CN110184286B - OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用 - Google Patents

OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用，涉及基因功能验证技术领域，本发明所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。在本发明实施例中，所述OsMPK15通过调节PRs和SA/JA相关基因的表达以及ROS爆发来负调控对不同稻瘟菌和Xoo菌株的抗性。此外，OsMPK15的敲除也导致粒长增加。

Description

OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用
技术领域
本发明属于基因功能验证技术领域，具体涉及OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用。
背景技术
植物已经进化出两层免疫系统以抵御病原体的攻击，包括模式识别受体 (PRRs)触发免疫反应(PTI)和特定病原体的效应子触发的免疫反应(ETI)， ETI通过识别特异性的细胞质抗性蛋白激活。通常抗病反应的激活需要三个步骤：一是细胞外信号的感知；二是向细胞的传递以及最后通过磷酸化激活防御反应；这三个步骤在防御信号传导中起着重要作用。其中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应是研究相对透彻和保守的信号传导途径之一，其在植物生长发育以及非生物和生物应激反应中起着至关重要的作用。
植物MAPK级联信号传导模块由三种功能上相互交织的蛋白激酶组成，包括MAPK激酶激酶(MPKKK)，MAPK激酶(MPKK)和MAPK，基本过程是MPKKK磷酸化并激活MPKK，MPKK反过来磷酸化并激活MAPK。通常活化后的MAPK进入细胞核并与特定的下游组分如转录因子相互作用。到目前为止，根据水稻基因组数据库通过计算机搜索已经确定了至少17种水稻MAPK，但大部分成员尚待功能鉴定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用，OsMPK15基因负调控水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性，同时敲除所述OsMPK15基因后显著增加了粒长。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了OsMPK15基因在调控水稻对疾病抗性中的应用，所述 OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。
优选的，所述疾病包括稻瘟病和水稻白叶枯病。
优选的，所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对稻瘟病和水稻白叶枯病的抗性。
本发明还提供了所述OsMPK15基因在调控水稻粒长中的应用。
本发明还提供了OsMPK15蛋白在调控水稻抗性中的应用，所述 OsMPK15蛋白由所述OsMPK15基因转录翻译得到。
本发明还提供了所述OsMPK15蛋白在调控水稻粒长中的应用。
本发明还提供了包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻抗性中的应用。
优选的，所述重组载体的制备方法，包括：将所述OsMPK15基因的全长ORF克隆至以玉米泛素启动子修饰的pCAMBIA 1301载体中，得重组载体pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15。
本发明还提供了所述包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻粒长中的应用。
本发明提供了OsMPK15基因在调控水稻抗性中的应用，所述OsMPK15 基因的登录号为LOC_Os11g17080。本发明实施例中构建了OsMPK15的敲除和过表达突变体，并在不同真菌和细菌菌株接种下研究其抗病性。敲除突变OsMPK15(mpk15)后导致病程相关(PRs)基因的组成型表达，由病原体相关分子模式(PAMP)激发子几丁质诱导的活性氧(ROS)积累，并显著增强了对不同稻瘟病和白叶枯病生理菌株的抗性。稻瘟菌和白叶枯菌分别是引起水稻稻瘟病和白叶枯病的致病菌株。相反，在过表达OsMPK15 (OsMPK15-OE)家系中，PR基因和ROS的表达显著下调。同时，植物激素如水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)在mpk15突变体系中积累，但在 OsMPK15-OE家系中减少。在mpk15突变体中SA和JA途径相关基因的表达显著上调，而在OsMPK15-OE家系中则表现为显著下调。因此OsMPK15 可能通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对水稻稻瘟病(M.oryzae) 和白叶枯病(Xoo)抗性。此外，OsMPK15可能通过牺牲抗病性来正向调节水稻产量，OsMPK15的敲除也导致粒长增加。
附图说明
图1为本发明制备得到的mpk15突变体和OsMPK15-OE家系；
图2为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的表型比较；
图3为OsMPK15负调控对水稻稻瘟菌的抗病性；
图4为OsMPK15负调控对水稻白叶枯病的抗性；
图5为mpk15突变体中ROS积累和SA/JA激素含量增加；
图6为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系中防卫基因的表达模式；
图7为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的农艺表型；
图8为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的粒长和粒宽。
具体实施方式
