CN110170043A - 假单胞菌属抑制组合物及其在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用 - Google Patents

假单胞菌属抑制组合物及其在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及假单胞菌属抑制组合物及其在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用。所述的假单胞菌属抑制组合物，主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisin Z与多粘菌素B(下文称PB)的质量比为500‑4000:1，nisin Z的浓度为250‑2000μg/ml。该假单胞菌属抑制组合物对多种革兰氏阴性菌有明显的抑制作用，特别是对大黄鱼内脏白点致病菌有明显的长效的抑制作用，因此能有效预防和治疗大黄鱼内脏白点病。

Description

假单胞菌属抑制组合物及其在制备防治大黄鱼内脏白点病的 药物中的应用
技术领域
本发明涉及大黄鱼养殖领域，具体涉及假单胞菌属抑制组合物及其在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用。
背景技术
大黄鱼肉质鲜嫩，营养价值高，是我国传统的“四大海鱼”之一，是我国主要的近海经济鱼类。随着大黄鱼养殖规模的不断扩大，养殖环境负荷量也不断加重，大黄鱼各种病害也日趋频繁，大黄鱼内脏白点病是近年网箱养殖大黄鱼较为常见的病害之一，由该病害造成的大黄鱼高死亡率给闽东地区大黄鱼养殖带来严重的经济损失。相关研究显示假单胞菌属(Pseudomonas spp.)是引起大黄鱼内脏白点病的主要致病菌，并且该假单胞菌属属于革兰氏阴性菌。目前，在大黄鱼内脏白点病爆发期间，养殖户主要采取投放药物抑制假单胞菌。然而药物投放可能对养殖环境造成影响，一方面使水体中有益菌遭到灭活，另一方面使致病菌逐渐产生耐药性，不利于水产养殖的可持续健康发展。
乳酸菌细菌素是一种由乳酸菌核糖体合成对亲缘细菌具有抑菌作用的多肽。目前唯一通过FDA/WHO允许添加到食品中的市售乳酸菌细菌素为nisin(氨基酸序列为MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK)。Nisin的抑菌机理主要是锚定细菌细胞壁上的脂膜II(lipid II)，造成细菌细胞结构松散，从而杀灭细菌。然而由于细菌细胞壁的结构不同，根据目前的发现，nisin只对革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，对革兰氏阴性菌抑制作用还未发现。因此，目前还不能单独利用nisin抑制假单胞菌属(革兰氏阴性菌)。
发明内容
本发明提供假单胞菌属抑制组合物及其在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用，该假单胞菌属抑制组合物对假单胞菌属具有长效的抑制作用，对大黄鱼内脏白点致病菌具有长效的抑制作用，因此能有效预防和治疗大黄鱼内脏白点病。
本发明通过以下技术方案实现：
假单胞菌属抑制组合物，主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisinZ与多粘菌素B(下文称PB)的质量比为500-4000:1，nisin Z的浓度为250-2000μg/ml。
假单胞菌属抑制组合物在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用，将所述的假单胞菌属抑制组合物应用于制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中。
较之前的现有技术，本发明具有以下有益效果：
该假单胞菌属抑制组合物对多种革兰氏阴性菌有明显的抑制作用，特别是对大黄鱼内脏白点致病菌有明显的长效的抑制作用，因此能有效预防和治疗大黄鱼内脏白点病。
附图说明
图1为本发明的nisin Z与nisin的氨基酸差别
图2为nisin Z对单增李斯特菌(革兰氏阳性菌)抑制效果图，其中2813代表单增李斯特菌。
图3为nisin Z+PB对假单胞菌12h抑制数量对比
图4为本发明组合物对恶臭假单胞菌种的抑制作用效果图。其中A是PB(1.0μg/ml)，B是NisinZ(250μg/ml)，C为PB+NisinZ(1.0μg/mlPB+250μg/ml NisinZ)，D为PB+NisinZ(0.5μg/mlPB+250μg/ml NisinZ)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步阐述：但是不只仅仅局限于以下实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
实施例1
假单胞菌属抑制组合物，主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisinZ与多粘菌素B的质量比为500:1，nisin Z的浓度为250μg/ml。
