的显性负性Stat3(图2D)。结果显示，共表达Stat3D会降低SLC29A2诱导的Stat3磷酸化且逆转周期蛋白D1下调(图2E)。功能性研究亦显示，Stat3D的共表达逆转SLC29A2诱导的致癌作用，包括增殖(图2F)、迁移(图2G)、AIG能力(图2H)及球体形成(图2I)。这些结果显示SLC29A2调控的致癌作用是Stat3依赖性的。
SLC29A2的异常核表达促成致癌特性及Stat3磷酸化。
免疫组织化学染色的结果显示，相比于相邻正常组织，在HCC组织中的细胞核中SLC29A2表达异常(图3A)。我们藉由亚细胞分划确认核表达，且发现SLC29A2异位表达细胞显示出在核分划中SLC29A2表达增加，而对照组仅在膜部分中表达SLC29A2(图3B)。相比于对照组，在核分划中磷酸化Stat3(p-STAT3)亦增加，这与免疫组织化学染色的结果一致(图3A-B)。为确认异常核表达确实自膜移位，我们在细胞中表达控制核孔物质运输的野生型与显性负性Ran-GTP酶(Ran-Q69L)。共焦显微试验显示表达Ran-Q69L可降低SLC29A2的核转运(图3C)。功能性研究亦显示阻断SLC29A2的核转运会减少HCC细胞的增殖(图3D)及跨室迁移(图3E)。此外，藉由免疫沉淀法发现SLC29A2可与Stat3相互作用(图3F)，且主要在细胞核中相互作用。这些结果说明，SLC29A2的核转运藉由与Stat3相互作用并促使Stat3移位而促成致癌作用。
SLC29A2的糖基化修饰对膜锚定(membrane anchorage)及致肿瘤性至关重要。
在SLC29A2中有两个N-糖基化修饰位点，残基48及残基57，且在蛋白质已经翻译之后这些修饰对膜锚定十分重要。我们研究这些修饰是否亦促成SLC29A2核转运。在产生且表达糖基化位点突变体(N48D及N57D，图4A)之后，我们发现当破坏膜锚定时SLC29A2的核转运降低(图4B)。异位表达接着脱氧土霉素(doxycyclin)处理显示糖基化突变体不改变SLC29A2的蛋白稳定性(图4A-B)。功能性测定显示，相比于野生型，糖基化突变体的增殖(图4C)及迁移(图4D)降低。且在表达糖基化突变体的细胞中，EMT标记被逆转为上皮表型(图4E)。这些结果表示，SLC29A2的糖基化修饰对于膜锚定及核转运十分重要，随后促成致癌特性。
抑制SLC29A2减少SLC29A2核表达细胞中的致癌表型。
我们发现SLC29A2在HCC肿瘤形成中扮演重要角色。随后我们研究SLC29A2是否可以是一个治疗目标。在用SLC29A2抑制剂处理HCC细胞株之后，我们发现相比于非扩增细胞，SLC29A2扩增细胞对SLC29A2抑制剂敏感得多(图5A)。异位表达SLC29A2的SK-hep1细胞亦比对照细胞敏感得多(图5B)。抑制SLC29A2亦降低SLC29A2异位表达细胞的迁移能力(图5C)。此外，我们发现SLC29A2抑制剂处理以剂量依赖性方式降低SLC29A2诱导的Stat3磷酸化，且逆转周期蛋白D1的下调(图5D)。共焦显微试验的结果显示SLC29A2抑制剂处理亦降低SLC29A2及Stat3核转运(图5E)。这些结果表示，藉由降低核转运及Stat3磷酸化，抑制SLC29A2会减少异常表达细胞中的致癌表型。
与索拉非尼的组合治疗增强SLC29A2抑制剂的抗肿瘤作用。
索拉非尼是唯一经FDA核准用于治疗晚期HCC患者的药品。然而，我们发现相比于对照细胞，SLC29A2表达细胞对索拉非尼的抗性大得多(图6A)。为寻求新的治疗策略，我们使用SLC29A2抑制剂及索拉非尼的组合来处理细胞。结果显示组合治疗进一步减少对照细胞与SLC29A2异位表达细胞的细胞存活率(图6A)。我们亦发现组合治疗进一步降低SLC29A2异位表达细胞中的Stat3磷酸化(图6B)。为进一步观察治疗效果，我们设计了原位肿瘤小鼠模型来检验SLC29A2抑制剂与索拉非尼组合的作用(图6C)。在注射携有萤光素酶表达的SK-hep1细胞(媒剂组或经HA-SLC29A2转染的SK-hep1)之后四周，小鼠一天一次以胃管灌食SLC29A2抑制剂、索拉非尼或组合治疗。结果显示在原位肿瘤小鼠模型中SLC29A2促使肿瘤进展，且以索拉非尼治疗，在SLC29A2表达组与对照组中皆减少肿瘤负荷(图6D)。在SLC29A2表达组中用SLC29A2抑制剂双嘧达莫治疗会降低肿瘤进展，这与活体外试验结果一致(图6D)。组合治疗在SLC29A2表达组与对照组中皆显著降低肿瘤负荷(图6D)。此外，组合治疗在SLC29A2表达组及对照组中皆显著增加总存活期(图6E)。