本发明提供了OsMPK15基因在调控水稻对疾病抗性中的应用，所述 OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。本发明所述OsMPK15基因含有TDY磷酸化位点，可编码498个氨基酸。本发明所述疾病优选包括稻瘟病(M.oryzae)和白叶枯病(Xoo)。本发明所述OsMPK15基因通过调节SA 和JA介导的信号通路来负调控对稻瘟病和水稻白叶枯病的抗性。
本发明还提供了所述OsMPK15基因在调控水稻粒长中的应用。在本发明中，敲除所述OsMPK15基因可增加粒长。
本发明还提供了OsMPK15蛋白在调控水稻对疾病抗性中的应用，所述 OsMPK15蛋白由所述OsMPK15基因转录翻译得到。本发明所述OsMPK15 蛋白对调控水稻广谱抗性的分子机理与所述OsMPK15基因相同，在此不再赘述。
本发明还提供了所述OsMPK15蛋白在调控水稻粒长中的应用。本发明所述调控的机理与所述OsMPK15基因相同，在此不再赘述。
本发明还提供了包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻对疾病抗性中的应用。本发明所述重组载体的制备方法，优选包括：将所述 OsMPK15基因的全长ORF克隆至玉米泛素启动子驱动的经过修饰的 pCAMBIA 1301载体中，得重组载体pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15。
本发明还提供了所述包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻粒长中的应用。本发明所述调控的机理与所述OsMPK15基因相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CRISPR/Cas9编辑得到mpk15突变体和OsMPK15-OE家系
使用Crispr/Cas9编辑系统得到mpk15突变体。OsMPK15 (LOC_Os11g17080)的靶序列设计为TTCCTCTATCAGTTGCTTCGAGG。 mpk15突变体通过测序验证是纯合的。将OsMPK15的全长ORF克隆到玉米泛素启动子修饰的pCAMBIA 1301载体中，得到pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15质粒。然后将重组质粒导入水稻栽培品种中花11(ZH11)得到 OsMPK15过表达(OsMPK15-OE)家系。转基因水稻在自然条件下在转基因田生长。
测序分析表明两个mpk15突变体纯合家系插入“A”或“T”分别导致移码突变(图1中A)。对于过量表达OsMPK15，将完整的OsMPK15基因ORF 序列构建到玉米泛素启动子控制下的修饰后的双元载体中(图1中B)，重组载体通过农杆菌转化至水稻品种ZH11。选择两个表达量比野生型高173.1 和104.5倍的家系OE-17和OE-19(图1中C)。在每个生长阶段，都没有观察到OsMPK15-OE与野生型植物在幼苗期和成株期有任何显著变化(图2 中A)。在剑叶、倒二叶和倒三叶时期，WT中发现了轻微的类病斑，而在田间条件下mpk15突变体中没有类病斑。然而在OsMPK15-OE家系的倒三叶中观察到白叶枯病斑(图2中B)。
实施例2
OsMPK15在水稻稻瘟病抗性中的作用
参照Overexpression of MoSM1,encoding for an immunity-inducing proteinfrom Magnaporthe oryzae,in rice confers broad-spectrum resistance againstfungal and bacterial disease(Hong,Y.,Yang,Y.,Zhang,H.,Huang,L.,Li,D.,andSong,F.(2016).)中方法评估苗期的稻瘟病抗性：用30日龄的水稻幼苗喷雾接种稻瘟菌株46-2和RB22的孢子。稻瘟菌株在燕麦琼脂培养基上生长10 天，10天后收集分生孢子并将其浓度调节至105个/mL，添加0.02％吐温-20。然后离体叶片接种：使用移液管尖端在每片叶子上的三个点处滴加5μL孢子悬浮液。将接种的叶子在25℃，100％湿度下在黑暗中保持24小时，然后在25℃，12小时光照12小时黑暗循环正常条件下生长。在接种后6天(dpi) 测量病斑长度。
结果如图3中A和图3中B所示，在接种菌株46-2和RB22后， OsMPK15-OE家系OE-17和OE-19上的典型的稻瘟病斑表型比野生型更严重。在OsMPK15-OE和野生型植物的叶上观察到典型的稻瘟菌病斑，而在 mpk15突变体家系的叶片上几乎没有观察到典型的稻瘟病斑(图3中A，图 3中B)。在接种稻瘟菌后6天，OsMPK15-OE家系接种叶片的平均病斑直径比野生型增加了2.14至2.41倍，而mpk15突变植物的接种叶片的病斑直径与WT相比减少了60.5％至68.9％(图3中D)。
使用qRT-PCR方法通过测定稻瘟菌28SrDNA的基因组DNA水平间接计算稻瘟菌DNA量，并且通过比较基因组真菌28SrDNA水平与水稻OsEF1 基因组DNA获得的比率表示稻瘟菌相对生长量。通过稻瘟菌28S rDNA基因组DNA水平测定表明，OsMPK15-OE家系在接种的叶子中具有更多的稻瘟菌含量，与WT相比增加了7.60至9.92倍，而mpk15突变体植物减少了81.71％至89.15％。即mpk15突变体增加了水稻稻瘟病的抗性，而 OsMPK15-OE表现出增加了对水稻稻瘟菌的感病性。
实施例3
OsMPK15在水稻白叶枯病抗性中的作用
通过剪叶法对3个月大的OsMPK15-OE和mpk15突变体家系接种两个白叶枯菌株：菲律宾白叶枯菌株PXO96和中国白叶枯菌浙江菌株Zhe817，并将接种后的水稻在白天30℃和夜晚25℃、保持适当的湿度的温室中发病，接种15天后通过测量病斑长度来评价其对白叶枯病的抗性。
结果如图4中A和4中B所示，与WT相比，mpk15突变体家系整体发病不太严重，而OsMPK15-OE发病严重。PXO96菌株接种后的mpk15 突变体的剑叶病斑平均长度分别为3.68和4.81cm，分别为WT的51.47％和 62.82％，而OsMPK15-OE家系分别为18.98和13.32cm，与WT(9.90cm) 相比，增加了34.45％和91.58％(图4中C)。表明mpk15突变体显著增加了对白叶枯病的抗性，而OsMPK15-OE家系显示出增加了对白叶枯菌的感病性。