在大黄鱼内脏白点病爆发期间，挑取在体外能检测到假单胞菌的大黄鱼，将每千克大黄鱼与40毫升的所述的假单胞菌属抑制组合物混合24小时后，大黄鱼体外没有检测到假单胞菌，1周后体外仍然没有检测到假单胞菌，解剖后没有发现大黄鱼内脏白点。
实施例2
假单胞菌属抑制组合物，主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisinZ与多粘菌素B的质量比为1000:1，nisin Z的浓度为500μg/ml。
在大黄鱼内脏白点病爆发期间，挑取在体外能检测到假单胞菌的大黄鱼，将每千克大黄鱼与50毫升的所述的假单胞菌属抑制组合物混合20小时后，大黄鱼体外没有检测到假单胞菌，1周后体外仍然没有检测到假单胞菌，解剖后没有发现大黄鱼内脏白点。
实施例3
假单胞菌属抑制组合物，主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisinZ与多粘菌素B的质量比为2000:1，nisin Z的浓度为1000μg/ml。
在大黄鱼内脏白点病爆发期间，挑取在体外能检测到假单胞菌的大黄鱼，将每千克大黄鱼与45毫升的所述的假单胞菌属抑制组合物混合22小时后，大黄鱼体外没有检测到假单胞菌，1周后体外仍然没有检测到假单胞菌，解剖后没有发现大黄鱼内脏白点。
实施例4
假单胞菌属抑制组合物，主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisinZ与多粘菌素B的质量比为4000:1，nisin Z的浓度为2000μg/ml。
在大黄鱼内脏白点病爆发期间，挑取在体外能检测到假单胞菌的大黄鱼，将每千克大黄鱼与41毫升的所述的假单胞菌属抑制组合物混合23小时后，大黄鱼体外没有检测到假单胞菌，1周后体外仍然没有检测到假单胞菌，解剖后没有发现大黄鱼内脏白点。
以上实施例的nisin Z为(比利时出产的汉德瑞)，多粘菌素B为市售。
实验证明上述实施例的组合物都有抑制大黄鱼内脏白点病的作用。
①从病变的大黄鱼中分离出假单胞菌；
②然后将该假单胞菌属接种于5ml假单胞菌属肉汤(Oxoid，UK)，30℃有氧条件下过夜培养；
③将100μl过夜培养的假单胞菌属与5ml软琼脂(0.8％的琼脂粉)混合均匀，然后倒入脑心浸出液培养基中，待软琼脂凝固后，采用点样法，用实施例1-实施例4的组合物用于抑制假单胞菌；
④将点样好的培养基置于30℃条件下；
⑤观察过夜培养的培养基，记录培养基上出现明显抑菌圈的浓度；
⑥根据步骤⑤得到的抑菌浓度利用96孔细胞板(生工购买)进行浓度稀释，将梯度浓度的nisin Z与PB混合溶液与100μl过夜培养的假单胞菌混合，以未加nisin Z与PB混合溶液的假单胞菌作为对照组，在200μl体系30℃条件下培养直至对照组细菌的OD600nm到达0.4-0.5，实验组找到小于对照组OD600nm一半(即为半抑制效果)，约为0.2左右，找到产生半抑制效果的最低混合液浓度；
⑦将此混合液的最低半抑制假单胞菌的浓度添加到5ml脑心浸出液肉汤中，并添加100μl假单胞菌，在30℃条件下培养，并每隔一定时间内在假单胞菌培养基上进行涂布，记录假单胞菌的数量，并对比空白组(只添加假单胞菌但未添加nisin Z+PB的脑心浸出液)假单胞菌的数量，进一步确定该混合液最低配比抑制浓度下是否有效地抑制假单胞菌。
多次重复实验结果显示：只添加nisin Z未对假单胞菌有抑制作用，只添加PB对假单胞菌有抑制作用，但是不长效。
两者按比例混合添加对假单胞菌的最低抑制浓度见表1。混合液中所添加的PB初始抑制浓度为16μg/ml，随着PB的添加浓度逐渐降低，最低抑制浓度可降低为0.5μg/ml，即nisin Z+PB的混合液(其中nisin Z的浓度为250μg/ml，PB的浓度为0.5μg/ml)时对假单胞菌仍有明显的抑制作用。协同抑制效果通过计算分级抑菌浓度(Fractional inhibitoryconcentration,FIC)，nisin+PB混合液的分级抑菌浓度为FIC＝0.16(＜0.5)，可以认为两者混合液对假单胞菌有明显的协同抑菌作用。利用nisin Z+PB混合液最低抑制浓度对假单胞菌进行体外抑制。6h后假单胞菌的数量有明显的抑制作用(如图3所示)。
上述实验的结果证明，该方法利用较低浓度的常见的抗生素PB(16μg/ml)抑制假单胞菌属的作用，混合液并对其有明显的抑制作用。该方法可以有效降低抗生素等药物的使用量，抑制致病假单胞菌，为解决大黄鱼内脏白点病提供了一种新型方法。
表1.Nisin Z，PB和本发明组合物对假单胞菌、恶臭假单胞菌、铜绿色假单胞菌和变形假单胞菌的抑制效果
表1.Nisin Z，PB和本发明组合物对假单胞菌、恶臭假单胞菌、铜绿色假单胞菌和变形假单胞菌的抑制效果

Claims (2)

1.一种假单胞菌属抑制组合物，其特征在于：主要为nisin Z和多粘菌素B的混合水溶液，其中，nisin Z与多粘菌素B的质量比为500-4000:1，nisin Z的浓度为250-2000μg/ml。
2.权利要求1所述的假单胞菌属抑制组合物在制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中的应用，其特征在于：将权利要求1所述的假单胞菌属抑制组合物应用于制备防治大黄鱼内脏白点病的药物中。
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