图10A-D显示，双嘧达莫与索拉非尼的组合进一步降低HCC细胞株的细胞存活率，在SLC29A2高度表达细胞中尤其如此(10B、10D)。在SLC29A2表达的肝原位模型中，双嘧达莫治疗降低肿瘤进展(10E)。双嘧达莫与索拉非尼的组合可进一步降低肿瘤进展。(10F)双嘧达莫与索拉非尼的组合进一步增加小鼠存活期。(图10G、图10H、图10I显示双嘧达莫治疗减少在原发性肝(10H)及转移性肺(10I)中的结节。在肝(10H)及肺(10I)中双嘧达莫与索拉非尼的组合治疗可进一步减少在肝(10H)及肺(10I)中的结节。用双嘧达莫及/或索拉非尼处理的小鼠未显示显著体重变化或毒性(10J)。
总而言之，我们发现SLC29A2是一新的致癌基因，且藉由与磷酸化Stat3相互作用而促进HCC细胞增殖、AIG能力、迁移及癌症引发的细胞特性(图7)。我们发现不仅SLC29A2扩增与晚期相关；SLC92A2的表达亦增加肿瘤进展(图1A-B)。公共数据集亦显示，在其他癌症类型(包括乳癌、胰脏癌及肺癌)中SLC29A2扩增且高度表达。这些结果表示，SLC29A2在不同组织的肿瘤形成中扮演重要角色。
SLC29A2表达促使Stat3磷酸化。在SLC29A2表达细胞中，下游信号因子周期蛋白D1下调(图2C)。尽管许多研究已显示，在肿瘤进展期间周期蛋白D1的表达增加(Tashiro等人(2007)Cancer Science,98(5),629-635)，但一些研究指出周期蛋白D1的下调与患者的癌症转移(Mejlvang等人(2007)Molecular Biology of the Cell,18(11),4615-4624)、干细胞特性(Matsui等人(2002)The Journal of Biological Chemistry,277(39),36167-36173)及存活期结果不良(Lehn等人(2010)The American Journal of Pathology,177(6),2886-2897)相关。这些研究结果显示在SLC29A2表达细胞中的相似表型。我们亦发现周期蛋白D1的下调由促使周期蛋白D1磷酸化及增加蛋白质降解引起(数据未示出)。这些结果表示SLC29A2可能经由其他机制促成晚期癌症的进展。
我们的结果显示SLC29A2的异常核表达及核表达SLC29A2促成致癌表型(图3)。SLC29A2的糖基化修饰不仅对膜锚定十分重要，而且对致癌表型也十分重要(图4)。研究已显示糖基化修饰对于膜蛋白质折叠及正常功能十分重要(Console等人(2015).BiochimicaEt Biophysica Acta,1853(7),1636-1645)。我们的数据暗示糖基化突变体不影响SLC29A2的蛋白稳定性(数据未示出)。结果亦显示SLC29A2与Stat3的相互作用主要发生在细胞核中，从而暗示参与肿瘤进展的新颖Jak/Stat路径。
对于晚期HCC患者来说，索拉非尼是唯一经FDA核准的治疗方式。然而，接受索拉非尼治疗的患者，有严重副作用且花费上百万美元仅使总存活期延长3至6个月。在此研究中，我们发现抑制SLC29A2显著降低肿瘤进展，在活体外及活体内SLC29A2表达细胞中尤其如此。我们的结果亦指示组合SLC29A2抑制剂与索拉非尼的组合进一步增强抑制作用(图6)，这暗示患者能够减少索拉非尼剂量且减轻副作用。而且，相比于单一治疗，组合治疗延长小鼠总存活期。由于在其他类型癌症中SLC29A2亦扩增及高度表达，故抑制SLC29A2可能亦对其他癌症类型有效。总之，我们发现一新的致癌基因SLC29A2可以是癌症中的生物标记及治疗目标。
总之，在HCC患者内SLC29A2的过度表达显示与分化不良及远距转移具有相关性。SLC29A2在HCC细胞株中的异位表达显示，在原位HCC模型中SLC29A2促进致癌特性(包括增殖、非锚定依赖性生长能力、上皮细胞-间充质细胞转换、癌症引发细胞特征及肿瘤进展)。SLC29A2过度表达促使STAT3磷酸化且与STAT3相互作用以促进肿瘤进展。在HCC细胞株与在HCC患者组织的肿瘤进展中，SLC29A2的核表达增加。SLC29A2与STAT3之间的相互作用主要发生在细胞核中。抑制核运输会减少SLC29A2的核转运、其与STAT3的相互作用及其致癌表型。抑制SLC29A2的氨基酸残基48或57处的糖基化修饰亦减少其核转运及致癌特征，这说明了SLC29A2的膜锚定对其核转运至关重要。最后，我们显示抑制SLC29A2会降低活体内核表达及肿瘤负荷。结果指示过度表达的SLC29A2在促成HCC肿瘤进展上扮演新的角色，且SLC29A2做为研发新的治疗方法及诊断策略的新目标。
前述的本发明例示性实施方式的呈现目的仅于说明及描述，且不意欲为穷尽性或局限将本发明所揭示的精确形式。鉴于上述教示，可能有许多个修良及变化。