实施例4
ROS的测量
将三个月大的水稻叶片用打孔器打出叶盘在无菌蒸馏水中孵育过夜消除损伤。使用鲁米诺化学发光测定法测定几丁质处理后的ROS产生曲线。将每个编号的三个叶盘置于含有100μL鲁米诺(Wako Pure Chemical Corporation的L-012)，1.0μL辣根过氧化物酶(Sigma)的1.5mL微量离心管中，加入1.0μL激发子(800nM几丁质，水作为模拟对照)立即在Glomax 20/20发光计(Promega)中，每10秒记录发光读数，并连续记录读数20分钟。每个样品至少进行3次生物学重复。
结果如图5所示，对于几丁质处理，mpk15突变体家系中的ROS积累显著高于WT，而OsMPK15-OE家系中的积累显著低于WT。在几丁质处理后约5分钟和6分钟出现峰值ROS水平(图5中A)。在mpk15突变体系中几丁质处理的ROS积累是WT中的1.56倍，而OsMPK15-OE系在峰值时间仅具有WT的58.3％(图5A中)。相反，对照处理后不同品系均保持在基础 ROS水平。通过使用3'-3'-二氨基联苯胺(DAB)染色定量内源性H2O2也证实了这一发现(图3中C)。这些结果表明几丁质触发的ROS积累在 OsMPK15-OE家系中被抑制而在mpk15突变体家系中增加。
实施例5
SA和JA测定
在正常条件下测定了4周龄OsMPK15-OE，mpk15突变体和WT中的内源SA和JA水平(通过HPLC-MS系统(1290/6460型，Agilent)进行SA 和JA的定量，其中稳定同位素标记的SA和JA作为内标。每次测量三次重复)。
结果显示，mpk15家系中的SA水平比WT中的SA水平高1.69至1.98 倍，而OsMPK15-OE系分别与WT相比降低了36.69％和22.06％(图5中B)。类似地，与WT相比，mpk15突变体家系中的内源JA水平分别增加了41.47％和24.06％，而OsMPK15-OE家系分别减少了78.87％和71.91％。这些结果表明，在正常条件下，OsMPK15-OE家系中SA和JA积累减少，而mpk15 家系中SA和JA积累增加。
实施例6
实时定量PCR表达分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen，Shanghai，China)提取相同发育阶段的 WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒合成第一链cDNA。使用LightCycler 480 II实时PCR系统(Roche，USA) 将0.5μL cDNA用于qRT-PCR的模板。OsActin基因(LOC_Os03g50885)用作内部对照。基因特异性引物列于表1中。对每种表达评估进行三次独立的生物学和技术重复。
表1引物名称及序列
Figure RE-GDA0002118403010000071
Figure RE-GDA0002118403010000081
分析4周龄mpk15突变体，OsMPK15-OE和WT中PR4，PR5，PR8， PR10和PAL的表达模式，结果如图6中A所示，在mpk15突变体家系中 PR4，PR5，PR8，PR10和PAL的表达水平(其中PAL是SA生物合成基因) 显著上调，分别是WT的9.85、4.15、3.41、4.94和2.23倍，而在OsMPK15-OE 家系中该基因都保持非常低的水平(WT的8.9％至89％)。此外，MAPK级联翻译中枢基因包括MAPK3和MAPK6的表达，SA信号标记基因WRKY45，以及JA生物合成基因LOX，OPR1，AOS1，AOS2和AOS4。MAPK3、MAPK6 和WRKY45在mpk15突变体家系中显著上调并在OsMPK15-OE家系中被抑制(图6中B)。在mpk15突变体家系中，包含LOX和OPR1的JA生物合成基因显著上调，显示比WT高出2.61和6.78倍，而其他JA生物合成基因如AOS1，AOS2和AOS4则略有上调，显示比WT增加1.46至2.36倍；而它们在OsMPK15-OE家系中被抑制(图6中B)，与mpk15突变体中升高的 SA和JA含量表现一致。这些结果表明OsMPK15可能在调节针对稻瘟菌和 Xoo的SA和JA信号传导途径中起负调控作用。
实施例7
农艺性状比较
在田间条件下检查不同水稻家系的株高和分蘖数。将收获的谷物风干并在室温下储存一个月。使用常规方法选择每个品系的20个随机主穗，用于穗重、每穗总数、结实率和单株产量的测量。使用自动种子考种及千粒重分析系统(万深SC-G，中国杭州)计算来自WT、mpk15突变体、OsMPK15-OE 植株的千粒重、粒长和粒宽。至少三次重复。
结果显示，OsMPK15-OE家系的株高高于WT(图2中A，图7中A)。此外，OsMPK15-OE家系的每穗粒数和穗长均高于WT，而mpk15突变体比 WT少(图2中C，图2中D)。即mpk15突变体中增强的抗病性可能会消耗更多的能量，导致更少的生物量和穗粒数。
与野生型植株相比，mpk15突变体系每穗粒数和结实率显著下降，千粒重增加；然而OsMPK15-OE家系显著增加了每穗粒数(图7中C)。分蘖数，结实率和千粒重在OsMPK15-OE和WT之间没有显著差异(图7中B，D， E)。
田间评估对单株籽粒产量显示，与WT相比，OsMPK15-OE家系每株植物的籽粒产量增加了14.02％和23.23％，而mpk15突变体家系分别仅为WT 的60.2％至66.93％(图7中F)。此外，OsMPK15的敲除产生更大的种子，而在OsMPK15-OE和WT之间没有观察到粒长、粒宽和幼苗发育有显著差异(图8中A-D)。这些结果表明，OsMPK15可能通过牺牲抗病性来正向调节水稻产量。
本发明提供了OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用， OsMPK15通过调节PRs和SA/JA相关基因的表达以及ROS爆发来负调控对不同菌株稻瘟菌和Xoo的抗性。此外，OsMPK15的敲除也导致粒长增加。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcgcatatt gtgccacatg 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggatacactt gccacacgag tct 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caacagcaac taccaagtcg tctt 24