所选用及描述的实施方式与实施例是为了解释本发明的原理及其实际应用，从而使熟习本技术领域者能够利用本发明及各种实施方式以及进行各种修改，已符合预期的特定用途。在不偏离本发明的精神及范围的情况下，其他实施方式对于熟习本发明所属技艺者将变得显而易见。因此，本发明的范围由所附权利要求定义，而非本文前面的叙述及其例示性实施方式来定义。
本发明的描述中引用且论述的一些参考文献，其可能包括专利、专利申请案及各种出版物。引用及/或论述此类参考文献仅提供以阐明本发明的描述并不承认任何此类参考文献是本文中所描述的本发明的“先前技术”。在本说明书中引用及论述的所有参考文献均以全文引用的方式并入本文，某种程度上如同各参考数据皆单独地并入本案以作为参考数据。
SEQUENCE LISTING
<110> 中央研究院
<120> 双嘧达莫用于治疗SLC29A2核-表达癌症
<130> 10011-067PCT
<150> 62437666
<151> 2016-12-22
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC29A2-N48D 正向
<400> 1
ccggggccgg cgacagcaca gcc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC29A2-N48D 反向
<400> 2
ggctgtgctg tcgccggccc cgg 23
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC29A2-N57D 正向
<400> 3
gatcctgagc accgaccaca cgggtcc 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SLC29A2-N57D 反向
<400> 4
ggacccgtgt ggtcggtgct caggatc 27

Claims (15)

1.一种药物组合物的用途，该药物组合物包含：
(i)治疗有效量的双嘧达莫；及
(ii)药学上可接受的载体，
其用于制造抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
2.如权利要求1所述的用途，其中，在所述用途之前，该癌症患者经鉴别为双嘧达莫治疗的候选者，条件是自该患者取得的癌细胞群体与对照相比，显示具SLC29A2的核过度表达。
3.如权利要求1所述的用途，其中，所述癌细胞是选自以下群组中的至少一者：肝癌细胞、乳癌细胞、头颈癌细胞及卵巢癌细胞。
4.如权利要求1所述的用途，其中，所述癌细胞是肝癌细胞且含有显示对索拉非尼治疗抗性的群体。
5.如权利要求1所述的用途，其同时组合使用索拉非尼用于制造抑制癌症患者的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
6.如权利要求1所述的用途，其中，该药物组合物进一步包含索拉非尼。
7.一种双嘧达莫的用途与索拉非尼的用途，其用于制造抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
8.如权利要求7的用途，其中，所述癌细胞是选自以下群组中的至少一者：肝癌细胞、乳癌细胞、头颈癌细胞及卵巢癌细胞。
9.一种药物组合物的用途，该药物组合物包含：
(i)治疗有效量的致癌基因SLC29A2抑制剂；及
(ii)药学上可接受的载体，
其用于制造抑制癌症患者的过度表达致癌基因SLC29A2的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
10.如权利要求9所述的用途，其中，该致癌基因SLC29A2的抑制剂是选自以下群组中的至少一者：双嘧达莫、地拉齐普、曲氟嗪、硝基苯甲基硫肌苷，及其衍生物。
11.如权利要求9所述的用途，其中，该致癌基因SLC29A2的抑制剂选自以下群组：双嘧达莫、SLC29A2反义短小干扰RNA(siRNA)、抗SLC29A2短发夹RNA(shRNA)及抗SLC29A2中和抗体。
12.如权利要求9所述的用途，其中，所述癌细胞是选自以下群组中的至少一者：肝癌细胞、乳癌细胞、头颈癌细胞及卵巢癌细胞。
13.如权利要求9所述的用途，其中，所述癌细胞是肝癌细胞且含有显示对索拉非尼治疗抗性的群体。
14.如权利要求9所述的用途，其中，该组合物进一步包含索拉非尼。
15.如权利要求9所述的用途，其同时组合使用索拉非尼用于制造抑制癌症患者的癌细胞的增殖、发生及转移及/或延长癌症患者存活期的药剂。
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