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caaggtgtcg ttttattcat caacttt 27
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttcatctgg tcagcggata gc 22
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcataagtat tatcacgacc gttcga 26
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccctgccgaa tacgcctaa 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ctcaaacgcc acgagaattt g 21
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctcgccatc gccaacatc 19
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgcccttgaa cccgtagtcc 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gacgcgagga agtacatgag g 21
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cagcgggttg aaggtgagc 19
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgcacgctca gggagatc 18
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggtatgatat cccttatggc aacaa 25
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcgtccggga atacggtggt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aggcctttgg gtgcttggag 20
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccgagcttga cgcgaaga 18
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gatcgtcgtc gtccacattg t 21
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caccgccggt caaagtct 18
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccgtatccgt acaagctgat tg 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
caatacgtgt actggtcgaa tgg 23
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aaggtgtcgt accggaggaa 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaggagtacg tgccggacag 20
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggagtcgtat cggaggaaga gc 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
cgggaggaag ggaacaaggt 20
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aatggtgcgt caagctcaaa c 21

Claims (7)

1.OsMPK15基因在调控水稻主要病害抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080；
所述病害为水稻稻瘟病和白叶枯病；
所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性。
2.权利要求1所述应用中的OsMPK15基因在调控水稻粒长中的应用。
3.OsMPK15蛋白在调控水稻主要病害抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK15蛋白由权利要求1中的所述OsMPK15基因转录翻译得到；
所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080；
所述病害为水稻稻瘟病和白叶枯病；
所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性。
4.权利要求3所述应用中的OsMPK15蛋白在调控水稻粒长中的应用。
5.包含权利要求1所述应用中的OsMPK15基因的重组载体在调控水稻主要病害抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080；
所述病害为水稻稻瘟病和白叶枯病；
所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述重组载体的制备方法包括：将所述OsMPK15基因的全长ORF克隆至以玉米泛素启动子修饰的pCAMBIA 1301载体中，得重组载体pCAMBIA1301-Ubi :: OsMPK15。
7.权利要求5或6所述的应用中的重组载体在调控水稻粒长中的应用。
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